Gen-målrettet tilfældig mutagenese at vælge Heterochromatin-destabiliserende proteasom mutanter i Fission gær
Summary
I denne artikel beskrives en detaljeret metode for tilfældig mutagenese af et target gen i fission gær. Som et eksempel målrette vi rpt4 +, som koder en underenhed af 19S proteasom og screene for mutationer, at destabilisere heterochromatin.
Abstract
Tilfældig mutagenese af et gen, målet er almindeligt anvendt til at identificere mutationer, der giver den ønskede fænotype. Af de metoder, der kan bruges til at opnå tilfældig mutagenese, fejlbehæftet PCR er en praktisk og effektiv strategi til at generere en forskelligartet gruppe af mutanter (dvs., en mutant bibliotek). Fejlbehæftede PCR er den foretrukne metode, når en forsker søger at mutere en pre-definerede region, som regionen kodning af et gen, mens upåvirket andre genomisk regioner. Når biblioteket mutant forstærkes af fejlbehæftede PCR, skal det blive klonet i en egnet plasmid. Størrelsen af biblioteket genereret af fejlbehæftede PCR er begrænset af effektiviteten af trinnet kloning. I fission gær, Schizosaccharomyces pombe, kan trinnet kloning udskiftes ved hjælp af en yderst effektiv one-step fusion PCR til at generere konstruktioner til transformation. Mutanter af ønskede fænotyper kan derefter vælges ved hjælp af passende journalister. Her beskriver vi denne strategi i detaljer, tager som et eksempel, en reporter indsat på centromeric heterochromatin.
Introduction
Fremad genetik er et klassisk metode hvor forskere søger naturligt forekommende mutanter, der viser en særlig fænotype, og udføre genetiske analyser. I reverse genetik, mutationer er indført i et gen af interesse og fænotype er undersøgt. I sidstnævnte tilfælde bruges tilfældig mutagenese af et target gen ofte til at generere en pulje af mutanter, som efterfølgende vælges til ønskede fænotyper, såsom temperatur følsomhed eller ændret enzymatisk aktivitet. Forskellige metoder kan bruges til at opnå tilfældig mutagenese, herunder fejlbehæftet PCR1; UV bestråling2; kemiske mutagener, såsom ethyl methanesulfonate (EMS) eller salpetersyrling3; brugen af midlertidige mutator stammer, som dem over at udtrykke mutD5 4; og DNA blander5.
Her, beskriver vi en reverse-genetik strategi, hvor vi udnytter fejlbehæftet PCR for at generere mutant pools for et mål gen i fission gær. Som man kunne gætte fra navnet, genererer denne metode mutationer ved bevidst at indføre fejl under PCR. I modsætning til andre metoder til mutagenese tillader fejlbehæftet PCR bruger hen til definere regionen til at være mutagenized. Dette gør det særligt nyttig i bestræbelserne på at studere funktionen af en protein/domæne af interesse.
For at demonstrere denne tilfældig mutagenese procedure, bruger vi heri rpt4 +, som koder 19S proteasom subunit, som et eksempel. Rpt4 har vist sig at have proteolyse-uafhængig funktioner i organismer end fission gær6,7,8,9, og en defekt i proteolyse kunne forårsage indirekte effekter ved at ændre proteiner niveauer. Vi er derfor, screenes for mutanter, der udløste proteolyse-uafhængig ændringer, med mål at undersøge funktionen af proteasom på heterochromatin.
Fejlbehæftede PCR kan anvendes til nogen gene region ved tuning den placering, hvor primere binde. Mutanter, som udviser den ønskede fænotypiske forandringer kan identificeres med passende journalister. Her, vi udnyttet en ade6 + reporter indsat på centromer 1 ydre Gentag (otr) region10. Konstituerende heterochromatin er dannet på denne region11, så ade6 + reporter er tavshed i wild-type betingelse; Det angives ved røde kolonier10. En mutation, der destabiliserer det konstituerende heterochromatin på centromer vil føre til ekspression af ade6 + -reporter, der er visualiseret som hvide kolonier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tilfældig mutagenese via fejlbehæftet PCR er et kraftfuldt værktøj til at generere en forskelligartet gruppe af mutanter i en given region. Denne teknik er især nyttig for undersøgelser, der forsøger at vurdere funktionen af en protein under en bestemt omstændighed. For eksempel, brugte vi heri fejlbehæftet PCR for at vurdere funktionen af 19S proteasom subunit, Rpt4, i heterochromatin vedligeholdelse. Ved at variere regionen målrettet af fejlbehæftede PCR og justere screening betingelser, vi var i stand til a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Finansiering støtte til dette projekt blev leveret af den grundlæggende videnskab forskningsprogram gennem National Research Foundation af Korea (NRF) finansieret af Ministeriet for videnskab og IKT (2016R1A2B2006354).
Materials
| 1. Media | |||
| Glucose | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| Yeast extract | BD Biosciences | 212720 | |
| L-Leucine | JUNSEI | 87070-0310 | |
| Adenine sulfate | ACR | 16363-0250 | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| L-Histidine | Sigma-Aldrich | H8125 | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | JUNSEI | 19015-0350 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| Potassium phthalate | Sigma-Aldrich | P6758-500g | |
| Inositol | Sigma-Aldrich | I7508-50G | |
| Biotin | Sigma-Aldrich | B4501-100MG | |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | Sigma-Aldrich | M7634-500G | |
| ZnSO4•7H2O | JUNSEI | 83060-031 | |
| FeCl2•4H2O | KANTO | CB8943686 | |
| Sodium molybdate dihydrate | YAKURI | 31621 | |
| KI | JUNSEI | 80090-0301 | |
| CuSO4•5H2O | YAKURI | 09605 | |
| D-myo-inositol | MP biomedicals | 102052 | |
| Pantothenate | YAKURI | 26003 | |
| Nicotinic Acid | Sigma-Aldrich | N4126-500G | |
| (NH4)2SO4 | Sigma-Aldrich | A4418-100G | |
| Agarose | Biobasic | D0012 | |
| G418, geneticin | LPS | G41805 | |
| 2. Enzyme reactions | |||
| PfuUltra II Fusion HS DNA Polymerase | Aglient | 600380 | For site-directed mutagenesis |
| GeneMorphII Random mutagenesis Kit | Aglient | 200500 | For error-prone PCR |
| Phusion High-Fidelity DNA Polymerase | Thermo Fisher | F-530L | For fusion PCR |
| Ex Taq DNA Polymerase | Takara | RR001b | For general PCR |
| BamH1 | New England BioLabs | R0136S | |
| Xho1 | New England BioLabs | R0146S | |
| Dpn1 | New England BioLabs | R0176S | |
| 3. Equipment | |||
| Velveteen square, black | VWR | 89033-116 | For replica |
| Replica-plating tool | VWR | 25395-380 | For replica |
| MicroPulser Electroporator | Biorad | 1652100 | For fission yeast transformation |
| Electroporation Cuvettes, 0.2 cm gap | Biorad | 1652086 | For fission yeast transformation |
| Thermal Cycler | Bioer | BYQ6078 | For fusion PCR ramp reaction |
References
- Pritchard, L., Corne, D., Kell, D., Rowland, J., Winson, M. A general model of error-prone PCR. J Theor Biol. 234 (4), 497-509 (2005).
- Pfeifer, G. P., You, Y. H., Besaratinia, A. Mutations induced by ultraviolet light. Mutat Res. 571 (1-2), 19-31 (2005).
- Moreno, S., Klar, A., Nurse, P. Molecular genetic analysis of fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Methods Enzymol. 194, 795-823 (1991).
- Selifonova, O., Valle, F., Schellenberger, V. Rapid evolution of novel traits in microorganisms. Appl Environ Microbiol. 67 (8), 3645-3649 (2001).
- Cohen, J. How DNA shuffling works. Science. 293 (5528), 237 (2001).
- Sahu, P. P., Sharma, N., Puranik, S., Chakraborty, S., Prasad, M. Tomato 26S Proteasome subunit RPT4a regulates ToLCNDV transcription and activates hypersensitive response in tomato. Sci Rep. 6, 27078 (2016).
- Xu, Q., Singer, R. A., Johnston, G. C. Sug1 modulates yeast transcription activation by Cdc68. Mol Cell Biol. 15 (11), 6025-6035 (1995).
- Bhat, K. P., et al. The 19S proteasome ATPase Sug1 plays a critical role in regulating MHC class II transcription. Mol Immunol. 45 (8), 2214-2224 (2008).
- Chang, C., et al. The Gal4 activation domain binds Sug2 protein, a proteasome component, in vivo and in vitro. J Biol Chem. 276 (33), 30956-30963 (2001).
- Ekwall, K., Cranston, G., Allshire, R. C. Fission yeast mutants that alleviate transcriptional silencing in centromeric flanking repeats and disrupt chromosome segregation. Genetics. 153 (3), 1153-1169 (1999).
- Grewal, S. I., Jia, S. Heterochromatin revisited. Nat Rev Genet. 8 (1), 35-46 (2007).
- Forsburg, S. L. . Forsburg Lab Recipes: Fission Yeast Media. , (2011).
- . . QIAquick PCR Purification Kit. , (2013).
- . . pBlueScript II Vector. , (2005).
- . . QIAquick Gel Extraction Kit. , (2013).
- . . QuickGene SP Kit Plasmid Kit II (SP-PL2). , (2016).
- . . PfuUltra High-fidelity DNA Polymerase. , (2004).
- . . Gibson Assembly Master Mix. , (2017).
- . . GeneMorph II Random Mutagenesis Kits. , (2012).
- . . Plasmid Plus Midi Kit. , (1999).
- Bahler, J., et al. Heterologous modules for efficient and versatile PCR-based gene targeting in Schizosaccharomyces pombe. Yeast. 14 (10), 943-951 (1998).
- Szewczyk, E., et al. Fusion PCR and gene targeting in Aspergillus nidulans. Nat Protoc. 1 (6), 3111-3120 (2006).
- Nurse, P. . Fission Yeast Handbook. , (2000).
- Seo, H. D., et al. The 19S proteasome is directly involved in the regulation of heterochromatin spreading in fission yeast. J Biol Chem. , (2017).
- Tang, N. H., et al. Generation and characterisation of temperature sensitive mutants of genes encoding the fission yeast spindle pole body. PeerJ Preprints. 5, e3377v3371 (2017).
- Rasooly, A., Weisz, A. In vitro antibacterial activities of phloxine B and other halogenated fluoresceins against methicillin-resistant Staphylococcus aureus. Antimicrob Agents Chemother. 46 (11), 3650-3653 (2002).
- Wilson, D. S., Keefe, A. D. Random mutagenesis by PCR. Curr Protoc Mol Biol. , (2001).
