Summary
여기, 선물이 수정된 oocyte의 perivitelline 공간에서 lentiviral 벡터의 간단한 주입에 의해 transgene 통합 및 높은 효능과 설립자 유전자 변형 생쥐의 생산을 촉진 하는 프로토콜.
Abstract
거의 40 년 동안, pronuclear DNA 주입 transgenes의 임의의 통합 유전자 변형 쥐를 생성 하는 표준 메서드를 나타냅니다. 일상적인 절차는 전 세계에 걸쳐 널리 활용 하 고 그것의 주요 제한은 transgene 통합, 설립자 동물의 낮은 수율 결과의 가난한 효능에 있는. 주입 된 수정 된 oocytes의 이식 후 동물의 몇 %만는 transgene를 통합 했습니다. 반면, lentiviral 벡터 통합 유전자 이동에 대 한 강력한 도구 이며 transduce 수정 된 oocytes를 그들의 사용 허용 설립자의 고효율 생산 70% 이상 평균 수확량을 가진 유전자 변형 쥐. 또한, 모든 마우스 변형 유전자 변형 동물을 생산 하기 위해 사용할 수 있습니다 이며 transgene 표현의 penetrance lentiviral 중재 transgenesis DNA microinjection에 비해 80% 이상의 매우 높은. Lentiviral 벡터에 의해 화물을 될 수 있는 DNA 조각의 크기 10 kb로 제한 하 고이 방법의 주요 한계를 나타냅니다. 간단 하 고 쉽게 수정 된 oocytes의 zona pellucida 아래 주입 절차를 수행 하려면 사용 하 여, 50 개 이상의 설립자 동물 microinjection의 단일 세션에서 생산 수 있습니다. 이러한 메서드는 설립자 동물, 신속한 이득 및 손실 함수 연구 또는 자신의 능력을 제어 하 고 진 식에 vivo에서규제에 대 한 화면 genomic DNA 영역에서 직접 수행에 매우 적응.
Introduction
1980 년에 고 든 외 의 선구적인 작품 pseudopregnant 마우스에 이식 후 수정 된 oocytes의 남성 pronuclei 에 플라스 미드 DNA 주입 통합 유전자 변형 동물의 생산 얻을 수 있습니다 보여주었다는 플라스 미드 DNA1. Transgenic 포유류를 생성할 수 있습니다 데모 모두 기본적인 과학 및 변환 생물 의학 연구의 새로운 분야에 길을 열어 글로벌 생명과학에 엄청난 영향을 했다. 지난 4 년간 DNA microinjection은 일상적인 연습 되었다. 유전자 변형 쥐의 거 대 한 수 제작 되었습니다, 하지만 표준 방법 모든 마우스 긴장에 대 한 완벽 하 게 사용할 수 이며 시간이 소요 backcrosses2,3를 요구 한다. 다른 종에의 응용 도전4 유적과 전반적인 transgene 통합 수익률 태어난된 동물5의 몇 %로 제한 됩니다. 또한, transgene 통합의 효능 pronuclear DNA 주입의 가난한 전체 수익률을 설명 하는 제한 요소를 나타냅니다. 이 점에서 통합 바이러스 성 벡터 화물을 가장 효율적인 도구 transgenes 통합 그리고 이렇게 크게 증가 통합 수확량, 유일한 제한은 transgene 크기를 10 kb6 초과할 수 없습니다 되 고 새로운 의미를 제공할 수 있습니다. .
Lentiviral 벡터 의사 봉투 단백질 Vesicular 구내 염 바이러스 (VSV)의 형식의 pantropic 및 높은 통합 유전자 전송 도구 이며 transduce 수정 된 oocytes7을 사용할 수 있습니다. Zona pellucida 는 oocytes를 둘러싼 자연 바이러스 방 벽 고 lentiviral 벡터와 변환 있도록 전달 될 필요 합니다. 유전자 변형 동물 마이크로 드릴링 또는 zona pellucida8,9의 제거 후 수정 된 oocytes 시험에 의해 생성 된 것. 그러나, zona pellucida perivitelline 공간에서 아래 주입 transduce 로이스와 동료7에서 처음 설명한 대로 수정 된 달걀을 간단한 방법으로 나타납니다.
Lentiviral 벡터의 perivitelline 주입 태어난된 동물의 70% 이상 유전자 변형 동물의 생산에 높은 수율을 수 있습니다. 이러한 수익률 표준 pronuclei DNA 주입7,,1011를 사용 하 여 얻을 수 있는 최고의 수익률 보다 10 배 이상 높습니다. 이러한 맥락에서 주사의 단일 세션 50 유전자 변형 설립자 (F0)를 생성 합니다. 설립자의 다 수는, 그러므로, F0 생쥐 유전자 변형 마우스 라인을 생성 하는 필요 없이 직접 수행 transgene 효과의 형질과 호환. 이 장점은 transgene 효과의 신속한 심사 가능 하며 특히 적응 주 이내 vivo에서 이득과 손실의 기능 연구를 수행 하는. 또한, 규제 DNA 요소 수 있습니다 또한 빠르게 상영 지도 강화 및 녹음 방송 요인11,12으로 DNA 주제에. Pronuclear 주사와 transgenes는 일반적으로 독특한 소재 시로 여러 복사본 통합. Lentiviral 벡터와 통합 로커 스10,13당 단일 복사본으로 여러 loci에서 발생합니다. 따라서, 통합된 loci의 다양성 유전자 변형 설립자에서 관찰은 새로운 생성 된 모델을 더 강력한 시키는 매우 높은 식 penetrance에 관련 된 가장 가능성이 높습니다.
중요 한 것은, DNA의 pronuclear 주입을 사용 하 여, 절차 동안 pronuclei 의 시각화는 절대적으로 필요 합니다. 이 기술적 제한 수정 된 oocytes 마우스 긴장의 큰 다양성에서 발생의 사용을 방지 합니다. 따라서, 특정에서 유전자 변형 모델의 생산 뒤에 적어도 10 연속 backcrosses 원하는 마우스 transgene 전송 허용 스트레인에 동물의 생산을 필요는 pronuclei 표시 되지 않습니다 변형 스트레인입니다. Lentiviral 벡터 주사 perivitelline 공간은 항상 표시와 주사 매우 구체적인 기술이 필요 하지 않습니다. 예를 들어, pronuclei 주입에 적합 하지 않은 끄 덕/SCID 유전자 변형 쥐 바이러스 성 벡터 주사14로 얻은 되었습니다 있다.
여기, 포괄적인 프로토콜 lentiviral 벡터 주사 한 세포 단계 태아의 perivitelline 공간에를 사용 하 여 유전자 변형 마우스의 간단한 생산을 허용 하도록 제공 됩니다. Transgene 식으로 제어 유비 쿼터 스 또는 셀 특정 발기인 자세하게 설명 됩니다.
PTrip ΔU3 lentiviral 백본15이 연구 사용 되었다. 이 벡터는 U3 시퀀스 부분적으로 삭제 된 U3 발기인 활동을 제거 하 고16자기 inactivating 벡터 (죄) 생성 하는 복제 결함 lentiviral 벡터를 생산 수 있습니다. Lentiviral 벡터 주식 p8.91 캡슐화 플라스 미드 (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G 인코딩 vesicular 구내 염 바이러스 (VSV) 당단백질-G17및 pTRIP ΔU3와 HEK 293T 세포의 과도 transfection에 의해 제작 재조합 벡터입니다. 자세한 생산 절차 보완 방법으로 제공 됩니다.
생산의 높은 titer lentiviral 벡터 주식 Biosafety 수준 2 세 조건 (BSL-2)에서 수행 됩니다. 이 BSL-3에서 생산 해야 oncogenes 제외한 대부분 transgenes 마찬가지입니다. 따라서, 대부분의 경우 BSL-2 조건에서 생산은 충분 합니다. 또한, 사용 및 생산 일반적으로 끊어집니다 유전자 변형된 생물체 (GMO)을 다루는 대부분 국가 규제 기관에 대 한. 제한 된 양의 복제 무능 한 죄 lentiviral 벡터 (p24 capsid 단백질의 2 µ g) 아래 유럽 연합 권고와 프랑스 조합에 의해 설명 된 대로 BSL-1 조건에서 사용할 수 있습니다.
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Protocol
동물 작업을 포함 하는 모든 절차 윤리적인 승인을 얻은 및 번호 APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 교육과 연구의 프랑스 내각 및 05311.02에 의해 승인 되었습니다. PHENOPARC는 인증 번호 B75 프랑스 농림에 의해 공인 된 ICM 동물 시설 13 19. 전체 프로토콜 그림1에서에서 요약 된 정확한 시간 프레임 내에서 각 절차를 수행 해야 합니다.
1. 동물 구입과 기본적인 화합물의 준비
- 동물 구입
- (원래에서 F1 세대 ♀C57Bl/6JRj 및 ♂CBA/JRj 사이 십자가) 나이의 8 주 25 vasectomized 남성 B6CBAF1/JRj 주문.
참고: 격리 도착 시 남성. Vasectomized 남성 적어도 1 년 동안 다시 사용 될 수 있습니다.
감 금 소 3 주마다 변경 합니다. - 주문 50 B6CBAF1/JRj 여성을 나이의 10 주 이상 50 동물의 풀을 유지.
- 10-15 C57BL/6JRj 비옥한 남성 나이의 8 주를 주문.
- 나이의 4 주 30 C57BL/6JRj 여성 주문.
- (원래에서 F1 세대 ♀C57Bl/6JRj 및 ♂CBA/JRj 사이 십자가) 나이의 8 주 25 vasectomized 남성 B6CBAF1/JRj 주문.
- 마 취와 안락사
- 마 취 주사 intraperitoneally 300μL 케 타 민/xylazine 혼합의 볼륨을 사용 하 여 수행 됩니다 (150μg/g 몸 무게, 0.15μg의 복용량에 xylazine의 복용량 마 취 제 / g 몸 무게). 동물 체온을 조정 하는 패드를가 열에 배치 됩니다. 동물의 꼬리를 곤란 하 게 시작 절차 이전 하 여 반사를 확인 합니다.
- 안락사는 자 궁 경부 전위에 의해 수행 되었다. 잘린 동물의 죽음을 확인 하는 보조 방법으로 포함 되었다. 배아의 안락사는 잘린에 의해 수행 되었다.
참고: 도착 시 수 동물 시설 (처리 또는 짝짓기)에 길 들을 1 주 최소. 중요 한 것은, 유전자 변형 라인을 포함 한 모든 마우스 긴장 비옥한 남성과 비옥한 여성 superovulation에 대 한로 활용 될 수 있습니다. 긴장의 과학적 질문의 요구 사항에 따라 제출 되어야 합니다.
- 호르몬 준비
- PSMG (임신 암 말 혈 청 생식 샘 자극 호르몬) 버퍼의 910 µ L 1 동결 건조 된 PMSG 유리병에 추가, 100 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장
참고: 각 약 수 11 마우스 55 UI를 포함합니다. 결코 처음 사용 후 2 주 이상 계속 PMSG aliquots. - 2730 µ L 1으로 hCG (사람 융 생식 샘 자극 호르몬) 버퍼의 동결 건조 된 hCG 유리병 추가 합니다. 100 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장
참고: 각 약 수 11 마우스 55 UI를 포함합니다.
- PSMG (임신 암 말 혈 청 생식 샘 자극 호르몬) 버퍼의 910 µ L 1 동결 건조 된 PMSG 유리병에 추가, 100 µ L aliquots, 고-20 ° c.에 저장
- Hyaluronidase 준비
- 50 µ L aliquots를 얻을 10 mg/mL 재고 솔루션 M2 매체의 3 mL와 hyaluronidase의 1 유리병 reconstitute -20 ° c.에 저장
- 수술 도구 준비
- 오토 클레이 브를 사용 하 여 모든 수술 도구를 소독.
2입니다. 여성 기증자의 superovulation
- 12 h를 사용 하 여 동물 시설에서 하루-밤 주기, 오후 2 시-3 일에 PMSG를 주사. HCG 주입 직후 비옥한 남성과 12 시-1 일과 친구에 hCG 주사.
- -3 일에 PMSG의 100 µ L의 1 약 수로 살 균 0.9 %NaCl 용액 1 mL을 추가 (55 UI). 10 C57BL/6JRj 여성 intraperitoneally 죽은 볼륨 없이 주사기를 사용 하 여 100 µ L를 주사.
참고: 각 마우스 PMSG의 5 UI를 받게 됩니다. - -1 일에 hCG의 100 µ L의 1 약 수로 살 균 0.9 %NaCl 용액 1 mL을 추가 (55 UI). Intraperitoneally 100 µ L로 희석된 hCG 솔루션 (5UI)의 PMSG 주사 받은 쥐를 주입. 어떤 죽은 볼륨 없는 주사기를 사용 합니다. 천천히 삽입을 수행 하 고 액체 누설 하지 않습니다 있도록 바늘을 제거 하기 전에 기다립니다.
참고: 각 마우스 hCG의 5 UI를 받게 됩니다. HCG의 사출 PMSG 후 46 h 수행 되어야 한다. - 스 터 드 남성의 케이지 hCG 주사 후 직접 각 C57BL/6JRj 여성을 놓습니다.
- 0 하루 아침에 질 플러그를 확인 하 고 긍정적인 여성을 사용 하 여 수정 된 달걀을 수집.
3. 준비 B6CBAF1/jRj Pseudopregnant 여성
- 친구 하나 vasectomized 남성 계란 컬렉션 (주-1) 2 B6CBAF1/JRj 여성 5 오후에 전날.
참고: 여성 사이클의 동기화를 방지 하려면 다른 연습장에서 발생 하는 여성을 친구에 게 매우 중요 하다.입니다. 이 질 플러그의 수율을 증가할 것 이다. 또한, 지난 2 일 이내에 변경 된 남성 감 금 소에 여성을 추가 하지 마십시오. 남성의 생식 행동의 효능은 감 금 소는 더러운 때 증가 합니다.
4. 수정 된 난 자 컬렉션
- 준비
- Hyaluronidase 재고 솔루션 hyaluronidase 작업 솔루션을 준비 하 m 2의 1450 µ L를 추가 합니다.
- 100 mm 페 트리 접시에서에서 수정 된 달걀을 생산 하 고 실내 온도에 유지 하는 데 사용 하는 여성 당 hyaluronidase 작업 솔루션의 100 µ L의 한 방울을 배치 합니다.
- 4 우물 판으로 M16의 500 µ L를 추가 합니다. 주입 됩니다 lentiviral 벡터의 종류 당 2 우물을 사용 하 여: 하나 잘 삽입 된 계란 및 다른 포함 됩니다 비 주입 하는 것 들. 5% CO2 분위기 37 ° c 배양 기에서 4 잘 접시를 놓습니다.
- 펫 수집 및 배아의 처리에 대 한 준비.
- 불꽃에 하드 유리 모 세관 튜브의 중심을 회전 하 여 유리가 모세 혈관 (75 m m/60 µ L)를 부드럽게.
- 열에서 모세를 신속 하 게 가능 하 고 약 300 µ m. 풀 깔끔한 휴식을 얻기 위해 냉각된 배관에는 내부 직경 튜브를 당겨 제거 합니다.
- Oviducts 수집 합니다.
- 0 당일 오전 9 시 경부 전위에 의해 C57BL/6JRj 여성 안락사. 죽음은 잘린에 의해 확인 된다.
참고:이 안락사는 IACUC에 의해 승인 되었다 메서드와 유럽 권장 사항을 따릅니다. - 가 위로 복 부 구멍을 여는 큰 가로 절 개를 수행 합니다. 수 란 관은 자 궁과 난소 사이 있습니다.
- mesometrium와 곡선된 겸 자 저명한 혈관 들고 막 제거 합니다.
- 곡선된 겸 자는 수 란 관 난소에서 구분 합니다.
- 가이드로 곡선된 집게를 사용 하 여 곡선된가 위를 사용 하 여 난소에서 수 란 관을 잘라.
- 수 란 관을 당겨 하 고 곡선가 위는 자 궁에서 잘라.
주의: 수정 된 달걀을 포함 하는 부 ampulla를 만지지 마십시오. 불 임 악기를 사용 하 여 전체 프로시저를 수행 합니다. - 실 온에서 M2 매체 (35mm 문화 접시)에 모든 수집된 oviducts 장소
- 2 oviducts hyaluronidase 작업 솔루션 (0.3 mg/mL)의 같은 100 µ L 드롭 장소.
- 0 당일 오전 9 시 경부 전위에 의해 C57BL/6JRj 여성 안락사. 죽음은 잘린에 의해 확인 된다.
- 수정 된 난 자에서 적 운 세포를 제거 합니다.
- 2 인슐린 주사기를 사용 하는 stereomicroscope에서:는 ampulla 찢 해산 하는 수 란 관을 첫 번째 및 두 번째 hyaluronidase 작업 솔루션으로 계란을 수정.
- 달걀을 수집 하기 위한 준비 유리 피펫으로 받아 고 관과 모든 계란을 발음을 떠 벌이 0.22 μ m 필터를 연결 합니다. 모든 달걀을 수집 하 고 M2 매체의 100 µ L의 6 다른 방울에 연속 통행에 의해 그들을 씻어.
- 장소는 M16 매체에서 5% CO2 의 분위기와 습도 37 ° C 배양 기에 수정 된 달걀을 씻어.
5. 주입 펫
- 1 mm의 외부 직경이 얇은 벽 유리 모 세관 튜브 (10-15 cm 길이)를 사용 하 고 수평 micropipette 끌어당기는 사람으로이 모 세관을 클램프.
참고: 가장 수평 피 펫 pullers에서 3 매개 변수 조정 될 수 있다: 열 힘, 강도 및 시간 간격으로 난방 및 당기 당기. 그림 2A에 표시 한 유사한 주입 pipets를 얻기 위해 이러한 매개 변수를 조정 합니다. 정기적으로 DNA microinjection를 수행 하는 사용자에 대 한 표준 설정을 사용 하 고 난방 그리고 피 펫 팁의 전체 모양을 변경 하려면 사이의 지연이 조정 합니다.
6. 만들기 보유 펫
- 주입 피 펫을 사용 하 여 지주 피 펫을 준비.
- microforge를 주입 피 펫을 연결 합니다. 80 ~ 100 µ m 직경의 날카로운 대칭 팁을 얻기 위해 microforge와 피 펫을 잘라. 다음에 날카로운 헤 지 없이 대칭 둥근 모양을 얻기 위해 microforge에 열 팁 폴란드어.
7. Lentiviral 벡터를 포함 하는 주입 피 펫의 준비
- 종종 냉동된 lentiviral 주식에 있는 파편을 작은 2 분 160 x g lentiviral 벡터 정지 원심
- 복구는 상쾌한와 클래스 II 안전 캐비닛에서 새로운 0.5 mL 튜브로 전송 합니다.
- 마이크로-로더를 사용 하 여 5 단계에서 설명한 대로 준비 하는 주입 피 펫에 상쾌한의 1 µ L를 전송.
- 오른쪽 micromanipulator의 악기 소유자에 주입 피 펫을 설정 합니다. 왼쪽된 micromanipulator 지주 피펫으로 연결 합니다.
참고: lentiviral 벡터의 변환 titer 것입니다 수 직접 상관 설립자 생산의 효능. 높은 효능에 대 한 (> 70%), 바이러스 성 벡터를 사용 하 여 100의 범위에서 titer와 p24 capsid 단백질 / µ L의 ng. 10 위는 titer 이어야 한다는 titer 변환 단위 (TU)로 표시 됩니다 때9 화/mL. P8.91 encapsidation 플라스 미드와 293T 세포의 과도 transfection lentiviral 벡터 주식을 생성 해야 pHCMV-G, 보충 방법18에 설명 된 대로 vesicular 구내 염 바이러스 (VSV) 당단백질-G를 인코딩.
8입니다. 마이크로 주입
- 우울증 슬라이드 및 덮개의 센터에서 M2 매체의 8 µ L 라이트 파라핀 오일 (태아 테스트) 특 면 증발을 피하기 위해.
- 드롭 이상 가능한 분산으로에 장소 20 계란.
주의: 배아를 입금 할 때 거품을 만들지 마십시오. - 사출 피 펫의 끝 열려 있는지 확인 합니다. 그렇지 않은 경우에 지주 피 펫으로 주입 피 펫을 누릅니다.
- microinjector을 설정 하는 20의 주입 시간에 대 한 s.
참고: 바이러스 성 현 탁 액의 점도 perivitelline 공간에서 바이러스 성 벡터의 분산의 명확한 시각화 수 있습니다. 20 내 전체 공간을 채우기 위해 사출 압력을 조정 한다 주입 10 ~ 100의 볼륨을 나타내는 s와 줘. 사출 압력 600 hPa를 넘지 말아야 한다. - 2 프로 핵 및는 stereomicroscope 아래 지주 피 펫 2 극 지 몸을 포함 한 수정 된 달걀 발음
- 8.4 perivitelline 공간에서에서 설명 하는 설정을 사용 하 여 microinjector와 함께 계란을 주입.
주의: 주입 피펫으로와 원형질 막 만지지 마십시오. - 모든 수정 된 달걀 20 계란의 일괄 처리에서 사용할 수 있는 주사 고 주입 된 계란 즉시 사전 온수 M16 매체에 5% CO2의 분위기와 습도 37 ° C 배양 기 합니다.
참고: 배아 전송 하기 전에 주입 후 최소 30 분 동안 주입 된 알을 품 어.
9. B6CBAF1/JRj Pseudopregnant 여성 배아 전송
- B6CBAF1/JRj 정 관 남성과 B6CBAF1/JRj 암컷 짝짓기 후 결합 플러그 16 h를 확인 합니다. 그냥 계란 컬렉션을 시작 하기 전에 이렇게 합니다.
- 주입 된 배아 이식 펫 준비.
- 이식 펫 수집 하 고 배아 (4.2 단계) 처리에 대 한 설명으로 배아에 대 한 확인 합니다. 길이 좁은 부분 약 4-5 cm로 약 150 µ m의 내부 직경을 가진 펫을 선택 합니다.
참고: 팁 불꽃 광택, 계란에는 수 란 관 손상을 줄이기 위해 해야 합니다.- 피 펫 어깨 바로 위에 빛 파라핀 기름 (태아 테스트)를 채우십시오.
- 작은 공기 방울이 다음 M2 매체, 발음 그리고 마지막으로 두 번째 공기 거품.
- 배아와 수 란 관에 주입 하는 매체의 총 볼륨을 최소화 하기 위해 서로 뒤에 배아 하나를 그립니다.
- 한 배아 폭의 라이트 파라핀 오일 (태아 테스트)의 아주 작은 방울을 로드 하 여 마무리.
주의: 수 부드러운 피펫으로 처리 하는 동안.
- 이식 펫 수집 하 고 배아 (4.2 단계) 처리에 대 한 설명으로 배아에 대 한 확인 합니다. 길이 좁은 부분 약 4-5 cm로 약 150 µ m의 내부 직경을 가진 펫을 선택 합니다.
- 태아 이동입니다.
- 모든 악기를 소독.
- 케 타 민의 몸 무게의 g 당 150 μ g과 Xylazine의 몸 무게의 g 당 0.15 μ g를 포함 하는 살 균 NaCl 0.9% 솔루션의 300 μ의 복 주사를 사용 하 여 여성 anesthetize
- 집게와 동물의 꼬리를 곤란 하 게 하 여 마 취의 깊이 확인 하 고 절차를 시작 하기 전에 진통제 (Buprenorphine)의 subcutaneouly 0.1 mg/kg을 주사.
- 마지막 늑 골의 수준에서 척수를 따라 뒤쪽의 양쪽에 2cm를 면도.
- 생리대에 살 균 분야에서 여성 마우스를 놓습니다. 2 cm x 2 cm 창 마우스 뒷면 중간을 잘라.
- 그리고가 위, 1 cm 가로 절 개를 하 게 다음 난소 (오렌지 색상)은 체 벽을 통해 볼 수 때까지 피부를 옆으로 밀어 피부에 살 균 솔루션 (10 %Povidone 요오드 화물)를 적용 합니다.
- 눈 수술 현미경 미세가 위 체 벽 바로 위에 난소에 5 m m 절 개를 확인 합니다.
- Atraumatic 불독 클램프와 지방 패드를 선택 하 고 난소에서 수 란 관, 자 궁의 상단에 밖으로 당겨.
- 시각화는 ampulla 고 욕실이 위는 ampulla 난소를 연결 하는 수 란 관 세그먼트에는 hemisection를 확인 합니다.
- 전송 배아 피 펫을 소개 하 고 이식 피 펫에서 첫 번째 공기 거품에서 ampulla에 계란을 제공.
- 두 번째 수 란 관에서 절차를 반복 합니다.
- 피부 상처 클립 닫습니다.
- 장소는 복구에 동물 챔버 (39 ° C, 30-60 분) 완전히 깨어 때까지.
- 진통 주사 후 12 h와 통증이 나 조 난의 경우 48 h를 반복 합니다.
- 수술 후 7-10 일 상처 클립을 제거 합니다.
- 이식 후 3 일 마다 자신의 체중 곡선에 따라 임신에 대 한 이식된 여성을 확인 합니다. 상당한 체중 주입 후 10 ~ 12 일 관찰 될 수 있다 고 임신에 대 한 표시 됩니다.
참고: 모든 배아 지 여기 개발 상 상속 유전자 변형 설립자를 나타냅니다. 어떤 발달 단계에 또는 과학적인 질문에 따라 탄생이 유전자 변형 동물의 세대에 연결 후 이러한 설립자의 표현 형을 분석할 수 있습니다.
10. 유전형 유전자 변형 설립자
- 10 mM Tris HCl, pH 8;를 포함 하는 유전형 버퍼를 준비 5 m m EDTA, pH 8.0 0.2 %SDS (w/v), 50 mM NaCl로. 0.22 μ m 필터를 통해 유전형 버퍼를 소독 하 고 몇 달 동안 실내 온도에 저장.
- (배아)에 대 한 넣어 extraembryonic 막 또는의 500 µ L로 (태어난된 동물)에 대 한 꼬리의 작은 조각 유전형 버퍼를 필터링 하 고 15 µ L의 성분 K (20 mg/mL)를 추가 합니다. 55 ° c.에서 밤새 품 어
- 5 분 동안 15000 x g에서 lysate 원심 고 상쾌한의 1 µ L를 사용 하 여 PCR 반응에 대 한. Lysate 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 몇 달 동안.
- 1 x PCR 버퍼, 1.5 m m MgCl2, dNTPs, 각 PCR 뇌관의 0.2 µ M, 1 UI의 Taq DNA 중 합 효소 및 각 소화 샘플의 1 µ L의 200 µ M를 포함 하는 20 µ L 반응 볼륨에 있는 transgene의 파편의 PCR 증폭을 수행 합니다. 부정적인 제어를 사용 하 여 H2o.의 1 µ L 긍정적인 컨트롤로 포함 하는 transgene lentiviral 벡터 플라스 미드에서 DNA를 사용 합니다.
- EGFP의 검출에 대 한 사용 설명:
eGFP 앞으로 뇌관: 5' 3' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT
eGFP 반전 뇌관: 5' 3' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT - PCR 확대는 thermocycler 수행: 94 ° C, 60 ° C에서 1 분에 1 분의 35 주기 다음 94 ° C에서 4 분 및 72 ° c.에서 2 분
- 300 bp eGFP PCR 제품 그림 2B에서 같이 시각화 하기 위해서는 2 %agarose 젤에 PCR 제품을 로드 합니다.
참고: 모든 개인 300 bp PCR 밴드를 보여주는 eGFP transgene를 통합 하 고 제 닉으로 간주 될 수 있습니다. - 유전자 변형 동물에서 transgene 식 분석. 예를 들어 조직학 수행 하 고 immunostaining으로 그림 3 과 그림 4 에 나와 있는 보충 방법에 설명 된.
참고: 모두 transgene 식 분석 및 표현 형 분석 글로벌 과학적인 질문에 따라 적절 한 방법을 사용 하 여 수행 되어야 한다.
11입니다. Transgene 복사본 수의 정량화
- 양이 많은 PCR에 DNA 샘플을 준비 합니다.
- 10.3 제조업체 지침에 따라 상업 키트를 사용 하 여 단계에서 얻은 lysate 가수분해 K에서 게놈 DNA (gDNA)을 추출 합니다.
- 260에 분 광 광도 법에 의해 gDNA를 계량 nm.
- 각 gDNA 샘플 10 ng / µ L의 최종 농도에 희석.
- 각 샘플에 대 한 준비 5 직렬 희석 (1:5)에 H2O 6 튜브 다음 농도 얻기 위해: 10 ng / µ L, 2 ng / µ L, 0.4 ng / µ L, 0.08 ng / µ L, 0.016 ng / µ L 및 0.0032 ng / µ L
- 정량 PCR (정량) 반응 혼합을 준비 합니다.
- 정량 pcr 뇌관 믹스를 준비 합니다. 정량에 사용할 각 뇌관 커플에 대 한 추가 앞으로 뇌관 (뇌관 재고 솔루션을 100 µ M)의 10 µ L, 역방향 뇌관 (100 µ M)의 10 µ L 및 H2o.의 80 µ L
참고: eGFP 증폭, TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA 앞으로 반전 TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG 뇌관을 사용 합니다. Cdx2 유전자 normalizer 정량 (게놈 당 2 부)에 대 한 사용 됩니다. Cdx2 normalizer를 사용 하 여 앞으로 GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG와 반대로 GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT 뇌관 - 2 정량 믹스, eGFP 뇌관 믹스 및 Cdx2 뇌관 믹스와 함께 준비 합니다. 각 gDNA의 중복에 6 희석 증폭 충분 한 정량 혼합을 준비 합니다. 1 정량 반응 H2O, x 반응 혼합 형광 녹색 2의 5 µ L 및 뇌관 믹스의 0.2 µ L의 3.8 µ L를 포함합니다.
참고: 각 유전자 변형 동물 테스트를, 24 정량 Pcr 반응은 수행 됩니다. 반응 혼합은 384 잘 정량 Pcr 기계에 대 한 제공 됩니다. - 테스트를 각 동물에 대 한 배포: Cdx2 정량 혼합의 9 µ L로의 eGFP 정량 믹스와 12 우물 9 µ L와 12 우물. 2 우물 eGFP 정량 혼합을 포함 하 고 2 우물 eGFP 정량 혼합을 포함 하 각 gDNA 희석의 1 µ L를 추가 합니다.
- 각 정량에 대 한 휴가 2 웰 스 혼합 어떤 gDNA H2O 부정적인 컨트롤로 대체 되었습니다.
- 정량 pcr 뇌관 믹스를 준비 합니다. 정량에 사용할 각 뇌관 커플에 대 한 추가 앞으로 뇌관 (뇌관 재고 솔루션을 100 µ M)의 10 µ L, 역방향 뇌관 (100 µ M)의 10 µ L 및 H2o.의 80 µ L
- 정량 Pcr 기계에 384 잘 접시를 놓고 다음과 같은 실행 프로토콜 적용: 95 ° C 다음 50에서 10 분의 10 주기 s 95 ° C와 60 ° c.에 1 분에서
- 데이터를 분석 합니다. 각 gDNA를 테스트에 대 한 총 gDNA 금액 (6 포인트 중복에)의 로그의 기능으로 Ct 값을 플롯 합니다. 최소 제곱 방법으로 선형 회귀를 사용 하 여 곡선을 적합 하 고 y 축 절편에 해당 하는 Ct 값을 추정. EGFP 및 정규화 Cdx2 외삽된 Ct 값을 사용 하 여 Cdx2 상대적인 eGFP 복사본 수를 계산 (2 복사)11표준 2ΔdCt 메서드 사용 하 여.
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Representative Results
유전자 변형 동물 여기에 제시 된 프로토콜을 사용 하 여 생성 되었다. 대표 결과 모두 유비 쿼터 스 그리고 셀 형식 특정 transgene 식 설명 된다.
Transgenes 제정 표현
유비 쿼터 스 발기인은 transgenes는 지속적이 고 효율적인 방식으로 표현에 기초 연구 도구입니다. 이러한 발기인 매우 큰 다양 한 크고 작은 동물에 transgenesis vivo에서 세포 transfection 생체 외에서 에서 응용 프로그램에 사용 됩니다.
Lentiviral 벡터는 세포 (CMV) 발기인 또는 CAG 치킨 걸 발기인 및 CMV 증강의 융합에 따라 복합 발기인의 제어에서 녹색 형광 성 취재 원 유전자 (eGFP)를 표현 하기 위해 건설 되었다. 두 lentiviral 벡터 제작된 (보충 방법) 그리고는 titer 293T 세포에 변환 단위 (TU) eGFP 식을 기반으로 결정 했다. 두 lentiviral 벡터 구조 109 화/mL에 이식된 의사 임신 여성 쥐의 농도에 수정 된 oocytes perivitelline 공간에 주입 했다. 배아 이식된 되었고 다음 출산 직전 수집 genotyped eGFP 통합에 따라 PCR에 의해. 73% (n = 22) 및 83% (n = 32) 수집 된 배아의 통합 했다는 transgene는 CMV와 CAG lentiviral 구문에 대 한 각각 (표 1). 유전자 변형 태아 sectioned와 면역에 대 한 스테인드 eGFP 그때 있었다. 그림 3에서 볼 수 있듯이 모든 셀 CAG 발기인 사용 된 GFP를 표현 하는 반면 흩어져 eGFP 긍정적인 셀만 CMV 발기인 (그림 3, 맨 위 패널)와 관찰 된다 (그림 3, 중, 하단 패널).
CAG 모터와 수집 된 유전자 변형 태아의 96%는 편 eGFP transgene를 (표 1)을 표현 했다. 비록 두 발기인은 유비 쿼터 스, CAG 발기인만 드라이브 모든 셀에 있는 transgene의 강력한 표현 할 수 있다. 대체 유비 쿼터 스 발기인 phosphoglycerate 키 니 아 제 (PGK)과 유비퀴틴-C 발기인 등 사용 되었고 eGFP (데이터 표시 되지 않음)의 더 낮은 식 수준의 CAG 발기인으로 얻은 것 들과 비슷한 결과 굴복.
Vivo에서 조직 특정 컨트롤 요소를 테스트 하려면 규제 게놈 영역 매핑.
응용 프로그램의 많은 수, 표현의 transgenes 유전자 변형 동물에서 세포 특정 방식으로 필요 합니다. 또한, 유전자 변형 동물의 발생 사용할 수 있습니다 매우 주어진된 유전자의 세포 구체적인 표현을 제어 하 상 상속 규정 genomic DNA 파편의 능력에. 예를 들어, 유전자 변형 동물의 lentiviral 중재 생산 컨트롤 Neurogenin 3 (Neurog3) 식11셀 특정 강화를 매핑하는 데 사용 되었다. Neurog3 기초 나선 루프 나선 (bHLH) 녹음 방송 요인 내 분 비 운명으로 췌 장의 창시자의의 지를 제어 하는. Neurog3 null 돌연변이 생쥐, 췌 장의 내 분 비 셀19를 차별화할 수 있습니다. -5284 및-3061 Neurog3 전사를 기준으로 사이트를 시작 위치 사이의 지역화 2.2 kb DNA 파편 lentiviral 벡터 상류 앞에서 설명한 드라이브 식 eGFP 취재 원 유전자의 beta globin 최소한의 발기인으로 복제 했다 11. 제어 구문 마찬가지로 마우스 염색체 6에 지역화 2.4 kb intergenic 조각 복제에 의해 생성 되었다 (chr6: 14237279-14239685 mm9 마우스 게놈 어셈블리를 기준으로) 동일한 lentiviral 등뼈에. 이 게놈 지역 Gpr85 및 Ppp1r3a 유전자 사이 1 메가 베이스 긴 유전자 사막 내에서 지역화 됩니다. 높은 titer lentiviral 벡터 다음 구문 및 명명 된 Neurog3-증가 eGFP 및 Chr6 eGFP 사용 하 여 생산 되었다.
두 lentiviral 벡터 건설 되었다 고 제작 (보충 방법). 이후 셀 Neurog3 표현 했다 현재 사용할 수 있는, TU titer 확인할 수 없습니다 수 있습니다. 또는, p24 capsid 단백질의 농도 titer 측정 했다. 2 벡터의 수정 된 oocytes perivitelline 공간에 주입 되었고 의사 임신 여성 쥐에 이식. 로이 개발 단계 췌에 Neurog3 의 최대 표현에 해당 이식된 배아 배아 일 14.5 (E14.5)에서 수집 했다. 배아는 eGFP 통합에 따라 genotyped 다음 이었다. 84% (n = 47) 71% (n = 48) 수집 된 배아의 통합 했다 Neurog3-증가 eGFP 및 Chr6 eGFP lentiviral 구문 transgene 각각 (표 1). 각 태아에 대 한 췌 장 새싹은 해 부 되었고 immunostaining 수행 구분. 92 %Neurog3 -증가 eGFP 유전자 변형 태아의 췌 장의 그림 4 최고 패널 (대표 immunostaining)에서 볼 수 있듯이 eGFP 표현. 중요 한 것은, eGFP 긍정적인 세포는 또한 Neurog3 표현 셀 (그림 4) 나타내는 2.2 kb Neurog3 증강의 대다수는 Neurog3 세포 인구 내의 eGFP 식이 제한 수 있습니다. 반대에 의하여 Chr6 eGFP 배아의 eGFP (그림 4 하단 패널 및 표 1)에서 췌 장 또는 췌 외부 표현. 또한, 아니 소성 표현의 eGFP Neurog3-증가 eGFP 배아11췌 외부 관찰 되었다.
위의 4 실험에 대 한 절차의 각 단계의 정확한 양적 설명 표 1에 표시 됩니다. 이 절차의 글로벌 효능을 보여 줍니다. 실제로, 숫자 주입된 수정 된 달걀으로는 transgene를 통합 수집 된 동물의 숫자를 비교 하는 경우 프로시저의 글로벌 비중은 44%의 평균입니다. 베타-galactosidase 기자에 게 융합 Neurog3 증강을 포함 하는 구성의 pronuclear DNA 주입으로 같은 수익률은 3.1%를 초과 하지 않습니다.
수정 된 oocytes lentiviral 벡터와 변환 여러 사이트10,13에서 발생할 수 있는 transgene 통합 이끌어 낸다. Transgene 통합 사이트의 상대 수 정량 PCR를 사용 하 여 게놈 DNA (그림 5)에 평가 했다. 정량화의 eGFP 통합 정량 PCR (정량)에 의해 결정 되었고 Cdx2 유전자 게놈 앞에서 설명한11당 2 부에 존재 하는 정규화 된. 통합 사이트의 평균 수 19.36 ± 2.468 (S.E.M.) 되었고 각각 Neurog3-증가 eGFP 및 Chr6 eGFP 구문에서 생성 된 배아에서 9.537 ± 1.186 (S.E.M.). 흥미롭게도, 이러한 동물을 생산 하는 데 사용 하는 두 개의 lentiviral 벡터 다른 바이러스 titers을 제시. P24 capsid 단백질의 농도 Neurog3-증가 eGFP 벡터에 대 한 124 ng / µ L의 Chr6 eGFP 벡터 제어에 대 한 52 ng / µ L의 했다. 그것은 가장 가능성이 같은 titer 차이 통합 사이트 번호 유전자 변형 태아 (그림 5)의 두 인구에서 관찰 하는 중요 한 차이 대 한 계정을 것입니다. 이 설립자 유전자 변형 생쥐의 일괄 처리에서 얻은 통합 사이트의 평균 수 다른 titers 바이러스 성 주식을 사용 하 여 변조 될 수 있는 제안 합니다.
중요 한 것은, 직접적인 상관 관계가 eGFP Neurog3-증가 eGFP 유전자 변형 태아에서의 표현과 통합 transgene 사본의 수 사이 관찰 되었다. 즉, Neurog3-증가 eGFP transgene의 단일 또는 여러 복사본 통합 배아 Neurog3 긍정적인 세포에 표현 eGFP을 발견 유사 했다.
그림 1: 전체 절차의 흐름 차트 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 마이크로 주입 펫 및 유전형을 준비.
(A) microinjection pipets DNA 또는 lentiviral 벡터 주사 사용 사이의 주요 차이점을 강조 하기 위해 펫의 구조도 드로잉. 왼쪽 패널: 두 피 펫 종류의 전반적인 모양을 그려집니다. 점선된 원 피펫으로 팁의 확대 영역을 강조 표시합니다. 사진의 피펫으로 팁도 제공 됩니다. Note는 lentiviral 주입에 대 한 팁 해야 깨진 점선 및 해당 그림 표시. 오른쪽 패널: 계란 주입 중에 하나의 pronucleus 왼쪽, 수정 란 및 주입 피펫으로 지주 피펫으로와 설정의 또는 perivitelline 공간에서. 스케일 바 = 50 µ m.의 eGFP PCR 제품 agarose 젤에 (B) 시각화 8 다른 배아 (1 ~ 8 레인)에서 추출 하는 genomic DNA에서 증폭. 1, 2, 3, 5, 6, 8만 배아 eGFP transgene를 통합 했다. DNA 플라스 미드 pTrip PGK eGFP lentiviral 벡터 생산에 사용 되는 PCR 긍정적인 제어로 사용 되었다. 부정적인 통제에 대 한 H2O PCR 반응에서 DNA를 대체. MWM: 분자량 마커. bp = 기본적인 쌍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 유비 쿼터 스 발기인 유전자 변형 태아 eGFP 기자의 식 드라이브.
10 µ m cryo-섹션 유전자 변형 태아의 eGFP 식 (녹색) 및 (파란) 핵을 시각화 하 얼룩 했다. CMV 발기인 lentiviral와 생성 된 배아 구성 (상단 왼쪽된 레이블) E11.5에 모였다. CAG 발기인 lentiviral 구문 (하단 왼쪽된 레이블)으로 생성 된 배아는 E18.5에서 수집 했다. Pb: 췌 장 새싹, VSC: 복 부 척수, Vt: 척추 골, 리: 간, Ms: 복 부 벨트의 근육. 스케일 바 50 µ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 세포 유전자 변형 태아에 취재 원 유전자의 특정 식 Neurog3 증강에 의해 구동 됩니다. 10 µ m cryo-섹션 E14.5 유전자 변형 태아의 췌 장 새싹의 되었다 스테인드 보충 방법에 설명 된 대로 Neurog3 (적색), eGFP (녹색) 및 핵 (파란색)의 표현을 시각화 하). Neurog3 식 췌에 흩어져 있다. 통합 Neurog3-증가 eGFP 유전자 변형 태아 건설 익스프레스 eGFP와 eGFP 긍정적인 세포의 대부분은 Neurog3 양성 (상단 패널). Chr6-eGFP 구문으로 생성 된 배아 하지 eGFP (하단 패널)을 표현 했다. 스케일 바 50 µ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 통합된 transgenes의 상대 복사 번호. EGFP 통합 사이트 CDX2 유전자 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 상대적 부 량이 고 75번째 백분위 수를 25번째 에서 상자 그림 점 생성 된 다른 유전자 변형 태아를 나타냅니다. 두 개의 lentiviral 구조 사이 transgenes 통합 사이트의 비교는 상당히 다른 (짝이 없는 파라메트릭 t-검정, p = 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
표 1: 완전 한 절차 동안 단계적으로 양적 보고서. 절차의 과정, 계란 또는 배아의 총 숫자 계산 했다. 첫 번째 열 superovulated 여성 oviducts에서 검색 된 계란의 총 수를 나타냅니다. 달걀만 취소 2 극 시체 또는 표시 pronuclei 주입 했다 보고 됩니다. 주입 및 문화에 몇 시간 후 하지 lysed 했다 고 정상적인 형태를 했다만 주입 된 계란 이식 했다. 다음 pseudopregnant 여성에서 수집 된 배아의 총 수에 포함 됩니다. 마지막으로, 배아를 했다는 transgene 통합 기자는 마지막 두 개의 열에 나열 됩니다. 동일한 기능 또한 비교를 위해 표준 pronuclei DNA 주입을 사용 하 여 실험으로 지정 됩니다. 여기는 transgene 베타-galactosidase 취재 원 유전자 (Neurog3-증가-LacZ)의 식 운전 Neurog3 증강을 포함. 이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여기서 설명 하는 수정 된 oocytes에서 lentiviral 벡터의 perivitelline 주입 수집 된 배아의 총 수를 기준으로 유전자 변형 태아의 70% 이상 생성 하는 유전자 변형 태아의 생산 귀착되는. 이 결과 이전 보고서와 일치 하 고 절차2,7,10,,1112의 특이성을 단적으로 보여준다. 표 1에서 제시 하는 모든 데이터를 비교할 때 중요 한 기능을 강조 수 있습니다. 첫째, 이식된 계란의 수는 정상 형태 또는 문화에 몇 시간 후 lysed 하지 했다 모든 삽입 된 계란에 대응 했다. 주입 된 달걀의 93 %perivitelline 공간에서 lentiviral 벡터의 주입으로 인해 급속 한 독성의 거의 완전 한 부재를 제안 이식 했다. 주입 된 달걀의 44%만 살아 났 었던 이식 했다 이후 DNA 주입을 고려할 때 상황이 극적으로 다르다. 또한, 이식된 계란 기준으로 수집 된 배아의 비율은 lentiviral 벡터의 악화 없는 장기 독성을 제안 하는 두 절차 사이 동일 합니다. 둘째, transgene 삽입 된 계란의 수를 기준으로 통합 하는 배아의 수를 표현 하는 경우 글로벌 생산량은 이상 10 배 더 높은 DNA 주입에 비해 lentiviral 벡터 주사로. 86-fold 차이 transgene 동일한 Neurog3 증강 구문을 사용 하 여 두 절차 사이 표현 하는 배아의 수를 비교할 때에 발견 된다.
중요 한 것은, 유전자 변형 생산 수율 사용된 lentiviral 벡터의 변환 titer의 종속 것으로 보인다. 즉, 10 위 titer lentiviral 벡터 제작9 화/mL는 같은 고수익을 얻기 위해 충분 한. 프로토콜 섹션에 설명 된 대로 perivitelline 공간에 주입 된 볼륨은 10 ~ 100의 범위에와 줘. 이 볼륨은 10 ~ 100 활성 lentiviral 입자를 나타냅니다. 표준 pronuclei DNA 주사에 비해 태어난된 동물의 동일한 금액을 생성 하는 설립자 동물의 총 수 lentiviral 벡터를 사용 하 여 적어도 10 배 높은 수준 이다. 또한,는 transgene의 식 penetrance 매우 높은이 프로토콜은 유비 쿼터 스 모두 관찰 되었다 고 셀 CMV 발기인 제외한 특정 발기인. 세포질 유비 쿼터 스 발기인에 반대에 의하여 CMV 발기인 DNA 메 틸 화20 하 여 적극적으로 종료 하 고 유지할 pluripotent 줄기 세포21에서 변환 시 장기 식 수로 표시 되었습니다. 이 세포에서 유전자 변형 태아 관찰 표현 eGFP의 매우 제한 된 수를 설명할 수 있었다. 따라서 lentiviral 벡터는 transgene의 식 세포 특정 증강에 의해 제어 하는 유전자 변형 동물 생산에 잘 적응 됩니다. 중요 한 것은, 증강 활동에서 비보에 대 한 화면을 찾을 지도 전사 인자 바인딩 사이트 규제 지역11,12프로토콜을 사용할 수 있습니다. 이 검사 방법은 거의 표준 transgenesis를 사용 하 여 수행할 수 있습니다. 모든 다른 구문을 테스트 하 고 통계적 의미에 도달 하는 데 필요한 설립자 동물의 총 수는 lentiviral 중재 transgenesis로 빠르게 얻을 수 있습니다 반면 사출 세션의 수십을 요구할 것입니다.
표준 절차와 lentiviral 기반된 방법 사이의 주요 차이점 중 하나는 transgene 통합에 상주합니다. Pronuclear 주입을 사용 하 여, transgenes는 독특한 장소에서 여러 개의 복사본으로 무작위로 통합. Lentiviral 벡터를 사용 하 여 통합 엄격 하 게 임의 되지 않고 여러 loci (로커 스 당 1 부)에서 발생할 수 있습니다. 통합 사이트 선형 증폭 중재 PCR (램-PCR)를 사용 하 여 복제를 통해 디 Trono의 그룹 transgenes 수정 된 난 자13의 오픈 chromatin 지역에 우선적으로 통합을 보이고 있다. 통합 바이어스 방해 하거나 유전자 변형 쥐에 있는 transgene 식을 하지 해야 합니다. 통합 한 셀 단계 배아 lentiviral 변환 하는 동안 아직도 개발 중 나중 오픈 구성 또는 성인에 되지 않을 수 있습니다 오픈 chromatin에서 발생 합니다.
또한, 1 세대 동물 (F0) 또는 배아에 통합된 transgenes의 복사본 수를 분석, 통합된 transgene의 수에 있는 큰 변화 관찰 됩니다. 이 연구에서 19 통합 사본의 평균 발견 되었다 Neurog3 증가 eGFP 구조와. 이 큰 복사본 수 mosaicism의 높은 수준을 반영 하 고 있다. Sauvain 외. 광범위 한 수행한 F0 동물 lentiviral 중재 방법으로 생성 된 통합된 loci의 연구 설명13. 그들은 70 개별 통합 사이트 11 F0 동물에 따라 그들의 F1 자손을 F0 유전자 변형 쥐에서 각 사이트에 대 한 전송 속도 검사 하 고. 개별 통합된 transgene의 44%의 전송의 전반적인 속도 그들은 배아를 한 셀 또는 2 셀 단계에서 S 단계 전에 S 단계 후 설립 가장 자주 했다 나왔다. 실제로, S 단계 전에 통합 후 S 단계 하나만 딸 셀 전송 것이 통합 하면서 두 딸 세포를 통합된 transgene를 전송 합니다. 따라서, 개별 통합된 transgenes 위한 mosaicism의 정도이 기술을 통해 얻은 유전자 변형 생쥐에서 최소한의. 이 추가 대부분 통합 사용된 문화 조건에서 첫 번째 분열의 생산의 평균 시간을 해당 첫 번째 12 h 이내 발생 하는 것을 나타냅니다. 이 통합 운동는 lentiviruses T-림프 세포22에 대 한 설명과 일치 합니다.
중요 한 것은, 통합된 transgenes 베어링 loci의 높은 번호와 마우스 라인 구축 않을 것 이다 합리적인. 모든 이러한 loci를 분리 하는 횡단의 수는 상당히 높은 것입니다. 이 transgene 효과의 신속한 심사 또는 여러 transgenes의 동시 분석을 위해 사용 해야 하는이 방법의 한 가지 중요 한 한계를 나타냅니다. 그럼에도 불구 하 고, 마우스 선 여전히 낮은 통합된 transgene 복사 번호 F0 동물 들에서에서 선택 하 여 설정할 수 있습니다.
Pronuclear DNA 주입 방법1의 첫 번째 설명, 이후 개선 되었습니다 많은 초기 절차의 단점을 우회 하는. 개선의 첫 번째 집합 카세트 교환 전략을 사용 하 여 정확한 장소에서 대상된 통합에 근거 했다. Pronuclear 주입 중 CRE를 사용 하 여 수행 됩니다, 그리고 통합 DNA 조각 함께 플립 또는 PhiC31 recombinases 형벌 loxP, FRT 또는 attB 사이트, 각각. 이 상황에서 통합 DNA 같은 recombinase 특정 사이트23,24형벌 통합된 조각으로 교환 됩니다. 1 세대 동물의 60%까지 될 수 있지만 이러한 메서드를 사용 하 여 유전자 변형23 , pronuclear 주입의 기술에 연결 제한은 여전히 적용 됩니다. 개선의 두 번째 세트 하나 통합 조각 들고와 한 수 있도록 표현 중 하나는 Tol225, 원형 DNA의 세포질 주사에 따라 잠자는 미녀26 또는 piggyBac27 transposases. 이러한 방법을 사용 하 여, 높은 수율 획득 (> 30%), 하지만 더 중요 한 것은, 세포질 주입 수행 쉽습니다 lentiviral 기반 프로토콜로 pronuclear 주입으로 인해 금지 circumvents. 또한, 세균성 인공적인 염색체 등 매우 큰 DNA 파편을 통합할 수 있습니다.
표준도 개선된 절차 lentiviral 중재 transgenesis 대체 하지 것입니다 분명 하다. 아직도이 방법 상당히 이상 유전 가변성 동물의 적절 한 숫자를 생성 하기 위해 필요한 시간을 줄일 수 빠른 동물 모델 제작 및 특성을 위한 강력한 도구를 나타냅니다. 또한,이 기술은 모든 유전자 변형 라인을 포함 한 모든 마우스 계통에 직접 적용할 수 있습니다. 또한, 새로운 동물 모델의 세대의 글로벌 프리 CRISPR/Cas9 기술의 최근 발전으로 변경 하려고 말할 것이 결정적 이다. 오늘, Cas9 가이드 RNA와 단백질의 pronuclear 주사 게놈의 생산 4028의 효능과 동물 모델을 편집할 수 있습니다. 이 방법은 주로 lentiviral 중재 transgenesis 사용 하 여에서 유익할 수 있었다. 실제로, 더 높은 생산 수율 뚜렷이 표현 하 두 Cas9 고 RNAs 가이드 비 통합 lentiviral 벡터29 의 사용 될 수 있습니다. 적절 하 고 강력한 동물 모델을 생산 하는 최신 기술의 조합 가장 국제 연구 그룹 공부 질병 병 인 및 치료 접근에 관련 된 도움이 됩니다.
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Disclosures
저자는 공개 충돌의 관심 있다.
Acknowledgments
우리 마 갈리 Dumont와 롤란도 Meloni lentiviral 벡터 생산 및 동물 각각 주택 기술 지원에 대 한 원고와 iVector 및 Phenoparc ICM 코어의 중요 한 독서에 대 한 감사. 이 작품은 인 Hospitalo 대학 드 신경 과학 Translationnelles 드에 의해 지원 되었다 파리, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. 협회 드 언어 프랑스에 대 한 자금 지원을 받은 홍보 부 l'Etude du Diabète 동부 표준시 데스 외관 Métaboliques (ALFEDIAM)와 공동 JDRF INSERM 부여 /.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
| hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
| NaCl | Sigma | 7982 | |
| 100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
| 4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| 0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
| Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
| Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
| Curved forceps | Moria | 2183 | |
| Curved scissors | Moria | MC26 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
| Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
| Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
| Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
| Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
| vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
| Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
| ocrygel | centravet | OCR002 | |
| Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
| Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| SDS | Sigma | 436143 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | powder |
| proteinase K | Sigma | P2308 | |
| oneTaq kit | NEB | M0480L | |
| Primers | Eurogentec | ||
| Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
| 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
| Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
| Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
| qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |
References
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