Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Lentiviral medieret produktion af Transgene mus: en enkel og meget effektiv metode til direkte undersøgelse af grundlæggerne

Published: October 7, 2018 doi: 10.3791/57609
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM U1127, CNRS UMR 7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, Sorbonne Universités, 2UPMC Univ Paris 06, INSERM UMRS1166, Institute of Cardiometabolism and Nutrition, Sorbonne Universités

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at fremme transgen integration og produktion af grundlægger Transgene mus med høj effektivitet ved en simpel indsprøjtning af en lentiviral vektor i perivitelline rum af et befrugtet oocyt.

Abstract

I næsten 40 år repræsenterer pronuclear DNA injektion den standard metode til at generere Transgene mus med tilfældige integration af transgener. Sådan en rutinemæssig procedure anvendes bredt i hele verden og dens vigtigste begrænsning er bosat i den fattige effekten af transgenet integration, hvilket resulterer i et lavt udbytte af grundlægger dyr. Kun få procent af dyr født efter implantation af injicerede befrugtede oocytter har integreret transgenet. Derimod lentiviral vektorerne er kraftfulde værktøjer for Integrativ genoverførsel og deres anvendelse til transduce befrugtede oocytter giver højeffektiv produktion af grundlægger Transgene mus med en gennemsnitlige udbytte over 70%. Endvidere, enhver mus stamme kan bruges til at producere transgene dyr og penetrans af transgenet udtryk er ekstremt høje, over 80% med lentiviral medieret transgenese i forhold til DNA mikroinjektion. Størrelsen af det DNA-fragment, der kan last ved den lentiviral vektor er begrænset til 10 kb og repræsenterer den største begrænsning af denne metode. Ved hjælp af en enkel og let at udføre injektion procedure under zona pellucida af befrugtede oocytter, kan mere end 50 grundlægger dyr produceres i en enkelt session af mikroinjektion. En sådan metode er meget tilpasset til at udføre direkte i grundlægger dyr, hurtig gevinst og tab af funktion undersøgelser eller at skærmen genomisk DNA regioner for deres evne til at styre og regulere gen udtryk i vivo.

Introduction

Det banebrydende arbejde af Gordon et al. i 1980 viste, at efter implantation i pseudopregnant mus, plasmid DNA injektion i den mandlige pronuclei af befrugtede oocytter kan give produktionen af transgene dyr, som integreres i plasmid DNA1. Demonstration at transgene pattedyr kan genereres havde en enorm indflydelse på globale biovidenskab, åbner vejen for nye felter af forskning både for Grundvidenskab og translationel biomedicinske videnskaber. I de sidste fire årtier, er DNA mikroinjektion blevet en rutinemæssig praksis. Selv om et enormt antal af Transgene mus har været produceret, standard metode er ikke fuldt brugbar for alle mus stammer og kræver tidskrævende backcrosses2,3. Dets anvendelse til andre arter forbliver udfordrende4 og den samlede transgen integration udbytte er begrænset til et par procent af født dyr5. Desuden, repræsenterer effekten af transgenet integration den begrænsende faktor, der forklarer den fattige samlede udbytte af pronuclear DNA injektion. I denne henseende Integrativ virale vektorer er de mest effektive værktøjer til fragt og integrere transgener og dermed kunne give nye midler til at øge integrationen udbytte, den eneste begrænsning er, at den transgene størrelse ikke kan overstige 10 kb6 .

Lentiviral vektorer pseudo maskinskrevet med indhylle protein af vesikulær Stomatitis Virus (VSV) er pantropic og højt Integrativ gen overførsel værktøjer og kan bruges til at transduce befrugtede oocytter7. Zona pellucida omkring oocyter er en naturlig virus barriere og skal være bestået for at tillade transduktion med de lentiviral vektorer. Transgene dyr er blevet genereret af transducing befrugtede oocytter efter mikro-boring eller fjernelse af zona pellucida8,9. Indsprøjtning under zona pellucida i perivitelline rum synes imidlertid at være den enkleste metode til at transduce de befrugtede æg som oprindeligt beskrevet af Lois og kolleger7.

Perivitelline injektion af lentiviral vektorer giver høje udbytter i produktionen af transgene dyr, der er over 70% af født dyr. Sådant udbytte er over 10-fold højere end det bedste udbytte, der kan opnås ved hjælp af standard pronuclei DNA injektion7,10,11. I denne forbindelse vil en enkelt session af injektioner generere mindst 50 transgene stiftere (F0). Det store antal af grundlæggerne er derfor kompatible med fænotyper af transgenet effekten direkte udføres på F0 mus uden at skulle generere Transgene mus linjer. Denne fordel giver mulighed for hurtig screening af transgenet virkning og er specielt tilpasset til at udføre i vivo gevinst og tab af funktion undersøgelser inden for uger. Derudover kan regulerende DNA elementer også hurtigt screenes for at kortlægge smagsforstærkere og DNA motiver bundet af transskription faktorer11,12. Med pronuclear injektioner integrere transgener normalt som flere eksemplarer i en unik locus. Med lentiviral vektorer sker integration i flere loci som en enkelt kopi pr. locus10,13. Derfor er mangfoldighed af integrerede loci sandsynligvis knyttet til den meget høje udtryk penetrans observeret i transgene stifterne, hvilket gør den nye genererede model mere robust.

Vigtigere, når du bruger pronuclear injektion af DNA, er visualisering af pronuclei under proceduren, der absolut nødvendige. Denne tekniske begrænsninger forhindrer brugen af befrugtede oocytter med oprindelse fra en lang række mus stammer. Derfor, produktion af transgene model i en bestemt stamme for hvilke pronuclei er usynlige kræver produktion af dyr i en eftergivende stamme efterfulgt af mindst 10 successive backcrosses at overføre transgenet i den ønskede mus stamme. Med lentiviral vektor injektioner, perivitelline plads er altid synlig og injektion kræver ikke meget specifikke færdigheder. Som et eksempel, er NOD/SCID Transgene mus, ikke der er relevante for pronuclei injektion opnået med den virale vektor injektioner14.

Her præsenteres en omfattende protokol for at tillade simpel produktion af Transgene mus bruger lentiviral vektor injektioner i perivitelline rum i en én celle stadium embryo. Transgenets udtryk styres med enten allestedsnærværende eller celle specifikke initiativtagere er beskrevet i detaljer.

PTrip ΔU3 lentiviral rygrad var brugt i denne undersøgelse15. Denne vektor giver mulighed for at producere replikering defekte lentiviral vektorer, hvor U3 sekvensen er blevet delvist slettet for at fjerne U3 promotor aktivitet og generere en selvstændig inactivating vektor (synd)16. Lentiviral vektor bestande blev produceret af forbigående Transfektion af HEK-293T celler med p8.91 indkapsling plasmid (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G kodning vesikulær stomatitis-virus (VSV) glycoprotein-G17og pTRIP ΔU3 rekombinant vektor. Detaljerede produktionsregler fremgangsmaade som supplerende metoder.

Produktion af høj titer lentiviral vektor lagre udføres biosikkerhed niveau II betingelser (BSL-2). Dette gælder for de fleste transgener undtagen onkogener, der skal produceres i BSL-3. Derfor er produktionen i BSL-2 betingelser for de fleste tilfælde tilstrækkelig. Desuden er brug og produktion normalt afbrudt for de fleste nationale reguleringsorganer beskæftiger sig med genetisk modificerede organismer (GMO). Begrænsede mængder af replikering inkompetente synd lentiviral vektorer (under 2 µg af p24 kapsid proteiner) kan anvendes på BSL-1 betingelser som beskrevet af det franske GMO agenturet i samarbejde med EU 's henstillinger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle procedurer, der omfatter animalske arbejde har fået etiske godkendelse og er godkendt af det franske ministerium for forskning og uddannelse under nummer APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 og 05311.02. ICM Dyrefacilitet PHENOPARC er blevet akkrediteret ved den franske landbrugsministeriet under akkreditering nummer B75 13 19. Den samlede protokollen kræver udfører hver procedure inden for en præcis tidsramme, der er opsummeret i i figur 1.

1. animalsk køb og forberedelse af grundlæggende forbindelser

  1. Animalske køb
    1. Bestil 25 vasectomized hanner B6CBAF1/Johns, der er 8 ugers alder (F1 generation fra oprindelige krydser mellem ♀C57Bl/6JRj og ♂CBA/Johns).
      Bemærk: Isolere hanner ved ankomsten. Vasectomized hanner kan genbruges i mindst et år.
      Ændre bure hver 3 uge.
    2. Bestil 50 B6CBAF1/Johns hunner, der er 10 uger gammel og holde en pulje af mindst 50 dyr.
    3. Bestil 10-15 C57BL/6JRj frugtbar hanner, der er 8 uger gammel.
    4. Bestil 30 C57BL/6JRj hunner, der er 4 ugens i alder.
  2. Anæstesi og aktiv dødshjælp
    1. Anæstesi er udført ved hjælp af et volumen af 300μL ketamin/xylazin mix, injiceres intraperitoneal (ketamin i en dosis på 150μg/g kropsvægt, xylazin i en dosis på 0.15μg / g kropsvægt). Dyr er placeret under varme pad for at regulere kropstemperaturen. Kontrollere reflekser ved at klemme halen af dyret før proceduren.
    2. Dødshjælp blev udført af cervikal dislokation. Halshugning blev inkluderet som en sekundær metode til at bekræfte død af dyret. Eutanasi af embryoner blev udført ved halshugning.
      Bemærk: Ved ankomsten, Tillad dyr mindst 1 uge til habituate til faciliteten (ingen håndtering eller parring). Vigtigere, kan enhver mus stammer herunder transgene linjer udnyttes som frugtbare mænd og fertile kvinder for superovulation. Valget af stamme bør træffes af kravene i det videnskabelige spørgsmål.
  3. Hormon forberedelse
    1. Tilføje 910 µL PSMG (gravide Mare Serum Gonadotropin) buffer ind 1 frysetørrede PMSG hætteglas og gøre 100 µL delprøver opbevares ved-20 ° C.
      Bemærk: Hver delprøve indeholder 55 UI for 11 mus. Aldrig holde PMSG delprøver i mere end 2 uger efter den første brug.
    2. Tilføje 2730 µL af hCG (humant choriongonadotropin) buffer ind 1 frysetørret hCG hætteglas. Gøre 100 µL delprøver, og opbevares ved-20 ° C.
      Bemærk: Hver delprøve indeholder 55 UI for 11 mus.
  4. Hyaluronidase forberedelse
    1. Rekonstituer 1 hætteglas af hyaluronidase med 3 mL af M2 Medium til at opnå en 10 mg/mL stamopløsning og gøre 50 µL delprøver. Derefter opbevares ved-20 ° C.
  5. Kirurgi værktøjer forberedelse
    1. Sterilisere alle kirurgi værktøjer ved hjælp af autoklave.

2. superovulation kvindelige donorers

  1. I en dyr facilitet bruger 12t dag - nat cyklus, injicere PMSG kl 2 dag -3. Injicere hCG kl 12 om dagen -1 og makker med frugtbar hanner lige efter hCG injektion.
  2. På dag -3, tilsættes 1 mL steril 0,9% NaCl opløsning i 1 alikvot af 100 µL af PMSG (55 UI). Injicér 10 C57BL/6JRj hunner med 100 µL intraperitoneal ved hjælp af en sprøjte uden nogen dødvolumen.
    Bemærk: Hver mus vil modtage 5 UI af PMSG.
  3. På dag -1, tilsættes 1 mL steril 0,9% NaCl opløsning i 1 alikvot af 100 µL af hCG (55 UI). Injicere de mus, der modtog PMSG injektion med 100 µL fortyndede hCG løsning (5UI) intraperitoneal. Bruge en sprøjte uden nogen dødvolumen. Udføre injektionen langsomt og vente med at fjerne nålen, således at væsken ikke lække.
    Bemærk: Hver mus vil modtage 5 UI af hCG. Injektion af hCG bør udføres 46 h efter PMSG.
  4. Placer hver C57BL/6JRj kvinde i bur af stud mandlige direkte efter hCG injektion.
  5. Kontrollere vaginal stik om morgenen den dag 0 og bruge positivt hunnerne til at indsamle befrugtede æg.

3. Forbered B6CBAF1/Johns Pseudopregnant hunner

  1. Parre en vasectomized mand dagen før ægudtagningen (dag -1) med 2 B6CBAF1/Johns hunnerne 5 kl.
    Bemærk: Det er meget vigtigt at makker med kvinder, der stammer fra forskellige bure at undgå synkronisering af kvindelige cyklusser. Dette vil øge udbyttet af at opnå vaginal stik. Derudover føje ikke en kvinde til en mandlig bur, der er ændret inden for de sidste 2 dage. Effekten af reproduktive adfærd i mandlige øges, når buret er snavset.

4. befrugtede æg samling

  1. Forberedelse
    1. Tilføje 1450 µL af M2 til hyaluronidase stamopløsning at forberede hyaluronidase brugsopløsning.
    2. Anbring en dråbe af 100 µL af hyaluronidase brugsopløsning pr. kvinde bruges til at fremstille befrugtede æg i en 100 mm petriskål og holde ved stuetemperatur.
    3. Tilsættes 500 µL af M16 i 4 brønde plader. Bruge 2 brønde pr. type af lentiviral vektorer, der vil blive injiceret: en godt vil indeholde de injicerede æg og den anden ikke-indsprøjtning dem. Placer de 4 godt plader i varmeskab ved 37 ° C med en 5% CO2 atmosfære.
  2. Forberede pipetter til indsamling og håndtering af embryoner.
    1. Blødgøre glas hæmatokrit kapillærer (75 mm/60 µL) ved at dreje centrum af hårdt glas kapillær slangen i flammen.
    2. Fjerne kapillærer fra varmen så hurtigt som muligt og trække til at opnå et rør med en indvendig diameter på omkring 300 µm. trække på den afkølede slanger til at opnå en pæn pause.
  3. Indsamle æggelederne.
    1. Aflive C57BL/6JRj hunner af cervikal dislokation kl 9 på dag 0. Død er blevet bekræftet ved halshugning.
      Bemærk: Denne eutanasi metode blev godkendt af IACUC og følger europæiske anbefalinger.
    2. Udføre en stor vandret snit for at åbne bughulen med saks. Ovidukten er placeret mellem livmoderen og æggestokkene.
    3. Fjerne mesometrium og membranen transporterer fremtrædende blodkar med buet pincet.
    4. Adskille ovidukten fra æggestokken med buet pincet.
    5. Brug buet pincet som en guide til at skære oviduct fra æggestokken bruger buet saks.
    6. Træk ovidukten og klip fra livmoderen med buet saks.
      Forsigtig: Rør ikke den hævede ampulla, der indeholder de befrugtede æg. Udføre hele proceduren ved hjælp af sterile instrumenter.
    7. Placere alle indsamlede æggelederne i M2 medium (35 mm kultur parabol) ved stuetemperatur
    8. Placer 2 æggelederne i den samme 100 µL dråbe hyaluronidase brugsopløsning (0,3 mg/mL).
  4. Fjerne cumulus celler fra befrugtede æg.
    1. Under et stereomikroskop, bruge 2 insulin sprøjter: den først sig hen til holde ovidukten og den anden til at rive op ampulla og sprede befrugtet æg i brugsopløsning hyaluronidase.
    2. Tage rede glas med pipette overfoeres til opsamling af æg og Tilslut den til slangen og et 0,22 μm filter monteret på mundstykket til Aspirér alle æg. Indsamle alle æg og vaske dem af successive passage i 6 forskellige dråber af 100 µL af M2 medium.
    3. Placere vaskede befrugtede æg i fugtig 37 ° C kuvøse med en atmosfære med 5% CO2 i M16 medium.

5. gør injektion pipetter

  1. Bruge tyndvæggede glas kapillær slanger (10-15 cm lang) med en udvendig diameter på 1 mm og klemme denne kapillær i vandrette mikropipette puller.
    Bemærk: I de fleste horisontale pipette aftrækkere, 3 parametre kan justeres: varme strøm, trække styrke og gang forsinkelse mellem varme og trække. Justere disse parametre for at få indsprøjtning pipets, der ligner en præsenteret i figur 2A. For brugere, der rutinemæssigt udfører DNA mikroinjektion, bruge de standard indstillinger og justere forsinkelsen mellem varme og trække for at ændre den globale form af pipette tip.

6. at gøre bedrift pipetter

  1. Bruge en indsprøjtning pipette til at forberede bedrift pipette.
  2. Vedhæfte en indsprøjtning pipette til en microforge. Skære pipette med microforge at opnå en skarp symmetrisk spids på 80-100 µm i diameter. Derefter polsk tip med varme på microforge at få en symmetrisk runde form uden skarpe hække.

7. forberedelse af injektion Pipette indeholdende Lentiviral vektor

  1. Der centrifugeres lentiviral vektor suspension ved 160 x g i 2 min at sammenpresse vragdele ofte til stede i frosne lentiviral bestande.
  2. Genskab supernatanten og overføre det ind i en ny 0,5 mL rør i en klasse II sikkerhed kabinet.
  3. Overføre 1 µL af supernatanten til en injektion pipette forberedt som beskrevet i trin 5 ved hjælp af en mikro-loader.
  4. Indstille injektion pipette på instrument indehaveren af den rigtige micromanipulator. Tilslut bedrift med pipette overfoeres til den venstre micromanipulator.
    Bemærk: Transduktion titer af vektoren, lentiviral vil være direkte korreleret med effekten af grundlægger produktion. For høj effektivitet (> 70%), bruge virale vektorer med en titer i rækken af 100 ng af p24 kapsid proteiner/µL. Når titer udtrykkes som transduktion enheder (TU), titer skal være over 109 TU/mL. Lentiviral vektor bestande skal være produceret af forbigående Transfektion af 293T celler med p8.91 encapsidation plasmid, pHCMV-G, kodning vesikulær stomatitis-virus (VSV) glycoprotein-G som beskrevet i supplerende metoder18.

8. mikroinjektion

  1. Dispensere 8 µL af M2 medium i midten af en depression dias og dække med lys paraffinolie (embryoner testet) at undgå fordampning.
  2. Sted 20 æg i drop da det mindste spredt som muligt.
    Forsigtig: Må ikke lave bobler ved deponeringen af embryoner.
  3. Sørg for at spidsen af injektion pipette er åben. Hvis ikke, tryk på injektion pipette med bedriften pipette.
  4. Sæt microinjector injektion tid 20 s.
    Bemærk: Viskositet af viral suspensionen giver klart visualisering af spredningen af den virale vektor i perivitelline rummet. Indsprøjtning pres burde justeres for at fylde hele rummet inden for 20 s af injektion, som repræsenterer en volumen på 10 til 100 pL. Indsprøjtning pres bør ikke overstige 600 hPa.
  5. Opsug et befrugtet æg, der indeholder 2 pro kerner og 2 polar organer med bedriften pipette under stereomikroskopet.
  6. Injicere ægget med microinjector ved hjælp af indstillingerne beskrevet i punkt 8.4, i perivitelline rum.
    Forsigtig: Rør ikke plasma membranen med indsprøjtning pipette.
  7. Injicere alle befrugtede æg i partier på 20 æg og placere injiceres æggene umiddelbart i forvarmet M16 medium i befugtet 37 ° C kuvøse med en atmosfære med 5% CO2.
    Bemærk: Inkuber de injicerede æg i mindst 30 min efter injektion før embryo overførsler.

9. overførsel af embryoner i B6CBAF1/Johns Pseudopregnant hunner

  1. Kontrollere samleje plug 16 h efter parring B6CBAF1/Johns hunner med B6CBAF1/Johns vasektomi hanner. Gør dette lige før ægudtagningen.
  2. Forberede den injicerede embryo implantation pipetter.
    1. Gøre implantation pipetter for embryoner som beskrevet for indsamling og håndtering af embryoner (trin 4.2). Vælg pipetter med en indre diameter på omkring 150 µm med en smal del omkring 4-5 cm i længden.
      Bemærk: Spidsen skal være flamme poleret, for at mindske eventuelle skader til æggene eller ovidukten.
      1. Fyldes med lette paraffinolie (embryoner testet) lige over pipette skulder.
      2. Opsug en lille luftboble, så M2 medium, og endelig en anden luftboble.
      3. Udarbejde embryoner én bag hinanden for at minimere det samlede volumen af medium, der vil blive injiceret i oviduct sammen med embryoner.
      4. Afslut ved at indlæse en meget lille dråbe af lys paraffinolie (embryoner testet) af omkring ét embryon bredde.
        Forsigtig: Være blid mens håndtering af pipette.
  3. Ægoplægning.
    1. Sterilisere alle instrumenter.
    2. Bedøver den kvindelige ved hjælp af en intraperitoneal injektion af 300 μl sterilt NaCl 0,9% opløsning indeholdende 150 μg pr. g kropsvægt af ketamin og 0,15 μg pr. g kropsvægt af xylazin.
    3. Kontroller dybden af anæstesi ved at klemme halen af dyret med pincet og injicere subcutaneouly 0,1 mg/kg af smertestillende (buprenorphin) før proceduren.
    4. Barbere 2 cm på begge sider af bagsiden langs rygmarven på niveau med den sidste ribben.
    5. Sted den kvindelige mus på en varmepude og i et sterilt felt. Skåret en 2 cm x 2 cm vindue i midten af musen ryggen.
    6. Anvende en antiseptisk opløsning (10% povidon Iodid) på huden og gøre en 1 cm tværgående snit med en saks, så skub huden sideværts indtil æggestok (orange farve) er synlige gennem kroppen væggen.
    7. Gøre en 5 mm snit ind i kroppen væggen lige over æggestokken med den fine saks under en kikkert kirurgisk mikroskop.
    8. Afhente den fedt pad med en atraumatisk bulldog klemme og trække ud af æggestokken, ovidukten og toppen af livmoderen.
    9. Visualisere ampulla og gøre en hemisection med markriyor saks i oviduct segment, der forbinder æggestokken til ampulla.
    10. Indføre overførsel embryo pipette og levere æg i ampulla, stopper ved den første luftboble i implantation pipette.
    11. Gentag fremgangsmåden på det andet oviduct.
    12. Lukke huden med såret klip.
    13. Sted dyret i inddrivelse kammer (39 ° C, 30-60 min) indtil helt vågen.
    14. Gentag smertestillende injektion efter 12 h og 48 h i tilfælde af tegn på smerte eller lidelse.
    15. Fjern sår klip 7-10 dage efter operationen.
    16. Tjek implanterede hunnerne for graviditet ved at følge deres vægt kurve hver 3 dage efter implantation. En betydelige vægtstigning kan observeres 10 til 12 dage efter implantation og vil være vejledende for graviditet.
      Bemærk: Alle embryoner, der vil udvikle her vil repræsentere formodede transgene grundlæggerne. Fænotypen af disse grundlæggerne kan analyseres på alle udviklingsstadier, eller efter foedslen ifoelge de videnskabelige spørgsmål knyttet til generation af disse transgene dyr.

10. genotypebestemmelse transgene grundlæggerne

  1. Forberede genotypebestemmelse buffer indeholdende 10 mM Tris-HCl, pH 8; 5 mM EDTA, pH 8,0 med 0,2% SDS (w/v), 50 mM NaCl. Sterilisere genotypebestemmelse buffer gennem et 0,22 µm filter og opbevares ved stuetemperatur i flere måneder.
  2. Put extraembryonic membraner (for embryoner) eller lille stykke af halen (for født dyr) til 500 µL af filtreret genotypebestemmelse buffer og tilføje 15 µL af proteinase K (20 mg/mL). Der inkuberes natten over ved 55 ° C.
  3. Der centrifugeres i lysate på 15.000 x g i 5 min og derefter bruge 1 µL af supernatanten til PCR reaktionen. Lysate kan opbevares ved 4 ° C i flere måneder.
  4. Udføre PCR-amplifikation af et fragment af transgenet i en 20 µL reaktion volumen indeholdende 1 x PCR buffer, 1,5 mM MgCl2, 200 µM dNTP'er, 0,2 µM hver PCR primere, 1 UI af Taq DNA polymerase og 1 µL af hver prøve, fordøjet. Som en negativ kontrol bruge 1 µL af H2O. Som en positiv kontrol bruge DNA fra lentiviral vektor plasmid som indeholder transgenet.
  5. Brug til påvisning af eGFP beskrevet:
    eGFP fremad Primer: 5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3'
    eGFP vende Primer: 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3'
  6. Udføre PCR-amplifikation i en thermocycler: 4 min på 94 ° C efterfulgt af 35 cykler for 1 min på 94 ° C, 1 min. ved 60 ° C, og 2 min på 72 ° C.
  7. Indlæse PCR produkt på en 2%-agarosegel for at visualisere en 300 bp eGFP PCR produkt som illustreret i figur 2B.
    Bemærk: Alle personer viser en 300 bp PCR band har integreret eGFP transgenet og kan betragtes som transgenics.
  8. Analysere transgen udtryk i transgene dyr. For eksempel udfører histologiske og immunfarvning som illustreret i figur 3 og figur 4 og beskrevet i supplerende metoder.
    Bemærk: Begge transgen udtryk analyse og fænotype analyse bør udføres ved hjælp af relevante metoder ifølge den globale videnskabelige spørgsmål.

11. kvantificering af transgenet kopi nummer

  1. Forberede kvantitativ PCR DNA-prøver.
    1. Uddrag genomisk DNA (gDNA) fra Proteinase K lysate fremstillet i trin 10.3 ved hjælp af en kommerciel kit ifølge producentens anvisninger.
    2. Kvantificere gDNA ved spektrofotometri på 260 nm.
    3. Fortynd hver gDNA prøve til en 10 ng/µL endelige koncentration.
    4. For hver prøve, forberede 5 serielle fortyndinger (1:5) i H2O at få 6 rør på følgende koncentrationer: 10 ng/µL, 2 ng/µL, 0,4 ng/µL, 0,08 ng/µL, 0,016 ng/µL og 0.0032 ng/µL
  2. Forberede kvantitativ PCR (qPCR) reaktion mix.
    1. Forberede qPCR primer mix. For hver primer par til brug for qPCR, tilsæt 10 µL af fremad primer (100 µM primer stamopløsning), 10 µL af reverse primer (100 µM) og 80 µL af H2O.
      Bemærk: For at forstærke eGFP, bruge frem TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA og Reverse TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG primere. Cdx2 gen er brugt som normalizer for qPCR (2 kopier pr. genom). For Cdx2 bruger normalizer frem GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG og Reverse GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT primere
    2. Forberede 2 qPCR blander, en med eGFP primer blandes og en med Cdx2 primer mix. Forberede tilstrækkelige qPCR blanding til at forstærke de 6 fortyndinger i dubletter af hver gDNA. Én qPCR reaktion indeholder 3,8 µL af H2O, 5 µL af fluorescerende grøn 2 x mastermix og 0,2 µL af primer mix.
      Bemærk: For hvert transgene dyr til at teste, 24 qPCR reaktioner vil blive udført. Reaktionen mix er fastsat en 384 godt qPCR maskine.
    3. For hvert dyr at teste, distribuere: 12 brønde med 9 µL af eGFP qPCR mix og 12 brønde med 9 µL af Cdx2 qPCR mix. Tilføje 1 µL af hver gDNA fortynding til 2 brønde indeholdende eGFP qPCR mix og 2 brønde indeholdende eGFP qPCR mix.
    4. Efterlad 2 brønde for hver qPCR blandes i hvilke gDNA blev erstatter af H2O som negativ kontrol.
  3. 384 godt pladen anbringes i qPCR maskine og anvende følgende løbende protokol: 10 min. ved 95 ° C derefter 50 cykler 10 s ved 95 ° C og 1 min. ved 60 ° C.
  4. Analysere data. For hver gDNA at teste, skal du afbilde Ct værdier som funktion af Log af samlede gDNA beløb (6 point i dubletter). Passer den kurve ved hjælp af lineær regression med de mindste kvadraters metode og ekstrapolere Ct værdi svarende til skæringspunktet med y-aksen. Bruge ekstrapoleret Ct værdierne for eGFP og den normaliserede Cdx2 til at beregne eGFP kopi nummeret i forhold til Cdx2 (2 kopier) ved hjælp af standard 2ΔdCt metode11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transgene dyr blev genereret ved hjælp af den protokol, der præsenteres her. Repræsentant resultater både allestedsnærværende og celle type specifikke transgen udtryk er illustreret.

Konstituerende udtryk af transgener

Allestedsnærværende initiativtagere er grundlæggende forskningsværktøjer til at udtrykke transgener i en vedvarende og effektiv måde. Sådanne initiativtagere bruges til et meget stort udvalg af ansøgning fra in vitro- celle Transfektion til i vivo transgenese i små og store dyr.

Lentiviral vektorer blev bygget for at udtrykke det grønne fluorescerende reporter gen (eGFP) under kontrol af enten cytomegalovirus (CMV) promotor eller komposit initiativtageren CAG baseret på fusion af kylling actin promotor og CMV enhancer. Begge lentiviral vektorer var produceret (supplerende metoder) og titer blev fastsat i 293T celler som transduktion enheder (TU) baseret på eGFP udtryk. Begge lentiviral vektor konstruktioner blev injiceret i perivitelline rum af befrugtede oocytter ved en koncentration på 109 TU/mL og implanteret i pseudo gravid hunmus. Implanteret embryoner blev næste indsamlet lige før fødslen og genotypebestemmes ved PCR til at følge eGFP integration. 73% (n = 22) og 83% (n = 32) af indsamlet embryoner havde integreret transgenet for CMV og CAG lentiviral konstruktion, henholdsvis (tabel 1). Transgene embryoner blev derefter sektioneret og immuno-farvet for eGFP. Som illustreret i figur 3, kun spredte eGFP positive celler overholdes med CMV promoter (figur 3, toppanelet), der henviser til, at alle celler udtrykt normal god landbrugspraksis, når CAG promotor blev brugt (figur 3, midten og bunden paneler).

Med CAG promotor udtrykt 96% af indsamlede transgene embryoner allestedsnærværende eGFP transgenet (tabel 1). Selv om begge initiativtagere er allestedsnærværende, kan kun CAG selskabet drev robust udtryk af transgenet i alle celler. Alternative allestedsnærværende initiativtagere blev brugt som fosfoglycerat kinase (PGK) og ubiquitin-C initiativtagere og givet lignende resultater som dem, der opnås med CAG promotor med lavere udtryk niveauer af eGFP (data ikke vist).

In vivo kortlægning af regulerende genomisk regioner at teste væv specifikke betjeningselementer.

For et stort antal ansøgninger er udtrykket af transgener i en celle specifik måde i transgene dyr påkrævet. Derudover kan generation af transgene dyr være stærkt medvirkende til at screene formodede regulerende genomisk DNA fragmenter evne til at styre celle specifikt udtryk for et givent gen. Som et eksempel, blev lentiviral medieret produktion af transgene dyr brugt til at knytte celle specifikke smagsforstærkere der styrer Neurogenin 3 (Neurog3) udtryk11. Neurog3 er en basis Helix-Loop-Helix (bHLH) transkriptionsfaktor, der styrer forpligtelsen af pancreas stamfaderen mod de hormonforstyrrende skæbne. I Neurog3 null mutant-mus, kan ingen endokrine celler i bugspytkirtlen differentiere19. En 2,2 kb DNA fragment lokaliseret mellem holdninger,-5284 og-3061 i forhold til Neurog3 transskription start webstedet blev klonet i en lentiviral vektor opstrøms en beta globin minimal initiativtageren til drev udtryk for en eGFP reporter gen som tidligere beskrevet 11. en kontrol konstruktion blev ligeledes genereret af kloning en 2,4 kb intergenic fragment lokaliseret på musen kromosom 6 (chr6: 14237279-14239685 i forhold til mm9 mus genom forsamling) i den samme lentiviral rygrad. Denne genomisk region er lokaliseret inden for en 1 mega-base lang gen ørken mellem Gpr85 og Ppp1r3a gener. Høj titer lentiviral vektorer var næste fremstillet ved hjælp af både konstruktioner og navngivet Neurog3- enh-eGFP og Chr6-eGFP.

Begge lentiviral vektorer blev konstrueret og produceret (supplerende metoder). Da ingen celler, der udtrykker Neurog3 var i øjeblikket tilgængelige, kunne TU titer ikke bestemmes. Alternativt, titer blev målt som koncentrationen af p24 kapsid proteiner. De 2 vektorer var indsprøjtes i perivitelline rummet af befrugtede oocytter og implanteret i pseudo gravid hunmus. Implanteret embryoner blev indsamlet på embryonale dag 14.5 (E14.5) som denne udviklingsstadiet svarer til den maksimale udtryk for Neurog3 i bugspytkirtlen. Embryoner blev næste genotypebestemmes at følge eGFP integration. 84% (n = 47) og 71% (n = 48) af indsamlet embryoner havde integreret transgen til Neurog3- enh-eGFP og Chr6-eGFP lentiviral konstruktioner henholdsvis (tabel 1). Hvert embryon, var i bugspytkirtlen opløbet dissekeret og derefter i snit for at udføre immunfarvning. 92% af Neurog3- enh-eGFP transgene embryoner udtrykt eGFP i bugspytkirtlen som illustreret i figur 4 toppanelet (repræsentative immunfarvning). Vigtigere, er langt størstedelen af eGFP positive celler blev også Neurog3 udtrykker celler (figur 4) angiver, at 2,2 kb Neurog3 forstærker stand til at begrænse eGFP udtryk i Neurog3 celle population. Af oppositionen udtrykte ingen af embryonerne, Chr6-eGFP eGFP (figur 4 nederste panel og tabel 1) i bugspytkirtlen eller uden for bugspytkirtlen. Derudover blev ingen Ektopisk udtryk for eGFP observeret uden for bugspytkirtlen i Neurog3- enh-eGFP embryoner11.

For de 4 eksperimenter præsenteret ovenfor, er en præcis kvantitativ beskrivelse af hvert trin af proceduren præsenteret i tabel 1. Dette illustrerer den globale effekt af proceduren. Faktisk, når man sammenligner antallet af indsamlede dyr, som integreret transgenet med nummer injiceres befrugtede æg, den globale udbytte af proceduren er 44% i gennemsnit. Det samme udbytte med en pronuclear DNA injektion af en konstruktion, der indeholder Neurog3 forstærker smeltet til beta-galactosidase reporter overstiger ikke 3,1%.

Transduktion af befrugtede oocytter med en lentiviral vektor fører til transgen integration, der kan opstå på flere sites10,13. Det relative antal af transgenet integration websteder blev evalueret ved hjælp af kvantitativ PCR på genomisk DNA (figur 5). Kvantificering af eGFP integrering var bestemt af kvantitativ PCR (qPCR) og normaliserede Cdx2 gen, der er til stede i 2 eksemplarer pr. genom som tidligere beskrevet11. Det gennemsnitlige antal integration sites var 19.36 ± 2.468 (S.E.M.) og 9.537 ± 1.186 (S.E.M.) i embryoner genereret fra Neurog3- enh-eGFP og Chr6-eGFP konstruktion, henholdsvis. Interessant, præsenteret de to lentiviral vektorer bruges til at producere disse dyr forskellige viral titers. Koncentrationen af p24 kapsid proteiner var 124 ng/µL til Neurog3- enh-eGFP vektor og 52 ng/µL for kontrolelementet Chr6-eGFP vektor. Det er mest sandsynligt, at sådanne titer forskel vil tage hensyn til den betydelige forskel observeret i integration site numre i begge befolkning af transgene embryoner (figur 5). Dette tyder på, at det gennemsnitlige antal integration websteder er fremstillet i en batch af grundlægger Transgene mus kan moduleres ved hjælp af viral bestande med forskellige titers.

Vigtigere, blev ingen direkte sammenhæng observeret mellem udtryk for eGFP i Neurog3- enh-eGFP transgene embryoner og antallet af transgenet kopier, der var integreret. Embryoner, integreret enten enkelt eller flere kopier af Neurog3- enh-eGFP transgenet fandtes altså på samme måde at udtrykke eGFP i Neurog3 positive celler.

Figure 1
Figur 1: Flow diagram af den samlede procedure Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Forberedelse af mikro injektion pipetter og genotypebestemmelse.
(A) skematiske tegninger af mikroinjektion pipetter til at fremhæve væsentlige forskelle mellem pipets anvendes til DNA eller lentiviral vektor injektioner. Venstre panel: den overordnede form af begge pipette typer er trukket. Den stiplede cirkel fremhæver det udvidede område af afpipetteres tip. Billeder af pipette tips er også præsenteret. Bemærk at lentiviral injektionsvæske spidsen skal brydes, som angivet med den stiplede linje og det tilsvarende billede. Højre panel: eksempel af æg injektion indstilling med bedrift med pipette overfoeres til venstre, befrugtede æg og injektion afpipetteres enten i en pronucleus eller i perivitelline rum. Skalere barer = 50 µm. (B) visualisering på agarosegel eGFP PCR produkt amplificeret fra genomisk DNA ekstraheret fra 8 forskellige embryoner (lane 1 til 8). Kun embryoner 1, 2, 3, 5, 6 og 8 havde integreret eGFP transgenet. DNA plasmid pTrip PGK-eGFP anvendes til lentiviral vektor produktion blev brugt som PCR positiv kontrol. For den negative kontrol erstattet H2O DNA i PCR reaktionen. MWM: molekylvægt markør. BP = basepar. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Allestedsnærværende initiativtagere drive udtryk af eGFP reporter i transgene embryoner.
10 µm cryo-sektioner af transgene embryoner blev farvet for at visualisere eGFP udtryk (grøn) og kerner (blå). Embryoner genereret med CMV promotor lentiviral konstruere (top venstre etiket) blev indsamlet på E11.5. Embryoner genereret med CAG promotor lentiviral konstruktion (nederste venstre etiket) blev indsamlet på E18.5. PB: pancreas bud, VSC: ventrale rygmarven, Vt: ryghvirvel, Li: leveren, Ms: muskel af abdominale bælte. Skalere barer = 50 µm venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: Celle specifikt udtryk for reporter genet i transgene embryoner er drevet af Neurog3 enhancer. 10 µm cryo-dele af E14.5 i bugspytkirtlen knopper af transgene embryoner blev farvet for at visualisere udtryk for Neurog3 (rød), eGFP (grøn) og kerner (blå) som beskrevet i supplerende metoder). Neurog3 udtryk er spredt i bugspytkirtlen. Transgene embryoner, som integreret Neurog3- enh-eGFP konstruere udtrykkelige eGFP og de fleste af eGFP positive celler er Neurog3 positiv (toppanelet). Embryoner genereret med Chr6-eGFP-konstruktionen ikke udtryk for eGFP (nederste panel). Skalere barer = 50 µm venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: Relative kopier række integrerede transgener. Kvantificering af eGFP integrering sites i forhold til CDX2-gen som beskrevet i protokollen afsnit. Box plot fra 25th til 75th percentil. Prikker repræsenterer de forskellige transgene embryoner, der blev genereret. Sammenligning af transgener integreret steder mellem de to lentiviral konstruktioner er signifikant forskellig (uparret parametrisk t-test, p = 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Table
Tabel 1: trin for trin kvantitative rapport under den fuldstændige procedure. I løbet af proceduren, blev det samlede antal æg eller embryoner talt. Den første kolonne repræsenterer det samlede antal æg, der blev hentet fra æggelederne af superovulated hunner. Kun æg med klare 2 polar organer og/eller synlige pronuclei blev injiceret og rapporteres. Efter injektion, og et par timer i kultur blev kun de injicerede æg, der ikke var mængden og havde en normal morfologi implanteret. Næste, tælles antallet af embryoner, som blev indsamlet fra de pseudopregnant hunner. Endelig er embryoner, der havde integreret transgenet og udtrykt reporter angivet i de sidste to kolonner. De samme funktioner er også givet for sammenligning med et eksperiment ved hjælp af standard pronuclei DNA injektion. Her indeholdt transgenet Neurog3 forstærker kørsel udtryk for en beta-galactosidase reporter gen (Neurog3- enh-LacZ). Venligst klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Perivitelline injektion af lentiviral vektorer i befrugtede oocytter beskrevet her resulterede i produktionen af transgene embryoner, der gav mere end 70% af transgene embryoner i forhold til samlede antal indsamlet embryoner. Dette resultat er i overensstemmelse med tidligere betænkninger og eksemplificerer specificiteten af procedure2,7,10,11,12. Når man sammenligner alle oplysningerne i tabel 1, kan vigtige elementer fremhæves. Først, antallet af æg, indopererede svarede til alle injiceres æg, der havde en normal morfologi eller var ikke mængden efter få timer i kultur. 93% af injicerede æg blev implanteret tyder på en næsten komplet fravær af hurtige toksicitet som følge af injektion af lentiviral vektor i perivitelline rummet. Situationen er dramatisk anderledes, når man overvejer DNA injektion, da kun 44% af injicerede æg havde overlevet og blev implanteret. Desuden er forholdet mellem indsamlet embryoner i forhold til implanterede æg identiske mellem de to procedurer, foreslår ingen forværret langtidstoksicitetstest lentiviral vektorer. For det andet, når udtryk for antallet af embryoner, integreret transgenet i forhold til antallet af injicerede æg globale udbyttet er mere end 10 gange højere med lentiviral vektor injektion i forhold til DNA injektion. Der konstateres endnu en 86-fold forskel, når man sammenligner antallet af embryoner udtrykker transgen mellem de to procedurer ved hjælp af den samme Neurog3 forstærker konstruktion.

Vigtigere, synes transgene produktion udbytte at være afhængige af transduktion titer af de anvendte lentiviral vektorer. Med andre ord, lentiviral vektorer produceret med en titer over 109 TU/mL er tilstrækkelig til at opnå sådanne højt udbytte. Som beskrevet i afsnittet protokol, den injicerede volumen i perivitelline rum er i rækken af 10 til 100 pL. Dette volumen vil repræsentere 10 til 100 aktive lentiviral partikler. I forhold til standard pronuclei DNA injektioner er det samlede antal grundlægger dyr genereret med den samme mængde født dyr mindst 10-fold højere, når du bruger lentiviral vektorer. Derudover udtryk penetrans af transgenet er ekstremt høj med denne protokol og blev observeret både med allestedsnærværende og celle specifikke initiativtagere med undtagelse af CMV promotor. Af modstand mod cellulære allestedsnærværende initiativtagere, CMV promotor lukkes aktivt af DNA methylering20 og har vist sig at være i stand til at opretholde langsigtet udtryk ved transduktion i pluripotente stamceller21. Dette kunne forklare det meget begrænsede antal eGFP udtrykker celler observeret i de transgene embryoner. Derfor er lentiviral vektorerne godt tilpasset til at producere transgene dyr som udtryk for en transgen styres af en celle specifikke forstærker. Vigtigere, kan at protokollen bruges til at screene for enhancer aktivitet i vivo og finde kort transskription faktor bindingssteder inden for regulerede områder11,12. Denne screening tilgang kan næppe udføres ved hjælp af standard transgenese. Det samlede antal grundlægger dyr skulle afprøve alle de forskellige konstruktioner og nå Statistisk signifikans ville kræve snesevis af injektion sessioner, der henviser til, at det kan opnås hurtigt med lentiviral medieret transgenese.

En af de vigtigste forskelle mellem den normale procedure og den lentiviral baserede metode er bosat i transgene integration. Bruger pronuclear injektion, integrere transgener tilfældigt som flere kopier i en unik locus. Bruger lentiviral vektorer, kan integration forekomme på flere loci (én kopi pr. locus) uden at være strengt tilfældig. Ved kloning integration websteder ved hjælp af lineær forstærkning medieret PCR (LAM-PCR), har gruppen af D. Trono vist at transgener integrere fortrinsvis i åbne kromatin regioner af befrugtede æg13. Integration bias bør ikke påvirke eller bidrage til Transgenets ekspression i Transgene mus. Integration under lentiviral transduktion i en én celle stadium embryo forekommer i åbne kromatin, der ikke muligvis er stadig i den åbne konfiguration senere under udvikling eller i voksen.

Desuden, når du analyserer kopi numre af integrerede transgener i første generation dyr (F0) eller embryoner, er en stor variation i antallet af integrerede transgen observeret. I denne undersøgelse, et gennemsnit på 19 integreret kopier blev fundet med Neurog3-enh-eGFP konstruktion. Denne store eksemplarnummer kunne afspejle høje niveauer af mosaicisme. Sauvain et al. har udført en omfattende undersøgelse af integrerede loci i F0 dyr genereret med lentiviral-medieret metoden beskrevet her13. De fulgte 70 individuelle integration steder i 11 F0 dyr og undersøgt priser for fremsendelse af hvert websted fra F0 Transgene mus til deres F1-afkom. Den samlede hastighed for overførsel af 44% for individuelle integreret transgen tyder på, at de oftest blev etableret enten efter S fase af én celle embryoner eller før S fase på to-celle stadium. Faktisk ville integration inden S fase overføre den integrerede transgen til begge datterceller, mens integration efter S fase ville sende det til kun én datter celle. Således er graden af mosaicisme for individuelle integreret transgener minimal i Transgene mus opnået gennem denne teknik. Dette viser yderligere, at de fleste integration vil ske inden for de første 12 timer svarende til den gennemsnitlige tid for produktionen af den første kavalergang i de anvendte dyrkningsbetingelserne. Denne integration kinetic er i overensstemmelse med det, der er beskrevet for lentiviruses i T-lymfoide celler22.

Vigtigere, med et stort antal loci blottelse integreret transgener, oprettelse af mus linjer ville ikke være rimeligt. Antallet af afgange til adskille alle disse loci ville være betydeligt høj. Dette repræsenterer en vigtig begrænsning af denne metode, der skal bruges til hurtig screening af transgene virkninger eller til simultan analyse af flere transgener. Mus linjer kan dog stadig etableres ved at vælge fra F0 dyret dem med laveste integreret transgen kopi nummer.

Siden den første beskrivelse af pronuclear DNA injektion metode1, er foretaget forbedringer at omgå mange af ulemperne ved den indledende procedure. Det første sæt af forbedringer var baseret på den målrettede integration i en præcis locus ved hjælp af en kassette exchange strategi. Pronuclear injektion udføres ved hjælp af enten CRE, Flip eller PhiC31 recombinases sammen med en integrativ DNA-fragment flankeret med loxP, FRT eller attB steder, henholdsvis. I denne situation, er den integrative DNA udveksles med en integreret fragment flankeret med samme recombinase bestemt websted23,24. Selv om op til 60% af første generation dyr kan være transgene23 ved hjælp af denne metode, gælder begrænsninger knyttet til teknologi af pronuclear injektion stadig. Det andet sæt af forbedring er baseret på cytoplasmatisk injektioner af to cirkulære DNA, man bærer fragment at integrere og ét giver udtryk af enten Tol225, Tornerose26 eller piggyBac27 transposases. Ved hjælp af disse metoder, høje udbytter er opnået (> 30%), men endnu vigtigere, den cytoplasmatisk injektion er let at udføre og omgår restriktioner på grund af pronuclear injektion som en lentiviral baseret protokol. Desuden kan meget store DNA fragmenter, såsom bakteriel kunstige kromosomer, integreres.

Det er klart, at lentiviral medieret transgenese ikke vil erstatte standarden eller de forbedrede procedurer. Denne metode repræsenterer fortsat et stærkt værktøj til hurtig dyremodel produktion og karakterisering som det betydeligt reducerer den krævede tid til at generere korrekt antal dyr med den mindste genetisk variation. Desuden, denne teknologi kan anvendes direkte på alle mus stammer herunder transgene linjer. Derudover er det vigtigt at nævne, at det globale landskab i generation af roman dyremodeller er ved at ændre sig med den seneste udvikling af CRISPR/Cas9-teknologi. I dag, pronuclear injektioner af Cas9 protein sammen med guide RNA giver mulighed for fremstilling af genom redigeret dyremodeller med en effektivitet på 40%28. Denne tilgang kan i høj grad drage fordel af brugen af lentiviral medieret transgenese. Faktisk kunne brug af ikke-Integrativ lentiviral vektorer29 forbigående udtrykke både Cas9 og guide RNA'er resultere i endnu større produktionsudbytte. Kombinationen af de nyeste teknologier til at producere relevante og robust dyremodeller ville gavne mest internationale forskergrupper involveret i at studere sygdom patogenese og terapeutiske tilgange.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har nogen interessekonflikt at videregive.

Acknowledgments

Vi takker Magali Dumont og Rolando Meloni for kritisk læsning af håndskriftet, iVector og Phenoparc ICM kerner til teknisk bistand i lentiviral vektor produktion og dyr bolig henholdsvis. Dette arbejde blev støttet af Institut Hospitalo-Universitaire de neurovidenskab Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. P.R. modtaget støtte til foreningen de Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) og en fælles JDRF / INSERM give.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PMSG 50UI Sigma G4527
hCG 5000UI Sigma CG5-1VL
NaCl Sigma 7982
100 mm petri dish Dutsher 353003
4 wells Nunc dish Dutsher 56469 IVF dish
M2 medium Sigma M7167
M16 medium Sigma M7292
0,22 µm Syringe filter Dutsher 146611
Hyaluronidase Enzyme 30mg Sigma H4272 mouse embryo tested
Insulin serynge VWR 613-3867 Terumo Myjector
Curved forceps Moria 2183
Curved scissors Moria MC26
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA
Borosilicate glass capillaries Harvard apparatus GC 100-10
Horizontal micropipette puller Narishige PN-30
Microforge Narishige MF-900
Inverted microscope Nikon Transferman NK2 5188 Hoffman modulation contrast illumination is required
Micromanipulator Eppendorf Celltram air
Controler of holding pipet Eppendorf Femtojet
Mineral oil Sigma M8410 mouse embryo tested
Microinjector Eppendorf Femtojet Can be used to inject DNA or viral vectors
Dumont # 5 forceps Moria MC 40
vannas micro scissors Moria 9600
Isoflurane centravet ISO005 ISO-VET 100% 250ml
ocrygel centravet OCR002
Povidone iodure centravet VET001 vetedine 120ml
Buprenorphine centravet BUP002 Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HCl Sigma T5941 Trizma hydrochloride
EDTA Sigma E9884
SDS Sigma 436143
NaCl Sigma S7653 powder
proteinase K Sigma P2308 
oneTaq kit NEB M0480L
Primers Eurogentec
Strip of 8 PCR tube 4titude 4ti-0781
96 well thermal cycler Applied Biosystems 4375786 Veriti
Genomic DNA mini kit invitrogen K1820-02
Nanodrop 2000 Thermo Scientific ND-2000C 
qPCR Master mix Roche 4887352001 SYBR Green 
Multiwell plate 384 Roche 5217555001
qPCR instrument 384 well Roche 5015243001 LightCycler 480

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  2. Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
  3. Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
  4. Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
  5. Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
  6. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  7. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  8. Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
  9. Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
  10. Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
  11. van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
  12. Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
  13. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
  14. Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
  15. Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
  16. Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
  17. Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
  18. Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
  19. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
  20. Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
  21. Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
  22. Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
  23. Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
  24. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  25. Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
  26. Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
  27. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  28. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
  29. Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).

Tags

Genetik spørgsmål 140 Lentiviral vektorer Transgene mus transduktion af befrugtede oocytter overførsel af Integrativ gener injektion i perivitelline plads allestedsnærværende initiativtagere celle specifikke enhancer
Lentiviral medieret produktion af Transgene mus: en enkel og meget effektiv metode til direkte undersøgelse af grundlæggerne
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., … More

Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders. J. Vis. Exp. (140), e57609, doi:10.3791/57609 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter