Summary
Her presenterer vi en protokoll for å fremme transgene integrering og produksjon av grunnleggeren transgene mus med høy effekt ved en enkelt injeksjon av en lentiviral vektor i perivitelline løpet av et befruktet oocyte.
Abstract
For nesten 40 år representerer pronuclear DNA injeksjon standardmetoden generere transgene mus med tilfeldig integrering av effekter av transgener. Slike en rutinemessig prosedyre benyttes mye i hele verden og dens viktigste begrensningen ligger i dårlig effekt av transgene integrasjon, noe som resulterer i en lav avkastning grunnlegger dyr. Bare få prosent av dyr født etter implantasjon av injisert befruktet oocytes har integrert av transgene. Derimot lentiviral vektorer er kraftige verktøy for integrerende genoverføring og kunne transduce befruktet oocytes tillater svært effektiv produksjon av grunnleggeren transgene mus med en gjennomsnittlig avkastning over 70%. Videre musen belastning kan brukes til å produsere transgene dyr og penetrance av transgene uttrykk er ekstremt høy, over 80% med lentiviral mediert transgenesis sammenlignet DNA microinjection. Størrelsen på DNA fragmentet som kan Last av lentiviral vektoren er begrenset til 10 kb og representerer stor begrensning av denne metoden. Bruker en enkel og lett å utføre injeksjon prosedyren under zona pellucida av befruktet oocytes, kan mer enn 50 grunnlegger dyr produseres i én økt av microinjection. Slik metode er svært tilpasset å utføre, direkte i grunnlegger dyr, rask gevinst og tap av funksjon studier eller til skjermen genomisk DNA områder for sin evne til å kontrollere og regulere genet uttrykk i vivo.
Introduction
Det banebrytende arbeidet til Gordon et al. i 1980 viste at etter implantasjon i pseudopregnant mus, plasmider DNA injeksjon i den mannlige pronuclei av befruktet oocytes kan gi produksjon av transgene dyr som er integrert i plasmider DNA1. Demonstrasjon at transgene pattedyr kan genereres hatt en enorm innvirkning på globale biovitenskap, åpner veien til romanen felt forskning både for basalfag og translasjonsforskning biomedisinske vitenskaper. I de siste fire tiårene blitt DNA microinjection en rutinen praksis. Selv om et enormt antall transgene mus har blitt produsert, er ikke fullt brukbare for alle mus stammer standardmetoden og krever tidkrevende backcrosses2,3. Sin søknad til andre arter er fortsatt utfordrende4 og generelle transgene integrering avkastningen er begrenset til noen få prosent av født dyr5. I tillegg representerer effekten av transgene integrering den begrensende faktoren som forklarer dårlig totale avkastningen av pronuclear DNA injeksjon. I denne forbindelse integrerende viral vektorer er de mest effektive verktøyene til Last og integrere effekter av transgener og dermed kan gi nye midler til en betydelig økning integrering avkastning, den eneste begrensningen er at transgene størrelsen ikke kan overstige 10 kb6 .
Lentiviral vektorer pseudo skrevet med konvolutt protein av Vesicular stomatitt Virus (VSV) er pantropic og svært integrerende genet overføring verktøy og kan brukes til å transduce befruktet oocytes7. Den zona pellucida rundt oocytes er en naturlig virus barriere og må sendes for å tillate signaltransduksjon med lentiviral vektorer. Transgene dyr har blitt generert av transducing befruktet oocytes etter mikro-boring eller fjerning av zona pellucida8,9. Men synes injeksjon under zona pellucida inn perivitelline å være den enkleste metoden å transduce befruktede eggene som først beskrevet av Lois og kolleger7.
Perivitelline injeksjon av lentiviral vektorer gir høy avkastning i produksjonen av transgene dyr som er over 70% av født dyr. Slike avkastning er over 10-fold høyere enn best utbytte som kan oppnås ved hjelp av standard pronuclei DNA injeksjon7,10,11. I denne sammenheng generere en enkeltøkt av innsprøytninger minst 50 transgene grunnleggerne (F0). Det store antallet grunnleggerne er derfor kompatibel med phenotyping av transgene effekten direkte utført på F0 mus uten å generere transgene musen linjer. Denne fordelen tillater rask screening av transgene effekten og er spesielt tilpasset for å utføre i vivo gevinst og tap av funksjon studier innen uker. I tillegg kan regulatoriske DNA elementer også bli raskt vist for å tilordne enhancers og DNA motiver bundet av transkripsjon faktorer11,12. Med pronuclear injeksjoner integrere effekter av transgener vanligvis som flere eksemplarer i et unikt locus. Med lentiviral vektorer skjer integrasjon i flere loci som ett eksemplar per locus10,13. Derfor er mangfoldet av integrert loci mest sannsynlig knyttet til svært høy uttrykket penetrance observert i transgene grunnleggerne, som gjør den nye genererte modellen mer robust.
Betydelig, når du bruker pronuclear injeksjon av DNA, er visualisering av pronuclei under prosedyren helt nødvendig. Denne tekniske begrensningen forhindrer bruken av befruktet oocytes fra en rekke musen stammer. Derfor produksjon av transgene modell på en bestemt belastning for hvilke pronuclei er usynlig krever produksjon av dyr i en ettergivende belastning etterfulgt av minst 10 påfølgende backcrosses overføre transgene ønsket musen belastning. Med lentiviral vektor injeksjoner, perivitelline plass er alltid synlig og injeksjon krever ikke svært spesifikke ferdigheter. Som et eksempel, er hilsen/SCID transgene musene som ikke passer i pronuclei injeksjon anskaffet med viral vektor injeksjoner14.
Her vises en omfattende protokoll for å tillate enkel produksjon av transgene mus bruke lentiviral vektor injeksjoner i perivitelline plass på en én celle scenen fosteret. Transgene uttrykk kontrollert med enten allestedsnærværende eller cellen bestemt arrangører er beskrevet i detalj.
PTrip ΔU3 lentiviral ryggraden ble brukt i denne studien15. Denne vektoren kan produsere replikering defekt lentiviral vektorer der U3 sekvensen er delvis slettet for å fjerne U3 promoter aktivitet og generere en selv inactivating vektor (SIN)16. Lentiviral vector aksjer ble produsert av forbigående transfection av HEK-293T-celler med p8.91 innkapsling plasmider (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G koding vesicular stomatitt virus (VSV) glykoprotein-G17, og pTRIP ΔU3 rekombinant vektor. Detaljert produksjon fremgangsmåten oppgis som supplerende metoder.
Produksjon av høy titer lentiviral vektor aksjer utføres under Biosafety nivå II forhold (BSL-2). Dette gjelder for de fleste effekter av transgener bortsett fra oncogenes som produseres i BSL-3. Produksjon i BSL-2 forhold i de fleste tilfeller er derfor tilstrekkelig. Dessuten, kobles bruk og produksjon vanligvis til de fleste nasjonale reguleringsorganer håndtere genmodifiserte organismer (GMO). Begrensede mengder replikering inkompetente synd lentiviral vektorer (under 2 µg p24 kapsid protein) kan brukes under BSL-1 forhold som beskrevet av fransk GMO byrået med EU anbefalingene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som inkluderer dyr arbeid har fått etiske godkjenning og har blitt godkjent av det franske ministeriet for forskning og utdanning under nummer APAFIS #5094-20 16032916219274 v6 og 05311.02. ICM dyr anlegget PHENOPARC har blitt akkreditert av franske Landbruksdepartementet under akkreditering nummer B75 som går 13 19. Den generelle protokollen krever utføre hver prosedyre innenfor en presis tidsramme som er oppsummert i i figur 1.
1. dyr kjøp og utarbeidelse av grunnleggende forbindelser
- Dyr kjøp
- Bestille 25 vasectomized menn B6CBAF1/JRj som er 8 ukens av alderen (F1 generasjon fra opprinnelige krysser mellom ♀C57Bl/6JRj og ♂CBA/JRj).
Merk: Isolere menn ved ankomst. Vasectomized menn kan brukes om igjen for minst ett år.
Endre merdene hver 3 uker. - Bestille 50 B6CBAF1/JRj kvinner som er 10 ukens av alderen og holde en pool av minst 50 dyr.
- Bestill C57BL/6JRj 10-15 fruktbare menn som er 8 ukens av alderen.
- Bestille 30 C57BL/6JRj kvinner som er 4 ukens av alderen.
- Bestille 25 vasectomized menn B6CBAF1/JRj som er 8 ukens av alderen (F1 generasjon fra opprinnelige krysser mellom ♀C57Bl/6JRj og ♂CBA/JRj).
- Anestesi og Eutanasi
- Anestesi er utført med et volum av 300μL ketamin/xylazine mix, injisert intraperitoneally (ketamin på en dose 150μg/g kroppsvekt, xylazine på en dose 0.15μg / g body vekt). Dyr er plassert under varmeputen å regulere kroppstemperaturen. Sjekk reflekser ved pinching halen av dyret før prosedyren.
- Eutanasi ble utført av cervical forvridning. Halshogging ble inkludert som en sekundær metode å bekrefte drap av dyret. Eutanasi av embryo ble utført ved halshogging.
Merk: Ved ankomst, Tillat dyr minimum 1 uke å venne til anlegget (ingen håndtering eller parring). Viktigere, kan noen musen stammer inkludert transgene linjene benyttes som fruktbare menn og fruktbare kvinner for superovulation. Valg av belastning bør gjøres i henhold til kravene av vitenskapelige spørsmålet.
- Hormon forberedelse
- Legg 910 µL PSMG (gravid Mare Serum Gonadotropin) bufferen til 1 lyofilisert PMSG hetteglass gjøre 100 µL dele og lagre på 20 ° C.
Merk: Hver aliquot inneholder 55 UI for 11 mus. Aldri holde PMSG dele mer enn 2 uker etter den første bruken. - Legg 2730 µL av hCG (humant choriongonadotropin) buffer i 1 lyofiliserte hCG hetteglass. Gjøre 100 µL dele og lagre på 20 ° C.
Merk: Hver aliquot inneholder 55 UI for 11 mus.
- Legg 910 µL PSMG (gravid Mare Serum Gonadotropin) bufferen til 1 lyofilisert PMSG hetteglass gjøre 100 µL dele og lagre på 20 ° C.
- Hyaluronidase forberedelse
- Rekonstituer 1 hetteglass med hyaluronidase med 3 mL M2 Medium for å få en 10 mg/mL lagerløsning og gjøre 50 µL dele. Deretter lagre på-20 ° C.
- Kirurgi verktøy forberedelse
- Sterilisere alle kirurgi verktøy å bruke autoclave.
2. superovulation av kvinnelige givere
- I en dyr anlegg med 12 h dag - natt-sykluser, injisere PMSG 2 pm på dag -3. Injisere hCG kl 12 dagen -1 og kompis med fruktbare menn bare etter hCG injeksjon.
- På dag -3, sammenlegge 1 mL steril 0,9% NaCl løsning i 1 aliquot av 100 µL av PMSG (55 UI). Injisere 10 C57BL/6JRj kvinner med 100 µL intraperitoneally bruker en sprøyte uten noe døde volum.
Merk: Hver musen får 5 UI på PMSG. - På dag -1, sammenlegge 1 mL steril 0,9% NaCl løsning i 1 aliquot av 100 µL av hCG (55 UI). Injisere musene som mottok PMSG injeksjon med 100 µL utvannet hCG løsning (5UI) intraperitoneally. Bruk en sprøyte uten noe døde volum. Utføre injeksjon sakte og vente før nålen slik at væsken ikke lekker.
Merk: Hver musen får 5 UI HCG. Injeksjon av hCG skal utføres 46 h etter PMSG. - Plass hver C57BL/6JRj kvinne i buret av stud mannlige rett etter hCG injeksjon.
- Sjekk vaginal plugger på morgenen dagen 0 og bruk positiv kvinner for å samle befruktede egg.
3. klargjør B6CBAF1/jRj Pseudopregnant kvinner
- Mate en vasectomized mann dagen før egg samling (dag -1) 2 B6CBAF1/JRj kvinner 5 PM.
Merk: Det er svært viktig å mate kvinner som kommer fra ulike bur å unngå synkronisering av kvinnelige sykluser. Dette vil øke avkastningen av å skaffe vaginal plugger. I tillegg legger ikke til en kvinnelig å en mannlig bur som er endret i de siste 2 dagene. Effekten av reproduktive opptreden inne mannlig er økt når buret er skitten.
4. befruktede egg samling
- Forberedelse
- Legge til 1450 µL m2 hyaluronidase lagerløsning å forberede hyaluronidase fungerende løsning.
- Plass en dråpe 100 µL av hyaluronidase fungerende løsning hver kvinnelige brukes til å produsere befruktede egg i en 100 mm Petriskål og holde ved romtemperatur.
- Legg til 500 µL av M16 i 4 brønner platene. Bruk 2 brønner per type lentiviral vektorer som injiseres: en godt vil inneholde injisert egg og den andre de ikke-injisert. Sett 4 godt platene i kuvøse på 37 ° C med en 5% CO2 atmosfære.
- Klargjør Pipetter for informasjonsinnsamling og håndtering av embryo.
- Myke glass hematokrit kapillærene (75 mm/60 µL) ved å rotere midten av hard glass kapillær slangen i flammen.
- Fjern kapillærene fra varmen så raskt som mulig og trekk å få en rør med en indre diameter på ca 300 µm. trekk på avkjølt slangen å få en pen pause.
- Samle oviducts.
- Euthanize C57BL/6JRj kvinner av cervical forvridning 9 am på dag 0. Døden er bekreftet ved halshogging.
Merk: Denne euthanasia metoden ble godkjent av IACUC og følger europeiske anbefalinger. - Utføre en stor horisontal snitt for å åpne bukhulen med saks. Oviduct ligger mellom livmoren og eggstokkene.
- Fjerne mesometrium og membranen bærer fremtredende blodkar med buet tang.
- Skille oviduct fra eggstokken med buet tang.
- Bruke buede tang som en guide for å kutte oviduct fra eggstokken med buet saks.
- Trekk oviduct og kuttet fra livmoren med buet saks.
Advarsel: Ikke berør den hovne ampulla som inneholder befruktede egg. Utføre hele prosedyren sterilt instrumenter. - Plassere alle samlet oviducts i M2 middels (35 mm kultur parabol) ved romtemperatur
- Sett 2 oviducts i den samme 100 µL dråpen hyaluronidase fungerende løsning (0,3 mg/mL).
- Euthanize C57BL/6JRj kvinner av cervical forvridning 9 am på dag 0. Døden er bekreftet ved halshogging.
- Fjern cumulus cellene fra befruktede egg.
- Under en stereomicroscope, bruker 2 insulin sprøyter: den første som holder oviduct og den andre til å rive opp på ampulla og spre befruktede egg til hyaluronidase fungerende løsning.
- Ta forberedt glass Pipetter for innsamling av egg og koble den til slangen og filtere 0.22 μm montert på munnstykket inneholder alle eggene. Samle alle eggene og vaske dem av påfølgende passasje i 6 forskjellige dråper 100 µL av M2 medium.
- Plass vasket befruktede egg i fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2 i M16 medium.
5. gjøre injeksjon Pipetter
- Bruke tynnvegget glass kapillær rør (10-15 cm lang) med en utvendig diameter på 1 mm og klemme denne kapillær i vannrett brønnene avtrekker.
Merk: I de fleste vannrett pipette pullers, 3 parametere kan justeres: varme strøm, trekke styrke og tid forsinkelsen mellom oppvarming og trekke. Justere disse parameterne for å få sprøytebruk Pipetter for flergangsbruk som ligner det presentert i figur 2A. For brukere som rutinemessig utfører DNA microinjection, bruke standardinnstillingene og justere intervallet mellom oppvarming og trekke for å endre globale formen pipette tips.
6. å holde Pipetter
- Bruk en sprøytebruk pipette for å forberede holder pipette.
- Knytte en sprøytebruk Pipetter til en microforge. Kuttet pipette med microforge å få en skarp symmetrisk spissen av 80 til 100 µm diameter. Deretter polsk spissen med varme på microforge å få en symmetrisk rund form uten skarpe hekker.
7. utarbeidelse av injeksjon Pipette inneholder Lentiviral vektoren
- Sentrifuge lentiviral vektor suspensjon 160 x g i 2 minutter til pellets rusk ofte tilstede i frosne lentiviral aksjer.
- Gjenopprette nedbryting og overføre den til en ny 0,5 mL tube i en klasse II sikkerhet regjering.
- Overføre 1 µL av nedbryting til en injeksjon pipette forberedt som beskrevet i trinn 5 ved hjelp av en mikro-loader.
- Angi injeksjon pipette instrument innehaver av den høyre micromanipulator. Koble holder Pipetter til den venstre micromanipulator.
Merk: Signaltransduksjon titer av lentiviral vektoren vil være direkte korrelert med effekten av grunnleggeren produksjon. For høy effekt (> 70%), bruke viral vektorer med en titer mellom 100 ng av p24 kapsid protein/µL. Når titer uttrykkes signaltransduksjon enheter (TU), titer bør være over 109 TU/mL. Lentiviral vector aksjer må produseres av forbigående transfection av 293T celler med p8.91 encapsidation plasmider, pHCMV-G, koding vesicular stomatitt virus (VSV) glykoprotein-G som beskrevet i supplerende metoder18.
8. micro-injeksjon
- 8 µL av M2 medium i midten av en depresjon lysbilde og dekk dispensere lys parafinolje (embryoet testet) å unngå fordampning.
- Sted 20 egg i rullegardinlisten som minst spredt som mulig.
FORSIKTIG: Ikke gjør bobler når innskudds embryoene. - Sørg for at spissen av injeksjon pipette er åpen. Hvis ikke, trykker injeksjon pipette med holder pipette.
- Angi microinjector for en injeksjon tid 20 s.
Merk: Viskositeten av viral suspensjon kan tydelig visualisering av spredningen av viral vektoren i feltet perivitelline. Injeksjon trykket skal justeres for å fylle hele plassen i 20 s av injeksjon, som representerer et volum på 10 til 100 pL. Injeksjon press bør ikke overstige 600 hPa. - Sug opp et befruktet egg som inneholder 2 pro kjerner og 2 polar organer med holder pipette under stereomicroscope.
- Injisere egg med microinjector bruker innstillingene beskrevet under 8.4, i feltet perivitelline.
FORSIKTIG: Berør ikke plasma membranen med injeksjon pipetter. - Injisere alt befruktede egg tilgjengelig i grupper på 20 egg og plasser injisert eggene umiddelbart i forvarmet M16 medium i fuktet 37 ° C inkubator med en atmosfære av 5% CO2.
Merk: Ruge injisert eggene i minst 30 min etter injeksjon før embryoet overføringer.
9. overføring embryo til B6CBAF1/JRj Pseudopregnant kvinner
- Sjekk copulation plug 16 h etter mating B6CBAF1/JRj kvinner med B6CBAF1/JRj vasektomi menn. Gjør like før embryo.
- Forberede implantering Pipetter injisert fosteret.
- Gjøre implantering Pipetter for embryo som innsamling og håndtering av embryo (trinn 4.2). Velg Pipetter med en indre diameter på ca 150 µm med en smal del rundt 4-5 cm i lengde.
Merk: Tipset skal flamme polert, for å redusere mulig skade egg eller oviduct.- Fylle med lys parafinolje (embryoet testet) like over pipette skulderen.
- Sug opp en liten luftboble, så M2 medium, og til slutt litt luft boble.
- Utarbeide embryo en bak hverandre å minimere det totale volumet av medium som injiseres i oviduct sammen med embryoene.
- Slutten av lasting en svært liten dråpe lys parafinolje (embryoet testet) om en embryoet bredde.
Forsiktig: Vær forsiktig ved håndtering av pipette.
- Gjøre implantering Pipetter for embryo som innsamling og håndtering av embryo (trinn 4.2). Velg Pipetter med en indre diameter på ca 150 µm med en smal del rundt 4-5 cm i lengde.
- Embryoer.
- Sterilisere alle instrumenter.
- Bedøve kvinner med en intraperitoneal injeksjon av 300 μL sterile NaCl 0,9% løsning som inneholder 150 μg per g kroppsvekt av ketamin og 0,15 μg per g av kroppsvekt av Xylazine.
- Kontrollere dybden av anestesi ved å knipe halen av dyret med tang og injisere subcutaneouly 0,1 mg/kg av smertestillende (buprenorfin) før prosedyren.
- Barbere 2 cm på begge sider av baksiden langs ryggmargen på nivå med den siste vrborden.
- Plass kvinnelige musen på en varmeputen og i et sterilt. Skjær en 2 cm x 2 cm vinduet midt musen baksiden.
- Bruke en antiseptisk løsning (10% povidon iodide) på huden gjør en 1 cm tverrgående snitt med saks, og skyv huden lateralt til eggstokkene (oransje) er synlig gjennom kroppen veggen.
- Gjøre en 5 mm snitt inn i kroppen veggen like over eggstokken med fine saksen under kikkert kirurgisk mikroskop.
- Plukke opp fett pad med en atraumatiske bulldog klemme og dra ut eggstokken, oviduct og toppen av livmoren.
- Visualisere ampulla og gjøre en hemisection med vannas saks på oviduct segmentet som kobler eggstokken til ampulla.
- Introdusere overføring embryoet pipette og levere egg i ampulla, stopper ved den første luftboble i implantering pipetter.
- Gjenta på den andre oviduct.
- Lukk huden med såret klipp.
- Sted dyret i utvinningen kammer (39 ° C, 30-60 minutter) til fullt våken.
- Gjenta smertestillende injeksjon etter 12 h og 48 h ved tegn på smerte eller ubehag.
- Fjerne såret klipp 7-10 dager etter operasjonen.
- Sjekk implantert kvinner for graviditet etter deres vekt kurve hver 3 dager etter implantasjon. En betydelig vektøkning kan observeres 10 til 12 dager etter implantasjon og vil være indikativ for graviditet.
Merk: Alle embryo som vil utvikle her vil representere antatte transgene grunnleggerne. Fenotypen av disse grunnleggerne kan analyseres på noen utviklingsstadier eller etter fødselen ifølge det vitenskapelige spørsmålet knyttet til generasjon av disse transgene dyrene.
10. genotyperingteknologi transgene grunnleggerne
- Forberede genotyperingteknologi buffer inneholder 10 mM Tris-HCl, pH 8; 5 mM EDTA, pH 8.0 med 0,2% SDS (w/v), 50 mM NaCl. Sterilisere bufferen som genotyperingteknologi gjennom en 0.22 µm og lagre i romtemperatur i flere måneder.
- Sett extraembryonic membraner (for embryoer) eller lite stykke hale (for født dyr) til 500 µL av filtrert genotyperingteknologi buffer og legge 15 µL av proteinasen K (20 mg/mL). Ruge over natten på 55 ° C.
- Sentrifuge lysate på 15 000 x g i 5 min og deretter bruke 1 µL av nedbryting for PCR reaksjonen. Lysate kan lagres på 4 ° C i flere måneder.
- Utføre PCR forsterkningen på et fragment av av transgene i et 20 µL reaksjon volum som inneholder 1 x PCR buffer, 1,5 mM MgCl2, 200 µM dNTPs, 0,2 µM i hver PCR primere, 1 UI Taq DNA utvalg og 1 µL av hver fordøyd prøve. Som en negativ kontroll, kan du bruke 1 µL av H2O. Som en positiv, bruke DNA fra lentiviral vektor plasmider som inneholder transgene.
- Bruk for oppdagelsen av eGFP beskrevet:
eGFP frem Primer: 5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3
eGFP omvendt Primer: 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3 - Utføre PCR forsterkning i en thermocycler: 4 min 94 ° c etterfulgt av 35 sykluser av 1 min 94 ° c, 1 min på 60 ° C og 2 min på 72 ° C.
- Laste PCR produktet på en 2% agarose gel for å visualisere et 300 bp eGFP PCR produkt som vist i figur 2B.
Merk: Alle individer viser et 300 bp PCR band har integrert eGFP transgene og kan betraktes som transgenics. - Analysere transgene uttrykk i transgene dyr. For eksempel utføre histologiske og immunostaining som vist i Figur 3 og Figur 4 og beskrevet i supplerende metoder.
Merk: Begge transgene uttrykk analyse og fenotypen analyse bør utføres med relevant metoder fokus på globale vitenskapelige spørsmålet.
11. kvantifisering av Transgene kopi
- Forberede DNA-prøver kvantitative PCR.
- Ekstra genomisk DNA (gDNA) fra proteinasen K lysate fikk i trinn 10.3 bruker en kommersiell kit i henhold til instruksjonene fra produsenten.
- Kvantifisere gDNA av spectrophotometry på 260 nm.
- Fortynn hver gDNA prøve å en 10 ng/µL siste konsentrasjon.
- For hver prøve, forberede 5 føljetong fortynninger (1:5) i H2O å få 6 rør på følgende konsentrasjonen: 10 ng/µL, 2 ng/µL, 0.4 ng/µL, 0,08 ng/µL, 0.016 ng/µL og 0.0032 ng/µL
- Forberede kvantitative PCR (qPCR) reaksjonen blanding.
- Klargjør primer blandingen for qPCR. For hver primer par bruke for qPCR, Legg 10 µL av fremover primer (100 µM primer lagerløsning), 10 µL av omvendt primer (100 µM) og 80 µL av H2O.
Merk: For å forsterke eGFP, bruke frem TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA og omvendt TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG primere. Cdx2 gene brukes som normalizer for qPCR (2 eksemplarer per genomet). Cdx2 bruke normalizer frem GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG og omvendt GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT primere - Forberede 2 qPCR blander, ett med eGFP primer mix og ett med Cdx2 primer blanding. Forbered tilstrekkelig qPCR blandingen til å forsterke de 6 fortynninger i duplikater av hver gDNA. En qPCR reaksjonen inneholder 3,8 µL av H2O, 5 µL av fluorescerende grønne 2 x reaksjonen blanding og 0,2 µL av primer.
Merk: For hvert transgene dyr å teste, 24 qPCR reaksjoner utføres. Reaksjonen blanding er gitt for en 384 godt qPCR maskin. - For hvert dyr å teste, distribuere: 12 brønner med 9 µL eGFP qPCR mix og 12 brønner med 9 µL av Cdx2 qPCR. Legge til 1 µL av hver gDNA fortynning 2 inneholder eGFP qPCR mix og 2 førte inneholder eGFP qPCR mix.
- La 2 brønner for hver qPCR bland i gDNA som var erstatte med H2O som negativ kontroll.
- Klargjør primer blandingen for qPCR. For hver primer par bruke for qPCR, Legg 10 µL av fremover primer (100 µM primer lagerløsning), 10 µL av omvendt primer (100 µM) og 80 µL av H2O.
- Plasser 384 godt platen i qPCR maskinen og bruke følgende kjører protokollen: 10 minutter til 95 ° C deretter 50 kretsløpene 10 s på 95 ° C og 1 min på 60 ° C.
- Analysere data. For hver gDNA å teste, tegne Ct verdiene som en funksjon av loggen av total gDNA (6 poeng i duplikater). Passer kurven med lineær regresjon med metoden minst kvadrat og ekstrapolere Ct verdien tilsvarer skjæringspunktet med y-aksen. Bruke ekstrapolert Ct verdiene for eGFP og den normaliserte Cdx2 til å beregne hvor eGFP kopi i forhold til Cdx2 (2 kopierer) ved hjelp av standard 2ΔdCt metode11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transgene dyr ble generert ved hjelp av protokollen som presenteres her. Representant resultater både allestedsnærværende og celle type bestemt transgene uttrykk er illustrert.
Grunnleggende uttrykk for effekter av transgener
Allestedsnærværende arrangører er grunnleggende forskningsverktøy for å uttrykke effekter av transgener i en vedvarende og effektiv måte. Slike arrangører brukes for et stort utvalg av programmet fra i vitro celle transfection i vivo transgenesis i små og store dyr.
Lentiviral vektorer ble bygget for å uttrykke den grønne fluorescerende reporter genet (eGFP) under kontroll av cytomegalovirus (CMV) selskapet eller sammensatt arrangøren CAG basert på blanding av kylling begrepsordbok arrangøren og CMV enhancer. Begge lentiviral vektorer var produsert (ekstra metoder) og titer ble bestemt i 293T celler som signaltransduksjon enheter (TU) basert på eGFP-uttrykk. Begge lentiviral vektor konstruksjoner ble injisert i perivitelline løpet av befruktet oocytes i en konsentrasjon av 109 TU/mL og implantert i pseudo gravid kvinne mus. Implantert embryoer var neste samlet rett før fødselen og genotyped av PCR å følge eGFP integrasjon. 73% (n = 22) og 83% (n = 32) av samlet embryo hadde integrert av transgene for CMV og CAG lentiviral Konstruer, henholdsvis (tabell 1). Transgene embryo ble deretter delt og immun-farget for eGFP. Som illustrert i Figur 3, bare spredte eGFP positive celler er observert med CMV arrangøren (Figur 3toppanelet) mens alle celler uttrykt GFP når CAG selskapet ble brukt (Figur 3, midten og bunnen panel).
Med CAG arrangøren uttrykt 96% av samlet transgene embryo overalt eGFP transgene (tabell 1). Selv om begge arrangører er allestedsnærværende, er bare CAG Promotoren stand til å kjøre robuste uttrykket av transgene i alle celler. Alternative allestedsnærværende arrangører ble brukt som phosphoglycerate kinase (PGK) og ubiquitin-C arrangører og ga lignende resultater som de oppnådd med CAG selskapet med lavere uttrykk nivåer av eGFP (data ikke vist).
I vivo tilordning av regulatoriske genomisk områder å teste vev bestemt kontrollelementer.
Et stort antall programmer er uttrykk for effekter av transgener på en celle bestemt måte i transgene dyr nødvendig. I tillegg kan generasjon av transgene dyr være sterkt medvirkende til skjermen evne til antatte regulatoriske genomisk DNA fragmenter å kontrollere celle bestemte uttrykk for et gitt gen. Som et eksempel, var lentiviral mediert produksjon av transgene dyr brukes til å tilordne celle bestemt enhancers som kontrollerer Neurogenin 3 (Neurog3) uttrykk11. Neurog3 er en basis Helix-Loop-Helix (bHLH) transkripsjon faktor som styrer innsatsen til bukspyttkjertelen progenitors mot endokrine skjebnen. I Neurog3 null mutant mus, kan ingen endokrine cellene i bukspyttkjertelen skiller19. En 2,2 kb DNA fragment lokalisert mellom posisjoner-5284 og-3061 i forhold til Neurog3 transkripsjon starter nettsted ble klonet inn lentiviral vektor oppstrøms en beta globin minimal pådriver for stasjonen uttrykk for en eGFP reporter genet som tidligere beskrevet 11. en kontroll konstruere ble tilsvarende generert av kloning en 2,4 kb intergenisk fragment lokalisert på musen kromosom 6 (chr6: 14237279-14239685 i forhold til mm9 musen genomet montering) i samme lentiviral ryggraden. Denne genomisk regionen er lokalisert i en 1 mega-base lang genet ørken mellom Gpr85 og Ppp1r3a gener. Høy titer lentiviral vektorer neste produsert med både konstruksjoner og navngitt Neurog3- enh-eGFP og Chr6-eGFP.
Begge lentiviral vektorer ble konstruert og produsert (ekstra metoder). Noen celler uttrykke Neurog3 var tilgjengelig, kunne TU titer ikke fastslås. Alternativt ble titer målt som konsentrasjonen av p24 kapsid protein. 2 vektorer ble injisert i perivitelline løpet av befruktet oocytes og implantert i pseudo gravid kvinne mus. De implanterte embryoene var samlet på embryonale dag 14.5 (E14.5) som denne utviklingsstadiet tilsvarer maksimal uttrykk for Neurog3 i bukspyttkjertelen. Embryo var neste genotyped å følge eGFP integrasjon. 84% (n = 47) og 71% (n = 48) av samlet embryo hadde integrert transgene Neurog3- enh-eGFP og Chr6-eGFP lentiviral konstruksjoner henholdsvis (tabell 1). For hver embryo, ble bukspyttkjertelen bud dissekert og deretter delt for å utføre immunostaining. 92% av Neurog3- enh-eGFP transgene embryo uttrykt eGFP i bukspyttkjertelen som vist i Figur 4 toppanelet (representant immunostai-). Viktigere, er det store flertallet av eGFP positive celler var også Neurog3 uttrykke celler (Figur 4) angir at 2,2 kb Neurog3 enhancer kjøpedyktig begrense eGFP uttrykket i Neurog3 celle befolkningen. Av motstand uttrykt ingen av Chr6-eGFP-embryo eGFP (Figur 4 nedre panelet og tabell 1) i bukspyttkjertelen eller utenfor bukspyttkjertelen. I tillegg ble ingen ektopisk uttrykk for eGFP observert utenfor bukspyttkjertelen i Neurog3- enh-eGFP embryo11.
For 4 eksperimentene presentert ovenfor, er en presis kvantitative beskrivelse av hvert trinn i prosedyren presentert i tabell 1. Dette illustrerer den globale effekten av prosedyren. Når du sammenligner tallene samlet dyr som integrert av transgene med nummer injisert befruktede eggene, er faktisk den globale avkastningen av prosedyren 44% i gjennomsnitt. Den samme avkastningen med en pronuclear DNA injeksjon av en konstruksjon som inneholder Neurog3 enhancer smeltet til beta-galactosidase reporteren overstiger ikke 3,1%.
Signaltransduksjon av befruktet oocytes med en lentiviral vektor fører til transgene integrering som kan oppstå på flere nettsteder10,13. Den relative antallet transgene integrering områder ble vurdert ved hjelp av kvantitative PCR på genomisk DNA (figur 5). Kvantifisering av eGFP integrasjon var bestemt av kvantitative PCR (qPCR) og normalisert til Cdx2 genet som finnes på 2 eksemplarer per genomet som beskrevet tidligere11. Gjennomsnittlig antall integrering nettsteder var 19.36 ± 2.468 (S.E.M.) og 9.537 ± 1.186 (S.E.M.) i embryoer genereres fra Neurog3- enh-eGFP og Chr6-eGFP konstruksjon, henholdsvis. Interessant, presentert de to lentiviral vektorene brukes til å produsere disse dyrene ulike viral titers. Konsentrasjonen av p24 kapsid protein var 124 ng/µL for Neurog3- enh-eGFP vektor og 52 ng/µL for kontrollen Chr6 eGFP vektor. Det er mest sannsynlig at slike titer forskjellen vil utgjøre den betydelig forskjellen i integrering området tall i begge befolkningen av transgene embryo (figur 5). Dette tyder på at gjennomsnittlig antall integrering nettsteder innhentet i en gruppe med grunnlegger transgene mus kan være modulert av bruker viral aksjer med forskjellige titers.
Viktigere, ble ingen direkte sammenheng observert mellom uttrykk for eGFP i Neurog3- enh-eGFP transgene embryoer og antall transgene eksemplarer som ble integrert. Med andre ord, var embryo som integrert ett eller flere eksemplarer av Neurog3- enh-eGFP transgene tilsvarende funnet å uttrykke eGFP i Neurog3 positivt celler.
Figur 1: flytdiagram for generelle prosedyren Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Forberede mikro injeksjon Pipetter og genotyperingteknologi.
(A) skjematisk tegninger av microinjection Pipetter å markere hovedforskjellene mellom Pipetter for flergangsbruk brukes for DNA eller lentiviral vektor injeksjoner. Venstre panel: den generelle formen av begge pipette trekkes. Stiplet sirkelen fremhever det forstørrede området Pipetter tips. Bilder av Pipetter tips er også presentert. Merk at for lentiviral injeksjon spissen må brytes som indikert med den stiplede linjen og tilhørende bildet. Høyre panel: eksempel egg injeksjon innstillingen med holder Pipetter på venstre, befruktet egg og injeksjon Pipetter enten i en pronucleus eller i feltet perivitelline. Skalere barer = 50 µm. (B) effekt på agarose gel eGFP PCR produktet forsterkes fra genomisk DNA utvunnet fra 8 forskjellige embryos (lane 1 til 8). Bare embryo 1, 2, 3, 5, 6 og 8 hadde integrert eGFP transgene. DNA plasmider pTrip PGK-eGFP brukes for lentiviral vektor produksjon ble brukt som PCR positiv kontroll. For negative kontrollen erstattet H2O DNA i PCR reaksjonen. ÅRENE: molekylvekt markør. BP = base par. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Allestedsnærværende arrangører kjøre uttrykk for eGFP reporteren i transgene embryoer.
10 µm cryo-seksjoner av transgene embryo var farget for å visualisere eGFP uttrykk (grønn) og kjerner (blå). Embryo generert med CMV arrangøren lentiviral konstruere (øverste venstre etikett) ble samlet på E11.5. Embryo generert med CAG arrangøren lentiviral Konstruer (nederste venstre etikett) ble samlet på E18.5. PB: bukspyttkjertelen bud, VSC: ventrale ryggmargen, Vt: vertebra, Li: leveren, Ms: muskel av abdominal belte. Skalere barer = 50 µm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Cellen bestemte uttrykk for reporter genet i transgene embryoer er drevet av Neurog3 -enhancer. 10 µm cryo-seksjoner E14.5 bukspyttkjertelen knopper av transgene embryo var farget for å visualisere uttrykk for Neurog3 (rød), eGFP (grønn) og kjerner (blå) som beskrevet i supplerende metoder). Neurog3 uttrykk er spredt i bukspyttkjertelen. Transgene embryo som integrert Neurog3- enh-eGFP konstruere express eGFP og eGFP positive celler er Neurog3 positive (topp panel). Embryo generert med Chr6-eGFP-konstruere var ikke uttrykke eGFP (nedre panelet). Skalere barer = 50 µm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Relative kopien antall integrert effekter av transgener. Kvantifisering av eGFP integrasjon i forhold til CDX2 genet som beskrevet under protokollen. Boksen plott fra 25th til 75th persentil. Prikker representerer de forskjellige transgene embryoene som ble generert. Sammenligning av effekter av transgener integrert områder mellom de to lentiviral konstruksjoner er signifikant forskjellig (hender parametrisk t-test, p = 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Tabell 1: trinnvis kvantitative rapporten under den komplette prosedyren. Det totale antallet egg eller embryo ble talt, i løpet av prosedyren. Den første kolonnen representerer antall egg som ble Hentet fra oviducts superovulated kvinner. Bare egg med Fjern 2 polar organer og/eller synlig pronuclei ble injisert og rapporteres. Etter injeksjon og et par timer i kultur ble bare injisert eggene som ikke var lysed og hadde en normal morfologi implantert. Neste telles antall embryo som ble samlet inn fra pseudopregnant kvinner. Til slutt, embryo som hadde integrert av transgene og uttrykt reporteren vises i de to siste kolonnene. De samme funksjonene er også gitt for sammenligning med et eksperiment ved hjelp av standard pronuclei DNA injeksjon. Her finnes transgene Neurog3 enhancer kjøring uttrykk for en beta-galactosidase reporter genet (Neurog3- enh-LacZ). Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Perivitelline injeksjon av lentiviral vektorer i befruktet oocytes beskrevet her resulterte i produksjonen av transgene embryo som gitt mer enn 70% av transgene embryo i forhold til totalt antall samlet embryoer. Dette resultatet samsvarer med tidligere rapporter og eksemplifiserer spesifisitet av prosedyren2,7,10,11,12. Når du sammenligner alle dataene som vises i tabell 1, kan viktige funksjoner utheves. Først tilsvarte antall implantert egg alle injisert egg som hadde en normal morfologi eller var ikke lysed etter noen timer i kultur. 93% av injisert egg ble implantert tyder på en nesten fullstendig fravær av rask toksisitet på grunn av injeksjon av lentiviral vektor i feltet perivitelline. Situasjonen er forskjellig når DNA injeksjon siden bare 44% av injisert egg hadde overlevd og ble implantert. Videre, samlet embryo i forhold til implantert egg er like mellom to prosedyrene, antyder ingen forsterket langsiktig toksisitet av lentiviral vektorer. Andre når uttrykk for hvor mange embryoer som integrert transgene i forhold til antall injisert egg er den globale avkastningen mer enn 10 ganger høyere med lentiviral vektor injeksjon sammenlignet DNA injeksjon. En 86-fold forskjell finnes selv når sammenligne antall embryo uttrykke transgene mellom de to fremgangsmåtene ved hjelp av samme Neurog3 enhancer konstruere.
Viktigere, synes transgene produksjonsytelse å være avhengige av signaltransduksjon titer av brukte lentiviral vektorer. Med andre ord, lentiviral vektorer produsert med en titer over 109 TU/mL er tilstrekkelig for å oppnå så høy avkastning. Som beskrevet i delen protokollen, injisert volumet i feltet perivitelline er i området fra 10 til 100 pL. Dette volumet vil representere 10 til 100 aktive lentiviral partikler. I forhold til standard pronuclei DNA injeksjoner er antall grunnlegger dyr generert med samme mengde født dyr minst 10-fold høyere ved lentiviral vektorer. I tillegg uttrykket penetrance av av transgene er ekstremt høy med denne protokollen og ble observert både med allestedsnærværende og celle bestemte arrangørene med unntak av CMV arrangøren. Motstand mot mobilnettet allestedsnærværende arrangører, CMV arrangøren avsluttes aktivt av DNA metylering20 og har vist seg å være ikke opprettholde lang sikt uttrykk på signaltransduksjon i pluripotent stamceller21. Dette kan forklare svært begrenset antall eGFP uttrykke celler i transgene embryoer. Derfor er lentiviral vektorer godt tilpasset til å produsere transgene dyr som uttrykk for en transgene er kontrollert av en bestemt celle-enhancer. Viktigere, kan protokollen brukes å skjermen for enhancer aktivitet i vivo og finne kart transkripsjon faktor bindende områder innenfor regulatoriske regioner11,12. Dette screening tilnærming kan neppe utføres ved hjelp av standard transgenesis. Totalt antall grunnlegger dyr nødvendig å teste alle ulike konstruksjoner og nå statistisk signifikans ville kreve mange injeksjon sesjoner mens den kan oppnås raskt med lentiviral mediert transgenesis.
En av de viktigste forskjellene mellom standard prosedyre og lentiviral basert metoden ligger i transgene integrering. Bruker pronuclear injeksjon, integrere effekter av transgener tilfeldig som flere eksemplarer i et unikt locus. Bruker lentiviral vektorer, kan integrering forekomme på flere loci (ett eksemplar per locus) uten å være strengt tilfeldig. Ved kloning integrering nettsteder bruker lineær forsterkning mediert PCR (LAM-PCR), har gruppen av D. kom vist at effekter av transgener integrere fortrinnsvis i åpen chromatin regioner av befruktet egg13. Integrering bias skal ikke påvirke eller bidra til transgene uttrykk i transgene mus. Under lentiviral signaltransduksjon i en én celle scenen embryoet skjer i åpne chromatin som ikke kanskje er fortsatt i den åpne konfigurasjonen senere under utvikling eller i voksen.
I tillegg når du analyserer kopi antall integrert effekter av transgener i første generasjon dyr (F0) eller embryo, er en stor variasjon i antall integrert transgene observert. I denne studien gjennomsnittlig 19 integrert eksemplarer ble funnet med den Neurog3-enh-eGFP konstruere. Dette store kopi nummeret kan reflektere høye nivåer av mosaicism. Sauvain et al. har utført en omfattende studie av integrert loci i F0 dyr generert med lentiviral mediert metoden beskrevet her13. De fulgte 70 personlige integrering steder i 11 F0 dyr og undersøkt satsene for overføring for hvert område fra F0 transgene mus til deres F1 avkom. Den totale hastigheten for overføring av 44% for individuelle integrert transgene antyder at de ofte ble etablert enten etter S fasen av én celle embryo eller før den S fasen på to-celle scenen. Faktisk vil integrering før S fase overføre den integrerte transgene både datter celler, mens integrasjon etter S fasen vil overføre den til bare én datter celle. Dermed er graden av mosaicism for individuelle integrert effekter av transgener minimal transgene mus oppnådd gjennom denne teknikken. Dette viser videre at de fleste integrering vil skje innen de første 12 h tilsvarer gjennomsnittlig tid for produksjon av den første cleavage brukte kultur forhold. Denne integreringen kinetic er konsistent med beskrevet for lentiviruses i T-lymfoide celler22.
Viktigst, med et høyt antall loci baring integrert effekter av transgener, etablere musen linjer vil ikke være rimelig. Antall kryssinger å skille alle disse loci ville være stor. Dette representerer en viktig begrensning av denne metoden som skal brukes for rask gjennomgang av transgene effekter eller samtidige analyse av flere effekter av transgener. Likevel kan musen linjer fortsatt kan opprettes ved å velge fra F0 dyret de med lavest integrert transgene kopi nummer.
Siden den første beskrivelsen av den pronuclear DNA injeksjon metode1, har forbedringer blitt gjort som omgå mange av ulempene ved den første fremgangsmåten. Det første settet med forbedringer basert på målrettet integrering i et nøyaktig locus bruker en kassett exchange strategi. Pronuclear injeksjon utføres med enten Grobunn, Vend eller PhiC31 recombinases sammen med en integrerende DNA-fragment flankert med loxP, FRT eller attB steder, henholdsvis. I denne situasjonen er integrerende DNA utvekslet med et integrert fragment flankert med de samme recombinase bestemte område23,24. Selv om 60% av første generasjon dyr kan være transgene23 bruker slik metode, gjelde begrensningene knyttet til teknologi av pronuclear injeksjon fortsatt. Det andre settet med forbedring er basert på cytoplasmatiske injeksjoner av to sirkulær DNA, en bærer fragmentet å integrere og et slik uttrykk for enten Tol225, Sleeping Beauty26 eller piggyBac27 transposases. Benytter disse metoder, høy avkastning hentes (> 30%), men enda viktigere, cytoplasmatiske injeksjon er enkel å utføre og omgår begrensningene på grunn av pronuclear injeksjon som lentiviral basert protokoll. Videre kan stor DNA fragmenter, som bakteriell kunstig kromosomer, integreres.
Det er klart at lentiviral mediert transgenesis ikke erstatte standard eller forbedret prosedyrene. Fremdeles representerer denne metoden et kraftig verktøy for rask dyremodell produksjon og karakterisering som betydelig reduserer tidsnok generere riktig antall dyr med den minste genetisk variasjonen. Videre, denne teknologien kan brukes direkte å alle musen stammer inkludert transgene linjer. I tillegg er det viktig å nevne at det globale landskapet av generasjon av romanen dyremodeller er ferd med å endre med den siste utviklingen av CRISPR/Cas9-teknologi. I dag pronuclear injeksjoner av Cas9 protein med guide RNA kan produksjon av genomet endret dyremodeller med en effekt av 40%28. Denne tilnærmingen kan i stor grad dra nytte av lentiviral mediert transgenesis. Bruk av ikke-integrerende lentiviral vektorer29 transiently express både Cas9 og veilede RNAs kan faktisk føre til enda høyere produksjon gir. Kombinasjonen av den nyeste teknologien å produsere relevante og robust dyremodeller ha nytte de fleste internasjonale forskning-gruppene som er involvert i å studere sykdom patogenese og terapeutiske metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har noen interessekonflikt avsløre.
Acknowledgments
Vi takker Magali Dumont og Rolando Meloni for kritisk lesning av manuskriptet og iVector og Phenoparc ICM kjerner for kundestøtte i lentiviral vektor produksjon og dyr boliger henholdsvis. Dette arbeidet ble støttet av Institut Hospitalo-Universitaire de Neurosciences Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. PR mottatt finansiering for foreningen de Langue Française hell l'Etude du Diabète et des sykdommer Métaboliques (ALFEDIAM) og en felles JDRF INSERM støtte.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
| hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
| NaCl | Sigma | 7982 | |
| 100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
| 4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| 0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
| Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
| Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
| Curved forceps | Moria | 2183 | |
| Curved scissors | Moria | MC26 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
| Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
| Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
| Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
| Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
| vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
| Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
| ocrygel | centravet | OCR002 | |
| Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
| Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| SDS | Sigma | 436143 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | powder |
| proteinase K | Sigma | P2308 | |
| oneTaq kit | NEB | M0480L | |
| Primers | Eurogentec | ||
| Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
| 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
| Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
| Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
| qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |
References
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
- Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
- Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
- Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
- van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
- Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
- Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
- Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
- Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
- Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
- Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
- Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
- Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
- Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
- Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
- Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
- Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
- Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
- Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
- Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).
