Summary
Toeprinting נועד למדוד את היכולת של במבחנה עיבד RNA ל טופס תרגום חניכה מתחמי עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים. פרוטוקול זה מתאר שיטה עבור toeprinting בתרבית של RNA והוא יכול לשמש כדי ללמוד תרגום תלויי-קאפ והן מונחות IRES.
Abstract
תרגום חניכה היא הצעד הגבלת קצב של סינתזת חלבונים והוא מייצג נקודת מפתח שבה תאים לווסת את תפוקתן חלבון. רגולציה של סינתזת חלבונים היא המפתח מתח-תגובת תאי ולאחר dysregulation מקום מרכזי מדינות למחלות רבות, כגון סרטן. למשל, למרות מתח סלולארית מובילה עיכוב של תרגום הכללית על ידי חניכה תלויי-כיפה attenuating, חלבונים מסוימים הלחץ-תגובה סלקטיבית מתורגמים באופן שאינו תלוי-קאפ. דיסקרטי רכיבים רגולטוריות RNA, כגון אתרים כניסה הסלולר ריבוזום פנימית (IRESes), מאפשרים התרגום של אלה mRNAs ספציפיים. זיהוי של mRNAs כזה, אפיון מנגנוני הרגולציה שלהם, היה אזור מפתח בביולוגיה מולקולרית. Toeprinting היא שיטת המחקר של RNA מבנה ותפקוד כפי שהוא נוגע תרגום חניכה. המטרה של toeprinting היא להעריך את היכולת של במבחנה עיבד RNA ליצירת קומפלקסים יציבים עם הריבוזומים תחת מגוון תנאים, על מנת לקבוע אילו רצפים, אלמנטים מבניים או אביזר גורמים מעורבים ריבוזום איגוד — שלפני הסמן לטקס החניכה תרגום יעיל. לצד טכניקות אחרות, כגון ניתוח המערב והגדרת פרופיל polysome, toeprinting מאפשרת אפיון חזקים של מנגנוני ויסות תרגום חניכה.
Introduction
כמו תרגום צורכת אנרגיה תאית ביותר, זה הגיוני כי התרגום הוא מוסדר בחזקה1. לעומת זאת, dysregulation של תרגום- והשינויים הסוגר בפלט חלבון-נצפית לעיתים קרובות במצבי סטרס-תגובה ומחלות, כגון סרטן1,2. היתרון העיקרי של שליטה translational הוא המהירות שבה תאים יכולים לשנות תפוקתן חלבון על מנת להגיב לגירויים שונים3. תרגום תקנה ובכך מייצג מנגנון חשוב זה יכול להשפיע על הישרדות cell ומוות1,2,3. השלבים של תרגום, חניכה הוא רוב מוסדר ומורכבות מאוד3. בקצרה, mRNAs האיקריוטיים להכיל 5' m7G כובע חיונית כמעט תמיד את התרגום שלהם. תלוי cap-חניכה דורש חניכה האיקריוטים גורמים eIF4E, eIF4A ו- eIF4G (cap-זיהוי המתחם) כדי לקיים אינטראקציה עם תום 5' של mRNA. 43S preinitiation הריבוזום מורכב, המכיל eIF2 מכורך יוזם tRNA, eIF3, הוא גויס לסוף 5' ה-mRNA דרך אינטראקציה של eIF4G עם eIF3. Preinitiation מורכבים נחשב לסרוק mRNA, שנעזר eIF4A (הליקאז RNA) עד codon ההתחלה (אוגוסט) ממוקם. לאחר מכן נוצרת הקבלה 48S מורכבים, סינתזת מועבר לתוך P-האתר של הריבוזום. בסופו של דבר, subunits ריבוזום בשנות ה-60 וה -40 מאוחדים כדי ליצור את ה-80 חניכה מורכב, ואחריו תרגום התארכות1,3,4. לעומת זאת, אתרים כניסה ריבוזום פנימית (IRESes) לעקוף את הדרישה כובע 5' על-ידי גיוס של יחידת משנה ribosomal ישירות אל codon חניכה3בשנות ה-40. מצבים פיזיולוגיים מתח להחליש הכללית תרגום mRNA בשל שינויים גורמי מפתח חניכה האיקריוטים כללי (eIFs). עם זאת, התרגום קאנונית חניכה מאפשרים לתרגום סלקטיבי של mRNAs מסוימים, אשר לעיתים קרובות לקודד את תגובת המתח חלבונים ולאחר dysregulation של תרגום קאנונית החניכה הייתה שם במדינות מחלות כמו סרטן 1 , 2. רכיבים רגולטוריות RNA דיסקרטי, כגון IRESes הסלולר, לאפשר התרגום של כזה2,mRNAs3.
היבט מעניין במיוחד אחד של שליטה translational היא להבין מנגנונים של הקנוני לעומת תרגום קאנונית mRNA נתון. Toeprinting היא טכניקה המאפשרת המחקר מכניסטית מפורט חניכה תרגום RNAs ספציפיים בתוך חוץ גופית. המטרה הכוללת של toeprinting הוא להעריך את היכולת של RNA עניין nucleate את היווצרות חניכה תרגום מורכב עם הריבוזום תחת מגוון תנאים, על מנת לקבוע אילו רצפים, אלמנטים מבניים או אביזר גורמים נדרשים עבור תרגום יעיל חניכה. למשל, גיוס ריבוזום אולי הפריע בהיעדרו של כובע 5' אבל מגורה על ידי נוכחות IRES.
העקרון של השיטה היא במבחנה לתמלל של RNA של עניין, דגירה זה בנוכחות הסלולר תמציות המכילות רכיבים תרגום (או הרכיבים מטוהרים) כדי לאפשר חניכה מתחמי לטופס, וכדי להפוך לתמלל הרנ א עם פריימר ספציפיים. מתחמי RNA-ריבוזום יציב יגרום שעתוק במהופך לעכב בקצה 3' של הריבוזום-מה שנקרא 'toeprint'5,6,7.
ב פרוטוקול זה, ribosomal subunits, eIFs, tRNAs, ו IRES הטרנס-משחק גורמים (ITAFs) נתרמים בנוחות על ידי ארנב רטיקולוציט lysate. כמובן, (. ררילה ררילה). יתרון נוסף של פרוטוקול זה הוא השימוש של פריימר fluorescently התווית על-ידי קרינה פלואורסצנטית מבוסס על ג'ל imager, ולא פריימר radiolabeled. פעולה זו מבטלת צעדים נוספים, כולל radiolabeling הראשיים, כמו גם ייבוש הג'ל, לחשוף אותה למסך מעצימה. הלהקות פלורסנט נרשמים בזמן אמת, כמו שלשול ג'ל, המאפשרות ברזולוציה גדולה יותר. Uncapped X-linked המדכא של אפופטוזיס חלבון (XIAP) IRES RNA משמשת כדוגמה כאן, למרות mRNAs רצ'ט ניתן לנתח גם על-ידי טכניקה זו8.
בניגוד לניתוח המערבי, אשר מודד את הפלט הסופי של תהליך התרגום בתא lysates, toeprinting היא גישה במבחנה כדי למדוד את התרגום חניכה היווצרות מורכבות על RNA. גישה זו רדיוקציוניסטי מאפשרת לצורך המחקר ומפורט של סובסטרטים או גורמים המסדירים תרגום חניכה (למשל., רצ'ט או משולחים שאינם רצ'ט mRNA, IRES מבנה, נוכחות או היעדרות של זנב poly-A, אספקת חלבון ספציפי גורמים, וכו.). לפיכך, toeprinting ניתן ללמוד מצבים שונים של תרגום8 או ההשפעות של מבנים mRNA, כגון IRESes,9,של סינתזת חלבון10.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: ה-RNA היא רגישים מאוד השפלה על-ידי ribonucleases (RNases). סטנדרט הזהירות כדי לשמור את הרנ א ללא שינוי. משתנים לעתים קרובות כפפות. להשתמש פיפטה מסוננים טיפים, נטולת נוקלאז plasticware, וכימיקלים נוקלאז ללא כל השלבים של הפרוטוקול. שימוש ללא נוקלאז או diethyl pyrocarbonate (DEPC)-מים עבור כל הפתרונות מטופלים.
1. הכנת פתרונות
- הכנת מאגר Toeprinting: 20 מ מ טריס-HCl (pH 7.6), 100 מ מ KOAc, 2.5 מ מ Mg(OAc)2, 5% (w/v) סוכרוז, spermidine dithiothreitol (DTT), ו- 0.5 מ מ 2 מ מ.
- לאחסן DTT, spermidine לשימוש יחיד aliquots ב-20 ° C כדי להימנע מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה.
הערה: DTT, spermidine יש להוסיף למאגר toeprinting מיד לפני השימוש. פתרון חסר DTT, spermidine שניתן לאחסן ב-20 ° C.
- לאחסן DTT, spermidine לשימוש יחיד aliquots ב-20 ° C כדי להימנע מחזורים ההקפאה חוזרות ונשנות-הפשרה.
- להכין את aliquots של 85 מ מ 5'-guanylyl imidodiphosphate (GMP-PNP), מ מ 91 אדנוזין טריפוספט (ATP). לאחסן את aliquots ב-20 ° C.
- להכין 450 מ של 6% לזיהוי - שבעה מ' אוריאה ג'ל מיקס: 67.5 מ של 40% acrylamide:bis-אקרילאמיד (19:1), g 189 של אוריאה, mL 112.5 של 5 x TBE (טריס/בוראט/thylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA)), ו- 120 מ ל מים. להמיס האוריאה על-ידי חימום באמבט מים 37 ° C או על פלטה חמה עם ערבוב. לסנן את הפתרון (למשל., 0.2 μm ניטרוצלולוזה מסנן ואקום).
הערה: הפתרון שניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד לפחות.
זהירות: אקרילאמיד Monomeric היא רעלן עצבי אשר יכול להיספג דרך העור. . שמור על עצמך כדי למנוע מגע עם העור (כלומר. ללבוש כפפות, מעיל המעבדה, עין הגנה). לזיהוי צריך גם לטפל טיפול, כפי הפילמור רשאי להמשיך עד 100% השלמת. - להכין formamide בטעינת צבע: 95% formamide, EDTA 18 מ מ, 0.025% (w/v) נתרן dodecyl סולפט (מרחביות), כחול bromophenol 0.025% (w/v), cyanol קסילן 0.025% (w/v). חנות ב-20 ° C.
- יתמוסס nmol 1 של פריימר (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' שכותרתו סיום עם IRDye 800.) 100 μL של מים עבור ריכוז עבודה של 10 pmol/μL. לאחסן ב-20 ° C ב- aliquots חד-פעמיים (µL כ 10), מוגן מפני אור.
2. הכנת mRNA
- להגביר את תבניות DNA לסינתזה של mRNA לפי תגובת שרשרת פולימראזית (PCR) מתוך תבניות המתאימות (כלומר-, DNA גנומי או דנ א פלסמיד, לפי הצורך). להשתמש על אמינות גבוהה DNA פולימראז בהתאם להוראות היצרן, עם התנאים הבאים התגובה (מחזורים 35): להמיס, 98 ° C, 10 s; anneal, 53 ° C, 20 s; להרחיב, 72 ° C, 30 s.
הערה: פריימר לפנים (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) משלבת את רצף יזם T7 כדי לאפשר שעתוק RNA; ומהצמיגים הפוכה (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) כולל שאריות תימין 51 לספק זנב poly-A הרנ א משועתקים. שימו לב כי ה-RNA ניתן גם במבחנה עיבד מ פלסמיד ה-DNA. - שימוש ערכת שעתוק המתאים כדי במבחנה לתמלל המכילות IRES RNA או רצ'ט RNA מתבנית DNA. בצע הוראות היצרן. הכנת המדגם RNA רגיל 20 כרכים תגובה μL. להתייחס את הרנ א מסונתז החדש עם 2 יחידות של נטול RNase DNase למשך 30 דקות ב- 37 מעלות צלזיוס.
- לדלל את הרנ א שטופלו DNase עד 110 µL במים נטולי נוקלאז להוסיף 110 µL חומצת פנול, מערבולת 5 s וצנטריפוגה למשך 3 דקות ב g 20,000 x בטמפרטורת החדר. הסר µL 100 של שלב מימית לרכבת התחתית microfuge 1.5 mL החדש, להוסיף 10 µL של 3 מ' סודיום אצטט, מערבולת 2 ס הוספה, שלושה כרכים של 100% אתנול, מערבולת 5 s, ולאחר לזרז את הרנ א ב-20 ° C בלילה.
- צנטריפוגה > g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C ו להשליך תגובת שיקוע. לשטוף את גלולה עם 500 µL של אתנול 70% (v/v) קרה כקרח וחזור על צנטריפוגה. האחות רב תגובת שיקוע ככל האפשר, מילה נהדרת בגדר במשך 5-10 דקות להיזהר לא להוציא את גלולה.
- Resuspend את הרנ א באמצעי האחסון המתאים של מים נטולי נוקלאז להניב ריכוז העבודה של 0.5 μg/μL. זה יכול להיות מאוחסן ב- 80 ° C או שימוש באופן מיידי.
3. Toeprinting תגובה
- לערבב 15 μL של הארנב רטיקולוציט Lysate (כמובן, ררילה ררילה, אינם מטופלים נוקלאז), 1 μL (40 יחידות) של RNase מעכב, 1 µL של 91 מ מ ATP (סופי 1.82 גיגה מ"מ) μL 1 של 85 מ מ GMP-PNP (1.7 מ"מ הסופי) צינור microfuge 1.5 mL. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
הערה: כמובן, ררילה ררילה צריך להיות aliquoted לשימוש יחיד להימנע ההקפאה-מפשיר חוזרות. פקד קריטי הוא תגובה חסר, כמובן, ררילה ררילה. כדי להבהיר את ההפסקות הטבעי של שעתוק במהופך בזכות מבנה משני הרנ א. להוסיף מאגר toeprinting להחליף כמובן, ררילה ררילה עבור פקד זה. - להוסיף 0.5 µg (1 µL) של RNA, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס במשך 5 דקות.
- הוסף µL 22 מאגר Toeprinting, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
- להוסיף 0.5 µL (5 pmol) של פריימר התווית על-ידי IRDye, דגירה על קרח למשך 10 דקות.
- להוסיף 2 µL של 25 מ מ dNTPs (הריכוז הסופי: 1 מ מ), 2 µL של 100 מ מ Mg(OAc)2, µL 1 של העופות Myeloblastosis וירוס רוורס טרנסקריפטאז (ס ס-RT) µL 3.5 Toeprinting מאגר. עוצמת הקול הסופי הוא 50 μL.
- דגירה התגובה ב 30 מעלות צלזיוס למשך 45 דקות.
- להוסיף 200 µL של מים נטולי נוקלאז ולחלץ מיד עם µL 250 25:24:1 פנול: כלורופורם: isoamyl אלכוהול (pH 8.0 בקירוב). מערבולת 5 s וצנטריפוגה ב 20,000 x g למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר. להסיר את שלב מימית צינור microfuge 1.5 mL, להוסיף שלושה כרכים של 100% אתנול, מערבולת 5 s, וכן לזרז ב-20 ° C בלילה.
- צנטריפוגה > g 20,000 x למשך 30 דקות ב 4 ° C ו להשליך תגובת שיקוע. רחץ בגדר DNA עם 500 µL של אתנול 70% (v/v) קרה כקרח. צנטריפוגה > g 20,000 x למשך 15 דקות ב 4 º C. וביופסיה supernatant הרבה ככל האפשר, אוויר יבש בגדר במשך 5-10 דקות להיזהר לא להוציא את גלולה.
- להמיס בגדר ב 6 μL של מים נטולי נוקלאז ולהוסיף 3 μL של formamide טעינה לצבוע.
4. רצף תגובות
- השתמש את תבנית ה-DNA מ 2.1 תחל את התווית על-ידי IRDye מהשלב 3.4 לתגובות רצף רגיל, באמצעות dideoxynucleotides (ddNTPs) כמו שרשרת מחסלים. השתמש ערכת המתאים של רצפי DNA ופעל לפי הוראות היצרן.
- מיקס 6 μL של כל תגובה רצף עם 3 μL של formamide טעינה לצבוע.
5. הכנת רצף ג'ל ו אלקטרופורזה
הערה: פרוטוקול זה משתמש imager מבוסס על ג'ל של זריחה של 21 ס"מ על 23 ס"מ x ג'ל 0.2 מ מ, אך ניתן להתאים עבור סקוונסרים או ג'ל-גדלים, אחרים במידת הצורך.
- ניקוי יסודי קפיציות 0.2 מ מ וכן את קצר (23 × 25 ס מ), זמן (30 × 25 ס מ) צלחות זכוכית עם 100% אתנול. אוויר יבש.
- לערבב 30 מ"ל של 6% לזיהוי - שבעה מ' אוריאה ג'ל לערבב עם 200 μL של 10% (w/v) קירור (APS) ו 20 μL של tetramethylethylenediamine (TEMED). יוצקים את הג'ל, מקפיד להימנע בועות, והכנס את המסרק ג'ל "כריש-שן". לאפשר את הג'ל פולימריזציה לשעה בטמפרטורת החדר.
- להרכיב את המנגנון רצף ולמלא את מאגרי מים עם 1 x TBE.
- מראש לפעול למשך 15 דקות ב-1500 V עד טמפרטורה אופטימלית של 55 ° C מושגת.
- מחממים את התמהיל צבע מדגם/טעינה (מן השלבים 3.9 או 4.2) עד 85 מעלות צלזיוס במשך 5 דק 1 טען μL על גבי הג'ל רצף.
- הפעל את הג'ל ב-1500 V עבור 8 שעות. המכונה יקרא הלהקות בזמן אמת.
- לפרק את המנגנון, ולחסל את ג'ל אקרילאמיד ואת מאגר הפעלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
בעבר תארנו את היכולת של IRES XIAP כדי לתמוך את החניכה תלוי cap-תרגום במבחנה8,10. Toeprinting הייתה הטכניקה מפתח לחקור את הפרטים מכניסטית חניכה XIAP IRES מורכבים. מבנה ה-DNA קידוד של mRNA המכיל את IRES XIAP (איור 1א') היה במבחנה עיבד ונחשפו ניתוח toeprinting. וריאנטים מוטציה של ה-mRNA XIAP IRES המשמש כאן מוצגים באיור 1B. שעתוק במהופך של המתחם mRNA-ריבוזום XIAP הניב toeprints טיפוסי +17 כדי +19 nt במורד הזרם של אוגוסט (איור 1C, ליין 1). . זה מעיד על גיוס ריבוזום codon את ההתחלה, היווצרות של ריבוזום יציב-RNA מתחמי5,6,7. ריבוזום הגיוס היה לקוי חריפה בהיעדרו של זנב poly-A (איור 1C, ליין 9), כפי שדווחה בעבר11. היווצרות Toeprint היה לקוי גם בהיעדר כמובן, ררילה ררילה ו GMP-PNP (איור 1C, ליין 8) ועבור ההתחלה codon החשבונאי (איור 1C, ליין 7), המאשר כי toeprint נצפתה אינו מבנה-induced הפסקה של שעתוק במהופך אבל הוא, למעשה, ספיציפית היווצרות מורכבות חניכה. היווצרות Toeprint היה לקוי עבור 5' polypyrimidine בדרכי (PPT) החשבונאי (איור 1C, ליין 2) ו- 3' PPT החשבונאי (איור 1C, ליין 4), אשר לשבש את מבנה IRES (איור 1B)8 10, ,12. היווצרות Toeprint שוחזר כאשר המוטנטים PPT תמללו עם 5' כובע (איור 1C, מסלולים 3 ו- 5). היווצרות Toeprint שוחזר גם עבור PPT זוגי החשבונאי (איור 1C, ליין 6), אשר משחזר את מבנה שניוני (איור 1B)10. יחד, נתונים אלה לציין מבנה שניוני של IRES XIAP קריטי עבור תרגום חניכה של RNA האו ם רצ'ט IRES מבנה זה לוותר על התרגום תלוי cap-חניכה. להפגין יותר דרישות ספציפיות עבור 5' כובע בהיעדרו של מבנה IRES, mRNA β גלובין אנושי (HBB) היה נתון לניתוח toeprinting (איור 1D). Toeprint לא נצפתה בהיעדרו של 5' כובע (איור 1D, ליין 1) אבל הריבוזומים גויסו בהצלחה ל RNA HBB רצ'ט (איור 1D, ליין 2).
איור 1 . ניתוח Toeprinting מאשרת את החשיבות של IRES מבנה שניוני של הקמת מתחמי חניכה תרגום ב- RNA IRES uncapped XIAP. (א) תרשים סכמטי של הבונה DNA קידוד RNA IRES את XIAP ניתוח זה. 3' סוף המפתח toeprinting היא 42 bp במורד הזרם של codon ההתחלה. (B) משני מבנים של IRES XIAP את WT (בפינה השמאלית העליונה), 5' PPT החשבונאי (מימין), החשבונאי 3' PPT (השמאלית התחתונה) ו- PPT זוגי החשבונאי (הימנית התחתונה). 'PPT מוטציה' מתייחס מוטציה (UU ל AA) במערכת polypyrimidine קריטי, אשר משבשת את מבנה שניוני IRES8,10,12. Codon ההתחלה הוא התאגרף; מוטציות נקודה מסומנים עם כוכביות (*). (ג) Toeprinting ניתוח של היכולת של XIAP IRES משתנים טופס תרגום חניכה מתחמי כמובן, ררילה ררילה שטופלו GMP-PNP ו- ATP. AUG codon ההתחלה הוחלף AAC ב החשבונאי Codon להתחיל. כדי להפוך את ה-RNA חסר זנב poly-A, ומהצמיגים הפוכה נהגה להכין את התבנית שעתוק במבחנה חסרה פשוט חבל פולי-T. (ד) מתחם חניכה הוקמה ב רצ'ט (אך לא האו ם רצ'ט) 5' UTR של האדם β גלובין (HBB). פאנלים (ג) (ד) השמאלי ביותר 4 נתיבים מייצגים רצף תגובות עם נוקלאוטידים dideoxy שתואר לעיל כל ליין; הרצף מסומן שמאלה של כל לוח. פל, באורך מלא. RNAs כל היו רצ'ט האו ם, אלא אם צוין אחרת. איור זה השתנה בין פרסומים קודמים8,10. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Toeprinting היא טכניקה חזקה למדוד ישירות את היכולת של RNA עניין לתמוך היווצרות של תרגום מתחמי חניכה בנסיבות מבוקרת מאוד. פרוטוקול זה מתאר טכניקה פשוטה עבור toeprinting RNAs יונקים. ארנב רטיקולוציט lysate. כמובן, (. ררילה ררילה) משמש כמקור נוח של הריבוזומים, eIFs, יוזם tRNA, IRES הטרנס-מתנהג גורמים (ITAFs). הנסיין מספק RNA שלהם של בחירה, יכול גם לשמש כתוספת התגובה toeprinting עם cofactors הספציפיים המעניינים אותם. למשל, 48S לעומת ה-80 תרגום חניכה מתחמי ניתן להבחין מבוסס על חלוקת עוצמות קרינה פלואורסצנטית של toeprints7. הקבלה מורכבים נצפתה יהיה תלוי בסוג של נוקלאוטיד גואנין בשימוש. במקרה של IRES XIAP שנדונו כאן, GMP-PNP בתוספת ATP מייצבת מתחמי חניכה טרום 48S, המאופיינת על ידי התפלגות toeprint + 17≥ + 18 > +19. GMP-PNP הוא nonhydrolyzable GTP אנלוגי כי מעכב ribosomal יחידה משנית מצטרף, ובכך חוסם תרגום חניכה-שלב 48S13. לעומת זאת, GTP, ATP, או ATP פלוס GTP מייצבת מתחמי חניכה שנות ה-80, מאופיין toeprint הפצה +17 +19 < +18 >8.
המשתמש יצטרך לקחת בחשבון את סוג ה-RNA הם רוצים toeprint. אם המטרה היא ללמוד מנגנון שאינו תלוי-קאפ, כגון רכיב IRES, הרנ א יכול להיות במבחנה עיבד עם ערכת זמינים מסחרית כלשהי. עם זאת, כל RNA יונקים יכולה להיות נתונה לשיטה זו toeprinting ', ובלבד יש לו כיפה מבנה 5'. MRNA רצ'ט להפיקם באמצעות ערכת המתאים. בכל מקרה, הפרוטוקולים של היצרן צריכה להיות צמוד מלווה, כפי ההכנה של RNA באיכות גבוהה מייצג צעד. מפתח במסגרת ההליך. נקודה קריטית נוספת היא כי החילוץ פנול בשלב 3.7 צריך להתבצע בדרגות pH ניטראלי; אם חומצת פנול בשלב זה, cDNA לאחרונה מסונתז יאבדו. ראוי לציין כי הריכוז של אצטט מגנזיום משמש בשלב 3.5 יכולים להשפיע על היעילות של שעתוק במהופך, ייתכן שיהיה עליך להיות אופטימיזציה עבור כל ה-mRNA.
כמה בקרות מפתח נחוצים להבטיח יחודיות של toeprint. ראשית, אין toeprint חזקים להתייחס בהיעדר כמובן, ררילה ררילה או נוקלאוטיד. הדבר מבטיח ההשהיה שעתוק במהופך שנצפה בשל מתחם הריבוזום-RNA ולא מבנה יציב משני RNA או פגם כלשהו עם התגובה שעתוק במהופך עצמה. שנית, toeprint לא צריך להיות שנצפו אם codon ההתחלה הוא מוטציה. זה מבטיחה הריבוזום הקימה קומפלקס במיוחד עם codon ההתחלה של RNA כי למשתמש יש כראוי המזוהים עם codon התחל הקצה 3' של הריבוזום במתחם. זה חשוב במיוחד עבור רכיבים IRES, אשר עשוי לגייס הריבוזום codon התחלה חלופי14. באופן דומה, toeprint אולי להיות לקוי בהיעדרו של זנב poly-A, כפי שהיה XIAP IRES8. עם זאת, כמה אלמנטים IRES טופס toeprints בהיעדר זנב poly-A, כגון ה CrPV IRES10. בסופו של דבר, בנוסף toeprint הנכון, ההפסקות שעתוק במהופך אחרים יכול להיות שנצפו. אלה פשוט יכול לייצג הפסקות עקב מבנים משני יציבה ב ה-RNA, או הם יכולים להיות עקב תופעה המכונה "הריבוזום קפיצה", שבה הריבוזום שקופיות מתוך codon התחלה למיקומים אחרים על ה RNA15. כדי להבדיל בין האפשרויות הללו, ניתן לבצע את התגובה toeprinting בנוכחות cycloheximide8, אשר עוצר הריבוזום-codon התחל ביעילות אמור להפחית toeprints חלופי עקב ריבוזום קופץ. ראוי לציין, mRNAs שונים יהיו משני מבנים שונים, כלומר המספר ואת עוצמת להפוך את ההפסקות שעתוק (כלומר., רקע להקות) ישתנו גם.
מגבלה אפשרי של טכניקה זו היא זה מודד ריבוזום הגיוס mRNA בתוך חוץ גופית, אבל היווצרות חניכה תרגום מורכבים אינה אומרת בהכרח כי תרגום יתרחשו vivo בתוך. לכן, toeprinting הוא חזק במיוחד בשילוב עם טכניקות ויוו כדי למדוד את התרגום (למשל., polysome פרופיל16) ואת רמות חלבון שנוצר (למשל., ניתוח המערבי).
טכניקה עדכנית יותר "הריבוזום קיטלוג" (המכונה גם "הריבוזום footprinting"), שבה רצפי RNA תפוקה גבוהה משמש כדי למדוד את הנוכחות של הריבוזומים על סך mRNA הסלולר. זוהי טכניקה חזקה כדי למדוד את הריבוזום גיוס בקנה מידה רחב transcriptome. הטבועה אל הריבוזום פרופיל הוא השימוש של ריאגנטים, כגון cycloheximide, לייצב את הריבוזומים על mRNAs. זה מייצג פוטנציאל חיסרון, כמו מספר לא פרופורציונלי של הריבוזומים יכול התקועה הלא ספציפית באזור 5' לא מתורגם (UTR), אשר יכול להתפרש בטעות כשייך תרגום קאנונית חניכה17. Toeprinting, cycloheximide אינה חלק אינטגרלי של ההליך, שלילת האפשרות של תוצאות חיוביות שגויות כאלה. יתר על כן, mRNA כל יחיד שניתן ללמוד בפירוט רב יותר על-ידי toeprinting, כפי שהוא נתיישב לערוך בקרת ניסויים רבים, חזרות (למשל, בדיקת ההשפעה של כמה מוטציות נקודה, או העדר של זנב poly-A, על גיוס ריבוזום). זה יהיה ועתירת שאבטחה לבצע את מערך בקרת ניסויים בהקשר של ריבוזום פרופיל הניסוי המקביל. Toeprinting ובכך הגישה המשלימה של טכניקות מבוססות רצף תפוקה גבוהה, והוא עדיין נפוץ ללימודי במטרה להבהיר מנגנונים של תרגום בתקנה8,9,10, 18.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים שאין התנגשות-של-עניין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו הייתה במימון של מדעי הטבע, מחקר המועצה של קנדה-גילוי הנדסית (RGPIN-2017-05463), קרן קנדה חדשנות-ג'ון ר אוונס מנהיגים קרן (35017), התוכנית מחדשת הקמפוס אלברטה, אלברטה משרד סחר ופיתוח כלכלי.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).
- Lacerda, R., Menezes, J., Romao, L. More than just scanning: the importance of cap-independent mRNA translation initiation for cellular stress response and cancer. Cell Mol Life Sci. 74 (9), 1659-1680 (2017).
- Sharma, D. K., Bressler, K., Patel, H., Balasingam, N., Thakor, N. Role of Eukaryotic Initiation Factors during Cellular Stress and Cancer Progression. J Nucleic Acids. 2016, 8235121 (2016).
- Gebauer, F., Hentze, M. W. Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol. 5 (10), 827-835 (2004).
- Anthony, D. D., Merrick, W. C. Analysis of 40 S and 80 S complexes with mRNA as measured by sucrose density gradients and primer extension inhibition. J Biol Chem. 267 (3), 1554-1562 (1992).
- Hartz, D., McPheeters, D. S., Traut, R., Gold, L. Extension inhibition analysis of translation initiation complexes. Methods Enzymol. 164, 419-425 (1988).
- Shirokikh, N. E., et al. Quantitative analysis of ribosome-mRNA complexes at different translation stages. Nucleic Acids Res. 38 (3), 15 (2010).
- Thakor, N., Holcik, M. IRES-mediated translation of cellular messenger RNA operates in eIF2alpha- independent manner during stress. Nucleic Acids Res. 40 (2), 541-552 (2012).
- Liwak, U., et al. Tumor suppressor PDCD4 represses internal ribosome entry site-mediated translation of antiapoptotic proteins and is regulated by S6 kinase 2. Mol Cell Biol. 32 (10), 1818-1829 (2012).
- Thakor, N., et al. Cellular mRNA recruits the ribosome via eIF3-PABP bridge to initiate internal translation. RNA Biol. , 1-15 (2016).
- Thoma, C., Bergamini, G., Galy, B., Hundsdoerfer, P., Hentze, M. W. Enhancement of IRES-mediated translation of the c-myc and BiP mRNAs by the poly(A) tail is independent of intact eIF4G and PABP. Mol Cell. 15 (6), 925-935 (2004).
- Baird, S. D., Lewis, S. M., Turcotte, M., Holcik, M. A search for structurally similar cellular internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res. 35 (14), 4664-4677 (2007).
- Merrick, W. C. Evidence that a single GTP is used in the formation of 80 S initiation complexes. J Biol Chem. 254 (10), 3708-3711 (1979).
- Arnaud, E., et al. A New 34-Kilodalton Isoform of Human Fibroblast Growth Factor 2 Is Cap Dependently Synthesized by Using a Non-AUG Start Codon and Behaves as a Survival Factor. Mol Cell Biol. 19 (1), 505-514 (1999).
- Dmitriev, S. E., Pisarev, A. V., Rubtsova, M. P., Dunaevsky, Y. E., Shatsky, I. N. Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett. 533 (1-3), 99-104 (2003).
- Faye, M. D., Graber, T. E., Holcik, M. Assessment of selective mRNA translation in mammalian cells by polysome profiling. J Vis Exp. (92), e52295 (2014).
- Duncan, C. D. S., Mata, J. Effects of cycloheximide on the interpretation of ribosome profiling experiments in Schizosaccharomyces pombe. Sci Rep. 7 (1), 10331 (2017).
- Beck, H. J., Janssen, G. R. Novel Translation Initiation Regulation Mechanism in Escherichia coli ptrB Mediated by a 5'-Terminal AUG. J Bacteriol. 199 (14), (2017).
