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Genetics

Production de souris transgéniques par des gènes : une méthode Simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs

Published: October 7, 2018 doi: 10.3791/57609
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM U1127, CNRS UMR 7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, Sorbonne Universités, 2UPMC Univ Paris 06, INSERM UMRS1166, Institute of Cardiometabolism and Nutrition, Sorbonne Universités

Summary

Nous présentons ici un protocole visant à promouvoir l’intégration du transgène et la production de souris transgéniques fondateur avec grande efficacité par une simple injection d’un vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin d’un ovocyte fécondé.

Abstract

Depuis près de 40 ans, injection d’ADN pronucléaire représente la méthode standard pour générer des souris transgéniques avec intégration aléatoire des transgènes. Une telle procédure systématique est largement utilisée dans le monde entier et sa principale limitation réside dans l’efficacité médiocre de l’intégration de transgene, ce qui entraîne un faible rendement des animaux fondateurs. Seulement quelques pour cent des animaux nés après l’implantation des ovocytes fécondés injectés ont intégré le transgène. En revanche, les vecteurs LENTIVIRAUX sont des outils puissants pour le transfert de gène intégrative et leur utilisation pour transmettre les ovocytes fécondés permet une production très efficace du fondateur de souris transgéniques avec un rendement moyen supérieur à 70 %. En outre, toute souche de souris peut être utilisé pour produire des animaux transgénique et la pénétrance d’expression du transgène est extrêmement élevée, supérieur à 80 % avec des gènes transgénèse médiée par rapport à la microinjection de DNA. La taille du fragment ADN qui peut être des marchandises par le vecteur lentiviral est limitée à 10 Ko et représente la limitation majeure de cette méthode. À l’aide d’un simple et facile à exécuter la procédure d’injection sous la zone pellucide des ovocytes fécondés, plus de 50 animaux fondateurs peut être produites en une seule séance de microinjection. Une telle méthode est très adaptée pour effectuer, directement aux animaux fondateurs, gain rapide et perte de fonction ou de régions d’ADN génomiques écran pour leur capacité à contrôler et réglementer gene expression in vivo.

Introduction

Le travail de pionnier de Gordon et coll. en 1980 ont montré qu’après l’implantation chez des souris pseudopregnant, l’injection d’ADN de plasmide dans pronucléus mâle d’ovocytes fécondés peut produire la production d’animaux transgéniques qui intègre la l’ADN de plasmide1. La démonstration que les mammifères transgéniques peuvent être générés a eu un impact énorme sur les sciences de la vie mondiales, ouvrant la voie aux nouveaux champs de recherche pour les sciences fondamentales et sciences biomédicales translationnelles. Au cours des quatre dernières décennies, la microinjection de DNA est devenu une pratique courante. Bien qu’un grand nombre de souris transgéniques ont été produit, la méthode standard n’est pas parfaitement utilisable pour toutes les souches de souris et fonctionne avec votre temps rétrocroisements2,3. Son application à d’autres espèces reste difficile4 et le rendement global de l’intégration des transgènes est limité à quelques pourcentage d’animaux né5. En outre, l’efficacité de l’intégration du transgène représente le facteur limitant qui explique le faible rendement global de pronucléaire injection d’ADN. À cet égard, les vecteurs viraux intégratives sont les outils les plus efficaces pour la marchandise et intègrent des transgènes et ainsi pourraient fournir de nouveaux moyens d’augmenter sensiblement le rendement de l’intégration, la seule limite étant que la taille du transgène qui ne doit pas dépasser 10Ko6 .

Les vecteurs LENTIVIRAUX Pseudo-aléatoire typés avec la protéine de l’enveloppe du Virus de la stomatite vésiculaire (VSV) sont des outils de transfert de gène Pantropes et hautement intégrative et peuvent être utilisés pour transmettre des ovocytes fécondés7. La zone pellucide entourant les ovocytes est une barrière naturelle virus et doit être transmis pour permettre la transduction avec les vecteurs LENTIVIRAUX. Animaux transgéniques ont été générés par transduction ovocytes fécondés après forage au micro ou de la suppression de la zone pellucide8,9. Cependant, injection sous la zone pellucide dans l’espace périvitellin semble être la méthode la plus simple pour transmettre les œufs fécondés initialement décrite par les Lois et les collègues7.

L’injection de périvitellin de vecteurs LENTIVIRAUX permet des rendements élevés dans la production d’animaux transgéniques qui sont plus de 70 % des animaux nés. Ce rendement est de plus de 10 fois plus élevée que le meilleur rendement possible qui peut être réalisé à l’aide de standard pronucléus ADN injection7,10,11. Dans ce contexte, une seule séance d’injections va générer au moins 50 fondateurs transgéniques (F0). Le grand nombre des fondateurs est, par conséquent, compatible avec phénotypage de l’effet de transgene directement effectuée sur des souris F0 sans la nécessité de produire des lignées de souris transgéniques. Cet avantage permet un dépistage rapide de l’effet du transgène et est spécifiquement adapté pour effectuer en vivo gain et perte de fonction dans les semaines. En outre, éléments régulateurs de l’ADN peuvent également être projetés rapidement pour mapper des exhausteurs et des motifs d’ADN liés par des facteurs de transcription11,12. Pour les injections pronucléaire, transgènes intègrent généralement en plusieurs copies dans un locus unique. Avec les vecteurs LENTIVIRAUX, intégration se produit dans plusieurs loci en un seul exemplaire par locus10,13. Par conséquent, la multiplicité des loci intégrée est probablement associée à la pénétrance de très haute expression observée chez les fondateurs transgéniques, qui rend le nouveau modèle généré plus robustes.

Ce qui est important, lorsque vous utilisez pronucléaire injection d’ADN, visualisation des pronucléi au cours de la procédure est absolument nécessaire. Cette limitation technique empêche l’utilisation d’ovocytes fécondés provenant d’une grande variété de souches de souris. Par conséquent, la production d’un modèle transgénique dans un spécifique de la souche pour laquelle pronucléus sont invisibles exige la production d’animaux dans une souche permissive suivie d’au moins 10 rétrocroisements successifs de transférer du transgène chez la souris désiré souche. Avec les injections de vecteur lentiviral, espace périvitellin est toujours visible, et l’injection ne nécessite pas de compétences très spécifiques. À titre d’exemple, les souris transgéniques NOD/SCID qui ne conviennent pas pour injection pronucléus ont été obtenus avec le vecteur viral injections14.

Un protocole complet est présenté ici, afin de permettre la simple production de souris transgéniques à l’aide d’injections de vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin d’un embryon de scène une seule cellule. Transgene expression contrôlée soit omniprésente ou promoteurs spécifiques de la cellule est décrite en détail.

L’épine dorsale des gènes de pTrip ΔU3 a été utilisé dans cette étude de15. Ce vecteur permet de produire des vecteurs LENTIVIRAUX défectueux de réplication dans lequel la séquence U3 a été partiellement supprimée pour supprimer l’activité du promoteur U3 et générer une inactivation automatique vector (SIN)16. Les stocks de vecteur lentiviral ont été produits par transfection transitoire des cellules HEK-293 t avec le p8.91 encapsulation plasmide (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, le pHCMV-G codant pour la stomatite vésiculeuse virus (VSV) glycoprotéine-G17et le ΔU3 pTRIP vecteur recombinant. La procédure de production détaillé est fournie en tant que méthodes supplémentaires.

Production de stocks de vecteur lentiviral titre élevé est réalisée dans des conditions de biosécurité de niveau II (BSL-2). Cela est vrai pour la plupart des transgènes à l’exception des oncogènes qui doivent être produits au niveau de biosécurité 3. Par conséquent, la production dans des conditions de BSL-2 pour la plupart des cas est suffisante. En outre, l’utilisation et la production sont souvent déconnectés pour la plupart des organismes réglementaires nationales portant sur les organismes génétiquement modifiés (OGM). Une quantité limitée de réplication incompétent SIN vecteurs LENTIVIRAUX (en dessous de 2 µg de protéines de capside p24) peut être utilisée dans des conditions de BSL-1 tel que décrit par l’Office Français OGM en accord avec les recommandations de l’Union européenne.

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Protocol

Toutes les procédures qui comprennent le travail animal ont obtenu une approbation éthique et ont été autorisés par le Ministère Français de la recherche et l’éducation sous le numéro APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 et 05311.02. L’animalerie de l’ICM PHENOPARC a été accrédité par le Ministère Français de l’Agriculture sous le numéro d’agrément B75 13 19. Le protocole général doit réaliser chaque acte dans un délai précis qui est résumé dans la Figure 1.

1. animal achat et préparation de base composés

  1. Achat animaux
    1. Commandez 25 hommes vasectomisés B6CBAF1/JRj qui sont de 8 semaines d’âge (génération F1 d’original traverse entre ♀C57Bl/6JRj et ♂CBA/JRj).
      NOTE : Isoler les mâles à l’arrivée. Les hommes vasectomisés peuvent être réutilisés pendant au moins un an.
      Changer les cages toutes les 3 semaines.
    2. Commandez 50 femelles B6CBAF1/JRj que sont l’âge de 10 semaines et garder un bassin d’au moins 50 animaux.
    3. Commander 10-15 C57BL/6JRj mâles fertiles qui sont âgés de 8 semaines.
    4. Femelles de C57BL/6JRj commande de 30 qui sont âgés de 4 semaines.
  2. Anesthésie et l’euthanasie
    1. L’anesthésie est effectuée à l’aide d’un volume de 300μL mélange de kétamine/xylazine, injecté par voie intrapéritonéale (kétamine à une dose de 150μg/g de poids corporel, xylazine à une dose de 0.15μg / g de poids corporel). Animaux est placés sous le coussin pour ajuster la température du corps chauffant. Vérifier les réflexes en pinçant la queue de l’animal avant de démarrer la procédure.
    2. L’euthanasie a été effectuée par dislocation cervicale. La décapitation a été incluse comme une méthode secondaire pour confirmer la mort de l’animal. L’euthanasie des embryons a été effectuée par décapitation.
      Remarque : À l’arrivée, laissez animaux un minimum de 1 semaine à s’habituer à l’installation (aucune manipulation ou accouplement). Ce qui est important, des souches de souris, y compris les lignées transgéniques peuvent être utilisés comme fertiles mâles et des femelles fertiles pour la superovulation. Le choix de la souche il faudrait selon les exigences de la question scientifique.
  3. Préparation d’hormone
    1. Ajouter 910 µL de tampon de PSMG (enceintes Mare Serum Gonadotropin) dans 1 flacon lyophilisé de la PMSG, faire 100 µL d’extraits et conserver à-20 ° C.
      Remarque : Chaque aliquote contient 55 UI pour 11 souris. Ne jamais garder PMSG aliquotes pendant plus de 2 semaines après la première utilisation.
    2. Ajouter lyophilisé de 2730 µL de tampon de hCG (gonadotrophine chorionique humaine) dans 1 flacon de hCG. Faire 100 µL d’extraits et conserver à-20 ° C.
      Remarque : Chaque aliquote contient 55 UI pour 11 souris.
  4. Préparation de l’hyaluronidase
    1. Reconstituer 1 flacon de hyaluronidase avec 3 mL de milieu de M2 pour obtenir un 10 mg/mL de solution mère et faire 50 µL d’extraits. Puis conserver à-20 ° C.
  5. Préparation des outils de chirurgie
    1. Stériliser tous les outils de chirurgie à l’aide de l’autoclave.

2. superovulation des donateurs femelles

  1. Dans une animalerie, à l’aide de 12 h jour - cycles nuit, injecter PMSG à 14:00 jour -3. Injecter des hCG à 12 h le jour -1 et le second avec des mâles fertiles juste après l’injection d’hCG.
  2. Jour -3, ajouter 1 mL de solution de NaCl 0,9 % stérile dans 1 aliquote de 100 µL de PMSG (55 UI). Injecter 10 femelles C57BL/6JRj avec 100 µL par voie intrapéritonéale à l’aide d’une seringue sans n’importe quel volume mort.
    Remarque : Chaque souris recevra 5 UI de PMSG.
  3. Jour -1, ajouter 1 mL de solution de NaCl 0,9 % stérile en quantité de 1 100 µl d’hCG (55 UI). Injecter les souris qui ont reçu l’injection de PMSG avec 100 µL de la solution diluée de hCG (5UI) par voie intrapéritonéale. Utiliser une seringue sans n’importe quel volume mort. Effectuer l’injection lentement et attendre avant d’enlever l’aiguille pour que le liquide ne coule pas.
    Remarque : Chaque souris recevra 5 UI d’hCG. Injection de hCG doit être effectuée 46 h après PMSG.
  4. Placer chaque femelle C57BL/6JRj dans la cage du mâle stud directement après l’injection d’hCG.
  5. Vérifier vaginales bouchons dans la matinée du jour 0 et les femelles positives pour ramasser les œufs fécondés.

3. préparer les femelles Pseudopregnant B6CBAF1/jRj

  1. Accoupler un mâle vasectomisé la veille de la collecte des œufs (jour -1) avec 2 femelles B6CBAF1/JRj à 17:00.
    Remarque : Il est très important de s’accoupler avec les femelles qui sont originaires de différentes cages afin d’éviter la synchronisation des cycles féminins. Cela augmentera le rendement de l’obtention des fiches vaginales. En outre, ne pas ajouter une femelle à une mâle cage qui a été changée au cours des 2 jours. L’efficacité du comportement reproducteur chez l’homme augmente quand la cage est sale.

4. fécondés Collection

  1. Préparation
    1. Ajouter 1450 µL de M2 dans la solution mère de hyaluronidase pour préparer la solution de travail hyaluronidase.
    2. Déposer une goutte de 100 µL de solution de travail hyaluronidase par femelle permettant de produire des oeufs fécondés dans un 100 mm boîte de Pétri et conserver à température ambiante.
    3. Ajouter 500 µL de M16 en plaques de 4 puits. Utiliser 2 puits par type de vecteurs LENTIVIRAUX qui sera injectée : l’un contiendra bien les oeufs injectées et l’autre celles non injectées. Placer les 4 plaques bien dans l’incubateur à 37 ° C, avec une atmosphère de2 CO 5 %.
  2. Préparer les pipettes pour la collecte et du traitement des embryons.
    1. Adoucir les capillaires en verre hématocrite (75 mm/60 µL) en tournant le centre du tube capillaire verre dur dans la flamme.
    2. Retirer les capillaires du feu aussi rapidement que possible et tirez dessus pour obtenir un tube avec un diamètre intérieur d’environ 300 µm. Tirez sur le tube refroidi afin d’obtenir une pause soignée.
  3. Recueillir les oviductes.
    1. Euthanasier les femelles C57BL/6JRj par dislocation cervicale à 09:00 au jour 0. La mort est confirmée par la décapitation.
      Remarque : Cette méthode d’euthanasie a été approuvée par l’IACUC et suit les recommandations européennes.
    2. Réaliser une grande incision horizontale pour ouvrir la cavité abdominale avec des ciseaux. L’oviducte est situé entre l’utérus et l’ovaire.
    3. Retirer le mesometrium et la membrane transportant des vaisseaux sanguins importants avec une pince courbe.
    4. Séparer l’oviducte de l’ovaire avec une pince courbe.
    5. Utilisez pince courbée comme guide pour découper l’oviducte de l’ovaire à l’aide de ciseaux courbes.
    6. Tirez l’oviducte et taillés dans l’utérus avec des ciseaux courbes.
      ATTENTION : Ne pas toucher l’ampoule gonflée qui contient les œufs fécondés. Effectuer toute la procédure à l’aide d’instruments stériles.
    7. Placer des oviductes tous recueillis dans milieu de M2 (boîte de Petri 35 mm) à température ambiante
    8. Placer 2 oviductes dans la même chute de 100 µL de solution de travail hyaluronidase (0,3 mg/mL).
  4. Retirer les oeufs fécondés cellules du cumulus.
    1. Sous un stéréomicroscope, utiliser 2 seringues à insuline : le premier pour tenir l’oviducte et l’autre à déchirer l’ampoule et disperse les oeufs fécondés dans la solution de travail hyaluronidase.
    2. Tenir la pipette de verre préparée pour la collecte des oeufs et connectez-le à la tuyauterie et un filtre de 0,22 μm monté sur l’embout pour aspirer tous les oeufs. Recueillir tous les oeufs et les laver par passage successifs en 6 différentes gouttes de 100 µL de milieu de M2.
    3. Placez les oeufs fécondés lavés dans incubateur humidifié 37 ° C dans une atmosphère de 5 % de CO2 dans un milieu M16.

5. prise de Pipettes d’Injection

  1. Utilisez des tubes capillaires de verre à parois minces (10-15 cm de long) avec un diamètre extérieur de 1 mm et serrer ce capillaire dans l’horizontale de micropipettes.
    Remarque : En arrache plus horizontale de la pipette, 3 paramètres peuvent être ajustés : énergie thermique, en tirant la force et l’effet delay entre chauffage et en tirant. Ajuster ces paramètres pour obtenir des pipettes injection qui ressemble à celle présentée dans la Figure 2 a. Pour les utilisateurs qui effectuent régulièrement la microinjection de DNA, utilisez les paramètres standards et régler le délai entre le chauffage et en tirant pour modifier la forme globale de l’embout de la pipette.

6. faire Holding Pipettes

  1. Une pipette d’injection permet de préparer la pipette de l’exploitation.
  2. Fixer une pipette d’injection sur une microforge. Couper la pipette avec le microforge pour obtenir un bout pointu symétrique de 80 à 100 µm de diamètre. Puis polir le bout avec la chaleur sur la microforge pour obtenir une forme ronde symétrique sans haies vives.

7. préparation de la Pipette d’Injection contenant le vecteur Lentiviral

  1. Centrifuger la suspension de vecteur lentiviral à 160 x g pendant 2 min granuler débris souvent présent dans les stocks des gènes figés.
  2. Récupérer le surnageant et le transférer dans un nouveau tube de 0,5 mL dans une classe de sécurité II.
  3. Transférer 1 µL du liquide surnageant dans une pipette d’injection préparée comme décrit à l’étape 5 à l’aide d’un Micro-chargeur.
  4. Définissez la pipette d’injection sur le titulaire de l’instrument de la droit micromanipulateur. Connectez la pipette de tenue à la gauche micromanipulateur.
    NOTE : Le titre de transduction du vecteur lentiviral va être directement corrélé avec l’efficacité de la production du fondateur. Pour une efficacité élevée (> 70 %), utiliser des vecteurs viraux avec un titre dans l’ordre de 100 ng de p24 capside protéique/µL. Le titre est exprimée en unités de transduction (TU), le titre devrait être supérieur à 109 TU/mL. Les stocks de vecteur lentiviral doivent être produits par transfection transitoire des cellules 293 t avec le plasmide d’encapsidation de p8.91, pHCMV-G, codage de la stomatite vésiculeuse virus (VSV) glycoprotéine-G comme décrit dans méthodes complémentaires18.

8. la micro-injection

  1. Administrer 8 µL de milieu M2 dans le centre d’une diapositive de la dépression et la couverture avec du pétrole léger (embryon testé) pour éviter l’évaporation.
  2. Place 20 oeufs dans la baisse moins dispersés que possible.
    ATTENTION : Ne faites pas de bulles au moment du dépôt des embryons.
  3. Assurez-vous que l’embout de la pipette d’injection est ouvert. Si ce n’est pas le cas, cliquez sur la pipette d’injection avec la pipette de l’exploitation.
  4. La valeur de la microinjector pour un moment de l’injection de 20 s.
    Remarque : La viscosité de la suspension virale permet une visualisation claire de la dispersion du vecteur viral dans l’espace périvitellin. La pression d’injection doit être ajustée afin de combler tout l’espace intérieur 20 s d’injection, ce qui représente un volume de 10 à 100 pL. Pression d’injection ne doit pas dépasser 600 hPa.
  5. Aspirer un ovule fécondé qui contient 2 noyaux pro et 2 corps polaires avec la pipette de tenue sous le stéréomicroscope.
  6. Injecter le œuf avec le microinjector à l’aide de paramètres décrits en 8.4, dans l’espace périvitellin.
    ATTENTION : Ne pas toucher la membrane plasmique avec la pipette d’injection.
  7. Injecter des oeufs fécondés tous disponible en lots de 20 oeufs et placer les oeufs injectés immédiatement dans un milieu M16 préchauffé dans l’incubateur humidifié 37 ° C dans une atmosphère de 5 % de CO2.
    NOTE : Incuber les œufs injectées pendant au moins 30 min après l’injection avant transferts d’embryons.

9. transfert des embryons dans les femelles pseudo-gravides B6CBAF1/JRj

  1. Vérifiez la copulation fiche 16 h après l’accouplement B6CBAF1/JRj femelles avec des mâles de vasectomie B6CBAF1/JRj. Cela juste avant de commencer la collecte des œufs.
  2. Préparer pipettes d’implantation de l’embryon injectée.
    1. Faire des pipettes d’implantation des embryons comme décrit pour la collecte et la manipulation des embryons (étape 4.2). Sélectionnez pipettes avec un diamètre intérieur d’environ 150 µm, avec une partie étroite d’environ 4-5 cm de longueur.
      Remarque : La pointe est flamme poli, afin de réduire les dommages possibles pour les oeufs ou l’oviducte.
      1. Remplir avec du pétrole léger (embryon testé) juste au-dessus de l’épaule de la pipette.
      2. Aspirer une petite bulle, puis M2 moyen et enfin une deuxième bulle d’air.
      3. Élaborer des embryons un derrière l’autre afin de minimiser le volume total de milieu qui est injecté dans l’oviducte ainsi que les embryons.
      4. Finition en chargeant une très petite goutte d’huile de paraffine légères (embryon testé) de largeur sur un embryon.
        ATTENTION : Soyez doux tout en gérant la pipette.
  3. Transfert d’embryon.
    1. Stériliser tous les instruments.
    2. Anesthésier la femelle à l’aide d’une injection intrapéritonéale de 300 μL de solution stérile et NaCl 0,9 % 150 μg / g de poids corporel de kétamine et 0,15 μg / g de poids corporel de Xylazine.
    3. Vérifier la profondeur de l’anesthésie en pinçant la queue de l’animal avec une pince et injecter subcutaneouly 0,1 mg/kg d’analgésiques (buprénorphine) avant de démarrer la procédure.
    4. Se raser 2 cm des deux côtés de l’arrière le long de la moelle épinière au niveau de la dernière côte.
    5. Placez votre souris femelle sur un coussin chauffant et dans un champ stérile. Découper une fenêtre de 2 cm sur 2 cm au milieu du dos de la souris.
    6. Appliquer une solution antiseptique (10 % d’iodure de Povidone) sur la peau et faire une incision transversale de 1 cm avec des ciseaux, puis faites glisser la peau latéralement jusqu'à ce que l’ovaire (couleur orange) est visible à travers la paroi du corps.
    7. Faire une incision de 5 mm dans la paroi du corps juste au-dessus de l’ovaire avec les ciseaux fines au microscope binoculaire chirurgical.
    8. Ramasser les coussinets adipeux avec une pince de bouledogue atraumatique et sortir de l’ovaire, l’oviducte et le haut de l’utérus.
    9. Visualiser l’ampoule et faire une hémisection avec des ciseaux de vannas sur le segment de l’oviducte qui relie l’ovaire à l’ampoule.
    10. Introduire à la pipette de transfert embryonnaire et livrer des oeufs dans l’ampoule, s’arrêtant à la première bulle d’air dans la pipette de l’implantation.
    11. Répétez l’opération sur le deuxième oviducte.
    12. Bouchent la peau avec des clips de la plaie.
    13. Place l’animal dans la récupération de la chambre (39 ° C, 30-60 min) jusqu'à ce que tout à fait réveillé.
    14. Répéter l’injection analgésique après 12 h et 48 h en cas de signes de douleur ou de détresse.
    15. Retirez les clips de plaie 7-10 jours après la chirurgie.
    16. Vérifiez implanté les femelles pour la grossesse en suivant leur courbe de poids tous les 3 jours après l’implantation. Un gain de poids significatif peut être observé après l’implantation de 10 à 12 jours et sera indicatif pour la grossesse.
      Remarque : Tous les embryons qui vont se développer ici volonté représentent putatifs fondateurs transgéniques. Le phénotype de ces fondateurs peut être analysé à des stades de développement, ou après que la naissance selon la question scientifique liée à la génération de ces animaux transgéniques.

10. génotypage fondateurs transgéniques

  1. Préparer un tampon génotypage contenant 10 mM Tris-HCl, pH 8 ; 5 mM EDTA, pH 8.0 avec du SDS de 0,2 % (p/v), 50 mM NaCl. Stériliser le tampon de génotypage à travers une 0,22 µm et conserver à température ambiante pendant plusieurs mois.
  2. Mettre les membranes extra-embryonnaires (pour les embryons) ou petit morceau de queue (pour les animaux nés) dans 500 µL de filtré tampon de génotypage et ajouter 15 µL de protéinase K (20 mg/mL). Incuber une nuit à 55 ° C.
  3. Centrifuger le lysat à 15 000 x g pendant 5 min, puis utilisez 1 µL de surnageant de la réaction PCR. Lysate peut être conservé à 4 ° C pendant plusieurs mois.
  4. Effectuer l’amplification par PCR d’un fragment du transgène dans un volume de réaction 20 µL contenant 1 x PCR tampon, 1,5 mM MgCl2200 µM des dNTPs, 0,2 µM de chaque amorces PCR, 1 UI de Taq DNA polymérase et 1 µL de chaque échantillon digéré. Comme témoin négatif, utilisez 1 µL d’H2O. Comme témoin positif, utiliser l’ADN du plasmide vecteur lentiviral contenant le transgène.
  5. Pour la détection d’eGFP décrit l’utilisation :
    eGFP Forward Primer : 5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3'
    eGFP Reverse Primer : 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3'
  6. Effectuer l’amplification par PCR dans un thermocycleur : 4 min à 94 ° C suivie de 35 cycles de 1 min à 94 ° C, 1 min à 60 ° C et 2 min à 72 ° C.
  7. Charger le produit PCR sur un gel d’agarose de 2 % afin de visualiser un 300 bp eGFP produit PCR comme illustré dans la Figure 2 b.
    Remarque : Tous les individus présentant une bande PCR bp 300 ont intégré le transgène eGFP et peuvent être considérés comme des organismes transgéniques.
  8. Analyser l’expression du transgène chez les animaux transgéniques. Par exemple, effectuer histologiques et immuno-coloration comme illustré à la Figure 3 et Figure 4 et décrites dans les méthodes supplémentaires.
    NOTE : Les transgene expression analyse et phénotype analyse doivent être effectuées à l’aide des méthodes pertinentes selon la question scientifique mondiale.

11. quantification du nombre de copies de transgènes

  1. Préparer les échantillons d’ADN pour PCR quantitative.
    1. Extraire l’ADN génomique (ADNg) de la protéinase K lysat obtenu à l’étape de 10,3 à l’aide d’une trousse commerciale conformément aux instructions du fabricant.
    2. Quantifier l’ADNg par spectrophotométrie à 260 nm.
    3. Diluer chaque échantillon ADNg à une concentration finale de 10 ng/µL.
    4. Pour chaque échantillon, préparer 5 dilutions successives (1:5) en H2O d’obtenir 6 tubes pour les concentrations suivantes : 10 ng/µL, 2 ng/µL, 0,4 ng/µL, 0,08 ng/µL, 0,016 ng/µL et 0,0032 ng/µL
  2. Préparer le mélange de réaction quantitatif PCR (qPCR).
    1. Préparer le mélange de l’apprêt pour qPCR. Pour chaque couple d’amorces à utiliser pour qPCR, ajouter 10µl d’apprêt avant (solution d’amorce 100µm), 10 µL d’apprêt inverse (100 µM) et 80 µL d’H2O.
      Remarque : Pour amplifier eGFP, utiliser les amorces TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA Forward et Reverse TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG. CDX2 gène sert normalisateur pour le qPCR (2 copies par génome). Pour Cdx2 normalisateur utiliser les amorces GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG Forward et Reverse GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT
    2. Préparer les 2 mélanges de qPCR, un avec le mélange d’apprêt eGFP et l’autre avec mélange d’apprêt Cdx2. Préparer le mélange de qPCR suffisante pour amplifier les 6 dilutions en double de chaque ADNg. Une réaction de qPCR contient 3,8 µL d’H2O, 5 µL de fluorescent vert 2 x mélange réactionnel et 0.2 µL du mélange de l’apprêt.
      Remarque : Pour chaque animal transgénique tester, 24 réactions qPCR seront effectuées. Le mélange réactionnel est fourni pour une machine à 384 puits qPCR.
    3. Pour chaque animal tester, distribuer : 12 puits avec 9 µL du mélange de qPCR eGFP et 12 puits avec 9 µL du mélange de qPCR Cdx2. Ajouter 1 µL de chaque dilution ADNg 2 puits contenant le mélange de qPCR eGFP et 2 puits contenant le mélange de qPCR eGFP.
    4. Congé de 2 puits pour chaque qPCR mélangent dans laquelle ADNg a été remplacer par H2O comme contrôle négatif.
  3. Placer la plaque 384 puits dans la machine de qPCR et appliquer le protocole en cours d’exécution suivant : 10 min à 95 ° C puis 50 cycles de 10 s à 95 ° C et 1 min à 60 ° C.
  4. Analyser les données. Pour chaque ADNg tester, tracer les valeurs de Ct en fonction du Log du montant total ADNg (6 points en double). Ajustement de la courbe de régression linéaire par la méthode des moindres carrée et extrapoler la valeur de Ct correspondant à l’intersection avec l’axe des y. Les valeurs de Ct extrapolées pour eGFP et le Cdx2 normalisée permet de calculer le nombre de copies eGFP par rapport à Cdx2 (2 exemplaires) à l’aide de la méthode standard 2ΔdCt 11.

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Representative Results

Animaux transgéniques ont été générés en utilisant le protocole présenté ici. Représentant les résultats tant omniprésents et expression de transgene spécifiques de type de cellule sont illustrées.

Expression constitutive de transgènes

Promoteurs omniprésents sont des outils de recherche fondamentale pour exprimer des transgènes de façon soutenue et efficace. Ces promoteurs sont utilisés pour une très grande variété de la demande en vitro transfection de cellules à in vivo la transgenèse chez les animaux petits et grands.

Vecteurs LENTIVIRAUX furent construits pour exprimer le gène rapporteur fluorescent vert (eGFP) sous le contrôle du promoteur de cytomégalovirus (CMV) ou le promoteur composite que CAG issu de la fusion entre le promoteur de l’actine poulet et l’amplificateur de CMV. Les deux vecteurs LENTIVIRAUX ont été produites (méthodes supplémentaires) et le titre a été déterminé dans les cellules 293 t comme unités de transduction (TU) basées sur l’expression eGFP. Les deux constructions vecteur lentiviral ont été injectées dans l’espace périvitellin d’ovocytes fécondés à une concentration de 109 TU/mL et implantés dans les souris femelles Pseudo-enceintes. Les embryons implantés furent ensuite recueillis juste avant la naissance et génotypés par PCR à suivre eGFP intégration. 73 % (n = 22) et 83 % (n = 32) des embryons prélevés avait intégré le transgène pour le CMV et la construction des gènes de CAG, respectivement (tableau 1). Embryons transgéniques ont ensuite étaient sectionné et immuno-coloration pour eGFP. Tel qu’illustré à la Figure 3, seulement eGFP dispersées des cellules positives sont observées avec le promoteur du CMV (Figure 3, panneau supérieur) alors que toutes les cellules expriment GFP lorsqu’il est le promoteur de l’ACG a été utilisé (Figure 3, les panneaux de milieu et du bas).

Avec le promoteur de l’ACG, 96 % des embryons transgéniques recueillies exprimée partout eGFP transgène (tableau 1). Bien que les deux promoteurs sont omniprésents, seulement le promoteur de l’ACG est capable d’expression robuste entraînement du transgène dans toutes les cellules. Promoteurs omniprésents alternatifs ont été utilisés comme phosphoglycérate kinase (PGK) et promoteurs d’ubiquitine-C et a donné des résultats similaires que ceux obtenus avec le promoteur CAG avec des niveaux d’expression d’eGFP (données non présentées).

In vivo cartographie des régions génomiques régulatrices pour tester les éléments de contrôle spécifiques de tissus.

Pour un grand nombre d’applications, l’expression de transgènes d’une manière spécifique de cellules chez les animaux transgéniques est requise. En outre, la génération d’animaux transgéniques peut être largement contribue à la capacité des fragments d’ADN génomique réglementaires putatifs de contrôler l’expression spécifique de cellule d’un gène donné d’écran. À titre d’exemple, des gènes médiée par la production d’animaux transgéniques a été utilisée pour mapper exhausteurs spécifique de cellule ce contrôle 3 Neurogenin (Neurog3) expression11. Neurog3 est un facteur de transcription d’hélice-boucle-hélice (bHLH) de base qui contrôle l’engagement des progéniteurs pancréatiques vers le sort du système endocrinien. En Neurog3 des souris mutantes null, aucune cellule endocrine du pancréas ne peut différencier19. Un fragment d’ADN de 2,2 kb localisé entre les positions-5284 et-3061 par rapport à la transcription de Neurog3 site de commencer a été cloné dans un vecteur lentiviral en amont qu'un promoteur minimal de globine bêta à l’expression de la voiture d’un gène de journaliste eGFP décrite précédemment 11. une construction contrôle provenait de la même façon en clonant un fragment intergénique 2,4 kb localisé sur le chromosome 6 de la souris (chr6 : 14237279-14239685 par rapport à l’Assemblée du génome de souris mm9) dans le même squelette des gènes. Cette région génomique est localisée dans un désert de méga-base long gène 1 entre les gènes Gpr85 et Ppp1r3a . Ensuite, vecteurs LENTIVIRAUX titre élevé ont été produites en utilisant les deux constructions et nommé Neurog3- enh-eGFP et Chr6-eGFP.

Les deux vecteurs LENTIVIRAUX furent construits et produit (méthodes supplémentaires). Pas de cellules exprimant Neurog3 étant actuellement disponibles, le titre TU n’a pas pu être déterminé. Par ailleurs, le titre a été mesuré comme la concentration de la protéine de capside p24. Les 2 vecteurs ont été injectés dans l’espace périvitellin d’ovocytes fécondés et implantés chez des souris femelles enceintes Pseudo-aléatoire. Les embryons implantés ont été prélevés à jour embryonnaire 14,5 (E14.5) que ce stade de développement correspond à l’expression maximale de Neurog3 dans le pancréas. Embryons ont été ensuite génotypés pour suivre l’intégration eGFP. 84 % (n = 47) et 71 % (n = 48) des embryons collectés avaient intégré le transgène pour Neurog3- enh-eGFP et constructions des gènes Chr6-eGFP respectivement (tableau 1). Chaque embryon, le bourgeon du pancréas a été disséqué et puis sectionné pour exécuter immunostaining. 92 % des embryons transgéniques de la Neurog3- enh-eGFP exprimé eGFP dans le pancréas, comme illustré dans la Figure 4 panneau supérieur (immunomarquage représentatif). Ce qui est important, la grande majorité des eGFP positive cellules sont aussi des cellules exprimant Neurog3 (Figure 4) indiquant que le 2,2 Ko Neurog3 enhancer est en mesure de restreindre l’expression eGFP au sein de la population de cellules Neurog3 . Par opposition, aucun des embryons Chr6-eGFP exprimé eGFP (panneau inférieurFigure 4 et tableau 1) dans le pancréas ou à l’extérieur du pancréas. En outre, aucune expression ectopique d’eGFP a été observée à l’extérieur du pancréas chez les Neurog3- enh-eGFP embryons11.

Pour les 4 expériences présentées ci-dessus, une description quantitative précise de chaque étape de la procédure est présentée au tableau 1. Cela illustre l’efficacité globale de la procédure. En effet, si l'on compare le nombre d’animaux prélevés intégrer le transgène avec les œufs fécondés injectés numéros, le rendement global de la procédure est 44 % en moyenne. Le même rendement avec une injection d’ADN pronucléaire d’une construction contenant de l’amplificateur de Neurog3 fondue à la journaliste de bêta-galactosidase n’excède pas de 3,1 %.

Transduction des ovocytes fécondés avec un vecteur lentiviral mène à l’intégration de transgene qui peut se produire à plusieurs sites10,13. Le nombre relatif de transgene sites d’intégration ont été évalué à l’aide de la PCR quantitative sur l’ADN génomique (Figure 5). Quantification de l’intégration eGFP a été déterminée par la PCR quantitative (qPCR) et normalisée à Cdx2 gène qui est présent à 2 exemplaires par génome comme décrit plus haut11. Le nombre moyen de sites d’intégration a été 19.36 ± 2.468 (S.E.M.) et 9.537 ± 1,186 (S.E.M.) chez les embryons provenant des Neurog3- enh-eGFP et Chr6-eGFP construct, respectivement. Fait intéressant, les deux vecteurs LENTIVIRAUX utilisés pour produire ces animaux présentent différents titres viraux. La concentration de la protéine de capside p24 étaient de 124 ng/µL pour Neurog3- enh-eGFP vecteur et 52 ng/µl pour le contrôle de vecteur Chr6-eGFP. Il est fort probable que cette différence de titre représenteront la différence significative observée dans le nombre de site d’intégration dans les deux populations d’embryons transgéniques (Figure 5). Ceci suggère que le nombre moyen d’intégration sites obtenus dans un lot de souris transgéniques fondateur pourrait être modulé à l’aide de stocks viraux avec différents titres.

Ce qui est important, aucune corrélation directe a été observée entre l’expression d’eGFP dans Neurog3- enh-eGFP embryons transgéniques et le nombre de copies de transgènes qui ont été intégrés. En d’autres termes, les embryons qui intégrés ou plusieurs copies du transgène - enh-eGFP Neurog3ont été de même trouvées eGFP express dans Neurog3 cellules positives.

Figure 1
Figure 1 : organigramme de la procédure globale S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 2
Figure 2 : Préparation des pipettes de micro-injection et le génotypage.
(A) des schémas des pipettes de micro-injection pour mettre en évidence les principales différences entre les pipettes utilisées pour l’ADN ou les injections de vecteur lentiviral. Panneau latéral gauche: la forme globale de ces deux types de pipette est dessinée. Le cercle en pointillés met en évidence la zone élargie de la pointe de la pipette. Photos de la pointe de pipette sont également présentées. Notez que pour l’injection des gènes la pointe doit être rompu, comme il est indiqué par la ligne pointillée et l’image correspondante. Panneau de droite : exemple de réglage avec la pipette de tenue sur la gauche, l’ovule fécondé et la pipette d’injection soit en un seul pronucleus injection d’oeufs ou dans l’espace périvitellin. Barreaux de l’échelle = 50 µm. visualisation (B) sur gel d’agarose d’eGFP produit PCR amplifiés d’ADN génomique extrait de 8 différents embryons (voies 1 à 8). Seuls les embryons 1, 2, 3, 5, 6 et 8 avaient intégré le transgène eGFP. L’ADN plasmidique pTrip PGK-eGFP utilisé pour la production de vecteur lentiviral a été utilisé comme témoin positif de PCR. Pour le contrôle négatif, H2O a remplacé l’ADN dans la réaction de PCR. MWM: marqueur de poids moléculaire. BP = paires de bases. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 3
Figure 3 : Promoteurs omniprésents lecteur expression du reporter eGFP dans les embryons transgéniques.
10 µm cryo-sections d’embryons transgéniques ont été colorées pour visualiser eGFP expression (verte) et noyaux (bleus). Embryons générés avec le promoteur de CMV LENTIVIRAUX construire (étiquette supérieure gauche) ont été recueillis à E11.5. Embryons générés avec la construction des gènes du promoteur CAG (étiquette gauche bas) ont été recueillis à E18.5. PB: bourgeon pancréatique, VSC: moelle épinière ventrale, Vt: vertèbre, Li: foie, Ms : muscles de la ceinture abdominale. Barreaux de l’échelle = 50 µm s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 4
Figure 4 : Expression spécifique des cellules du gène rapporteur dans les embryons transgéniques est entraînée par l’amplificateur de Neurog3 . 10 µm cryo-sections de bourgeons pancréatiques E14.5 d’embryons transgéniques ont été colorées pour visualiser l’expression Neurog3 (rouge), eGFP (vert), des noyaux (bleus) comme décrit dans méthodes supplémentaires). Neurog3 expression est dispersée dans le pancréas. Les embryons transgéniques qui intègre la Neurog3- enh-eGFP construire eGFP express et Neurog3 la plupart des cellules positives eGFP sont positifs (panneau supérieur). Embryons générées par la construction Chr6-eGFP n’exprimaient pas eGFP (panneau inférieur). Barreaux de l’échelle = 50 µm s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Figure 5
Figure 5 : nombre de copies Relative de transgènes intégrés. Quantification des sites d’intégration eGFP par rapport au gène CDX2 tel que décrit dans la section protocole. Boîte à moustaches de 25ème au 75ème percentile. Les points représentent les différents embryons transgéniques qui ont été générés. La comparaison des sites de transgènes intégrés entre les deux constructions des gènes est sensiblement différente (t-test paramétrique non apparié, p = 0,001). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.

Table
Tableau 1 : étape par étape quantitative rapport au cours de la procédure complète. Au cours de la procédure, le nombre total de œufs ou embryons ont été dénombré. La première colonne représente le nombre total de œufs récupérés depuis les oviductes des femelles superovulation. Que des œufs avec effacer 2 corps polaires et/ou pronucléus visibles ont été injectés et sont rapportés. Après injection et quelques heures dans la culture que des oeufs injectées qui n’étaient pas lysées et avaient une morphologie normale ont été implantés. Ensuite, le nombre total d’embryons qui ont été prélevés dans les femelles pseudo-gravides est compté. Enfin, les embryons qui avaient intégré le transgène et exprimé le journaliste sont répertoriées dans les deux dernières colonnes. Les mêmes caractéristiques sont également indiquées pour comparaison avec une expérience en utilisant l’injection d’ADN pronucléus standard. Ici le transgène contenait le renforceur de Neurog3 conduite d’expression d’un gène de journaliste de bêta-galactosidase (Neurog3- enh-LacZ). S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.

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Discussion

L’injection de périvitellin de vecteurs LENTIVIRAUX dans les ovocytes fécondés décrites ici a entraîné la production d’embryons transgéniques qui ont rapporté plus de 70 % d’embryons transgéniques par rapport au nombre total d’embryons collectés. Ce résultat est conforme aux précédents rapports et illustre la spécificité de la procédure2,7,10,11,12. En comparant toutes les données présentées au tableau 1, caractéristiques importantes peuvent être mis en évidence. Tout d’abord, le nombre d’oeufs implantés correspondait à tous les œufs injectées qui avaient une morphologie normale ou n’étaient pas lysées après quelques heures dans la culture. 93 % des oeufs injectés ont été implantés en suggérant une absence presque totale de toxicité rapide en raison de l’injection d’un vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin. La situation est radicalement différente lors de l’examen d’injection de l’ADN puisque seulement 44 % des oeufs injectés ont survécu et ont été implantés. Par ailleurs, le ratio d’embryons prélevés par rapport aux oeufs implantés est identique entre les deux procédures, ce qui laisse supposer aucune toxicité à long terme exacerbée des vecteurs LENTIVIRAUX. Deuxièmement, lorsqu’elles expriment le nombre d’embryons qui a intégré le transgène par rapport au nombre d’oeufs injectés le rendement global est 10 fois plus élevé avec injection de vecteur lentiviral par rapport à l’injection de l’ADN. Une différence de 86-fold se trouve même lorsque l'on compare le nombre d’embryons exprimant le transgène entre les deux procédures en utilisant la même construction de renforceur de Neurog3.

Ce qui est important, rendement de production transgénique semble être dépendants de la titre de transduction des vecteurs LENTIVIRAUX utilisés. En d’autres termes, les vecteurs LENTIVIRAUX produites avec un titre supérieur à 109 TU/mL sont suffisants pour obtenir des rendements élevés. Comme décrit dans la section du protocole, le volume injecté dans l’espace périvitellin est de l’ordre de 10 à 100 pL. Ce volume représente 10 à 100 Particules Lentivirales actives. Par rapport aux injections d’ADN standard pronucléi , le nombre total d’animaux fondateurs généré avec la même quantité d’animaux nés est au moins 10 fois plus élevé lors de l’utilisation de vecteurs LENTIVIRAUX. En outre, la pénétrance de l’expression du transgène est extrêmement élevée avec ce protocole et a observé les deux avec omniprésent et cellule promoteurs spécifiques à l’exception du promoteur de CMV. Par opposition aux promoteurs omniprésents cellulaires, le promoteur de CMV est activement arrêté par méthylation de l’ADN20 et s’est avéré être incapable de maintenir l’expression à long terme sur la transduction de cellules souches pluripotentes21. Ceci pourrait expliquer le nombre très limité d’eGFP exprimant des cellules observées chez les embryons transgéniques. Par conséquent, vecteurs LENTIVIRAUX sont bien adaptés pour produire des animaux transgéniques, dans lequel l’expression d’un transgène est contrôlée par un exhausteur de cellules spécifiques. Ce qui est important, le protocole peut être utilisé pour dépister les enhancer activité in vivo et de trouver des sites de liaison dans les régions régulatrices11,12carte transcription. Cette approche de dépistage peine peut être effectuée qu’à l’aide de transgénèse standard. Le nombre total d’animaux fondateurs devaient tester toutes les différentes constructions et statistiquement significative exigerait des dizaines de séances d’injection alors qu’il peut être obtenu rapidement avec des gènes médiée par transgénèse.

Une des principales différences entre la procédure standard et la méthode de base des gènes réside dans l’intégration du transgène. En utilisant l’injection pronucléaire, transgènes intègrent au hasard comme plusieurs copies dans un locus unique. À l’aide de vecteurs LENTIVIRAUX, intégration peut se produire à plusieurs loci (un exemplaire par locus) sans être strictement aléatoires. En clonant les sites d’intégration à l’aide de la PCR de Mediated Amplification linéaire (LAM-PCR), le groupe de D. Trono a montré que les transgènes intègrent préférentiellement dans régions de chromatine ouverte des oeufs fécondés13. Le biais de l’intégration ne devrait pas interférer ou contribuent à l’expression de transgènes dans les souris transgéniques. Intégration au cours de la transduction des gènes dans un embryon de stade d’une cellule se produit dans la chromatine ouverte qui peut ne pas être toujours dans la configuration ouverte plus tard au cours du développement ou chez l’adulte.

En outre, lorsqu’on analyse le nombre de copies de transgènes intégrés dans les animaux de première génération (F0) ou des embryons, une grande variation dans le nombre de transgène intégré est observée. Dans cette étude, une moyenne de 19 copies intégrées a été trouvée avec la construction de Neurog3-enh-eGFP. Ce nombre de grandes copies pourrait refléter des niveaux élevés de mosaïcisme. Sauvain et coll. ont réalisé une vaste étude de loci intégrées chez les animaux de F0 généré avec la méthode de médiation des gènes décrits ici13. Ils ont suivi 70 sites d’intégration individuelle dans 11 animaux F0 et examiné les taux de transmission pour chaque site de souris transgéniques de F0 à leur progéniture F1. Le taux global de transmission de 44 % pour les individuel transgène intégré donne à penser qu’ils n’étaient plus souvent établi, soit après la phase de S des embryons d’une seule cellule ou avant la phase S au stade deux cellules. En effet, l’intégration avant la phase S transmettrait le transgène intégré pour les deux cellules filles, tandis que l’intégration après que la phase de S serait lui transmettre qu’une seule cellule fille. Ainsi, le degré de mosaïcisme pour différents transgènes intégrés est minime chez les souris transgéniques obtenues par le biais de cette technique. Plus loin, cela indique que la plupart d’intégration aura lieu au cours des 12 premières heures, correspondant à la durée moyenne de la production du premier clivage dans les conditions de culture utilisé. Cette intégration cinétique est conforme à celle décrite pour les lentivirus de cellules lymphoïdes T22.

Ce qui est important, avec un grand nombre de loci mise à nu des transgènes intégrés, établir des lignées de souris ne serait pas raisonnable. Le nombre de passages de séparer tous ces loci serait considérablement élevé. Il s’agit d’une limitation importante de cette méthode qui doit être utilisée soit pour le dépistage rapide des effets du transgène analyse simultanée de plusieurs transgènes. Néanmoins, lignées de souris encore peuvent être établies qu’en sélectionnant dans l’animal F0 ceux avec le nombre de copies plus bas intégré transgène.

Depuis la première description de la méthode injection d’ADN pronucléaire1, des améliorations ont été apportées qui contourner beaucoup des inconvénients de la procédure initiale. La première série d’améliorations a été basée sur l’intégration ciblée dans un lieu précis à l’aide d’une stratégie d’échange de cassettes. Pronucléaire injection est réalisée à l’aide soit CRE, recombinases Flip ou PhiC31 avec un fragment d’ADN intégratif flanqué de loxP, FRT ou attB sites, respectivement. Dans ce cas, l’ADN intégrative est échangé avec un fragment intégré flanqué au même recombinase site spécifique23,24. Bien que jusqu'à 60 % des animaux de première génération peuvent être transgénique23 de ces méthodes, les limitations liées à la technologie d’injection pronucléaire s’appliquent toujours. Le deuxième ensemble d’amélioration repose sur des injections cytoplasmiques des deux ADN circulaire, un transportant le fragment d’intégrer et une expression qui permet de soit le Tol225, belle au bois dormant26 ou piggyBac27 transposases. En utilisant ces méthodes, avec des rendements élevés sont obtenus (> 30 %), mais plus important encore, l’injection cytoplasmique est facile à réaliser et contourne les restrictions en raison de l’injection pronucléaire comme le protocole de base des gènes. Par ailleurs, les très grands fragments d’ADN, tels que les chromosomes artificiels bactériens, peuvent être intégrés.

Il est clair que des gènes médiée par transgénèse ne remplacera pas la norme, ni les procédures améliorées. Cette méthode représente toujours un outil puissant pour la production rapide de modèle animal et caractérisation car elle réduit considérablement le temps nécessaire pour générer un nombre adéquat d’animaux avec la variabilité génétique de moins. En outre, cette technologie peut être appliquée directement sur toutes les souches de souris, y compris les lignées transgéniques. En outre, il est essentiel de mentionner que le paysage mondial de la production de nouveaux modèles animaux est sur le point de changer avec le développement récent de la technologie CRISPR/Cas9. Aujourd'hui, pronucléaire injections de protéines Cas9 avec guide RNA permet la production du génome édité des modèles animaux avec une efficacité de 40 %,28. Cette approche pourrait largement bénéficier de l’utilisation de la transgénèse médiée par des gènes. En effet, l’utilisation de vecteurs LENTIVIRAUX non intégratifs29 d’exprimer les deux Cas9 transitoirement et de guider RNAs pourrait entraîner des rendements de production encore plus élevées. La combinaison des technologies pour produire des modèles animaux pertinents et robustes serait avantageux pour la plupart des groupes de recherche impliqués dans l’étude la pathogenèse de la maladie et des approches thérapeutiques.

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Disclosures

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêt à divulguer.

Acknowledgments

Nous remercions Magali Dumont et Rolando Meloni pour une lecture critique du manuscrit iVector et carottes ICM Phenoparc d’assistance technique dans la production vecteur lentiviral et respectivement au logement des animaux. Ce travail a été soutenu par l’Institut hospitalo-universitaire de Neurosciences Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements d’avenir ANR-10-IAIHU-06. P.R. a reçu de financement pour l’Association de Langue Française pour l’Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFÉDIAM) et un mixte FRDJ / INSERM grant.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PMSG 50UI Sigma G4527
hCG 5000UI Sigma CG5-1VL
NaCl Sigma 7982
100 mm petri dish Dutsher 353003
4 wells Nunc dish Dutsher 56469 IVF dish
M2 medium Sigma M7167
M16 medium Sigma M7292
0,22 µm Syringe filter Dutsher 146611
Hyaluronidase Enzyme 30mg Sigma H4272 mouse embryo tested
Insulin serynge VWR 613-3867 Terumo Myjector
Curved forceps Moria 2183
Curved scissors Moria MC26
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA
Borosilicate glass capillaries Harvard apparatus GC 100-10
Horizontal micropipette puller Narishige PN-30
Microforge Narishige MF-900
Inverted microscope Nikon Transferman NK2 5188 Hoffman modulation contrast illumination is required
Micromanipulator Eppendorf Celltram air
Controler of holding pipet Eppendorf Femtojet
Mineral oil Sigma M8410 mouse embryo tested
Microinjector Eppendorf Femtojet Can be used to inject DNA or viral vectors
Dumont # 5 forceps Moria MC 40
vannas micro scissors Moria 9600
Isoflurane centravet ISO005 ISO-VET 100% 250ml
ocrygel centravet OCR002
Povidone iodure centravet VET001 vetedine 120ml
Buprenorphine centravet BUP002 Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HCl Sigma T5941 Trizma hydrochloride
EDTA Sigma E9884
SDS Sigma 436143
NaCl Sigma S7653 powder
proteinase K Sigma P2308 
oneTaq kit NEB M0480L
Primers Eurogentec
Strip of 8 PCR tube 4titude 4ti-0781
96 well thermal cycler Applied Biosystems 4375786 Veriti
Genomic DNA mini kit invitrogen K1820-02
Nanodrop 2000 Thermo Scientific ND-2000C 
qPCR Master mix Roche 4887352001 SYBR Green 
Multiwell plate 384 Roche 5217555001
qPCR instrument 384 well Roche 5015243001 LightCycler 480

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References

  1. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  2. Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
  3. Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
  4. Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
  5. Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
  6. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  7. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  8. Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
  9. Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
  10. Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
  11. van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
  12. Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
  13. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
  14. Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
  15. Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
  16. Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
  17. Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
  18. Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
  19. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
  20. Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
  21. Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
  22. Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
  23. Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
  24. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  25. Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
  26. Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
  27. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  28. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
  29. Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).

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Numéro 140 vecteurs LENTIVIRAUX souris transgéniques génétique transduction des ovocytes fécondés transfert génétique intégrative injection dans l’espace périvitellin promoteurs omniprésents cellule spécifique enhancer
Production de souris transgéniques par des gènes : une méthode Simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs
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Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders. J. Vis. Exp. (140), e57609, doi:10.3791/57609 (2018).

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