Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Genetics
Click here for the English version

Genetics

Lentiviral medieras produktion av transgena möss: en enkel och mycket effektiv metod för direkta studier av grundarna

Published: October 7, 2018 doi: 10.3791/57609
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM U1127, CNRS UMR 7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, Sorbonne Universités, 2UPMC Univ Paris 06, INSERM UMRS1166, Institute of Cardiometabolism and Nutrition, Sorbonne Universités

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för att främja transgenens integration och produktion av grundaren transgena möss med hög effekt genom en enkel injektion av en lentiviral vektor i det perivitelline utrymmet i en befruktade äggcellen.

Abstract

För nästan 40 år representerar pronukleär DNA injektion standarden metod att generera transgena möss med slumpmässiga integration av transgener. Ett sådant rutinmässigt förfarande används allmänt i hela världen och dess huvudsakliga begränsning bosatt i fattiga effekten av transgenens integration, vilket resulterar i en låg avkastning av grundaren djur. Endast några procent av djur födda efter implantation av injicerade befruktade oocyter har integrerat transgenens. Däremot lentiviral vektorer är kraftfulla verktyg för integrativ genöverföring och deras användning till transduce befruktade oocyter tillåter mycket effektiv produktion av grundaren transgena möss med en genomsnittlig avkastning över 70%. Dessutom någon mus stam kan användas för att producera transgena djur och penetrans av transgenens uttryck är extremt hög, över 80% med lentiviral medierad genmodifiering jämfört DNA Mikroskop. Storleken på den DNA-fragment som kan vara last av lentiviral vektorn är begränsad till 10 kb och representerar den största begränsningen av denna metod. Använda en enkel och lätt att utföra injektionsproceduren under den zona pellucida befruktade oocyter, kan mer än 50 grundare djur produceras i en enda session av Mikroskop. En sådan metod är mycket anpassade till utföra, direkt i grundare djur, snabb vinst och förlust av funktion studier eller till skärmen genomisk DNA-regioner för sin förmåga att styra och reglera gen uttryck i vivo.

Introduction

Det banbrytande arbetet av Gordon et al. 1980 visade att efter implantation i pseudopregnant möss, en plasmid DNA injektion i den manliga pronuclei befruktade oocyter kan ge produktion av transgena djur som integrerade de plasmid DNA1. Demonstrationen att transgena däggdjur kan genereras hade en enorm inverkan på global life science, öppnar vägen till nya fält av forskning både för grundläggande vetenskaper och translationell biomedicinsk vetenskap. I de senaste fyra årtiondena blivit DNA Mikroskop en rutinmässig praxis. Trots ett enormt antal transgena möss har producerats, standardmetoden är inte fullt användbara för alla mus stammar och kräver tidskrävande backcrosses2,3. Dess tillämpning på andra arter förblir utmanande4 och övergripande transgenens integration avkastningen är begränsad till några procent av födda djur5. Dessutom representerar effekten av transgenens integration den begränsande faktorn som förklarar dålig totala avkastningen av pronukleär DNA injektion. I detta avseende integrativ virala vektorer är de mest effektiva verktygen till last och integrera transgener och därmed kunde ge nya sätt att avsevärt öka integrationen avkastning, den enda begränsningen är att transgenens storlek inte får överstiga 10 kb6 .

Lentiviral vektorer pseudo skrivit med omsluta proteinet av vesikulär stomatit Virus (VSV) är pantropic och mycket integrativ gen transfer verktyg och kan användas för att transduce befruktade oocyter7. Den zona pellucida kring oocyterna är en naturlig virus barriär och måste vidarebefordras för att tillåta transduktion med lentiviral vektorer. Transgena djur har genererats av transducing befruktade oocyter efter mikro-borrning eller borttagning av zona pellucida8,9. Injektion under de zona pellucida i perivitelline utrymmet tycks dock vara det enklaste sättet att transduce de befruktade äggen som inledningsvis beskrivs av Lois och kollegor7.

Perivitelline injektion av lentiviral vektorer tillåter hög avkastning i produktionen av transgena djur som är över 70% av födda djur. Sådan avkastning är över 10 gånger högre än den bästa avkastningen som kan uppnås med hjälp av standard pronuclei DNA injektion7,10,11. I detta sammanhang kommer att en enda session injektioner generera minst 50 transgena grundarna (F0). Det stora antalet grundarna är därför kompatibla med fenotypning av transgenens effekten direkt utförs på F0 möss utan att behöva generera transgena möss rader. Denna fördel kan för snabb screening av transgenens effekten och är speciellt anpassade att utföra i vivo vinst och förlust av funktion studier inom veckor. Dessutom kan regulatoriska DNA-element också snabbt kontrolleras för att mappa smakförstärkare och DNA motiv bunden av transkription faktorer11,12. Med pronukleär injektioner integrera transgener oftast multipla kopior i en unik locus. Med lentiviral vektorer sker integration i flera loci som ett enda exemplar per locus10,13. Multiplicityen av integrerade loci är därför sannolikt associerade till de mycket höga uttryck penetrans hos transgena grundarna, vilket gör den nya genererade modellen mer robust.

Ännu viktigare, när du använder pronukleär injektion av DNA, krävs visualisering av pronuclei under förfarandet absolut. Denna tekniska begränsning förhindrar användningen av befruktade oocyter med ursprung från en stor mängd mus stammar. Därför produktionen av transgena modell i en specifik stam för vilka pronuclei är osynliga kräver produktion av djur i en tillåtande stam följt av minst 10 på varandra följande backcrosses att överföra transgenens i önskad musen stam. Med lentiviral vector injektionerna, perivitelline utrymme är alltid synliga och injektionen kräver inte mycket specifika färdigheter. Exempel har nicka/SCID transgena möss som inte är lämpliga för pronuclei injektion erhållits med viral vektor injektioner14.

Här presenteras ett omfattande protokoll för att tillåta enkel produktion av transgena möss med lentiviral vector injektioner i perivitelline rymden av ett embryo med en cell i scenen. Transgenens uttryck kontrolleras med antingen allestädes närvarande eller cell specifika initiativtagare beskrivs i detalj.

PTrip ΔU3 lentiviral ryggraden användes i denna studie15. Denna vektor kan producera replikering defekta lentiviral vektorer där sekvensen U3 delvis har raderats för att ta bort U3 arrangören aktivitet och generera en egen inactivating vektor (SIN)16. Lentiviral vector bestånd producerades av övergående transfection HEK-293T celler med p8.91 inkapsling plasmid (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G kodning av vesikulär stomatit virus (VSV) glykoprotein-G17, och den pTRIP ΔU3 rekombinant vektor. Förfarandet för detaljerad produktion tillhandahålls som kompletterande metoder.

Produktionen av hög titer lentiviral vector lager utförs på biosäkerhet nivå II villkor (BSL-2). Detta är sant för de flesta transgener utom onkogener som måste produceras i BSL-3. Produktion i BSL-2 villkor i de flesta fall är därför tillräcklig. Dessutom, kopplas användning och produktion oftast för de flesta nationella tillsynsmyndigheter som arbetar med genetiskt modifierade organismer (GMO). Begränsade mängder av replikering inkompetenta synd lentiviral vektorer (under 2 µg p24 kapsid protein) kan användas under BSL-1 förhållanden som beskrivs av byråns franska GMO i samförstånd med Europeiska unionens rekommendationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alla rutiner som omfattar animaliska arbete erhållit etiskt godkännande och har godkänts av det franska ministeriet för forskning och utbildning under nummer APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 och 05311.02. ICM djuranläggningen PHENOPARC har ackrediterats av franska ministeriet för jordbruk under ackreditering nummer B75 13 19. Övergripande protokollet kräver utför varje förfarande inom en exakt tidsram som sammanfattas i Figur1.

1. animaliskt inköp och förberedelse av grundläggande föreningar

  1. Djur köp
    1. Beställa 25 vasektomerade män B6CBAF1/JRj som är 8 veckor (F1-generationen från ursprungliga korsar mellan ♀C57Bl/6JRj och ♂CBA/JRj).
      Obs: Isolera hanar vid ankomsten. Vasektomerade hanar kan återanvändas för minst ett år.
      Ändra burarna var tredje vecka.
    2. Beställ 50 B6CBAF1/JRj hondjur som är 10 veckor gammal och hålla en pool av minst 50 djur.
    3. Beställ 10-15 C57BL/6JRj fertila hanar som är 8 veckor.
    4. Beställ 30 C57BL/6JRj honor som är 4 veckors ålder.
  2. Anestesi och dödshjälp
    1. Narkos utförs med en volym av 300μL ketamin/xylazin mix, injiceras intraperitonealt (ketamin i en dos av 150μg/g kroppsvikt, xylazin vid en dos på 0.15μg / g kroppsvikt). Djur placeras under värmedyna för att justera kroppstemperaturen. Kontrollera reflexer genom att nypa svansen djuret före start förfarandet.
    2. Eutanasi utfördes av cervikal dislokation. Halshuggning ingick som en sekundär metod för att bekräfta djuret. Avlivning av embryon utfördes genom halshuggning.
      Obs: Vid ankomsten, Tillåt djur minst 1 vecka till habituerar till anläggningen (ingen hantering eller parning). Viktigast av allt, kan någon mus stammar inklusive transgena linjerna utnyttjas som fertila hanar och fertila honor för superovulation. Valet av stam bör göras enligt kraven i de vetenskapliga ifrågasätter.
  3. Hormon förberedelse
    1. Tillsätt 910 µL av PSMG (gravid Mare Serum Gonadotropin) buffert i 1 frystorkade PMSG injektionsflaska, gör 100 µL portioner och förvaras vid-20 ° C.
      Obs: Varje alikvot innehåller 55 UI för 11 möss. Aldrig hålla PMSG alikvoter för mer än 2 veckor efter den första användningen.
    2. Lägg till 2730 µL av hCG (humant koriongonadotropin) bufferten till 1 frystorkade hCG injektionsflaska. Gör 100 µL portioner och förvaras vid-20 ° C.
      Obs: Varje alikvot innehåller 55 UI för 11 möss.
  4. Hyaluronidas förberedelse
    1. Bered 1 injektionsflaska av hyaluronidas med 3 mL M2 Medium att få en 10 mg/mL stamlösning och göra 50 µL portioner. Och sedan förvaras vid-20 ° C.
  5. Kirurgi verktyg förberedelse
    1. Sterilisera alla kirurgi verktyg använder autoklav.

2. superovulation kvinnlig givare

  1. I en djuranläggningen med 12 h dag - natt cykler, injicera PMSG på 2 PM på dag -3. Injicera hCG vid 12 på dagen -1 och kompis med fertila hanar bara efter hCG-injektionen.
  2. Dag -3, tillsätt 1 mL steril 0,9% NaCl-lösning till 1 alikvot av 100 µL av PMSG (55 UI). Injicera 10 C57BL/6JRj honor 100 µL intraperitonealt med en spruta utan någon död volym.
    Obs: Varje mus får 5 UI av PMSG.
  3. Dag -1, tillsätt 1 mL steril 0,9% NaCl-lösning till 1 alikvot av 100 µL av hCG (55 UI). Injicera möss som fått PMSG injektion med 100 µL utspädda hCG lösning (5UI) intraperitonealt. Använd en spruta utan någon död volym. Utför injektionen långsamt och vänta innan du tar bort nålen så att vätskan inte läcker.
    Obs: Varje mus får 5 UI av hCG. Injektion av hCG bör utföras 46 h efter PMSG.
  4. Placera varje C57BL/6JRj kvinna i buren av stud hanen direkt efter hCG-injektionen.
  5. Kontrollera vaginal pluggar på morgonen den dag 0 och Använd positiva honorna för att samla befruktade ägg.

3. Förbered B6CBAF1/jRj Pseudopregnant honorna

  1. Mate en vasektomerade hane dagen före insamling av ägg (dag -1) med 2 B6CBAF1/JRj honor vid 5 PM.
    Obs: Det är mycket viktigt att mate med honor som har sitt ursprung från olika burar att undvika synkronisering av kvinnliga cykler. Detta kommer att öka avkastningen av att få vaginal pluggar. Dessutom lägger inte till en kvinna i en manlig bur som har ändrats under de senaste 2 dagarna. Effekten av reproduktiva beteende i manlign ökas när buren är smutsig.

4. befruktade ägg insamling

  1. Beredning
    1. Lägga till 1450 µL av M2 hyaluronidas stamlösning att förbereda hyaluronidas arbetslösning.
    2. Placera en droppe 100 µL av hyaluronidas fungerande lösning per hona som används för att producera befruktade ägg i en 100 mm petriskål och förvara i rumstemperatur.
    3. Tillsätt 500 µL av M16 i 4 brunnar plattor. Använda 2 brunnar per typ av lentiviral vektorer som injiceras: en väl kommer att innehålla de injicerade ägg och den andra de icke-insprutning. Placera de 4 plattorna i inkubatorn vid 37 ° C med en 5% CO2 atmosfär.
  2. Förbereda pipetter för insamling och hantering av embryon.
    1. Mjuka glas hematokrit kapillärerna (75 mm/60 µL) genom att vrida mitten av hårt glas kapillär slangen i lågan.
    2. Ta bort kapillärerna från värmen så snart som möjligt och dra för att få ett rör med en inre diameter av ungefär 300 µm. Pull på kyls slangen att få en ordentlig paus.
  3. Samla in oviducts.
    1. Euthanize C57BL/6JRj honor av cervikal dislokation kl 9.00 på dag 0. Död bekräftas genom halshuggning.
      Obs: Denna dödshjälp metod godkändes av IACUC och följer Europeiska rekommendationer.
    2. Utföra en stor horisontella snitt öppna bukhålan med sax. I äggledaren ligger mellan livmodern och äggstockarna.
    3. Ta bort mesometrium och membranet transporterar framstående blodkärl med böjd pincett.
    4. Separat i äggledaren från äggstocken med böjd pincett.
    5. Använda böjda pincetten som en guide för att skära i äggledaren från äggstocken med böjd sax.
    6. Dra i äggledaren och klipp från livmodern med böjd sax.
      Varning: Vid inte den svullna ampulla som innehåller de befruktade äggen. Utföra hela proceduren med hjälp av sterila instrument.
    7. Placera alla insamlade oviducts i M2 medium (35 mm kultur maträtt) vid rumstemperatur
    8. Placera 2 oviducts i samma 100 µL drop hyaluronidas arbetslösning (0,3 mg/mL).
  4. Ta bort cumulus celler från befruktade ägg.
    1. Under ett stereomikroskop, använda 2 insulinsprutor: den första att hålla i äggledaren och den andra en att riva upp ampulla och skingra befruktade ägg till hyaluronidas arbetslösning.
    2. Ta beredda glas Pipettera för att samla ägg och Anslut den till slangen och 0,22 μm filter monterade på munstycket till aspirera alla ägg. Samla alla ägg och tvätta dem genom successiva passage in i 6 olika droppar 100 µL av M2 medium.
    3. Placera tvättade befruktade ägg i befuktade 37 ° C inkubator med en atmosfär av 5% CO2 i M16 medium.

5. göra injektion pipetter

  1. Använd tunna glas kapillär slangar (10-15 cm lång) med en yttre diameter av 1 mm och klämma Detta kapillär i horisontella mikropipett avdragare.
    Obs: I den horisontella pipett avdragare, 3 parametrar kan justeras: värme effekt, dra styrka och tid fördröjning mellan värme och dra. Justera dessa parametrar för att få injicera pipetter som liknar den som presenteras i figur 2A. För användare som rutinmässigt utför DNA Mikroskop, använder standard inställningar och justera fördröjningen mellan värme och dra om du vill ändra den globala formen av pipettspetsen.

6. att göra anläggningen pipetter

  1. Använda en injicera pipetten för att förbereda anläggningen pipetten.
  2. Bifoga en injicera pipett till en microforge. Skär pipetten med microforge att få en skarp symmetrisk tip av 80 till 100 µm diameter. Då polska spetsen med värme på microforge att erhålla en symmetrisk rund form utan skarpa häckar.

7. förberedelse av injektionen pipett som innehåller Lentiviral Vector

  1. Centrifugera lentiviral vector suspensionen vid 160 x g i 2 min till pellet ofta skräp i frysta lentiviral bestånd.
  2. Återställa supernatanten och överför det till en ny 0,5 mL tub i en klass II säkerhetsskåp.
  3. Överföra 1 µL av supernatanten till en injektion pipett bereds enligt anvisningarna i steg 5 med en mikro-loader.
  4. Ange injektion pipetten på instrumentet innehavaren av den högra micromanipulator. Anslut den anläggning Pipettera till den vänstra micromanipulator.
    Obs: Transduktion antikroppnivåns på lentiviral vektorn kommer att vara direkt korrelerade med effekten av grundaren produktion. För hög effekt (> 70%), använda virala vektorer med en titer i intervallet 100 ng av p24 kapsid protein/µL. Titern är uttryckta transduktion enheter (TU), titern bör vara över 109 TU/mL. Lentiviral vector bestånd måste produceras av övergående transfection av 293T celler med p8.91 encapsidation plasmiden, pHCMV-G, kodning i vesikulär stomatit virus (VSV) glykoprotein-G som beskrivs i kompletterande metoder18.

8. micro-injektion

  1. Dispensera 8 µL M2 medium i mitten av en depression bild och täck med ljus paraffinolja (embryo testats) att undvika avdunstning.
  2. Placera 20 ägg i rullgardinsmenyn som minst spridda som möjligt.
    Varning: Gör inte bubblor vid insättning embryon.
  3. Se till att spetsen på pipetten injektion är öppen. Om inte, tryck injektion pipetten med innehav pipetten.
  4. Ange microinjector för en injektion tid 20 s.
    Obs: Viskositeten av viral fjädringen tillåter tydlig visualisering av spridningen av den virala vektorn i perivitelline utrymme. Injekteringstryck bör anpassas för att fylla hela utrymmet inom 20 s av injektion, vilket motsvarar en volym av 10 till 100 pL. Injekteringstryck bör inte överstiga 600 hPa.
  5. Aspirera ett befruktat ägg som innehåller 2 pro kärnor och 2 polar organ med innehav pipetten under stereomikroskopet.
  6. Injicera ägget med den microinjector som använder inställningarna som beskrivs i 8.4, i det perivitelline utrymmet.
    Varning: Vid inte plasmamembranet med injektion Pipettera.
  7. Injicera alla befruktade ägg tillgängliga i partier på 20 ägg och placera injicerade äggen omedelbart i förvärmda M16 medium i inkubatorn befuktade 37 ° C med en atmosfär av 5% CO2.
    Obs: Ruva injicerade äggen i minst 30 min efter injektion före embryo transfereringar.

9. överföra embryon till B6CBAF1/JRj Pseudopregnant honor

  1. Kontrollera att kopulera plug 16 h efter parning B6CBAF1/JRj honor med B6CBAF1/JRj vasektomi hanar. Gör detta precis innan start i insamling av ägg.
  2. Förbereda den injicerade embryon implantation pipetter.
    1. Gör implantation pipetter för embryon som beskrivs för insamling och hantering av embryon (steg 4.2). Välj pipetter med en innerdiameter på ca 150 µm med en smal del runt 4-5 cm i längd.
      Obs: Spetsen bör vara lågan polerad, för att minska eventuella skador till ägg eller i äggledaren.
      1. Fyll med ljus paraffinolja (embryo testats) strax ovanför pipett axeln.
      2. Aspirera en liten luftbubbla, sedan M2 medium, och slutligen en andra luftbubbla.
      3. Upprätta embryon en bakom varandra för att minimera den totala volymen av medium som kommer att injiceras i äggledaren tillsammans med embryon.
      4. Avsluta med att fylla en mycket liten droppe ljus paraffinolja (embryo testats) om ett embryo bredd.
        Försiktighet: Vara varsam vid hantering av pipetten.
  3. Embryotransfer.
    1. Sterilisera alla instrument.
    2. Söva honan använder en intraperitoneal injektion av 300 μL av steril NaCl 0,9% lösning innehållande 150 μg per gram kroppsvikt av ketamin och 0,15 μg per gram kroppsvikt xylazin.
    3. Kontrollera djup anestesi genom att nypa svansen av djuret med pincett och injicera subcutaneouly 0,1 mg/kg av smärtstillande (buprenorfin) före start förfarandet.
    4. Raka 2 cm på båda sidor av ryggen längs ryggmärgen på nivån av revbenet.
    5. Placera kvinnliga musen på en värmedyna och i ett sterilt fält. Skär ett 2 x 2 cm fönster i mitten av musen baksidan.
    6. Applicera en antiseptisk lösning (10% povidon jodid) på huden och gör en 1 cm tvärgående snitt med sax, och dra sedan huden sidled tills äggstocken (orange färg) är synlig genom kroppen väggen.
    7. Gör en 5 mm snitt in i kroppen väggen strax ovanför äggstockarna med fina saxen i kikare kirurgiska Mikroskop.
    8. Plocka upp fettet pad med en atraumatiska bulldog klämma och dra ut äggstockarna, i äggledaren och upp i livmodern.
    9. Visualisera ampulla och gör en hemisection med Vännäs sax i äggledaren segment som länkar äggstocken till ampulla.
    10. Införa överföring embryo pipetten och leverera ägg till de ampulla, stannar vid första luftbubblan i implantation pipetten.
    11. Upprepa proceduren på den andra äggledaren.
    12. Närbild av huden med såret klipp.
    13. Plats djuret i återhämtningen kammare (39 ° C, 30-60 min) tills fullt vaken.
    14. Upprepa smärtstillande injektion efter 12 h och 48 h vid tecken på smärta eller ångest.
    15. Ta bort såret klipp 7-10 dagar efter operationen.
    16. Kontrollera implanterade Honor för graviditet genom att följa deras vikt kurva varje 3 dagar efter implantationen. En signifikant viktökning kan observeras 10 till 12 dagar efter implantation och kommer att vara vägledande för graviditet.
      Obs: Alla embryon som kommer att utvecklas här kommer representera förmodad transgena grundarna. Fenotypen av dessa grundare kan analyseras i alla utvecklingsstadier eller efter födelsen enligt de vetenskapliga ifrågasätter kopplade till generation av dessa transgena djur.

10. genotypning transgena grundarna

  1. Förbereda genotypning buffert innehållande 10 mM Tris-HCl, pH 8. 5 mM EDTA, pH 8,0 med 0,2% SDS (w/v), 50 mM NaCl. Sterilisera genotypning bufferten genom ett 0,22 µm filter och förvara i rumstemperatur i flera månader.
  2. Put embryoniskt membran (för embryon) eller liten bit av svansen (för födda djur) till 500 µL filtreras genotypning buffert och tillsätt 15 µL av proteinas K (20 mg/mL). Inkubera över natten vid 55 ° C.
  3. Centrifugera det lysate vid 15 000 x g i 5 min och sedan använda 1 µL av supernatanten för PCR-reaktionen. Lysate kan lagras vid 4 ° C i flera månader.
  4. Utföra den PCR-amplifieringen av ett fragment av transgenens i en 20 µL reaktionsvolym som innehåller 1 x PCR buffert, 1,5 mM MgCl2, 200 µM dNTP, 0,2 µM av varje PCR primers, 1 UI av Taq-DNA-polymeras och 1 µL av varje smält provet. Som en negativ kontroll, Använd 1 µL H2O. Som positiv kontroll, Använd DNA från lentiviral vector plasmiden som innehåller transgenens.
  5. Använd för detektering av andra beskrivs:
    Andra framåt Primer: 5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3'
    Andra Reverse Primer: 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3'
  6. Utför PCR-amplifiering i en termocykler: 4 min vid 94 ° C följt av 35 cykler av 1 min vid 94 ° C, 1 min vid 60 ° C, och 2 min vid 72 ° C.
  7. Ladda PCR-produkten på en 2% agarosgel för att visualisera en 300 bp andra PCR-produkt som illustreras i figur 2B.
    Obs: Alla individer visar ett 300 bp PCR band har integrerat den andra transgenens och kan betraktas som transgenics.
  8. Analysera transgenens uttryck i transgena djur. Exempelvis utför histologiska och immunfärgning som illustreras i figur 3 och figur 4 och beskrivs i kompletterande metoder.
    Obs: Båda transgenens uttryck och fenotyp analys bör utföras med relevanta metoder enligt globala vetenskapliga frågan.

11. kvantifiering av transgenens kopienumret

  1. Förbereda DNA prover för kvantitativ PCR.
    1. Extrahera genomiskt DNA (gDNA) från proteinas K lysate erhölls i steg 10,3 använder ett kommersiella kit enligt tillverkarens anvisningar.
    2. Kvantifiera gDNA genom spektrofotometri på 260 nm.
    3. Späd varje gDNA prov 10 ng/µL koncentration.
    4. För varje prov, förbereda 5 seriella utspädningar (1:5) i H2O att få 6 rör på följande koncentrationer: 10 ng/µL, 2 ng/µL, 0,4 ng/µL, 0,08 ng/µL, 0,016 ng/µL och 0.0032 ng/µL
  2. Förbereda kvantitativ PCR (qPCR) reaktion mixen.
    1. Förbereda primer mixen för qPCR. För varje primer par att använda för qPCR, Lägg till 10 µL av forward primer (100 µM grundfärg stamlösning), 10 µL reverse primer (100 µM) och 80 µL av H2O.
      Obs: För att förstärka andra, Använd fram TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA och omvänd TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG primers. Cdx2 genen används som normalizer för qPCR (2 kopior per genomet). Använd framåt GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG och omvänd GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT primers för Cdx2 normalizer
    2. Förbered 2 qPCR mixar, en med andra primer mix och en med Cdx2 primer mix. Förbereda tillräckliga qPCR mix att förstärka de 6 utspädningarna i dubbletter av varje gDNA. En qPCR reaktion innehåller 3,8 µL av H2O, 5 µL av fluorescerande grön 2 x reaktionsblandning och 0.2 µL av primer mix.
      Obs: För varje transgena djur att testa, 24 qPCR reaktioner kommer att utföras. Reaktionsblandning tillhandahålls för en 384 väl qPCR-maskin.
    3. För varje djur att testa, distribuera: 12 brunnar med 9 µL av andra qPCR mix och 12 brunnar med 9 µL av Cdx2 qPCR mix. Tillsätt 1 µL av varje gDNA utspädning 2 brunnar som innehåller andra qPCR mixen och 2 brunnar som innehåller andra qPCR mixen.
    4. Lämna 2 brunnar för varje qPCR blanda i vilken gDNA var ersätta av H2O som negativ kontroll.
  3. Placera 384 väl plattan i qPCR maskinen och tillämpa följande löpande protokoll: 10 min vid 95 ° C sedan 50 cykler av 10 s vid 95 ° C och 1 min vid 60 ° C.
  4. Analysera data. För varje gDNA att testa, rita av Ct-värden som en funktion av stocken av totala gDNA belopp (6 Poäng i dubbletter). Passar kurvan med linjär regression med metoden minst fyrkantig och extrapolera den Ct-värde som motsvarar skärningspunkt med y-axeln. Använd de extrapolerade Ct-värdena för andra och de normaliserade Cdx2 för att beräkna antalet andra kopia i förhållande till Cdx2 (2 kopior) använder standard 2ΔdCt Metod11.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Transgena djur genererades med hjälp av protokollet som presenteras här. Representativa resultat både allestädes närvarande och cell typ specifika transgenens uttryck är illustrerade.

Konstitutiva uttryck av transgener

Allestädes närvarande initiativtagare är grundforskning verktyg att uttrycka transgener i ett varaktigt och effektivt sätt. Sådan initiativtagare används för en mycket stor mängd program från in vitro- cell transfection till i vivo genmodifiering i små och stora djur.

Lentiviral vektorer konstruerades för att uttrycka det grönt fluorescerande reporter gen (andra) under kontroll av cytomegalovirus (CMV) arrangören eller sammansatta arrangören CAG baserat på fusion av promotorn kyckling aktin och den CMV-förstärkare. Båda lentiviral vektorer var producerade (kompletterande metoder) och antikroppnivåns bestämdes i 293T celler som transduktion enheter (TU) baserat på andra uttryck. Båda lentiviral vector konstruktioner injicerades i perivitelline utrymme befruktade oocyter vid en koncentration på 109 TU/mL och implanterade i pseudo dräktiga honmöss. Implanterade embryon var nästa insamlade strax före födelsen och genotypning av PCR att följa andra integration. 73% (n = 22) och 83% (n = 32) av insamlade embryon hade integrerat transgenens för CMV och den CAG lentiviral bygga, respektive (tabell 1). Transgena embryon var då sektionerad och immuno-färgas för andra. Som illustreras i figur 3, endast spridda andra positiva celler observeras med promotorn CMV (figur 3, övre panelen) alla celler uttryckte god Jordbrukarsed när promotorn CAG användes (figur 3, mitten och botten panel).

Med CAG promotorn uttryckte 96% av insamlade transgena embryon ubiquitously den andra transgenens (tabell 1). Även om båda initiativtagare är allestädes närvarande, kan endast CAG arrangören driva robust uttryck för transgenens i alla celler. Alternativa allestädes närvarande initiativtagare användes såsom phosphoglycerate kinase (PGK) och ubiquitin-C initiativtagare och gett liknande resultat som de som erhålls med promotorn CAG med lägre nivåer av andra (inga data anges).

In vivo kartläggning av reglerande genomisk regioner att testa vävnad specifika kontrollelement.

För ett stort antal tillämpningar krävs uttryck av transgener i en cell specifika sätt i transgena djur. Generation av transgena djur kan dessutom vara mycket instrumental att skärmen förmodad reglerande genomisk DNA-fragment förmåga att styra cellen särskilda uttryck för en viss gen. Som ett exempel, var lentiviral medierad produktion av transgena djur används för att mappa cell specifika smakförstärkare som styr Neurogenin 3 (Neurog3) uttryck11. Neurog3 är en grund Helix-Loop-Helix (bHLH) transkriptionsfaktor som styr engagemang för bukspottskörteln föräldraparets mot endokrina öde. I Neurog3 null muterade möss, kan inga endokrina celler i bukspottkörteln skilja19. En 2,2 kb DNA-fragment som lokaliserade mellan positioner-5284 och-3061 i förhållande till Neurog3 transkription starta webbplats har klonats i en lentiviral vektor uppströms en beta globinzinkinsulin minimal arrangören att köra uttryck för en andra reporter gen som tidigare beskrivits 11. en kontroll konstruktion genererades på samma sätt genom att klona ett 2,4 kb intergenic fragment lokaliserade på mus kromosom 6 (chr6: 14237279-14239685 i förhållande till mm9 mus genomet församlingen) i samma lentiviral ryggraden. Denna genomisk region är lokaliserade inom en 1 mega-base lång gen öken mellan Gpr85 och Ppp1r3a gener. Hög titer lentiviral vektorer producerades nästa använder både konstruktioner och namngivna Neurog3- enh-andra och Chr6-andra.

Båda lentiviral vektorer konstruerades och producerade (kompletterande metoder). Eftersom inga celler som uttrycker Neurog3 var tillgängliga, kunde TU titern inte fastställas. Alternativt, titern mättes som koncentrationen av p24 kapsid protein. 2 vektorerna var injiceras i det perivitelline utrymmet befruktade oocyter och implanteras i pseudo dräktiga honmöss. Implanterade embryon insamlades på embryonala dag 14,5 (E14.5) som denna utvecklingsfas motsvarar maximal uttrycket av Neurog3 i bukspottkörteln. Embryon var nästa genotypbestämts att följa andra integration. 84% (n = 47) och 71% (n = 48) av insamlade embryon hade integrerat transgenens för Neurog3- enh-andra och Chr6-andra lentiviral konstruktioner respektive (tabell 1). För varje embryo, var bukspottskörteln knoppen dissekeras och sedan sektioneras för att utföra immunfärgning. 92% av Neurog3- enh-andra transgena embryon uttryckt andra i bukspottkörteln som illustreras i figur 4 övre panelen (representativa immunfärgning). Viktigt, är de allra flesta andra positiva celler var också Neurog3 uttrycker celler (figur 4) som anger att den 2,2 kb Neurog3 enhancer kunna begränsa andra uttryck inom den Neurog3 cell befolkningen. Av oppositionen uttryckte ingen av de Chr6-andra embryona andra (figur 4 nedre panelen och tabell 1) i bukspottkörteln eller utanför bukspottkörteln. Dessutom observerades inga ektopisk uttryck för andra utanför bukspottkörteln i Neurog3- enh-andra embryon11.

För 4 experiment presenteras ovan, presenteras en exakt kvantitativ beskrivning av varje steg i proceduren i tabell 1. Detta illustrerar den globala effekten av förfarandet. När man jämför antalet insamlade djur som integrerade transgenens med nummer injicerade befruktade ägg, faktiskt globala avkastningen av förfarandet 44% i genomsnitt. Den samma avkastningen med en pronukleär DNA-injektion av en konstruktion som innehåller den Neurog3 förstärkare smält till beta-galaktosidas reporter överstiger inte 3,1%.

Transduktion befruktade oocyter med en lentiviral vektor leder till transgenens integration som kan uppstå på flera platser10,13. Det relativa antalet transgenens integration platser utvärderades med kvantitativ PCR på genomisk DNA (figur 5). Kvantifiering av andra integration var bestäms av kvantitativ PCR (qPCR) och normaliserade till Cdx2 gen som är närvarande vid 2 kopior per genomet som tidigare beskrivits11. Det genomsnittliga antalet integration platser var 19.36 ± 2.468 (S.E.M.) och 9.537 ± 1.186 (S.E.M.) i embryon som genereras från Neurog3- enh-andra och Chr6-andra konstruktionen, respektive. Intressant, presenteras de två lentiviral vektorer används för att producera dessa djur olika viral titrar. Koncentrationen av p24 kapsid protein var 124 ng/µL för Neurog3- enh-andra vektor och 52 ng/µL för kontroll Chr6-andra vektor. Det är mest sannolikt att sådan titer skillnad kommer hänsyn till betydande skillnaden observerades i integration webbplats nummer i båda population av transgena embryon (figur 5). Detta tyder på att det genomsnittliga antalet integration platser erhålls i en batch av grundaren transgena möss kan moduleras med viral bestånd med olika titrar.

Viktigast av allt, observerades ingen direkt korrelation mellan uttrycket av andra i Neurog3- enh-andra transgena embryon och antalet transgenens kopior som integrerades. Med andra ord, befanns embryon som integrerade antingen enstaka eller flera kopior av den Neurog3- enh-andra transgenens likaså express andra i Neurog3 positiva celler.

Figure 1
Figur 1: flödesschema av övergripande förfarandet Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Förbereda micro injektion pipetter och genotypning.
(A) schematiska ritningar av Mikroskop pipetter framhäva viktiga skillnader mellan pipetter används för DNA eller lentiviral vector injektioner. Vänstra panelen: den övergripande formen av båda pipett typer dras. Streckad cirkel belyser det förstorade området av Pipettera spetsen. Bilder av Pipettera tips presenteras också. Observera att spetsen lentiviral injektionsvätska måste brytas som anges med den streckade linjen och motsvarande bild. Högra panelen: exempel ägg injektionsstället inställning med den anläggning Pipettera till vänster, det befruktade ägget och injektion Pipettera antingen i en pronucleus eller i perivitelline utrymme. Skala barer = 50 µm. (B) visualisering på agarosgel av andra PCR-produkten amplifierats från genomiskt DNA extraheras från 8 olika embryon (lane 1 till 8). Endast embryon 1, 2, 3, 5, 6 och 8 hade integrerat den andra transgenens. Det DNA plasmiden pTrip PGK-andra används för produktion av lentiviral vector användes som PCR-positiva kontroll. För den negativa kontrollen ersatt H2O DNA i PCR-reaktionen. MWM: molekylvikt markör. BP = baspar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Allestädes närvarande initiativtagare bil uttryck av andra reporter transgena embryon.
10 µm cryo-sektioner av transgena embryon var målat för att visualisera andra uttryck (grön) och atomkärnor (blå). Embryon som genereras med CMV promotorn lentiviral konstruera (övre vänstra etikett) samlades på E11.5. Embryon som genereras med den CAG arrangör lentiviral konstruktion (nedre vänster etikett) samlades på E18.5. PB: bukspottskörteln knopp, VSC: ventrala ryggmärgen, Vt: kotan, Li: levern, Ms: muskel av buken bältet. Skala barer = 50 µm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Cell specifika uttryck för reporter gen i transgena embryon drivs av den Neurog3 förstärkare. 10 µm cryo-sektioner E14.5 bukspottskörteln knoppar av transgena embryon var målat för att visualisera ett uttryck för Neurog3 (röd), andra (grön) och atomkärnor (blå) som beskrivs i kompletterande metoder). Neurog3 uttryck är spridda i bukspottkörteln. Transgena embryon som integrerade de Neurog3- enh-andra konstruera express andra och de flesta andra positiva celler är Neurog3 positiva (övre panelen). Embryon som genereras med den Chr6-andra konstruktion uttryckte inte andra (undersidan). Skala barer = 50 µm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: relativa kopia antal integrerade transgener. Kvantifiering av andra integration platser i förhållande till CDX2 genen som beskrivs i protokollet avsnitt. Lådagram från 25: e till 75: e percentilen. Punkter representerar olika transgena embryon som genererades. Jämförelse av transgener integrerade platser mellan de två lentiviral konstruktioner är betydligt annorlunda (oparade parametrisk t-test, p = 0,001). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Table
Tabell 1: steg för steg kvantitativa rapport under förfarandet för fullständig. Under förfarandet räknades det totala antalet ägg eller embryon. Den första kolumnen representerar det totala antalet ägg som hämtades från oviducts av superovulated honor. Bara ägg med klara 2 polar organ eller synliga pronuclei injicerades och redovisas. Efter injektionen och ett par timmar i kultur var endast injicerade äggen som inte var lyserat och hade en normal morfologi implanteras. Nästa räknas det totala antalet embryon som samlades in från pseudopregnant honorna. Slutligen listas embryon som hade integrerat transgenens och uttryckt reportern i de två sista kolumnerna. Samma funktioner ges också för jämförelse med ett experiment med standard pronuclei DNA injektion. Här innehöll transgenens den Neurog3 förstärkare körning uttrycket av en beta-galaktosidas reporter gen (Neurog3- enh-Lindholm). Vänligen klicka här för att hämta den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Perivitelline injektion av lentiviral vektorer i befruktade oocyter beskrivs här resulterat i produktionen av transgena embryon som gav mer än 70% av transgena embryon i förhållande till totala antalet insamlade embryon. Detta resultat överensstämmer med tidigare rapporter och exemplifierar specificiteten av förfarande2,7,10,11,12. När man jämför alla de data som presenteras i tabell 1, kan viktiga funktioner belysas. Först, motsvarade antalet implanterade ägg alla injicerade ägg som hade en normal morfologi eller inte var lyserat efter några timmar i kultur. 93% av injicerad ägg var implanteras tyder på en nästan total avsaknad av snabba toxicitet på grund av injektion av lentiviral vector i perivitelline utrymme. Situationen är dramatiskt annorlunda när man överväger DNA injektion eftersom endast 44% av injicerad ägg hade överlevt och var implanteras. Dessutom är förhållandet av insamlade embryon i förhållande till implanterade ägg identisk mellan de två förfarandena, föreslår ingen förvärras långsiktig toxicitet av lentiviral vektorer. Andra när uttrycker antalet embryon som integrerade transgenens i förhållande till antalet injicerade ägg är globala avkastningen mer än 10 gånger högre med lentiviral vector injektion jämfört DNA injektion. En 86-fold skillnad finns även när man jämför antalet embryon som uttrycker transgenens mellan de två förfarandena som använder samma Neurog3 enhancer konstruktion.

Ännu viktigare, verkar transgena produktion kapacitet vara beroende av transduktion titern används lentiviral vektorer. Med andra ord, lentiviral vektorer produceras med en titer över 109 TU/mL räcker för att få så hög avkastning. Som beskrivs i avsnittet protokoll, den injicerade volymen i perivitelline utrymme är i intervallet 10 till 100 pL. Denna volym kommer att representera 10 till 100 aktiva lentiviral partiklar. I jämförelse med standard pronuclei DNA injektioner är det totala antalet grundare djur genereras med samma mängd född djur minst 10 gånger högre när lentiviral vektorer. Dessutom den uttryck penetrans av transgenens är extremt hög med detta protokoll och observerades både med allestädes närvarande och cell specifika initiativtagare med undantag av promotorn CMV. Av motstånd mot cellulära allestädes närvarande initiativtagare, promotorn CMV är aktivt stänger du av DNA metylering20 och har visat sig vara oförmögen att upprätthålla långsiktigt uttryck vid transduktion i pluripotenta stamceller21. Detta kunde förklara det mycket begränsade antalet andra uttrycker celler observeras i transgena embryon. Lentiviral vektorer är därför väl anpassade att producera transgena djur som uttryck för en transgenens styrs av en specifik cell-förstärkare. Ännu viktigare, kan protokollet användas till skärmen för enhancer aktivitet i vivo och hitta karta transkription faktorn bindande platser inom regulatoriska regioner11,12. Denna screening metod kan knappast utföras med standard genmodifiering. Det totala antalet grundare djur behövs för att testa alla olika konstruktioner och nådde statistisk signifikans skulle kräva dussintals injektion sessioner medan det kan erhållas snabbt med lentiviral medierad genmodifiering.

En av de viktigaste skillnaderna mellan det normala förfarandet och metoden som lentiviral bor i transgenens integrationen. Pronukleär injektion integreras, transgener slumpmässigt som flera kopior i en unik locus. Använder lentiviral vektorer, kan integration uppstå på flera loci (ett exemplar per locus) utan att vara strikt slumpmässiga. Genom kloning integration platser med linjär förstärkning medierad PCR (LAM-PCR), visat gruppen av D. Trono att transgener integrera prioriterat i öppen kromatin regioner av befruktade ägg13. Integration bias bör inte störa eller bidra till transgenens uttryck i transgena möss. Integration under lentiviral transduktion i ett embryo med en cell i scenen sker i öppna kromatin som inte får fortfarande öppna konfigurationen senare under utveckling eller i vuxen.

När man analyserar kopia nummer av integrerade transgener i första generationens djur (F0) eller embryon, observeras dessutom en stor variation i antalet integrerade transgenens. I denna studie ett genomsnitt 19 integrerad exemplar hittades med den Neurog3-enh-andra konstruktion. Denna stora kopienumret kunde återspegla höga nivåer av mosaicism. Sauvain et al. har utfört en omfattande studie av integrerade loci i F0 djur genereras med metoden lentiviral medierad beskrivs här13. De följde 70 individuell integrering platser i 11 F0 djur och undersökt av överföring för varje webbplats från F0 transgena möss till deras F1-avkomman. Den totala frekvensen av överföring av 44% för enskilda integrerade transgenens tyder på att de oftast fastställts antingen efter den S-fasen av en cell embryon eller innan S fas i två-cellstadie. Faktiskt skulle integration före S fas överföra den integrerade transgenens att båda dottercellerna, medan integrering efter den S-fasen skulle överlämna det till endast en dotter cell. Således är graden av mosaicism för enskilda integrerade transgener minimal i transgena möss som erhållits genom denna teknik. Detta anger vidare att de flesta integration kommer att inträffa inom de första 12 h som motsvarar den genomsnittliga tiden för produktion av den första klyvning i villkoren används kultur. Denna integration kinetic är förenligt med det som beskrivs för lentiviruses i T-lymfoida celler22.

Viktigast av allt, med ett stort antal loci blottar integrerad transgener, upprätta mus linjer inte skulle vara rimligt. Antalet överfarter att avskilja alla dessa loci skulle vara betydligt hög. Detta utgör en viktig begränsning med denna metod som ska användas för snabb screening av transgenens effekter eller samtidig analys av flera transgener. Mus linjer kan dock fortfarande fastställas genom att välja från F0 djuret de med lägst integrerad transgenens kopia nummer.

Sedan den första beskrivningen av pronukleär DNA injektion metod1, har förbättringar gjorts att kringgå många av nackdelarna med det ursprungliga förfarandet. Den första uppsättningen av förbättringar baserades på riktade integrationen i en exakt locus använder en kassett exchange strategi. Pronukleär injektion utförs med antingen CRE, Flip eller PhiC31 rekombinaser tillsammans med en integrativ DNA-fragment flankerad med loxP, FRT eller attB platser, respektive. I det här fallet växlas integrativ DNA med en integrerad fragment flankerad på samma recombinase specifik plats23,24. Upp till 60% av första generationens djur kan vara transgena23 sådana metoden, gälla begränsningarna kopplade till teknologin av pronukleär injektion fortfarande. Den andra uppsättningen av förbättring är baserad på cytoplasmiska injektioner av två cirkulära DNA, en transporterar fragmentet att integrera och möjliggör uttryck antingen Tol225, Törnrosa26 eller piggyBac27 transposases. Med dessa metoder, kickavkastningar erhålls (> 30%), men ännu viktigare, cytoplasmiska injektionen är enkelt att utföra och kringgår restriktionerna på grund av pronukleär injektion som lentiviral baserat protokoll. Dessutom kan mycket stor DNA-fragment, såsom bakteriella artificiella kromosomer, integreras.

Det är tydligt att lentiviral medierad genmodifiering inte kommer att ersätta de förbättrade förfarandena eller standarden. Denna metod utgör fortfarande ett kraftfullt verktyg för snabb djurmodell tillverkning och karakterisering eftersom det minskar avsevärt de krävs tid att generera rätt antal djur med minst genetiska variabiliteten. Dessutom kan denna teknik tillämpas direkt på alla mus stammar inklusive eventuella transgena linjerna. Det är dessutom viktigt att nämna att det globala landskapet av generation av romanen djurmodeller är på att ändra med den senaste utvecklingen av tekniken CRISPR/Cas9. Idag tillåter pronukleär injektioner av Cas9 protein tillsammans med guide RNA produktion av genomet redigeras djurmodeller med en effekt på 40%28. Detta tillvägagångssätt kan till stor del nytta av användningen av lentiviral medierad genmodifiering. Användning av icke-integrativ lentiviral vektorer29 normalnivå uttrycka båda Cas9 och vägleda RNAs kan faktiskt resultera i ännu högre avkastningen. Kombinationen av den nyaste tekniken att producera relevant och robust djurmodeller gynnas mest internationella forskargrupper som är inblandade i att studera sjukdomspatogenes och behandlingsmetoder.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt att avslöja.

Acknowledgments

Vi tackar Magali Dumont och Rolando Meloni för kritisk läsning av manuskriptet och iVector och Phenoparc ICM kärnor för tekniskt bistånd i lentiviral vector produktion och djur bostäder respektive. Detta arbete fick stöd av Institut Hospitalo-Universitaire de neurovetenskap Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements pris ANR-10-IAIHU-06. P.R. fick finansiering för den förening de Langue françaisen pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) och en gemensam JDRF INSERM bevilja.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PMSG 50UI Sigma G4527
hCG 5000UI Sigma CG5-1VL
NaCl Sigma 7982
100 mm petri dish Dutsher 353003
4 wells Nunc dish Dutsher 56469 IVF dish
M2 medium Sigma M7167
M16 medium Sigma M7292
0,22 µm Syringe filter Dutsher 146611
Hyaluronidase Enzyme 30mg Sigma H4272 mouse embryo tested
Insulin serynge VWR 613-3867 Terumo Myjector
Curved forceps Moria 2183
Curved scissors Moria MC26
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA
Borosilicate glass capillaries Harvard apparatus GC 100-10
Horizontal micropipette puller Narishige PN-30
Microforge Narishige MF-900
Inverted microscope Nikon Transferman NK2 5188 Hoffman modulation contrast illumination is required
Micromanipulator Eppendorf Celltram air
Controler of holding pipet Eppendorf Femtojet
Mineral oil Sigma M8410 mouse embryo tested
Microinjector Eppendorf Femtojet Can be used to inject DNA or viral vectors
Dumont # 5 forceps Moria MC 40
vannas micro scissors Moria 9600
Isoflurane centravet ISO005 ISO-VET 100% 250ml
ocrygel centravet OCR002
Povidone iodure centravet VET001 vetedine 120ml
Buprenorphine centravet BUP002 Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HCl Sigma T5941 Trizma hydrochloride
EDTA Sigma E9884
SDS Sigma 436143
NaCl Sigma S7653 powder
proteinase K Sigma P2308 
oneTaq kit NEB M0480L
Primers Eurogentec
Strip of 8 PCR tube 4titude 4ti-0781
96 well thermal cycler Applied Biosystems 4375786 Veriti
Genomic DNA mini kit invitrogen K1820-02
Nanodrop 2000 Thermo Scientific ND-2000C 
qPCR Master mix Roche 4887352001 SYBR Green 
Multiwell plate 384 Roche 5217555001
qPCR instrument 384 well Roche 5015243001 LightCycler 480

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
  2. Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
  3. Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
  4. Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
  5. Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
  6. Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
  7. Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
  8. Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
  9. Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
  10. Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
  11. van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
  12. Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
  13. Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
  14. Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
  15. Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
  16. Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
  17. Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
  18. Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
  19. Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
  20. Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
  21. Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
  22. Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
  23. Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
  24. Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
  25. Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
  26. Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
  27. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  28. Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
  29. Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).

Tags

Fråga 140 transgena möss Lentiviral vektorer genetik transduktion befruktade oocyter integrativ genöverföring injektion i perivitelline rymd allestädes närvarande initiativtagare cell specifika enhancer
Lentiviral medieras produktion av transgena möss: en enkel och mycket effektiv metod för direkta studier av grundarna
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., … More

Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders. J. Vis. Exp. (140), e57609, doi:10.3791/57609 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter