Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

لينتيفيرال توسط إنتاج فئران المحورة وراثيا: طريقة بسيطة وذات كفاءة عالية للدراسة مباشرة من مؤسسي

Published: October 7, 2018 doi: 10.3791/57609
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM U1127, CNRS UMR 7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, Sorbonne Universités, 2UPMC Univ Paris 06, INSERM UMRS1166, Institute of Cardiometabolism and Nutrition, Sorbonne Universités

Summary

نقدم هنا، وضع بروتوكول لتعزيز التكامل التحوير وإنتاج مؤسس الفئران المحورة وراثيا بكفاءة عالية بحقنه بسيطة ناقل لينتيفيرال في الفضاء بيريفيتيليني البويضات المخصبة.

Abstract

لما يقرب من 40 عاماً، يمثل حقن الحمض النووي برونوكلير الطريقة القياسية لتوليد الفئران المحورة وراثيا مع التكامل العشوائي المتسلسلات. هذا إجراء روتيني ويستخدم على نطاق واسع في جميع أنحاء العالم، وأن العقبة الرئيسية تكمن في ضعف فعالية التكامل التحوير، أدى إلى انخفاض عائد من الحيوانات مؤسس. أدمجت في المائة عدد قليل فقط من ولد بعد زرع بويضات مخصبة حقن الحيوانات التحوير. على النقيض من ذلك، الناقلة لينتيفيرال أدوات قوية لنقل الجينات التكاملية واستعمالها ترانسدوسي بويضات مخصبة يسمح الإنتاج ذات كفاءة عالية لمؤسس الفئران المعدلة وراثيا وبمتوسط إنتاج أعلى من 70%. وعلاوة على ذلك، أي سلالة الماوس يمكن استخدامها لإنتاج الحيوانات المحورة وراثيا و penetrance التعبير التحوير مرتفعة للغاية، فوق 80% مع لينتيفيرال ترانسجينيسيس وساطة مقارنة microinjection الحمض النووي. حجم الجزء الحمض النووي التي يمكن أن تكون البضائع المتجهة لينتيفيرال يقتصر على 10 كيلو بايت ويمثل القيد الرئيسي لهذا الأسلوب. استخدام بسيطة وسهلة لإجراء الحقن تحت zona pellucida من بويضات مخصبة، يمكن أن تنتج أكثر من 50 مؤسس الحيوانات في جلسة واحدة من microinjection. هذا أسلوب تكييف عالية لأداء، مباشرة في الحيوانات مؤسس والربح السريع والخسارة للدراسات الدالة أو إلى مناطق الحمض النووي الجينومي الشاشة لقدرتها على ضبط وتنظيم الجينات التعبير في فيفو.

Introduction

العمل الريادي جوردون et al. في عام 1980 وأظهرت أن حقن الحمض النووي بلازميد في الذكور برونوكلي من بويضات مخصبة بعد زرع في الفئران بسيودوبريجنانت، يمكن أن تسفر عن إنتاج الحيوانات المحورة وراثيا التي تدمج بلازميد الحمض النووي1. المظاهرة أن الثدييات المعدلة وراثيا يمكن أن تتولد كان له تأثير هائل على علوم الحياة العالمية، وفتح الطريق إلى حقول جديدة من البحث سواء بالنسبة للعلوم الأساسية والعلوم الطبية الحيوية متعدية الجنسيات. في العقود الأربعة الماضية، أصبح الحمض النووي microinjection ممارسة روتينية. على الرغم من أن تم إنتاج عدد هائل من الفئران المحورة وراثيا، غير قابلة للاستخدام الكامل لجميع سلالات الماوس الطريقة القياسية ويتطلب وقتاً طويلاً باككروسيس2،3. تطبيقه على الأنواع الأخرى ويظل التحدي4 والعائد التكامل التحوير عموما تقتصر على نسبة قليلة من الحيوانات ولدت5. وباﻹضافة إلى ذلك، فعالية التكامل التحوير يمثل عاملاً يحد من يشرح العائد الإجمالي الفقراء pronuclear حقن الحمض النووي. وفي هذا الصدد، النواقل الفيروسية التكاملية هي الأدوات الأكثر فعالية لنقل البضائع وإدماج المتسلسلات وبالتالي يمكن أن توفر وسائل جديدة زيادة غلتها التكامل والقيد الوحيد هو أن الحجم التحوير الذي لا يمكن أن يتجاوز 10 كيلو بايت6 .

لينتيفيرال ناقلات الزائفة المكتوبة مع البروتين يأت من فيروس التهاب الفم الحويصلي (منظمة) هي أدوات نقل الجينات بانتروبيك وتكاملية عالية ويمكن استخدامها ترانسدوسي بويضات مخصبة7. Zona pellucida المحيطة بويضات حاجزاً فيروس طبيعي ويحتاج لتمريرها إلى السماح بتوصيل مع ناقلات لينتيفيرال. الحيوانات المحورة وراثيا تم إنشاؤها بواسطة بويضات مخصبة ترانسدوسينج بعد الحفر الصغيرة أو إزالتها من8، zona pellucida9. ومع ذلك، يبدو الحقن تحت zona pellucida في الفضاء بيريفيتيليني أن أبسط طريقة للبيض المخصب كما هو موضح في البداية ب لويس والزملاء7ترانسدوسي.

حقن بيريفيتيليني لينتيفيرال ناقلات يسمح الغلات العالية في إنتاج الحيوانات المحورة وراثيا التي أعلى من 70% حيوانات ولدت. هذا العائد ما يزيد على 10 إضعاف أعلى من عائد أفضل ما يمكن تحقيقه باستخدام معيار pronuclei الحمض النووي حقن7،10،11. وفي هذا السياق، سينشئ جلسة واحدة من حقن مؤسسي المحورة وراثيا على الأقل 50 (F0). ، ولذلك العدد الكبير من مؤسسي متوافق مع phenotyping أثر التحوير مباشرة أجريت على الفئران F0 دون الحاجة إلى إنشاء خطوط الماوس المحورة وراثيا. هذه الميزة تسمح للفحص السريع لتأثير التحوير وتكييف خصيصا لأداء في فيفو المكسب والخسارة للدراسات وظيفة في غضون أسابيع. وباﻹضافة إلى ذلك، العناصر التنظيمية الحمض النووي يمكن أيضا سرعة فحص لخريطة معززات وزخارف الحمض النووي ملزمة بالنسخ العوامل11،12. مع حقن برونوكليار، دمج المتسلسلات عادة نسخ متعددة كما في موضع فريد من نوعه. مع نواقل لينتيفيرال، يحدث التكامل في مواضع متعددة كنسخة واحدة كل10،موضع13. ولذلك، تعدد المكاني المتكامل الأكثر احتمالاً المرتبطة penetrance التعبير عالية جداً في مؤسسي المحورة وراثيا، مما يجعل هذا النموذج التي تم إنشاؤها جديدة أكثر قوة.

الأهم من ذلك، عند استخدام حقن برونوكليار للحمض النووي، التصور من برونوكلي أثناء الإجراء مطلوب على الإطلاق. يمنع هذا التقييد التقنية استخدام بويضات مخصبة مصدرها مجموعة كبيرة ومتنوعة من سلالات الماوس. ولذلك، إنتاج نموذج المعدلة وراثيا في محدد السلالة التي برونوكلي غير مرئية يتطلب إنتاج الحيوانات في سلالة متساهلة تليها على الأقل 10 باككروسيس المتعاقبة لنقل التحوير في الماوس المطلوبة سلالة. مع حقن متجه لينتيفيرال، بيريفيتيليني الفضاء دائماً مرئياً والحقن لا تتطلب مهارات محددة للغاية. على سبيل مثال، تم الحصول على موافقة/مشمولان الفئران المعدلة وراثيا التي لا تكون مناسبة لحقن برونوكلي مع حقن النواقل الفيروسية14.

هنا، يقدم بروتوكول شامل للسماح بإنتاج الفئران المعدلة وراثيا باستخدام الحقن لينتيفيرال المتجهات في الفضاء بيريفيتيليني جنين المرحلة خلية واحدة بسيطة. التعبير التحوير يسيطر مع أما في كل مكان أو المروجين الخلية المحددة يتم وصف بالتفصيل.

واستخدمت في هذه الدراسة15العمود الفقري لينتيفيرال ΔU3 بتريب. يسمح هذا متجه لإنتاج النسخ المتماثل ناقلات لينتيفيرال المعيبة التي تسلسل U3 جزئيا وحذفت لإزالة نشاط المروج U3 وتوليد متجه (سين) الذاتي إيناكتيفاتينج16. الأسهم ناقلات لينتيفيرال تم إنتاجها بواسطة عابر تعداء الخلايا HEK-293T مع p8.91 تغليف بلازميد (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6، فكمف-ز ترميز بروتين سكري-ز (منظمة) فيروس التهاب الفم الحويصلي17، و ΔU3 بتريب ناقل المؤتلف. ويرد الإجراء إنتاج مفصلة كأساليب تكميلية.

إنتاج مخزون متجه لينتيفيرال عيار عالية تتم تحت ظروف السلامة الأحيائية المستوى الثاني (BSL-2). وهذا صحيح بالنسبة لمعظم المتسلسلات باستثناء المسرطنة التي يمكن إنتاجها في BSL-3. ولذلك، يكفي بالإنتاج في ظروف BSL-2 لمعظم الحالات. وبالإضافة إلى ذلك، عادة ما تكون قطع الاستخدام والإنتاج لمعظم الوكالات التنظيمية الوطنية التي تتعامل مع الكائنات المحورة وراثيا (جينياً). ويمكن استخدام كميات محدودة من النسخ المتماثل غير كفء الخطيئة ناقلات لينتيفيرال (أقل من 2 ميكروغرام من البروتين قفيصه p24) تحت ظروف BSL-1 كما هو موضح بالوكالة "الفرنسية المعدلة وراثيا" بالاتفاق مع توصيات الاتحاد الأوروبي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

كافة الإجراءات التي تشمل أعمال الحيوانات حصلوا على الموافقة الأخلاقية وقد أذنت بالوزارة الفرنسية للبحوث والتعليم تحت رقم أبافيس #5094-20 v6 16032916219274 و 05311.02. مرفق الحيوان ICM فينوبارك قد اعتمدتها وزارة الزراعة الفرنسية تحت رقم الاعتماد B75 13 19. البروتوكول الشامل يتطلب تنفيذ كل إجراء في إطار زمني محدد تم تلخيصها في الشكل 1.

1-الحيوان الشراء وإعداد المركبات الأساسية

  1. شراء الحيوانات
    1. ترتيب الذكور استؤصل الاسهر لديهم 25 B6CBAF1/جرج هي 8 أسابيع عمر (الجيل F1 من الأصل تقاطع بين ♀C57Bl/6JRj و ♂CBA/جرج).
      ملاحظة: عزل الذكور عند وصولهم. ويمكن إعادة استخدام الذكور استؤصل الاسهر لديهم لمدة سنة واحدة على الأقل.
      تغيير في الأقفاص كل ثلاثة أسابيع.
    2. ترتيب الإناث B6CBAF1/جرج 50 10 أسابيع عمر والحفاظ على مجموعة حيوانات على الأقل 50.
    3. تأمر C57BL/6JRj الذكور الخصبة التي 8 أسابيع سن 10-15.
    4. ترتيب 30 C57BL/6JRj الإناث هي 4 أسابيع عمر.
  2. التخدير والقتل الرحيم
    1. التخدير تتم باستخدام كمية من مزيج الكيتامين/إكسيلازيني 300μL، وحقن إينترابيريتونيلي (الكيتامين في جرعة 150μg/غرام من وزن الجسم، إكسيلازيني بجرعة 0.15μg/غ وزن جسم). وتوضع الحيوانات تحت تدفئة وسادة لضبط درجة حرارة الجسم. التحقق من ردود الفعل معسر ذيل الحيوان قبل بدء هذا الإجراء.
    2. وكان يؤديها القتل الرحيم التفكك عنق الرحم. قطع الرأس وقد أدرج كوسيلة ثانوية لتأكيد وفاة الحيوان. كان تنفيذ القتل الرحيم للأجنة بقطع الرأس.
      ملاحظة: عند وصولهم، تتيح للحيوانات كحد أدنى أسبوع 1 روض للمرفق (لا معالجة أو التزاوج). الأهم من ذلك، يمكن أن تستخدم أي سلالات الماوس بما في ذلك خطوط محوره وراثيا كخصوبة الذكور والإناث الخصبة سوبيروفوليشن. ينبغي اختيار سلالة وفقا لمتطلبات السؤال العلمي.
  3. إعداد هرمون
    1. إضافة ميليلتر 910 من المخزن المؤقت بسمج (تروج مصل الفرس الحامل) إلى 1 فيال بمسج المجففة بالتبريد وجعل 100 ميليلتر مختبرين وتخزينها في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: كل قاسمة يحتوي على واجهة المستخدم 55 للفئران 11. ابدأ إبقاء بمسج مختبرين لأكثر من أسبوعين بعد أول استخدام.
    2. إضافة المجففة بالتبريد 2730 ميليلتر من قوات حرس السواحل الهايتية (الإنسان المشيمية تروج) المخزن المؤقت 1 فيال قوات حرس السواحل الهايتية. جعل 100 ميليلتر مختبرين، وتخزينها في-20 درجة مئوية.
      ملاحظة: كل قاسمة يحتوي على واجهة المستخدم 55 للفئران 11.
  4. إعداد البروتين السكري المثبط
    1. إعادة تشكيل 1 قنينة من البروتين السكري المثبط مع 3 مل من M2 المتوسطة للحصول 10 ملغ/مل الحل الأسهم وجعل 50 ميليلتر مختبرين. ثم تخزينها في-20 درجة مئوية.
  5. إعداد أدوات الجراحة
    1. تعقيم كل أدوات الجراحة باستخدام اﻷوتوكﻻف.

2-سوبيروفوليشن للمانحين الإناث

  1. في منشأة حيوان باستخدام ح 12 يوم-دورات ليلة، حقن بمسج الساعة 02:00 م-3 في اليوم. حقن قوات حرس السواحل الهايتية في الساعة 12 يوم-1 ورفيقه بخصوبة الذكور فقط بعد قوات حرس السواحل الهايتية الحقن.
  2. في يوم-3، أضف 1 مل محلول كلوريد الصوديوم 0.9% العقيمة إلى قاسمة 1 من 100 ميليلتر من بمسج (55 UI). حقن 10 C57BL/6JRj الإناث مع 100 ميليلتر إينترابيريتونيلي باستخدام المحاقن دون أي حجم القتلى.
    ملاحظة: سوف تتلقى كل الماوس واجهة المستخدم 5 من بمسج.
  3. في يوم-1، أضف 1 مل محلول كلوريد الصوديوم 0.9% العقيمة إلى قاسمة 1 من 100 ميليلتر من قوات حرس السواحل الهايتية (55 UI). حقن الفئران التي تلقت حقن بمسج مع 100 ميليلتر من حل قوات حرس السواحل الهايتية المخفف (5UI) إينترابيريتونيلي. استخدام المحاقن دون أي حجم القتلى. إجراء الحقن ببطء والانتظار قبل إزالة الإبرة حيث أن عدم تسرب السائل.
    ملاحظة: سوف تتلقى كل الماوس واجهة المستخدم 5 من قوات حرس السواحل الهايتية. وينبغي إجراء حقن من قوات حرس السواحل الهايتية ح 46 بعد بمسج.
  4. ضع كل أنثى C57BL/6JRj في القفص مسمار من الذكور مباشرة بعد قوات حرس السواحل الهايتية الحقن.
  5. فحص المهبل المقابس صباح اليوم 0 واستخدام الإناث الإيجابية لجمع البويضات المخصبة.

3-إعداد "الإناث" جرج B6CBAF1/بسيودوبريجنانت

  1. ورفيقه أحد الذكور استؤصل الاسهر لديهم اليوم قبل جمع البيض (اليوم-1) مع 2 B6CBAF1/جرج الإناث في 05:00 م.
    ملاحظة: من المهم جداً إلى رفيقه مع الإناث التي تنشأ من أقفاص مختلفة لتجنب تزامن دورات الإناث. وهذا سيزيد العائد من الحصول على المقابس المهبلية. وبالإضافة إلى ذلك، لا تضيف أنثى إلى قفص ذكور التي تغيرت في غضون الأيام الماضية 2. هو زيادة فعالية السلوك الإنجابي في الذكور عند القفص القذرة.

4. جمع البويضات المخصبة

  1. إعداد
    1. إضافة ميليلتر 1450 م 2 إلى حل مخزون البروتين السكري المثبط لإعداد الحل العامل البروتين السكري المثبط.
    2. ضع قطره واحدة من 100 ميليلتر من البروتين السكري المثبط العامل حل كل أنثى المستخدمة لإنتاج البيض المخصب في 100 مم طبق بيتري وتبقى في درجة حرارة الغرفة.
    3. إضافة 500 ميليلتر من M16 في لوحات 4 آبار. استخدام الآبار 2 كل نوع من ناقلات لينتيفيرال التي سيتم حقنها: واحدة كذلك ستحتوي البيض المحقون والآخر منها غير مدخلة. ضع 4 لوحات جيدا في الحضانة عند 37 درجة مئوية مع جو2 CO 5%.
  2. إعداد الماصات لجمع ومعالجة الأجنة.
    1. تنعيم الزجاج الهيماتوكريت الشعيرات الدموية (75 ملم/60 ميليلتر) عن طريق تناوب مركز الأنابيب الشعرية الثابت الزجاج في اللهب.
    2. إزالة الشعيرات الدموية من الحرارة في أسرع وقت ممكن، وسحب للحصول على أنبوب مع قطرها داخلي لحوالي 300 ميكرون. السحب على أنابيب تبريد للحصول على استراحة نظيفة.
  3. جمع أوفيدوكتس.
    1. Euthanize C57BL/6JRj الإناث بخلع عنق الرحم في 09:00 ص في اليوم 0. ويتأكد الإعدام بقطع الرأس.
      ملاحظة: هذا الأسلوب القتل الرحيم وافق IACUC وفيما يلي التوصيات الأوروبية.
    2. إجراء شق أفقي كبير لفتح التجويف البطني مع المقص. وتقع قناة بين الرحم والمبيض.
    3. إزالة ميسوميتريوم والغشاء الذي يحمل الأوعية الدموية بارزة مع منحنى ملقط.
    4. منفصلاً في قناة المبيض مع الملقط منحنية.
    5. استخدام الملقط منحنية كدليل لقطع قناة من المبيض باستخدام مقص منحنى.
    6. سحب قناة وقطع من الرحم مع مقص منحنى.
      تنبيه: لا تلمس ampulla منتفخة يحتوي على البيض المخصب. تنفيذ الإجراء بأكمله باستخدام أدوات معقمة.
    7. ضع أوفيدوكتس التي جمعت كل في المتوسط M2 (طبق الثقافة 35 ملم) في درجة حرارة الغرفة
    8. ضع أوفيدوكتس 2 في نفس قطره 100 ميليلتر من البروتين السكري المثبط العامل الحل (0.3 مغ/مل).
  4. إزالة خلايا الركام من البويضات المخصبة.
    1. تحت ستيريوميكروسكوبي، استخدام محاقن الأنسولين 2: أول واحد للاحتفاظ قناة وثانية واحدة تمزيق في ampulla وتفريق يخصب البيض في المحلول العامل البروتين السكري المثبط.
    2. تأخذ بيبيت الزجاج معدّة لجمع البيض وتوصيله إلى الأنبوب وعامل تصفية 0.22 ميكرومتر التي شنت على لسان نضح كل البيض. جمع كل البيض وغسلها بمرور المتعاقبة في 6 قطرات مختلفة من 100 ميليلتر من المتوسطة M2.
    3. تغسل مكان البويضات المخصبة إلى حاضنة هوميديفيد 37 درجة مئوية مع جو من 5% CO2 في المتوسط M16.

5-صنع الحقن الماصات

  1. استخدام أنابيب شعرية زجاجية رقيقة الجدران (10-15 سم) مع خارج قطر من 1 مم والمشبك هذا شعري إلى ساحبة ميكروبيبيتي الأفقي.
    ملاحظة: في معظم الأفقي ماصة جر، 3 معلمات يمكن تعديلها: الطاقة الحرارية، سحب قوة ووقت التأخير بين التدفئة وسحب. ضبط هذه المعلمات للحصول على بيبيتس عن طريق الحقن مشابهة لتلك المعروضة في الشكل 2 ألف. للمستخدمين الذين يؤدون بشكل روتيني microinjection الحمض النووي، استخدم الإعدادات القياسية وضبط التأخير بين التدفئة وسحب لتغيير شكل عالمي من طرف ماصة.

6-جعل عقد الماصات

  1. استخدم ماصة حقن لإعداد ماصة القابضة.
  2. إرفاق ماصة حقن ميكروفورجي. قطع الماصة مع ميكروفورجي للحصول على تلميح متناظرة حادة من 80 إلى 100 ميكرومتر القطر. ثم البولندية التلميح مع الحرارة في ميكروفورجي للحصول على شكل دائري متناظرة دون تحوط حادة.

7-إعداد ماصة الحقن التي تحتوي على ناقل لينتيفيرال

  1. الطرد المركزي تعليق متجه لينتيفيرال في ز 160 x لمدة 2 دقيقة بيليه الحطام موجودة غالباً في الأرصدة المجمدة لينتيفيرال.
  2. استعادة المادة طافية وتحويلها إلى أنبوب 0.5 مل جديدة في فئة السلامة الثاني مجلس الوزراء.
  3. نقل 1 ميليلتر من المادة طافية إلى ماصة حقن إعداد كما هو موضح في الخطوة 5 استخدام محمل الصغرى.
  4. تعيين ماصة حقن على حامل الصك ميكرومانيبولاتور الصحيح. قم بتوصيل بيبيت عقد ميكرومانيبولاتور اليسرى.
    ملاحظة: عيار توصيل ناقل لينتيفيرال سوف تكون مرتبطة ارتباطاً مباشرا بفعالية إنتاج مؤسس. لكفاءة عالية (> 70%)، استخدام النواقل الفيروسية مع عيار في نطاق 100 نانوغرام من p24 البروتين قفيصه/ميليلتر. عندما يتم التعبير عنها عيار كوحدات توصيل (تو)، ينبغي أن تكون عيار أعلى 109 تي يو/مليلتر. يجب أن تنتج مخزونات متجه لينتيفيرال طريق عابر تعداء الخلايا 293T مع بلازميد انكابسيديشن p8.91، فكمف-ز، ترميز (منظمة) فيروس التهاب الفم الحويصلي بروتين سكري-ز كما هو موضح في أساليب تكميلية18.

8-مايكرو--حقن

  1. الاستغناء عن 8 ميليلتر من المتوسطة M2 في وسط الشريحة الاكتئاب والغطاء مع زيت البارافين الخفيفة (اختبار الأجنة) لتجنب التبخر.
  2. 20 مكان البيض إلى الانخفاض كما فرقت أقل قدر ممكن.
    تنبيه: لا تجعل فقاعات عند إيداع الأجنة.
  3. تأكد من أن طرف ماصة حقن مفتوح. إذا لم يكن الأمر كذلك، انقر ماصة حقن مع ماصة عقد.
  4. تعيين ميكروينجيكتور النسبة لوقت حقن 20 ثانية.
    ملاحظة: يسمح لزوجة تعليق الفيروسية تصور واضح تشتت النواقل الفيروسية في الفضاء بيريفيتيليني. ينبغي تعديل ضغط الحقن لملء المساحة الكاملة داخل 20 ثانية حقن، الذي يمثل وحدة تخزين من 10 إلى 100 pl. وينبغي إلا يتجاوز الضغط حقن 600 hPa.
  5. نضح البويضة المخصبة واحدة تحتوي على نويات برو 2 والهيئات القطبي 2 مع ماصة عقد تحت ستيريوميكروسكوبي.
  6. حقن البيضة مع ميكروينجيكتور استخدام الإعدادات الموضحة في 8.4، في الفضاء بيريفيتيليني.
    تنبيه: لا تلمس غشاء البلازما مع بيبيت الحقن.
  7. حقن البويضات المخصبة كلها متاحة على دفعات من 20 البيض ووضع البيض المحقون فورا في حامية قبل M16 المتوسطة في حاضنة هوميديفيد 37 درجة مئوية مع جو من أول أكسيد الكربون 5%2.
    ملاحظة: احتضان البيض حقن لمدة 30 دقيقة بعد الحقن قبل نقل الجنين.

9-نقل الأجنة إلى الإناث جرج B6CBAF1/بسيودوبريجنانت

  1. تحقق الجماع التوصيل ح 16 بعد التزاوج B6CBAF1/جرج الإناث مع الذكور B6CBAF1/جرج استئصال الاسهر. القيام بذلك فقط قبل البدء في جمع البيض.
  2. إعداد الماصات زرع الجنين حقن.
    1. جعل الماصات غرس للأجنة كما هو موضح لجمع ومعالجة الأجنة (الخطوة 4، 2). حدد الماصات مع قطر داخلي لحوالي 150 ميكرومتر مع جزء ضيق حوالي 4-5 سم في الطول.
      ملاحظة: ينبغي أن يكون التلميح لهب مصقول، بغية الحد من الأضرار المحتملة للبيض أو في قناة.
      1. ملء مع زيت البارافين الخفيفة (اختبار الأجنة) فقط فوق الكتف ماصة.
      2. نضح فقاعة هواء صغيرة، ثم المتوسطة M2، وأخيراً فقاعة هواء ثانية.
      3. وضع الأجنة واحداً وراء الآخر لتقليل الحجم الكلي للمتوسطة التي سيتم ضخها في قناة جنبا إلى جنب مع الأجنة.
      4. الانتهاء من تحميل قطره قليل جداً من زيت البارافين الخفيفة (اختبار الأجنة) لعرض الجنين عن أحد.
        تنبيه: أن يكون لطيف أثناء معالجة الماصة.
  3. نقل الأجنة.
    1. تعقيم جميع الصكوك.
    2. تخدير الأنثى باستخدام حقن داخل 300 ميكروليتر معقمة كلوريد الصوديوم 0.9% الحل الذي يحتوي على 150 ميكروغرام كل غم وزن الجسم من الكيتامين و 0.15 ميكروغرام كل غم وزن الجسم من إكسيلازيني.
    3. تحقق من عمق التخدير معسر ذيل الحيوان بالملقط وحقن سوبكوتانيولي 0.1 مغ/كغ من مسكن (البوبرينورفين) قبل بدء هذا الإجراء.
    4. حلق 2 سم على كلا الجانبين من الخلف على طول الحبل الشوكي على مستوى الضلع الأخير.
    5. ضع الماوس الإناث على وسادة تدفئة، وفي حقل عقيمة. قطع نافذة 2 سم × 2 سم في منتصف الجزء الخلفي الماوس.
    6. شريحة الجلد جانبياً حتى المبيض (اللون البرتقالي) مرئياً من خلال جدار الجسم وجعل شق عرضية 1 سم بالمقص، ثم تطبيق حلاً مطهر (10% البوفيدون يوديد) على الجلد.
    7. جعل شق 5 ملم في جدار الجسم فقط فوق المبيض مع المقص غرامة تحت مجهر جراحي.
    8. تلتقط لوحة الدهون مع المشبك لدغ أتروماتيك وسحب المبيض وقناة في الجزء العلوي من الرحم.
    9. تصور في ampulla وجعل من هيميسيكشن مع مقص فانس في الجزء المتعلق بقناة تربط المبيض إلى أمبالا.
    10. إدخال الماصة الجنين نقل وتوصيل البيض إلى أمبالا، وتوقف عند أول فقاعة هواء في ماصة غرس.
    11. تكرار الإجراء على قناة ثانية.
    12. قرب الجلد مع مقاطع الجرح.
    13. مكان الحيوان في الاسترداد الدائرة (39 درجة مئوية، 30-60 دقيقة) حتى مستيقظا تماما.
    14. كرر حقن مسكن بعد ح 12 و 48 ساعة في حالة علامات الألم أو المعاناة.
    15. إزالة مقاطع الجرح 7-10 أيام بعد الجراحة.
    16. الاختيار مزروع الإناث للحمل باتباع ما منحنى وزن كل 3 أيام بعد زرع. كبيرة في الوزن يمكن ملاحظتها بعد زرع أيام من 10 إلى 12 وسوف يكون مؤشرا للحمل.
      ملاحظة: تمثل جميع الأجنة التي ستضع هنا الإرادة المفترضة مؤسسي المحورة وراثيا. يمكن تحليل النمط الظاهري لمؤسسي هذه في أي من مراحل النمو، أو بعد الولادة وفقا للمسألة العلمية المرتبطة بتوليد هذه الحيوانات المحورة وراثيا.

10-التنميط مؤسسي المحورة وراثيا

  1. الاستعداد الوراثي المخزن المؤقت الذي يحتوي على 10 ملم تريس-HCl، درجة الحموضة 8؛ 5 مم يدتا، pH 8.0 مع الحزب الديمقراطي الصربي 0.2% (w/v)، 50 مم كلوريد الصوديوم. تعقيم المخزن المؤقت الوراثي من خلال عامل تصفية 0.22 ميكرومتر وتخزينها في درجة حرارة الغرفة لعدة أشهر.
  2. وضع الأغشية اكسترامبريونيك (للأجنة) أو قطعة صغيرة من الذيل (للحيوانات المولود) إلى 500 ميليلتر لتصفية المخزن المؤقت للتنميط وإضافة 15 ميليلتر من البروتيناز ك (20 ملغ/مل). تبني بين عشية وضحاها في 55 درجة مئوية.
  3. الطرد المركزي ليساتي في س 15,000 ز لمدة 5 دقائق ومن ثم استخدام 1 ميليلتر من المادة طافية لتفاعل PCR. ويمكن تخزين ليستي عند 4 درجة مئوية لعدة أشهر.
  4. أداء [بكر] تضخيم جزء من التحوير حجم رد فعل ميليلتر 20 يحتوي على المخزن المؤقت x PCR 1، 1.5 مم مجكل2، 200 ميكرومتر دنتبس، 0.2 ميكرون لكل كبسولة تفجير بكر، 1 UI بوليميراز الدنا بوليميراز و 1 ميليلتر من كل عينة هضمها. كعنصر تحكم سلبية، استخدم 1 ميليلتر من H2o. كعنصر إيجابي، استخدام الحمض النووي من بلازميد متجه لينتيفيرال المتضمن في التحوير.
  5. للكشف عن اجفب ووصف الاستخدام:
    اجفب "إلى الأمام" التمهيدي: 5 '3' جاككاكاتجاجكاجكاكجاكتكت
    اجفب "عكس التمهيدي": تكتجكتجتاجتجتكجكجاجكت 3 '5'
  6. أداء [بكر] تضخيم في ثيرموسيكلير: 4 دقيقة في 94 درجة مئوية تليها دورات 35 من 1 دقيقة في 94 درجة مئوية، 1 دقيقة في 60 درجة مئوية، و 2 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
  7. تحميل المنتج بكر على 2% [اغروس] هلام من أجل تصور 300 شركة بريتيش بتروليوم اجفب بكر منتج كما هو موضح في الشكل 2.
    ملاحظة: جميع الأفراد عرض فرقة بكر bp 300 أدمجت التحوير اجفب ويمكن اعتبار الوراثي.
  8. تحليل التعبير التحوير في الحيوانات المحورة وراثيا. على سبيل المثال، تنفيذ غذائها و immunostaining كما هو موضح في الشكل 3 و 4 الشكل والموصوفة في أساليب تكميلية.
    ملاحظة: كل تحليل التعبير التحوير وتحليل النمط الظاهري ينبغي أن يؤديها باستخدام أساليب ذات الصلة وفقا للمسألة العلمية العالمية.

11-التحديد الكمي لعدد النسخ التحوير

  1. إعداد عينات من الحمض النووي ل PCR الكمي.
    1. استخراج الحمض النووي (جدنا) من "ك بروتيناز" ليساتي التي تم الحصول عليها في الخطوة 10.3 باستخدام مجموعة أدوات تجارية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    2. قياس جدنا التي كانت في 260 نيوتن متر.
    3. تمييع كل عينة جدنا إلى تركيز نهائي 10 نانوغرام/ميليلتر.
    4. لكل عينة، وإعداد 5 تخفيف المسلسل (1:5) في ح2س للحصول على أنابيب 6 في التركيزات التالية: 10 نانوغرام/ميليلتر، 2 نانوغرام/ميليلتر، 0.4 نانوغرام/ميليلتر، 0.08 نانوغرام/ميليلتر، 0.016 نانوغرام/ميليلتر و 0.0032 نانوغرام/ميليلتر
  2. إعداد مزيج تفاعل PCR (qPCR) الكمية.
    1. إعداد ميكس التمهيدي ل qPCR. لكل زوجين التمهيدي لاستخدام qPCR، إضافة 10 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام (حل الأسهم التمهيدي من 100 ميكرومتر)، 10 ميليلتر لعكس التمهيدي (100 ميكرومتر) وميليلتر 80 H2o.
      ملاحظة: لتضخيم اجفب، استخدم كبسولة تفجير تككاجاجكجكاككاتكتكتكا إلى الأمام وعكس تجاتجككجتكتكتجكتجتكج. جين Cdx2 كالأمور إلى حالة طبيعية ل qPCR (2 نسخة من كل الجينوم). للأمور إلى حالة طبيعية Cdx2 استخدام كبسولة تفجير جككاججاكتاتكااكتاكاج إلى الأمام وعكس جاكتكجتكاجتككاجكتاتكت
    2. إعداد 2 qPCR يمزج، أحدهما مع ميكس التمهيدي اجفب والآخر مع Cdx2 التمهيدي مزيج. إعداد مزيج qPCR كافية لتضخيم تخفيف 6 في التكرارات لكل جدنا. رد فعل qPCR واحد يحتوي على ميليلتر 3.8 ح2س، 5 ميليلتر من 2 أخضر فلوري س رد فعل مزيج و 0.2 ميليلتر من ميكس التمهيدي.
      ملاحظة: لكل الحيوانات المحورة وراثيا لاختبار، سيتم تنفيذ 24 qPCR ردود الفعل. مزيج رد فعل منصوص عليه آلة 384 qPCR جيدا.
    3. لكل الحيوانات لاختبار، توزيع: 12 بئرا مع ميليلتر 9 اجفب قبكر المزيج والآبار 12 مع 9 ميليلتر من مزيج قبكر Cdx2. إضافة 1 ميليلتر من كل تمييع جدنا 2 الآبار التي تحتوي على مزيج قبكر اجفب والآبار 2 التي تحتوي على مزيج قبكر اجفب.
    4. مزيج الآبار إجازة 2 لكل قبكر في جدنا الذي كان يحل ح2س كمراقبة سلبية.
  3. ضع لوحة جيدا 384 في الجهاز قبكر وتطبيق البروتوكول قيد التشغيل التالية: 10 دقيقة عند 95 درجة مئوية ثم 50 دورات من 10 s في 95 درجة مئوية و 1 دقيقة عند 60 درجة مئوية.
  4. تحليل البيانات. بالنسبة لكل جدنا لاختبار، رسم القيم المقطعية كدالة لسجل جدنا إجمالي المبلغ (6 نقاط في تكرارات). تناسب المنحنى باستخدام الانحدار الخطي باستخدام الأسلوب الأقل مربعة واستقراء Ct القيمة المقابلة للتقاطع مع محور y. استخدام قيم المستنتجة Ct اجفب و Cdx2 طبيعية لحساب عدد نسخ اجفب بالنسبة Cdx2 (2 نسخ) باستخدام أسلوب قياسي 2ΔdCt 11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

الحيوانات المحورة وراثيا تم إنشاؤها باستخدام بروتوكول المعروضة هنا. الممثل النتائج على حد سواء في كل مكان ويتم توضيح نوع الخلية المحددة التحوير التعبير.

التعبير التأسيسي المتسلسلات

دعاة في كل مكان أدوات البحث الأساسية التعبير عن المتسلسلات بطريقة مستدامة وتتسم بالكفاءة. تستخدم مثل المروجين لمجموعة كبيرة جداً من تطبيق من تعداء الخلايا في المختبر في فيفو ترانسجينيسيس في الحيوانات الصغيرة والكبيرة.

وشيدت ناقلات لينتيفيرال للتعبير عن الجينات مراسل الفلورية الخضراء (اجفب) تحت سيطرة المروج الفيروس المضخم للخلايا (CMV) أو المروج مركب كاج استناداً إلى الانصهار من المروج أكتين الدجاج ومحسن CMV. كلا ناقلات لينتيفيرال المنتجة (أساليب تكميلية) وتقرر عيار في الخلايا 293T كتوصيل وحدات (تو) استناداً إلى تعبير اجفب. تم حقن كل بنيات متجهة لينتيفيرال في الفضاء بيريفيتيليني من بويضات مخصبة بتركيز 109 تي يو/مليلتر ومزروع في الفئران الإناث الحوامل الزائفة. الأجنة مزروع بالتالية التي تم جمعها قبل الولادة وجينوتيبيد بكر متابعة التكامل اجفب. 73% (n = 22) و 83% (n = 32) من الأجنة التي تم جمعها قد أدمجت التحوير في CMV وبناء لينتيفيرال كاج، على التوالي (الجدول 1). وكانت الأجنة المعدلة وراثيا ثم اجفب مقطعة والملطخة المناعية ل. كما هو موضح في الشكل 3، لوحظت الخلايا إيجابية اجفب متفرقة فقط مع المروج CMV (الشكل 3، لوحة أعلى) بينما أعربت كافة الخلايا بروتينات فلورية خضراء عندما استخدمت المروج كاج (الشكل 3، لوحات الأوسط والسفلي).

مع المروج كاج، أعرب 96% أجنة المعدلة وراثيا التي يتم جمعها أوبيكويتوسلي التحوير اجفب (الجدول 1). على الرغم من أن كلا المروجين في كل مكان، فقط المروج كاج قادرة على التعبير محرك قوي للتحوير في كافة الخلايا. دعاة في كل مكان بديل المستخدمة مثل فوسفوجليسيراتي كيناز (PGK) والمروجين ubiquitin-ج وأسفرت عن نتائج مماثلة كتلك التي حصلت مع المروج المساعدة النقدية التي تنخفض فيها مستويات التعبير من اجفب (البيانات لا تظهر).

في فيفو رسم خرائط لمناطق الجينوم التنظيمية لاختبار عناصر التحكم المحددة الأنسجة.

لعدد كبير من التطبيقات، التعبير عن المتسلسلات بطريقة محددة خلية في الحيوانات المحورة وراثيا المطلوب. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تكون مفيدة جداً لفحص قدرة أجزاء الحمض النووي الجينومي التنظيمية المفترضة للتحكم في خلية محددة التعبير عن الجين المعطى جيل حيوانات المحورة وراثيا. على سبيل مثال، استخدمت لينتيفيرال إنتاج الحيوانات المحورة وراثيا وساطة لتعيين الخلية المحددة القدرة على عنصر التحكم هذا التعبير 3 نيوروجينين (Neurog3)11. Neurog3 هو عامل نسخ الحلزون-حلقة-اللولب (بهلة) أساس الذي يتحكم بالتزام المتكفل البنكرياس نحو مصير الغدد الصماء. يمكن التفريق لا خلايا الغدد الصماء في البنكرياس في الفئران متحولة فارغة Neurog3 ،19. تم استنساخ جزء الحمض النووي كيلو بايت 2.2 المترجمة بين المواقف-5284 و-3061 بالنسبة للنسخ Neurog3 بدء تشغيل الموقع إلى المنبع متجه لينتيفيرال بيتا جلوبين مروج الحد أدنى للتعبير بالسيارة من الجينات مراسل اجفب كما تم وصفه سابقا 11. وبالمثل تم إنشاؤه بنية عنصر تحكم باستنساخ جزء إينتيرجينيك 2.4 كيلو بايت مترجمة على الماوس الصبغي 6 (chr6: 14237279-14239685 بالنسبة للجمعية جينوم الفأر mm9) في نفس العمود الفقري لينتيفيرال. يتم ترجمة هذه المنطقة الجينوم داخل صحراء 1 ميجا-قاعدة طويلة جينات بين الجينات Gpr85 و Ppp1r3a . وأنتجت ناقلات لينتيفيرال عيار عالية التالية استخدام كل بنيات والمسماة Neurog3-enh-اجفب و Chr6-اجفب.

وشيدت كلا ناقلات لينتيفيرال وتنتج (أساليب تكميلية). وبأية خلايا معربا عن Neurog3 متاحة حاليا، لا يمكن تحديد عيار تو. وبدلاً من ذلك، كان يقاس عيار كتركيز البروتين قفيصه p24. ناقلات 2 حقنه في الفضاء بيريفيتيليني من بويضات مخصبة ومزروع في الفئران الإناث الحوامل الزائفة. وقد جمعت الأجنة مزروع في يوم الجنينية 14.5 (E14.5) كما يتوافق مع هذه المرحلة الإنمائية القصوى في التعبير عن Neurog3 في البنكرياس. وكانت الأجنة التالية جينوتيبيد لمتابعة التكامل اجفب. 84% (n = 47) و 71% (n = 48) من الأجنة التي تم جمعها قد أدمجت التحوير Neurog3-enh-اجفب وبني لينتيفيرال Chr6-اجفب على التوالي (الجدول 1). لكل جنين، برعم البنكرياس تشريح ومقطوع ثم القيام إيمونوستاينينج. وأعرب 92% أجنة المعدلة وراثيا-enh-اجفب Neurog3اجفب في البنكرياس كما هو موضح في الشكل 4 أعلى اللوحة (الممثل إيمونوستينينج). الأهم من ذلك، الغالبية العظمى من اجفب إيجابية الخلايا كانت أيضا Neurog3 وإذ تعرب عن الخلايا (الشكل 4) مشيراً إلى أن كيلو بايت 2.2 محسن Neurog3 قادرة على تقييد التعبير اجفب داخل السكان خلية Neurog3 . بالمعارضة، أعرب أيا من الأجنة Chr6-اجفب اجفب (لوحة أسفلالشكل 4 و الجدول 1) في البنكرياس أو خارج البنكرياس. وبالإضافة إلى ذلك، لوحظ لا التعبير حمل خارج الرحم من اجفب خارج البنكرياس في الأجنة-enh-اجفب Neurog311.

للتجارب 4 المعروضة أعلاه، يرد وصف كمي دقيق لكل خطوة من خطوات الإجراء في الجدول 1. وهذا يوضح فعالية الإجراء العالمي. في الواقع، عند مقارنة عدد الحيوانات التي تم جمعها متكاملة التحوير مع عدد البيض المخصب المحقون، المحصول العالمي من الإجراءات هو 44 في المائة في المتوسط. العائد نفسه بحقنه الحمض النووي برونوكلير لتركيبة تحتوي على محسن Neurog3 تنصهر فيها المراسل بيتا-جالاكتوسيداسي لا يتجاوز 3.1 في المائة.

توصيل بويضات مخصبة مع ناقل لينتيفيرال يؤدي إلى تكامل التحوير التي يمكن أن تحدث في عدة مواقع10،13. وقيمت العدد النسبي لمواقع التكامل التحوير باستخدام PCR الكمي على الحمض النووي (الشكل 5). التحديد الكمي للتكامل اجفب تحددها PCR الكمي (qPCR) وتطبيع للجين Cdx2 موجود في نسخ 2 كل الجينوم كما هو موضح سابقا11. وكان متوسط عدد مواقع التكامل ± 19.36 2.468 (S.E.M.) و ± 9.537 1.186 (S.E.M.) في الأجنة الناتجة عن Neurog3-enh-اجفب وبناء Chr6-اجفب، على التوالي. من المثير للاهتمام، وموجهات اثنين لينتيفيرال المستخدمة في إنتاج هذه الحيوانات قدم التتر الفيروسية المختلفة. وكان تركيز البروتين قفيصه p24 124 نانوغرام/ميليلتر للمتجهات-enh-اجفب Neurog3ومن 52 نانوغرام/ميليلتر لمكافحة ناقلات الأمراض Chr6-اجفب. فمن المحتمل أكثر أن هذه الفرق عيار سوف تمثل الفرق كبير لاحظ بإعداد موقع التكامل في كلا السكان الأجنة المعدلة وراثيا (الشكل 5). وهذا يوحي بأنه يمكن أن التضمين متوسط عدد مواقع التكامل التي تم الحصول عليها في مجموعة فئران المحورة وراثيا مؤسس باستخدام الأسهم الفيروسية مع التتر مختلفة.

الأهم من ذلك، لوحظ لا علاقة مباشرة بين التعبير عن اجفب في Neurog3اجفب-enh الأجنة المعدلة وراثيا وعدد النسخ التحوير التي تم دمجها. وبعبارة أخرى، عثر الأجنة متكاملة واحدة أو عدة نسخ من التحوير-enh-اجفب Neurog3وبالمثل للتعبير عن اجفب في Neurog3 الخلايا إيجابية.

Figure 1
رقم 1: مخطط التدفق الداخلي الإجمالي الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: إعداد الماصات الحقن الجزئي والتنميط.
(أ) الرسومات التخطيطي من الماصات microinjection لتسليط الضوء على الاختلافات الرئيسية بين بيبيتس المستخدمة للحمض النووي أو حقن متجه لينتيفيرال. غادر الفريق: يتم رسم الشكل العام لكلا النوعين ماصة. الدائرة المتقطعة يسلط الضوء على مجال تلميح بيبيت الموسع. وترد أيضا صوراً لنصائح بيبيت. لاحظ أن التلميح لحقن لينتيفيرال يحتاج إلى كسر كما هو مبين بالخط المنقط والصورة المقابلة. اللوحة اليمنى: سبيل المثال حقن البيض الإعداد مع بيبيت القابضة على اليسار، والبويضة المخصبة وحقن بيبيت واحد أما في برونوكليوس أو في الفضاء بيريفيتيليني. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرومتر. تضخيم التصور (ب) على [اغروس] هلام اجفب بكر المنتج من الحمض النووي المستخرج من أجنة مختلفة 8 (لين 1 إلى 8). قد أدمجت الأجنة فقط 1، 2، 3، 5 و 6 و 8 التحوير اجفب. بتريب بلازميد الدنا PGK-اجفب المستخدمة لإنتاج ناقلات لينتيفيرال كمراقبة إيجابية PCR. لمراقبة سلبية، استبدال ح2س الحمض النووي في تفاعل PCR. MWM: علامة الوزن الجزيئي. bp = زوج قاعدي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: محرك المروجين في كل مكان تعبيراً عن مراسل اجفب في الأجنة المعدلة وراثيا.
كانت الملون 10 ميكرون البرد-أبواب الأجنة وراثيا لتصور التعبير اجفب (الأخضر) ونوى (أزرق). بناء الأجنة التي تم إنشاؤها مع المروج CMV لينتيفيرال (التسمية الأيسر العلوي) جمعت في E11.5. وقد جمعت الأجنة التي تم إنشاؤها مع بناء المروج كاج لينتيفيرال (التسمية الأيسر السفلي) في E18.5. الجريدة الرسمية: البنكرياس برعم، VSC: الحبل الشوكي البطني، فاتو: فقرة، لي: الكبد، مرض التصلب العصبي المتعدد: العضلات حزام البطن. تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: خلية تعبيراً محدداً لمراسل الجينات في الأجنة المعدلة وراثيا هو يقودها محسن Neurog3 - كانت الملون 10 ميكرون البرد-الفروع من براعم E14.5 البنكرياس الأجنة المعدلة وراثيا لتصور التعبير عن Neurog3 (أحمر)، اجفب (الأخضر) ونوى (الأزرق) كما هو موضح في أساليب تكميلية). هي منتشرة في التعبير Neurog3 في البنكرياس. بناء الأجنة المعدلة وراثيا التي تدمج Neurog3-enh-اجفب اجفب إكسبرس ومعظم الخلايا إيجابية اجفب Neurog3 الإيجابية (اللوحة العلوية). كانت عن الأجنة التي تم إنشاؤها مع بناء Chr6-اجفب لا اجفب (أسفل اللوحة). تغيير حجم أشرطة = 50 ميكرون الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
رقم 5: عدد نسخ نسبي المتسلسلات المتكاملة- التحديد الكمي لمواقع التكامل اجفب بالنسبة للجينات CDX2 كما هو موضح في قسم البروتوكول. ارسم مربع من 25th إلى75 المئوية . وتمثل النقاط الأجنة المعدلة وراثيا المختلفة التي تم إنشاؤها. المقارنة بين مواقع المتسلسلات المتكاملة بين بنيات لينتيفيرال اثنين يختلف إلى حد كبير (مزاوج حدودي اختبار t, p = 0.001). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Table
الجدول 1: تقرير الكمية خطوة بخطوة أثناء الإجراء الكامل. وأثناء الإجراءات، أحصى مجموع إعداد البيض أو الأجنة. العمود الأول يمثل مجموع عدد البيض التي تم استردادها من أوفيدوكتس الإناث سوبيروفولاتيد. مسح البيض فقط مع 2 القطبية الهيئات و/أو تم حقن برونوكلي المرئية ويتم الإبلاغ عنها. بعد بضع ساعات في الثقافة وحقن تم زرعها فقط حقن البيض عدم تفكيك، وكان مورفولوجيا عادي. التالية يتم حساب إجمالي عدد الأجنة التي تم جمعها من الإناث بسيودوبريجنانت. وأخيراً، يتم سرد الأجنة التي متكاملة التحوير وأعرب المراسل في العمودين الأخيرين. وترد نفس الميزات أيضا للمقارنة مع تجربة استخدام حقن الحمض النووي برونوكلي القياسية. هنا الواردة التحوير محسن Neurog3 يقود التعبير عن الجين المراسل بيتا-جالاكتوسيداسي (Neurog3-enh-لاكز). اضغط هنا لتحميل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

حقن بيريفيتيليني لينتيفيرال ناقلات في بويضات مخصبة الموصوفة هنا أدت إلى إنتاج أجنة معدلة وراثيا التي أسفرت عن أكثر من 70% أجنة المعدلة وراثيا بالقياس إلى مجموع عدد الأجنة التي تم جمعها. هذه النتيجة تتسق مع التقارير السابقة وتجسد خصوصية الإجراء2،،من710،11،12. وعند مقارنة جميع البيانات الواردة في الجدول 1، يمكن إبراز الميزات الهامة. أولاً، أن عدد البيض مزروع مطابق لجميع البيض حقن مورفولوجيا عادي أو تم تفكيك ليس بعد ساعات قليلة في الثقافة. تم زرعها 93% بيض المحقون مما يوحي بغياب شبه كامل من سمية السريع بسبب حقن لينتيفيرال في مكافحة ناقلات الفضاء بيريفيتيليني. مختلفة إلى حد كبير الحالة عند النظر في حقن الحمض النووي منذ 44 في المائة فقط من البيض المحقون نجوا وتم زرعها. وعلاوة على ذلك، نسبة الأجنة التي تم جمعها بالنسبة للبيض مزروع متطابقة بين الإجراءين، مما يوحي لا سمية طويلة الأجل تفاقم لينتيفيرال العوامل الناقلة للمرض. ثانيا، عند التعبير عن عدد الأجنة التي تدمج التحوير بالنسبة لعدد البيض المحقون المحصول العالمي أكثر من 10 مرات أعلى من حقن متجه لينتيفيرال مقارنة بحقن الحمض النووي. حتى يتم العثور على فرق 86-fold عند مقارنة عدد الأجنة معربا عن التحوير بين الإجراءين باستخدام نفس بنية محسن Neurog3.

الأهم من ذلك، يظهر غلة الإنتاج المحورة وراثيا يكون معتمداً من عيار توصيل نواقل لينتيفيرال المستخدمة. وبعبارة أخرى، تنتج نواقل لينتيفيرال مع عيار أعلاه 109 تو/مل تكفي للحصول على تلك العوائد المرتفعة. كما هو موضح في المقطع بروتوكول، حجم المحقون في الفضاء بيريفيتيليني في النطاق من 10 إلى 100 pl. وسيمثل هذا الحجم الجسيمات لينتيفيرال النشطة 10 إلى 100. بالمقارنة مع معيار برونوكلي حقن الحمض النووي، العدد الإجمالي لمؤسس الحيوانات التي تم إنشاؤها مع نفس المقدار من الحيوانات ولدت على الأقل 10 إضعاف أعلى عند استخدام ناقلات لينتيفيرال. وباﻹضافة إلى ذلك، penetrance التعبير للتحوير مرتفعة للغاية مع هذا البروتوكول ولوحظ على حد سواء مع كل مكان وخلية المروجين محددة باستثناء المروج CMV. المعارضة للمروجين الخلوية في كل مكان، المروج CMV متوقف بنشاط بالحمض النووي مثلايشن20 وقد ثبت أن يكون غير قادر على الحفاظ على التعبير طويل الأجل عند توصيل في الخلايا الجذعية pluripotent21. وهذا يمكن أن يفسر العدد المحدود جداً من اجفب التعبير عن الخلايا التي لوحظت في الأجنة المعدلة وراثيا. ولذلك، ناقلات لينتيفيرال يتم تكييفها أيضا لإنتاج الحيوانات المحورة وراثيا التي يسيطر التعبير التحوير محسن خلية محددة. الأهم من ذلك، يمكن استخدام البروتوكول للشاشة لمحسن النشاط في فيفو وإيجاد النسخ خريطة مواقع الربط عامل ضمن المناطق التنظيمية11،12. يمكن يكاد تنفيذ هذا النهج الفحص باستخدام ترانسجينيسيس القياسية. العدد الكلي للحيوانات المؤسس بحاجة إلى اختبار كافة بنيات مختلفة والوصول إلى دلالة إحصائية سيتطلب عشرات الدورات الحقن بينما يمكن الحصول على سرعة مع لينتيفيرال ترانسجينيسيس وساطة.

أحد الاختلافات الرئيسية بين الإجراء القياسي وأسلوب يستند إلى لينتيفيرال تكمن في دمج التحوير. استخدام حقن برونوكلير، دمج المتسلسلات عشوائياً كنسخ متعددة في موضع فريد من نوعه. استخدام ناقلات لينتيفيرال، يمكن أن يحدث التكامل في مواضع متعددة (نسخة واحدة لكل محور) دون أن تكون عشوائية تماما. وقد أظهرت مجموعة "ترونو دال" باستنساخ مواقع التكامل باستخدام PCR وساطة التضخيم الخطي (لام-PCR)، أن إدماج المتسلسلات تفضيلي في مناطق الكروماتين مفتوحة من البويضات المخصبة13. الانحياز للتكامل ينبغي أن لا تتدخل أو تسهم في التعبير التحوير في الفئران المعدلة وراثيا. يحدث التكامل من خلال توصيل لينتيفيرال في جنينا مرحلة خلية واحدة في الكروماتين المفتوحة التي قد لا تكون لا تزال في التكوين مفتوحة في وقت لاحق أثناء تطوير أو الكبار.

وبالإضافة إلى ذلك، عند تحليل إعداد نسخة من المتسلسلات المتكاملة في الجيل الأول الحيوانات (F0) أو الأجنة، لوحظ تباين كبير في عدد من التحوير المتكاملة. وعثر في هذه الدراسة، في متوسط 19 نسخة متكاملة مع بناء Neurog3-enh-اجفب. هذا عدد النسخ الكبيرة يمكن أن تعكس مستويات عالية من mosaicism. سافين وآخرون أدوا واسعة دراسة المكاني المتكامل في الحيوانات F0 التي تم إنشاؤها باستخدام أسلوب الوساطة لينتيفيرال الموصوفة هنا13. أنها تابعت 70 مواقع التكامل الفردي في 11 F0 الحيوانات وفحص معدلات انتقال لكل موقع من الفئران المحورة وراثيا F0 إلى ذرياتهم F1. المعدل الإجمالي لانتقال نسبة 44 في المائة للتحوير المتكاملة فردية تشير إلى أنها أنشئت في أغلب الأحيان أما بعد المرحلة S من الأجنة خلية واحدة أو قبل مرحلة ثانية في مرحلة الخلية اثنين. وفي الواقع، سيحيل التكامل قبل المرحلة S التحوير المتكاملة لكل من الخليتين ابنه، بينما التكامل بعد مرحلة ثانية أن يحيله إلى خلية ابنه واحدة فقط. وهكذا، درجة mosaicism للفردية المتسلسلات المتكاملة الحد الأدنى في الفئران المعدلة وراثيا التي تم الحصول عليها من خلال هذا الأسلوب. كذلك يشير هذا إلى أن معظم التكامل سيحدث داخل ح 12 الأولى يساوي متوسط الوقت لإنتاج الانقسام الأولى في ظروف الثقافة المستخدمة. وهذا التكامل الحركي يتسق مع الموضحة لينتيفيروسيس في خلايا تي اللمفاوية22.

الأهم من ذلك، مع ارتفاع عدد المكاني حجب المتسلسلات المتكاملة، إنشاء خطوط الماوس لن يكون معقولاً. عدد المعابر فصل جميع المكاني هذه ستكون مرتفعة إلى حد كبير. ويمثل هذا القيد مهم واحد من هذه الطريقة التي يجب استخدامها للفرز السريع من آثار التحوير أو التحليل المتزامن المتسلسلات متعددة. ومع ذلك، يمكن إنشاء خطوط الماوس لا يزال بتحديد من الحيوان F0 منها مع عدد أدنى من التحوير المتكاملة نسخة.

ومنذ أول وصف ل طريقة حقن الحمض النووي برونوكلير1، أدخلت تحسينات التحايل على كثير من المآخذ على هذا الإجراء الأولى. كانت أول مجموعة من التحسينات استناداً إلى التكامل المستهدفة في موضع دقيق استخدام استراتيجية تبادل كاسيت. حقن برونوكلير تتم باستخدام أما لجنة المساواة العرقية، ويحف ريكومبيناسيس الوجه أو PhiC31 جنبا إلى جنب مع جزء بلغة الحمض النووي تكاملية مع لوكسب أو FRT أو أتتب المواقع، على التوالي. في هذه الحالة، يتم تبادل الحمض النووي التكاملية مع جزء بلغة متكامل الذي كان واقفاً مع نفس recombinase موقع محدد23،24. على الرغم من أن يمكن أن تصل إلى 60 في المائة من الجيل الأول الحيوانات المحورة وراثيا23 باستخدام هذا الأسلوب، لا تزال تنطبق القيود المرتبطة بتكنولوجيا الحقن برونوكلير. المجموعة الثانية من تحسين يستند إلى هيولى حقن الحمض النووي الدائري اثنين، واحد يحمل الجزء إلى إدماج والتعبير يسمح واحد أما Tol225، ترانسبوساسيس27 26 أو بيجيباك النائمة. باستخدام هذه الأساليب، ويتم الحصول على غلة عالية (> 30%)، ولكن الأهم من ذلك، من السهل القيام بحقن هيولى وتلتف القيود المفروضة بسبب حقن برونوكلير كبروتوكول يستند إلى لينتيفيرال. وعلاوة على ذلك، يمكن أن تكون متكاملة شظايا كبيرة جداً من الحمض النووي، مثل الكروموسومات البكتيرية المصطنعة،.

فمن الواضح أن لينتيفيرال ترانسجينيسيس الوساطة لن يحل محل المعيار ولا الإجراءات المحسنة. لا يزال هذا الأسلوب يمثل أداة قوية لإنتاج نموذج الحيوان السريع وتوصيف كما أنه يقلل إلى حد كبير الوقت اللازم لتوليد عدد مناسب من الحيوانات مع التنوع الجيني الأقل. وعلاوة على ذلك، يمكن تطبيق هذه التكنولوجيا مباشرة لجميع سلالات الماوس بما في ذلك أية أسطر المحورة وراثيا. وبالإضافة إلى ذلك، من الأهمية بمكان أن نذكر أن المشهد العالمي لتوليد نماذج حيوانية جديدة على وشك التغيير مع تطور التكنولوجيا كريسبر/Cas9 الأخيرة. اليوم، تسمح حقن برونوكليار للبروتين Cas9 جنبا إلى جنب مع دليل الحمض النووي الريبي إنتاج الجينوم تحرير نماذج حيوانية بكفاءة من 40%28. هذا النهج يمكن أن تستفيد إلى حد كبير من استخدام لينتيفيرال ترانسجينيسيس وساطة. في الواقع، يمكن أن يؤدي استخدام ناقلات لينتيفيرال غير التكاملية29 عابر التعبير عن كل Cas9 ودليل الكشف في أعلى إنتاج الغلال. الجمع بين أحدث تقنيات لإنتاج نماذج حيوانية ذات الصلة وقوى ستستفيد المجموعات البحثية الدولية الأكثر تشارك في دراسة الأمراض المرضية والنهج العلاجي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب قد لا يوجد تضارب في الكشف عن.

Acknowledgments

ونشكر دومون مجلي وميلوني رولاندو لقراءة نقدية من المخطوطة وإيفيكتور و "فينوبارك ICM النوى" للمساعدة التقنية في إنتاج ناقلات لينتيفيرال والحيوان السكن على التوالي. هذا العمل كان يدعمه دي ترانسلاتيونليس المعهد الجامعي هوسبيتالو "دي علوم الأعصاب" باريس، رامي-A-ICM، يشرف دعفينير ANR-10-إيايهو-06. العلاقات العامة وتلقى التمويل للفرنسية Langue de الرابطة من أجل دراسات دو Diabète et des علل Métaboliques (الفيديام) ومن JDRF مشترك/منح INSERM.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PMSG 50UI Sigma G4527
hCG 5000UI Sigma CG5-1VL
NaCl Sigma 7982
100 mm petri dish Dutsher 353003
4 wells Nunc dish Dutsher 56469 IVF dish
M2 medium Sigma M7167
M16 medium Sigma M7292
0,22 µm Syringe filter Dutsher 146611
Hyaluronidase Enzyme 30mg Sigma H4272 mouse embryo tested
Insulin serynge VWR 613-3867 Terumo Myjector
Curved forceps Moria 2183
Curved scissors Moria MC26
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA
Borosilicate glass capillaries Harvard apparatus GC 100-10
Horizontal micropipette puller Narishige PN-30
Microforge Narishige MF-900
Inverted microscope Nikon Transferman NK2 5188 Hoffman modulation contrast illumination is required
Micromanipulator Eppendorf Celltram air
Controler of holding pipet Eppendorf Femtojet
Mineral oil Sigma M8410 mouse embryo tested
Microinjector Eppendorf Femtojet Can be used to inject DNA or viral vectors
Dumont # 5 forceps Moria MC 40
vannas micro scissors Moria 9600
Isoflurane centravet ISO005 ISO-VET 100% 250ml
ocrygel centravet OCR002
Povidone iodure centravet VET001 vetedine 120ml
Buprenorphine centravet BUP002 Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HCl Sigma T5941 Trizma hydrochloride
EDTA Sigma E9884
SDS Sigma 436143
NaCl Sigma S7653 powder
proteinase K Sigma P2308 
oneTaq kit NEB M0480L
Primers Eurogentec
Strip of 8 PCR tube 4titude 4ti-0781
96 well thermal cycler Applied Biosystems 4375786 Veriti
Genomic DNA mini kit invitrogen K1820-02
Nanodrop 2000 Thermo Scientific ND-2000C 
qPCR Master mix Roche 4887352001 SYBR Green 
Multiwell plate 384 Roche 5217555001
qPCR instrument 384 well Roche 5015243001 LightCycler 480

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  2. Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
  3. Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
  4. Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
  5. Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
  6. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  7. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  8. Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
  9. Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
  10. Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
  11. van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
  12. Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
  13. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
  14. Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
  15. Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
  16. Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
  17. Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
  18. Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
  19. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
  20. Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
  21. Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
  22. Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
  23. Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
  24. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  25. Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
  26. Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
  27. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  28. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
  29. Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).

Tags

علم الوراثة، المسألة 140، ناقلات لينتيفيرال، الفئران المعدلة وراثيا، وتوصيل بويضات مخصبة، نقل الجينات التكاملية، وحقن في الفضاء بيريفيتيليني، ودعاة في كل مكان، خلية محددة محسن
لينتيفيرال توسط إنتاج فئران المحورة وراثيا: طريقة بسيطة وذات كفاءة عالية للدراسة مباشرة من مؤسسي
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., … More

Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders. J. Vis. Exp. (140), e57609, doi:10.3791/57609 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter