Summary
Toeprinting tiene como objetivo medir la capacidad de in vitro transcrito RNA para formar complejos de iniciación de traducción con los ribosomas en una variedad de condiciones. Este protocolo describe un método para RNA mamíferos toeprinting y puede utilizarse para estudiar traducción dependiente de la tapa y IRES-conducido.
Abstract
Iniciación de la traducción es el paso tarifa-limitador de la síntesis de proteínas y representa un punto clave en el cual las células regulan su producción de proteínas. Regulación de la síntesis de proteínas es la clave para la respuesta de estrés celular, y la desregulación es central a muchos Estados de enfermedad, como el cáncer. Por ejemplo, aunque estrés celular conduce a la inhibición de la traducción global de atenuación dependiente de la tapa de iniciación, ciertas proteínas de respuesta al estrés se convierten selectivamente en forma independiente de la tapa. Elementos reguladores discretos de RNA, como sitios de entrada interna del ribosoma celular (IRESes), permiten la traducción de los mRNAs específicos. Identificación de estos mRNAs y la caracterización de sus mecanismos, han sido una zona clave en biología molecular. Toeprinting es un método para el estudio de RNA estructura y función lo que respecta a la iniciación de la traducción. El objetivo de toeprinting es evaluar la capacidad de in vitro transcrito RNA para formar complejos estables con los ribosomas en una variedad de condiciones, para determinar que secuencias, elementos estructurales o factores accesorios participan en ribosoma vinculante, un pre-cursor de iniciación de traducción eficiente. Junto con otras técnicas, como análisis occidental y polysome perfilado, toeprinting permite una sólida caracterización de mecanismos para la regulación de la iniciación de la traducción.
Introduction
Como traducción consume energía celular más, es lógico que la traducción es bien regulada1. Por el contrario, la desregulación de la traducción- y las consiguientes alteraciones en la producción de proteína-se observa a menudo en Estados de la respuesta de estrés y enfermedad, como cáncer1,2. Una ventaja importante de control traduccional es la velocidad con que las células pueden alterar su producción de proteína para responder a diferentes estímulos3. Regulación de la traducción representa así un mecanismo importante que puede influir en la supervivencia celular y la muerte1,2,3. De los pasos de la traducción, la iniciación es la más altamente regulado y complejo3. Brevemente, más eukaryotic mRNAs contiene una 5' m7G tapa que casi siempre es esencial para su traducción. Dependiente de la tapa de iniciación requiere eIF4A y eucariótico de iniciación factores eIF4E y eIF4G (el complejo cap-reconocimiento) para interactuar con el extremo 5' del mRNA. 43S preinitiation ribosome complejo, que contiene eIF2-limite iniciador ARNt y eIF3, es reclutado para el extremo 5' de los ARNm a través de una interacción de eIF4G con eIF3. El complejo de preiniciación está pensado para escanear mRNA, ayudados por eIF4A (una RNA helicasa) hasta que encuentra el codón de inicio (AUG). Posteriormente se forma el complejo de iniciación 48S y tRNA se entrega en el sitio P del ribosoma. Finalmente, las subunidades 60S y 40S del ribosoma se unen para formar el inicio de los años 80 complejo, seguido por la traducción elongación1,3,4. En cambio, sitios de entrada interna del ribosoma (IRESes) eludir el requisito para un casquillo de 5' mediante la contratación de la subunidad ribosómica 40S directamente a la del codón de iniciación3. Condiciones de estrés fisiológico atenúan mundial traducción del mRNA debido a las modificaciones de los factores clave general eucariótico de iniciación (eIFs). Sin embargo, mecanismos de iniciación de traducción no-canónico permiten traducción selectiva de ciertos mRNAs que codifican a menudo proteínas de respuesta al estrés, y la desregulación de la iniciación de la traducción no-canónico está implicada en Estados de enfermedades como el cáncer 1 , 2. elementos reguladores RNA discreto, como IRESes celular, permiten la traducción de estos mRNAs2,3.
Un aspecto particularmente interesante de control traduccional es entender los mecanismos de la canónica versus no-canónico traducción de un ARNm determinado. Toeprinting es una técnica que permite el estudio detallado de mecanicista de la iniciación de la traducción de ARN específica in vitro. El objetivo de toeprinting es evaluar la capacidad de un RNA de interés nuclear la formación de una iniciación de la traducción con el ribosoma en una variedad de condiciones, para determinar que secuencias de elementos estructurales y accesorios factores son necesarios para la iniciación de la traducción eficaz. Por ejemplo, contratación de ribosoma puede obstaculizado en la ausencia de una 5' cap pero estimulado por la presencia de un IRES.
El principio de la técnica es en vitro transcribe un RNA de interés, incubar en presencia de extractos celulares que contienen componentes de traducción (o los componentes purificados) permitan transcriben de complejos de iniciación para formar y para invertir el ARN con una imprimación específica. Complejos estables de RNA ribosoma hará transcripción reversa a estancar en el 3' borde del ribosoma, el supuesto 'toeprint'5,6,7.
En este protocolo, subunidades ribosomales, eIFs, tRNAs y IRES trans-acción (ITAFs) están convenientemente contribuyeron por lisado de reticulocitos de conejo (RRL). Otra ventaja de este protocolo es el uso de una cartilla marcada con fluorescencia y reproductor de imágenes de fluorescencia basada en gel, en lugar de una cartilla radiactiva. Esto elimina pasos adicionales, incluyendo radiolabeling la cartilla, así como el gel de secado y exponerlo a una pantalla de intensificación. Las bandas fluorescentes se registran en tiempo real, como el gel, lo que permite una mayor resolución. Esté sin X-ligado inhibidor de apoptosis (XIAP) la proteína IRES ARN se usa como un ejemplo aquí, aunque tapado mRNAs también puede ser analizada por esta técnica8.
A diferencia de los análisis de western, que mide el resultado final del proceso de traducción en los lysates de la célula, toeprinting es un enfoque en vitro para medir la formación de complejos de iniciación traducción en un RNA. Este enfoque reduccionista permite el estudio muy detallado de sustratos o factores que regulan la iniciación de la traducción (ej., con o sin tapón mRNA, IRES estructura, presencia o ausencia de cola poly-A, disposición de los factores de la proteína específica, etcetera). Por lo tanto, toeprinting puede utilizarse para estudiar los diferentes modos de traducción8 o los efectos de estructuras de mRNA como IRESes, en síntesis de proteínas9,10.
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Protocol
Nota: El ARN es altamente susceptible a la degradación por ribonucleasas (RNasas). Tomar las precauciones normales para mantener intacto el ARN. Cambiar guantes con frecuencia. Usar filtrado pipetas, recipientes de plástico libre de nucleasas y productos químicos libre de nucleasas en todas las etapas del protocolo. Uso libre de nucleasas o dietil pirocarbonato (DEPC)-tratamiento de agua para todas las soluciones.
1. preparación de soluciones
- Preparación de buffer de Toeprinting: 20 mM Tris-HCl (pH 7.6), 100 mM KOAc, 2,5 mM Mg(OAc)2, 5% (p/v) de sacarosa, espermidina de Ditiotreitol (DTT) y 0,5 mM de 2 mM.
- Tienda TDT y espermidina en alícuotas de un solo uso a-20 ° C para evitar ciclos de congelación y descongelación repetida.
Nota: TDT y espermidina deben agregarse al búfer de toeprinting inmediatamente antes del uso. Una solución que carecen de TDT y espermidina puede almacenarse a-20 ° C.
- Tienda TDT y espermidina en alícuotas de un solo uso a-20 ° C para evitar ciclos de congelación y descongelación repetida.
- Preparar alícuotas de 85 mM guanylyl 5' imidodiphosphate (GMP-PNP) y 91 mM adenosín trifosfato (ATP). Almacenar las alícuotas a-20 ° C.
- Preparar 450 mL de mezcla de gel de urea de poliacrilamida - 7M de 6%: 67,5 mL de 40% acrylamide:bis-acrilamida (19:1), 189 g de urea, 112,5 de 5 x TBE (Tris/borato/thylenediaminetetraacetic ácido (EDTA)) y 120 mL de agua. Disolver la urea por calentamiento en un baño de agua de 37 ° C o en un plato caliente con agitación. Filtrar la solución (por ej., 0,2 μm filtro de vacío de nitrocelulosa).
Nota: La solución puede almacenarse a 4 ° C durante al menos un mes.
PRECAUCIÓN: Monómero acrilamida es una neurotoxina que puede ser absorbida por la piel. Tener mucho cuidado para evitar contacto con la piel (es decir., guantes, una bata de laboratorio y protección de los ojos). Poliacrilamida también debe manejarse con cuidado, como polimerización no puede proceder a la terminación de 100%. - Preparar formamida colorante de carga: 95% formamida, 18 mM EDTA, 0.025% (w/v) sodio dodecil sulfato (SDS), azul de bromofenol 0.025% (w/v), 0.025% (w/v) xileno cyanol. Almacenar a-20 ° C.
- 1 nmol de primer (5' CTCGATATGTGCATCTGTA; 5' extremo marcado con IRDye 800) se disuelven en 100 μL de agua para una trabajo de concentración de 10 pmol/μL. Almacenar a-20 ° C en alícuotas de un solo uso (aproximadamente 10 μl), protegidos de la luz.
2. preparación de ARNm
- Ampliar las plantillas de la DNA para la síntesis de mRNA por reacción en cadena de polimerasa (PCR) de las plantillas adecuadas (es decir., ADN genómico o DNA del plasmid, según sea el caso). Uso de una polimerasa de la DNA según las instrucciones del fabricante, de alta fidelidad con las siguientes condiciones de reacción (35 ciclos): derretir, 98 ° C, 10 s; Recueza, 53 ° C, 20 s; extender, 72 ° C, 30 s.
Nota: El primer forward (5' AAGCTTAATACGACTCACTATAG) incorpora la secuencia de promotor de T7 para permitir la transcripción de RNA; el primer revés (5' T51GAATTCGGATCCGACCGTGG) incluye 51 residuos de timina para prever una cola poly-A del ARN transcrito. Tenga en cuenta que también puede ser RNA en vitro transcritos del ADN plásmido. - Uso un kit apropiado de transcripción in vitro transcribir ARN que contiene IRES o ARN capsulado de la plantilla de la DNA. Siga las instrucciones del fabricante. Preparar la muestra de RNA en volúmenes de reacción μL 20 estándar. Tratar el ARN recién sintetizado con 2 unidades de libre de Rnasa DNasa durante 30 min a 37 ° C.
- Diluir el ARN tratados con DNasa a 110 μl con agua libre de nucleasa añadir 110 μl ácido fenol, agitarlos durante 5 s y centrifugar durante 3 minutos a 20.000 x g a temperatura ambiente. Quitar 100 μl de la fase acuosa a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL, añadir 10 μl de acetato de sodio de 3 M y s. vortex 2 Agregar 3 volúmenes de etanol al 100%, agitarlos durante 5 s y precipitar el ARN a-20 ° C durante la noche.
- Centrifugue a > 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Lavar el pellet con 500 μl de etanol al 70% (v/v) helado y repita la centrifugación. Aspirar tanto el sobrenadante como sea posible y secar el pellet para 5-10 minutos tenga cuidado de no desalojar la pelotilla.
- Resuspender el RNA en el volumen adecuado de agua libre de nucleasa para producir una concentración de trabajo de 0,5 μg/μL. Esto puede ser almacenado a-80 ° C o utilizar inmediatamente.
3. Toeprinting reacción
- Mix 15 μL de conejo reticulocitos lisado (RRL, no tratados con nucleasa), (40 unidades) de 1 μL de inhibidor de la Rnasa, 1 μl de 91 mM ATP (1,82 mM final) y 1 μL de 85 mM GMP-PNP (1,7 mM final) en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Incubar a 30 ° C durante 5 minutos.
Nota: La RRL debe alícuotas de un solo uso evitar repetidor hielo-deshielo. Control crítico es una reacción falta RRL, para aclarar las pausas naturales de transcripción inversa debido a la estructura secundaria del ARN. Añadir el tampón de toeprinting para reemplazar RRL para este control. - Añadir 0,5 μg (1 μl) de ARN e incubar a 30 ° C durante 5 minutos.
- Agregar 22 μL de tampón de Toeprinting e incubar a 30 ° C por 3 minutos.
- Añadir 0,5 μl (5 pmol) de primer etiquetado IRDye e incubar en hielo durante 10 minutos.
- Añadir 2 μl de 25 mM de dNTPs (concentración final: 1 mM), 2 μl de 100 mM de Mg(OAc)2, 1 μl de aviar Myeloblastosis Virus de la transcriptasa reversa (RT-AMV) y 3,5 μl de tampón de Toeprinting. El volumen final es de 50 μL.
- Incubar la reacción a 30 ° C por 45 min.
- Añadir 200 μL de agua libre de nucleasas y extraer inmediatamente con 250 μl de fenol: cloroformo: isoamílico de 25:24:1 alcohol (pH aproximadamente 8.0). Agitarlos durante 5 s y centrifugue a 20.000 x g durante 3 min a temperatura ambiente. Retirar la fase acuosa a un tubo nuevo de microcentrífuga de 1,5 mL, agregar 3 volúmenes de etanol al 100%, agitarlos durante 5 s y precipitar a-20 ° C durante la noche.
- Centrifugue a > 20.000 x g durante 30 min a 4 ° C y descarte el sobrenadante. Lavar el pellet de ADN con 500 μl de etanol al 70% (v/v) helada. Centrifugue a > 20.000 x g durante 15 min a 4 ° C. Aspiración flotante tanto como sea posible y seque el precipitado durante 5-10 minutos tenga cuidado de no desalojar la pelotilla.
- Disolver el precipitado en 6 μL de agua libre de nucleasas y agregar 3 μL de formamida carga del tinte.
4. secuencia de reacciones
- Utilice la plantilla de la DNA de 2.1 y la cartilla IRDye-etiquetados en el paso 3.4 para las reacciones de secuenciación estándar, utiliza dideoxynucleotides (ddNTPs) como terminadores de cadena. Utilice un kit de secuenciación de ADN adecuado y siga las instrucciones del fabricante.
- Mezcla 6 μL de cada reacción de secuenciación con 3 μL de formamida carga del tinte.
5. preparación de la secuenciación Gel y electroforesis
Nota: Este protocolo usa un sensor de fluorescencia basada en gel y una 21 cm x 23 cm x 0,2 gel de mm, pero puede ser adaptado para otros secuenciadores o tamaños de gel, si es necesario.
- Limpie bien los espaciadores de 0,2 mm, así como el corto (23 x 25 cm) y placas de vidrio de largo (30 × 25 cm) con 100% de etanol. Secar al aire.
- Mezclar 30 mL de gel de urea de 6% poliacrilamida - 7M se mezclan con 200 μL de persulfato de amonio 10% (p/v) (APS) y 20 μL de tetramethylethylenediamine (TEMED). Verter el gel, teniendo cuidado para evitar burbujas e inserte el peine de 'dientes de tiburón' gel. Permita que el gel polimerice durante 1 h a temperatura ambiente.
- Montar el aparato de la secuencia y llenar los depósitos con 1 x TBE.
- Funcionamiento previo durante 15 min a 1500 V hasta alcanzar la temperatura óptima de 55 ° C.
- Calentar la mezcla de tinte de la muestra/carga (de medidas 3.9 o 4.2) a 85 ° C por 5 min carga 1 μL en el gel de secuenciación.
- Correr el gel a 1500 V de 8 h. La máquina Lee las bandas en tiempo real.
- Desmontar el aparato y elimine el gel de acrilamida y buffer de corriente.
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Representative Results
Anteriormente hemos descrito la capacidad de los IRES XIAP para apoyar la iniciación de la traducción de la casquillo-independiente en vitro8,10. Toeprinting fue la técnica clave para interrogar los detalles mecanicistas de la iniciación de XIAP IRES complejo. Una construcción de ADN codifican un ARNm que contiene el IRES XIAP (figura 1A) fue en vitro transcritas y sometidas a análisis de toeprinting. Las variantes mutantes del mRNA XIAP IRES aquí están representadas en la figura 1B. Transcripción reversa del complejo mRNA-ribosoma XIAP rindió típico toeprints + 17 a + 19 nt aguas abajo del AUG (figura 1C, carril 1). Esto es indicativo de reclutamiento del ribosoma al codón de inicio y la formación de complejos de ARN ribosoma estable5,6,7. Reclutamiento de ribosoma fue deteriorado fuertemente en la ausencia de una cola poly-A (figura 1C, carril 9), como previamente divulgados11. Formación de Toeprint fue deteriorada fuertemente también en la ausencia de RRL y GMP-PNP (figura 1C, carril 8) y para el mutante del codón de inicio (figura 1C, carril 7), confirmando que la toeprint observada no es inducido por una estructura pausa de reversa de la transcripción pero es, de hecho, específico de formación de complejos de iniciación. Formación de Toeprint fue deteriorada para el 5' polypyrimidine tracto (PPT) mutante (figura 1C, carril 2) y el 3' PPT mutante (figura 1C, carril 4), que afecten la estructura del IRES (figura 1B)8 ,10,12. Formación de la Toeprint fue restaurada cuando los mutantes PPT se transcripción con una gorra 5' (figura 1C, carriles 3 y 5). Formación de Toeprint también fue restaurada por el PPT doble mutante (figura 1C, carril 6), que restaura la estructura secundaria (figura 1B)10. Juntos, estos datos indican que la estructura secundaria de las IRES XIAP es crítica para la iniciación de la traducción del ARN no capsulado y que estructura del IRES es prescindible para la iniciación de la traducción dependiente de la tapa. Para demostrar aún más los requerimientos específicos para un casquillo de 5' en la ausencia de una estructura del IRES, ARNm de β-globina humana (HBB) fue sometido a análisis toeprinting (figura 1D). No toeprint se observó en ausencia de un cap 5' (figura 1D, carril 1) pero los ribosomas con éxito fueron reclutados con HBB ARN (figura 1D, carril 2).
Figura 1 . Toeprinting análisis confirma la importancia de la estructura secundaria de IRES para la formación de complejos de iniciación de traducción en un RNA de IRES XIAP descontroladas. (A) esquema de la construcción de ADN que codifican el ARN de IRES XIAP utilizados en este análisis. El extremo 3' del primer toeprinting es 42 bp río abajo del codón de inicio. (B) estructuras secundarias de la WT XIAP IRES (superior izquierda), el 5' PPT mutante (parte superior derecha), el 3' PPT mutante (abajo a la izquierda) y el mutante doble PPT (abajo a la derecha). «PPT mutante» se refiere a una mutación de punto (UU AA) en una zona crítica polypyrimidine, que interrumpe la estructura secundaria de las IRES8,10,12. El codón de inicio es en caja; las mutaciones de punto se indican con asteriscos (*). (C) análisis de Toeprinting de la capacidad de variantes de IRES XIAP para formar complejos de iniciación de traducción en RRL tratan con GMP-PNP y ATP. El AUG del codón de inicio fue reemplazado con AAC en el mutante de codón de inicio. Para hacer el RNA que carecen de una cola poly-A, la cartilla inversa utilizada para hacer la plantilla de transcripción en vitro simplemente carecía de un tracto de poli-T. (D) complejo de iniciación se formó en el tapado (pero no las no capsuladas) 5' UTR de β-globina humana (HBB). En los paneles (C) y (D), los 4 carriles de la izquierda representan las reacciones de secuenciación con los nucleotides de dideoxy indicados cada carril; la secuencia se indica a la izquierda de cada panel. FL, larga duración. Los RNAs fueron sin tapón a menos que se especifique lo contrario. Esta figura ha sido modificada de anteriores publicaciones8,10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Toeprinting es una técnica poderosa para medir directamente la capacidad de un RNA de interés para apoyar la formación de complejos de iniciación de traducción bajo circunstancias muy controladas. Este protocolo describe una técnica simplificada para toeprinting RNAs mamíferos. Lisado de reticulocitos de conejo (RRL) se utilizaban como una fuente conveniente de los ribosomas, eIFs, iniciador ARNt y IRES trans-actuando factores (ITAFs). El experimentador proporciona su RNA de elección y también puede complementar la reacción de toeprinting con cofactores específicos de su elección. Por ejemplo, 48S versus 80 complejos de iniciación de traducción pueden ser distinguidas en base a la distribución de las intensidades de fluorescencia de la toeprints7. El complejo de iniciación observada dependerá el tipo de nucleótido de guanina utilizado. En el caso de los IRES XIAP discutido aquí, GMP-PNP más ATP se estabiliza complejos de pre-iniciación 48S, caracterizados por una distribución de toeprint + 17≥ + 18 > + 19. GMP-PNP es una nonhydrolyzable GTP análoga que inhibe la subunidad ribosomal uniendo, así bloqueando la iniciación de la traducción en la 48S paso13. Por el contrario, GTP, ATP, o ATP y GTP estabiliza complejos de iniciación de los años 80, caracterizados por toeprint distribución + 17 + 19 + < 18 >8.
El usuario tendrá que tener en cuenta el tipo de ARN que desean toeprint. Si el objetivo es el estudio de un mecanismo independiente de la tapa, como un elemento IRES, el RNA puede ser en vitro transcritos con cualquier juego disponible en el mercado. Sin embargo, cualquier mamífero RNA puede someterse a este método de toeprinting, siempre que tenga una estructura del casquillo 5'. Debe generar mRNA tapado con un kit adecuado. En cualquier caso, los protocolos del fabricante deben ser seguidos de cerca, como la preparación del ARN de alta calidad representa un paso clave en el procedimiento. Otro punto crítico es que la extracción de fenol en paso 3.7 debe llevarse a cabo en o por encima de pH neutro; Si ácido fenol se utiliza en esta etapa, el cDNA recién sintetizado se perderá. Cabe señalar que la concentración de acetato de magnesio utilizado en el paso 3.5 puede influir en la eficiencia de la transcripción inversa y puede tener que ser optimizado para cada mRNA.
Unos controles claves son necesarios para asegurar la especificidad de la toeprint. En primer lugar, no debe observarse toeprint robusta en la ausencia de RRL o nucleótido. Esto asegura que la pausa de la transcripción inversa observada es debida a un complejo ribosoma-ARN en lugar de una estructura secundaria del RNA estable o algún defecto con la reacción reversa de la transcripción sí mismo. En segundo lugar, no toeprint debe ser observado si el codón de inicio está mutado. Esto asegura que el ribosoma ha formado un complejo especialmente con el codón de inicio del ARN y que el usuario tiene correctamente identificado el 3' borde del ribosoma en complejo con el codón de inicio. Esto es particularmente importante para los elementos de IRES, que pudieran reclutar el ribosoma a un codón de inicio alternativo14. Del mismo modo, el toeprint podría ser deteriorada en la ausencia de una cola poly-A, como fue el caso para la XIAP IRES8. Sin embargo, algunos elementos de IRES forman toeprints en ausencia de una cola poly-A, como el CrPV IRES10. Finalmente, además de la toeprint adecuada, podrían observarse otras pausas de reversa de la transcripción. Puede simplemente suponen pausas debido a estructuras secundarias estables en el ARN, o podría ser debido a un fenómeno denominado "ribosoma saltando", en donde el ribosoma las diapositivas desde el codón de inicio a otros lugares en el RNA15. Para distinguir entre estas posibilidades, la reacción toeprinting puede realizarse en presencia de cicloheximida8, que inmoviliza el ribosoma en el codón de inicio y debe reducir toeprints alternativos debido a saltar del ribosoma. En particular, mRNAs diferentes tienen diferentes estructuras secundarias, lo que significa que el número y la intensidad de la reverso transcripción pausas (es decir., bandas de fondo) también variará.
Una posible limitación de esta técnica es que mide reclutamiento ribosoma a un mRNA in vitro, pero la formación de una complejo de iniciación de traducción no significa necesariamente que la traducción produzca en vivo. Por lo tanto, es particularmente potente cuando se combina con en vivo técnicas para medir la traducción toeprinting (e.g., polysome perfiles16) y los niveles de la proteína resultante (e.g., análisis occidental).
Una técnica más reciente es "ribosome profiling" (también llamado "huella de ribosoma"), en donde la secuencia de RNA de alto rendimiento se utiliza para medir la presencia de ribosomas en el mRNA celular total. Se trata de una técnica poderosa para medir reclutamiento ribosoma en una escala de transcriptoma. Inherente a ribosome profiling es el uso de reactivos, como la cicloheximida, para estabilizar los ribosomas en mRNAs. Esto potencialmente representa un inconveniente, como un número desproporcionado de los ribosomas puede ser no específica se estancó en el 5' región sin traducir (UTR), que puede ser malinterpretado como no-canónico traducción iniciación17. En toeprinting, cicloheximida no es parte integral del procedimiento, negando la posibilidad de tales falsos positivos. Por otra parte, cualquier mRNA solo puede estudiarse en mayor detalle por toeprinting, ya que es fácil de llevar a cabo muchos experimentos de control e iteraciones (por ejemplo, probando el efecto de varias mutaciones de punto, o la ausencia de una cola poly-A, en la contratación de ribosoma). Sería desperdiciador de tiempo y coste-prohibitivos para llevar a cabo una matriz equivalente de experimentos de control en el contexto de un experimento de perfiles del ribosoma. Toeprinting es un enfoque complementario a las técnicas basadas en la secuenciación de alto rendimiento y es todavía usado para estudios con el objetivo de dilucidar los mecanismos de traducción Reglamento8,9,10, 18.
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Disclosures
Los autores no tienen ningún conflicto de interés divulgar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por una Ciencias naturales e Ingeniería investigación Consejo de Canadá-Discovery Grant (RGPIN-2017-05463), la Fundación de Canadá para la innovación-John R. Evans líderes fondo (35017), el programa de Innova Campus Alberta y Alberta Ministerio de Desarrollo económico y comercio.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DEPC (Diethyl pyrocarbonate) | Sigma | D5758-100ML | |
| TRIS base, Ultrapure | JT Baker | 4109-01 | |
| KOAc (Potassium acetate) | Bio Basic | PB0438 | |
| Mg(OAc)2 (Magnesium acetate tetrahydrate) | Bio Basic | MB0326 | |
| Sucrose, molecular biology grade | Calbiochem | 573113-1KG | |
| Spermidine | Sigma | 85558 | |
| GMP-PNP (Guanosine 5′-[β,γ-imido]triphosphate trisodium salt hydrate) 0.1 M solution | Sigma | G0635 | |
| ATP (Adenosine 5′-triphosphate) disodium salt, 100 mM solution | Sigma | A6559 | |
| 19:1 Acrylamide:bis-acrylamide, 40% | Bio Basic | A0006 | |
| Urea | Bio Basic | UB0148 | |
| 500mL bottle top filtration units, 0.2 µm | Sarstedt | 83.1823.101 | |
| Formamide | Sigma | F9037-100ML | |
| EDTA (disodium salt, dihydrate) | Bio Basic | EB0185 | |
| SDS | Bio Basic | SB0485 | |
| Bromophenol blue | Bio Basic | BDB0001 | |
| Xylene cyanol FF | Bio Basic | XB0005 | |
| MEGAshortscript T7 transcription kit | Ambion | AM1354 | |
| mMESSAGE mMACHINE T7 transcription kit | Ambion | AM1344 | |
| Acid Phenol:Chloroform (5:1) | Ambion | AM9722 | |
| 25:24:1 Phenol:Chloroform:Isoamyl Alcohol | Invitrogen | 15593-049 | |
| Rabbit Reticulocyte Lysate (RRL). Should NOT be nuclease-treated. | Green Hectares, USA | Contact Green Hectares, ask for 1:1 RRL:water | |
| RiboLock RNase Inhibitor (40 U/µL) | Thermo Fisher | E00382 | |
| 100 mM dNTPs | Invitrogen | 56172, 56173, 56174, 56175 | Mix equal parts for a stock of 25 mM each. |
| AMV-RT, 10 U/µL | Promega | M5101 | |
| Sequenase Version 2.0 DNA Sequencing Kit | Thermo Fisher | 707701KT | |
| Model 4200 IR2 DNA analyzer | LI-COR | Product has been discontinued | |
| APS (Ammonium Persulfate) | Bio Basic | AB0072 | |
| TEMED | Bio Basic | TB0508 | |
| Phusion High Fidelity Polymerase | New England Biolabs | M0530 | |
| Turbo Dnase | Thermo Fisher | AM2238 |
References
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