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Genetics

ट्रांसजेनिक चूहों के Lentiviral मध्यस्थता उत्पादन: संस्थापकों के प्रत्यक्ष अध्ययन के लिए एक सरल और अत्यधिक कुशल विधि

Published: October 7, 2018 doi: 10.3791/57609
Automatic Translation
1,2, 1, 1, 1
1UPMC Univ Paris 06, INSERM U1127, CNRS UMR 7225, Institut du Cerveau et de la Moelle épinière, ICM, Sorbonne Universités, 2UPMC Univ Paris 06, INSERM UMRS1166, Institute of Cardiometabolism and Nutrition, Sorbonne Universités

Summary

यहां, हम एक lentiviral सदिश का एक सरल इंजेक्शन द्वारा एक निषेचित oocyte के perivitelline अंतरिक्ष में transgene एकीकरण और उच्च प्रभावकारिता के साथ संस्थापक ट्रांसजेनिक चूहों के उत्पादन को बढ़ावा देने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद ।

Abstract

लगभग ४० साल के लिए, परमाणु डीएनए इंजेक्शन मानक विधि transgenes के यादृच्छिक एकीकरण के साथ ट्रांसजेनिक चूहों उत्पंन करने के लिए प्रतिनिधित्व करता है । इस तरह के एक नियमित प्रक्रिया व्यापक रूप से दुनिया भर में उपयोग किया जाता है और इसकी मुख्य सीमा transgene एकीकरण के गरीब प्रभावकारिता में रहता है, संस्थापक पशुओं की एक कम उपज में जिसके परिणामस्वरूप । केवल इंजेक्शन निषेचित अंडाणुओं के आरोपण के बाद पैदा हुए पशुओं के कुछ प्रतिशत transgene एकीकृत किया है । इसके विपरीत, lentiviral वैक्टर एकीकृत जीन हस्तांतरण और उनके उपयोग के लिए transduce निषेचित अंडाणुओं के लिए शक्तिशाली उपकरण है संस्थापक ट्रांसजेनिक चूहों के अत्यधिक कुशल उत्पादन ७०% से ऊपर एक औसत उपज के साथ की अनुमति देता है । इसके अलावा, किसी भी माउस तनाव ट्रांसजेनिक पशु का उत्पादन और transgene अभिव्यक्ति के penetrance अत्यंत उच्च है, lentiviral मध्यस्थता transgenesis के साथ ८०% से ऊपर डीएनए microinjection की तुलना में इस्तेमाल किया जा सकता है । डीएनए टुकड़ा है कि lentiviral वेक्टर द्वारा कार्गो किया जा सकता का आकार 10 kb तक ही सीमित है और इस विधि की प्रमुख सीमा का प्रतिनिधित्व करता है । एक सरल और निषेचित अंडाणुओं के zona pellucida के नीचे इंजेक्शन प्रक्रिया करने के लिए आसान का उपयोग करना, अधिक से अधिक ५० संस्थापक जानवरों microinjection के एक सत्र में उत्पादित किया जा सकता है । इस तरह के एक विधि अत्यधिक प्रदर्शन करने के लिए अनुकूलित है, सीधे संस्थापक पशुओं में, तेजी से लाभ और समारोह के अध्ययन के नुकसान या अपने को नियंत्रित करने और vivo मेंजीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने की क्षमता के लिए जीनोमिक डीएनए क्षेत्रों स्क्रीन ।

Introduction

गॉर्डन एट अल के अग्रणी काम १९८० में पता चला कि pseudopregnant चूहों में आरोपण के बाद, निषेचित अंडाणुओं के पुरुष pronuclei में प्लाज्मिड डीएनए इंजेक्शन ट्रांसजेनिक पशुओं के उत्पादन की उपज कर सकते है कि एकीकृत प्लाज्मिड डीएनए1. प्रदर्शन है कि ट्रांसजेनिक स्तनधारियों उत्पंन किया जा सकता है वैश्विक जीवन विज्ञान पर एक भारी प्रभाव पड़ा, अनुसंधान के उपंयास क्षेत्रों के लिए रास्ता खोलने दोनों बुनियादी विज्ञान और शोधों जैव चिकित्सा विज्ञान के लिए । पिछले चार दशकों में डीएनए microinjection का रूटीन चलन हो गया है । हालांकि ट्रांसजेनिक चूहों की एक विशाल संख्या का उत्पादन किया गया है, मानक विधि सभी माउस उपभेदों के लिए पूरी तरह से प्रयोग करने योग्य नहीं है और समय लेने backcrosses2,3की आवश्यकता है । अन्य प्रजातियों के लिए इसके आवेदन4 चुनौतीपूर्ण रहता है और समग्र transgene एकीकरण उपज5जन्म जानवरों के कुछ प्रतिशत तक ही सीमित है । इसके अलावा, transgene एकीकरण की प्रभावकारिता सीमित कारक है कि परमाणु डीएनए इंजेक्शन के गरीब समग्र उपज बताते है का प्रतिनिधित्व करता है । इस संबंध में, एकीकृत वायरल वैक्टर कार्गो और transgenes को एकीकृत करने के लिए सबसे कुशल उपकरण है और इस तरह के लिए काफी एकीकरण उपज बढ़ाने के लिए नए साधन प्रदान कर सकता है, केवल सीमा जा रहा है कि transgene आकार 10 kb 6 से अधिक नहीं हो सकता .

Lentiviral वैक्टर छद्म Vesicular Stomatitis वायरस (VSV) के ढंक प्रोटीन के साथ टाइप pantropic और अत्यधिक एकीकृत जीन हस्तांतरण उपकरण है और transduce निषेचित अंडाणुओं7के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । अंडाणुओं आसपास के zona pellucida एक प्राकृतिक वायरस बाधा है और lentiviral वैक्टर के साथ transduction की अनुमति देने के लिए पारित करने की जरूरत है । ट्रांसजेनिक जानवरों transducing निषेचित अंडाणुओं द्वारा सूक्ष्म ड्रिलिंग या zona pellucida8,9के हटाने के बाद उत्पंन किया गया है । हालांकि, perivitelline अंतरिक्ष में zona pellucida के नीचे इंजेक्शन के रूप में शुरू में Lois और सहयोगियों द्वारा वर्णित निषेचित अंडे transduce करने के लिए सरलतम विधि प्रतीत होता है7।

lentiviral वैक्टर के perivitelline इंजेक्शन ट्रांसजेनिक पशुओं के उत्पादन में उच्च पैदावार की अनुमति देता है कि जंम पशुओं के ७०% से ऊपर हैं । इस तरह की उपज 10 से अधिक सबसे अच्छा उपज है कि मानक pronuclei डीएनए इंजेक्शन7,10,11का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता गुना अधिक है । इस संदर्भ में इंजेक्शन का एक भी सत्र कम से ५० ट्रांसजेनिक फाउंड्री (F0) जेनरेट करेगा । संस्थापकों की बड़ी संख्या है, इसलिए, transgene प्रभाव के phenotyping के साथ संगत सीधे ट्रांसजेनिक माउस लाइनों उत्पन्न करने की आवश्यकता के बिना F0 चूहों पर प्रदर्शन किया. यह लाभ transgene प्रभाव की तेजी से जांच के लिए अनुमति देता है और विशेष रूप से vivo लाभ और सप्ताह के भीतर समारोह के अध्ययन के नुकसान में प्रदर्शन के लिए अनुकूलित है । इसके अलावा, विनियामक डीएनए तत्वों को भी तेजी से नक्शे बढ़ाने और डीएनए रूपांकनों प्रतिलेखन कारकों11,12से बंधे के लिए जांच की जा सकती है । परमाणु इंजेक्शन के साथ, transgenes आम तौर पर एक अद्वितीय लोकस में एकाधिक प्रतियां के रूप में एकीकृत । lentiviral वैक्टर के साथ, एकीकरण लोकस10,13प्रति एक एकल प्रति के रूप में एक से अधिक loci में होता है । इसलिए, एकीकृत loci की बहुलता सबसे अधिक संभावना बहुत उच्च अभिव्यक्ति penetrance ट्रांसजेनिक संस्थापकों में मनाया जाता है, जो नए उत्पंन मॉडल बनाता है और अधिक मजबूत करने के लिए जुड़ा हुआ है ।

महत्वपूर्ण बात, जब डीएनए के परमाणु इंजेक्शन का उपयोग कर, प्रक्रिया के दौरान pronuclei के दृश्य बिल्कुल आवश्यक है । इस तकनीकी सीमा के उपयोग को रोकता है निषेचित अंडाणुओं की एक बड़ी विविधता से उद्भव माउस उपभेदों । इसलिए, एक विशिष्ट तनाव में एक ट्रांसजेनिक मॉडल के उत्पादन के लिए जो pronuclei अदृश्य है एक स्वतंत्र तनाव में पशुओं के उत्पादन की आवश्यकता है के बाद से कम 10 उत्तराधिकारी backcrosses के लिए वांछित माउस में transgene हस्तांतरण तनाव. lentiviral वेक्टर इंजेक्शन के साथ, perivitelline अंतरिक्ष हमेशा दिखाई देता है और इंजेक्शन अत्यधिक विशिष्ट कौशल की आवश्यकता नहीं है । एक उदाहरण के रूप में, मंजूरी/SCID ट्रांसजेनिक चूहों कि pronuclei इंजेक्शन के लिए उपयुक्त नहीं है वायरल वेक्टर इंजेक्शन14के साथ प्राप्त किया गया है ।

यहां, एक व्यापक प्रोटोकॉल ट्रांसजेनिक एक एक सेल स्टेज भ्रूण के perivitelline अंतरिक्ष में lentiviral वेक्टर इंजेक्शन का उपयोग चूहों के सरल उत्पादन की अनुमति प्रस्तुत किया है । Transgene अभिव्यक्ति या तो सर्वव्यापी या सेल विशिष्ट प्रवर्तकों के साथ नियंत्रित विस्तार से वर्णित है ।

इस अध् ययन में15pTrip ΔU3 lentiviral रीढ़ का इस् तेमाल किया गया । यह वेक्टर प्रतिकृति दोषपूर्ण lentiviral वैक्टर उत्पादन के लिए अनुमति देता है जिसमें U3 अनुक्रम आंशिक रूप से U3 प्रमोटर गतिविधि को हटाने के लिए हटा दिया गया है और एक स्वयं को निष्क्रिय वेक्टर (पाप)16उत्पंन । Lentiviral वेक्टर स्टॉक्स के साथ HEK-293T कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक द्वारा उत्पादित किया गया पी 8.91 encapsulation प्लाज्मिड (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-जी एंकोडिंग द vesicular stomatitis वायरस (VSV) ग्लाइकोप्रोटीन-g17, और द pTRIP ΔU3 रिकॉमबिनेंट वेक्टर । विस्तृत उत्पादन प्रक्रिया पूरक विधियों के रूप में प्रदान की गई है ।

उच्च titer lentiviral वेक्टर स्टॉक्स का उत् पादन, उच् च सुरक्षा स् तर की शर्तों (बीएसएल-2) के अंतर्गत किया जाता है । यह बीएसएल में उत्पादित किया जा करने के लिए है कि oncogenes के अलावा सबसे transgenes के लिए सच है-3. इसलिए, अधिकांश मामलों के लिए बीएसएल-2 शर्तों में उत्पादन पर्याप्त है । इसके अलावा, उपयोग और उत्पादन आमतौर पर सबसे राष्ट्रीय नियामक आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों (GMO) के साथ निपटने एजेंसियों के लिए काट रहे हैं । सीमित मात्रा में प्रतिकृति अक्षम सिन lentiviral वैक्टर (2 µ g of p24 कैप्सिड प्रोटीन) का उपयोग बीएसएल-1 शर्तों के तहत किया जा सकता है जैसा यूरोपियन यूनियन की सिफारिशों के साथ समझौते में फ्रांसीसी GMO एजेंसी द्वारा वर्णित है ।

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Protocol

सभी प्रक्रियाओं है कि पशु काम शामिल नैतिक स्वीकृति प्राप्त की है और अनुसंधान और शिक्षा के फ्रांसीसी मंत्रालय ने APAFIS # 5094-20 १६०३२९१६२१९२७४ v6 और ०५३११.०२ के तहत अधिकृत किया गया है । आईसीएम पशु सुविधा PHENOPARC को मान्यता संख्या B75 १३ १९ के तहत फ्रांस के कृषि मंत्रालय द्वारा मान्यता प्रदान की गई है. समग्र प्रोटोकॉल एक सटीक समय सीमा है कि चित्रा 1में संक्षेप में है के भीतर प्रत्येक प्रक्रिया प्रदर्शन की आवश्यकता है ।

1. पशु खरीद और बुनियादी यौगिकों की तैयारी

  1. पशु खरीद
    1. आदेश 25 vasectomized नर B6CBAF1/JRj कि उंर के 8 सप्ताह (♀ C57Bl/6JRj और ♂ CBA/JRj के बीच मूल पार से F1 पीढ़ी) हैं ।
      नोट: आने पर पुरुषों को अलग करें । Vasectomized नर को कम से एक वर्ष के लिए फिर से इस्तेमाल किया जा सकता है ।
      पिंजरों हर 3 सप्ताह बदलें ।
    2. आदेश ५० B6CBAF1/JRj महिलाओं कि उंर के 10 सप्ताह के है और एक पूल में रखने के कम से ५० पशुओं ।
    3. आदेश 10-15 C57BL/6JRj उपजाऊ नर है कि उंर के 8 सप्ताह हैं ।
    4. आदेश 30 C57BL/6JRj महिलाओं कि उंर के 4 सप्ताह हैं ।
  2. संज्ञाहरण और इच्छामृत्यु
    1. संज्ञाहरण ३०० μl ketamine/xylazine मिश्रण की एक मात्रा का उपयोग किया जाता है, इंजेक्शन intraperitoneally (ketamine की एक खुराक पर 150μg/जी शरीर के वजन, xylazine की एक खुराक पर 0.15 μg/ जानवरों हीटिंग पैड के तहत रखा शरीर के तापमान को समायोजित कर रहे हैं । प्रक्रिया शुरू करने से पहले पशु की पूंछ चुटकी द्वारा सजगता की जाँच करें ।
    2. इच्छामृत्यु ग्रीवा विस्थापन द्वारा किया गया था । Decapitation पशु की मृत्यु की पुष्टि करने के लिए एक द्वितीयक पद्धति के रूप में शामिल किया गया था । decapitation द्वारा भ्रूण की इच्छामृत्यु का प्रदर्शन किया गया ।
      नोट: आगमन पर, जानवरों की सुविधा के लिए habituate करने के लिए 1 सप्ताह की एक ंयूनतम अनुमति (कोई हैंडलिंग या संभोग) । महत्वपूर्ण बात, ट्रांसजेनिक लाइनों सहित किसी भी माउस उपभेदों उपजाऊ पुरुषों और superovulation के लिए उपजाऊ महिलाओं के रूप में उपयोग किया जा सकता है । तनाव का चुनाव वैज्ञानिक प्रश्न की आवश्यकताओं के अनुसार किया जाना चाहिए ।
  3. हार्मोन की तैयारी
    1. 1 lyophilized PMSG शीशी में PSMG (गर्भवती घोड़ी सीरम गोनॉडोट्रॉफिन) बफर के ९१० µ एल जोड़ें, १०० µ एल aliquots, और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस ।
      नोट: प्रत्येक aliquot में 11 चूहों के लिए ५५ यूआई शामिल हैं । पहले प्रयोग के बाद कभी भी अधिक से अधिक 2 सप्ताह तक PMSG aliquots न रखें ।
    2. 1 lyophilized एचसीजी की शीशी में एचसीजी (मानव Chorionic गोनॉडोट्रॉफिन) बफर के २७३० µ एल जोड़ें । १०० µ एल aliquots बनाओ, और स्टोर पर-20 डिग्री सेल्सियस ।
      नोट: प्रत्येक aliquot में 11 चूहों के लिए ५५ यूआई शामिल हैं ।
  4. Hyaluronidase तयारी
    1. एक 10 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक समाधान प्राप्त करने और ५० µ l aliquots बनाने के लिए M2 मध्यम के 3 मिलीलीटर के साथ hyaluronidase की 1 शीशी का पुनर्गठन । फिर-20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर ।
  5. शल्य चिकित्सा उपकरण तैयारी
    1. आटोक्लेव का उपयोग कर सभी सर्जरी उपकरण निष्फल ।

2. महिला दानदाताओं की Superovulation

  1. 12 ज दिन-रात चक्र का उपयोग कर एक पशु सुविधा में, दिन पर 2 बजे PMSG इंजेक्षन-3 । 12 दिन पर एचसीजी इंजेक्षन-1 और बस एचसीजी इंजेक्शन के बाद उपजाऊ पुरुषों के साथ मेट ।
  2. दिन-3 पर, PMSG (५५ यूआई) के १०० µ एल के 1 aliquot में बाँझ ०.९% NaCl समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें । १०० µ एल intraperitoneally के साथ 10 C57BL/6JRj महिलाओं इंजेक्षन किसी भी मृत मात्रा के बिना एक सिरिंज का उपयोग कर.
    नोट: प्रत्येक माउस PMSG के 5 UI प्राप्त होगा ।
  3. दिन-1 पर, 1 aliquot में बाँझ ०.९% NaCl समाधान की 1 मिलीलीटर जोड़ें १०० µ एल के एचसीजी (५५ यूआई) की. चूहों कि पतला एचसीजी समाधान (5UI) intraperitoneally के १०० µ एल के साथ PMSG इंजेक्शन प्राप्त इंजेक्शन । किसी भी मृत मात्रा के बिना एक सिरिंज का प्रयोग करें । इंजेक्शन धीरे से प्रदर्शन और सुई निकालने से पहले इंतजार है कि तरल रिसाव नहीं करता है ।
    नोट: प्रत्येक माउस एचसीजी के 5 UI प्राप्त होगा । एचसीजी के इंजेक्शन PMSG के बाद ४६ ज प्रदर्शन किया जाना चाहिए ।
  4. प्रत्येक C57BL/6JRj महिला के पिंजरे में स्टड पुरुष सीधे एचसीजी इंजेक्शन के बाद प्लेस ।
  5. 0 दिन की सुबह पर योनि प्लग की जाँच करें और निषेचित अंडे इकट्ठा करने के लिए सकारात्मक महिलाओं का उपयोग करें ।

3. B6CBAF1/jRj Pseudopregnant मिहला तैयार करें

  1. मेट वन vasectomized एग कलेक्शन (day-1) से पहले दिन पुरुष को 2 B6CBAF1/JRj मिहला के साथ शाम 5 बजे ।
    नोट: यह महिलाओं है कि अलग पिंजरों से उत्पंन कर रहे है महिला चक्र के तुल्यकालन से बचने के साथ दोस्त के लिए बहुत महत्वपूर्ण है । यह योनि प्लग प्राप्त करने की उपज में वृद्धि होगी । इसके अलावा, एक पुरुष पिंजरे कि पिछले 2 दिनों के भीतर बदल दिया गया है करने के लिए एक महिला जोड़ नहीं है । पिंजरे गंदा है जब पुरुष में प्रजनन व्यवहार की प्रभावकारिता बढ़ जाती है ।

4. निषेचित अंडे संग्रह

  1. तैयारी
    1. hyaluronidase कार्य समाधान तैयार करने के लिए hyaluronidase स्टॉक समाधान के लिए M2 के १४५० µ l जोड़ें ।
    2. प्लेस महिला प्रति hyaluronidase काम समाधान के १०० µ एल की एक बूंद १०० mm पेट्री डिश में निषेचित अंडे का उत्पादन और कमरे के तापमान पर रखने के लिए इस्तेमाल किया ।
    3. 4 कुओं प्लेटों में M16 के ५०० µ एल जोड़ें । lentiviral वैक्टर कि इंजेक्शन किया जाएगा के प्रकार प्रति 2 कुओं का प्रयोग करें: एक अच्छी तरह से इंजेक्शन अंडे और अंय गैर इंजेक्शन वाले शामिल होंगे । एक 5% सह2 वातावरण के साथ ३७ डिग्री सेल्सियस पर मशीन में 4 अच्छी तरह से प्लेटें रखें ।
  2. भ्रूण के संग्रह और हैंडलिंग के लिए पिपेट तैयार करें ।
    1. लौ में हार्ड ग्लास केशिका टयूबिंग के केंद्र घूर्णन द्वारा ग्लास हेमाटोक्रिट केशिकाओं (७५ mm/60 µ एल) नरम ।
    2. जल्दी संभव के रूप में गर्मी से केशिकाओं निकालें और के बारे में ३०० µm के एक आंतरिक व्यास के साथ एक ट्यूब प्राप्त करने के लिए खींचने के लिए एक स्वच्छ तोड़ प्राप्त करने के लिए ठंडा ट्यूबिंग पर खींचो ।
  3. oviducts लीजिए.
    1. Euthanize C57BL/6JRj मादा ग्रीवा विस्थापन द्वारा 9 दिन पर हूं 0 । मौत की पुष्टि decapitation द्वारा की जाती है ।
      नोट: यह इच्छामृत्यु विधि IACUC द्वारा अनुमोदित किया गया था और यूरोपीय सिफारिशों का पालन करता है ।
    2. एक बड़ी क्षैतिज चीरा कैंची के साथ उदर गुहा खोलने के लिए प्रदर्शन करते हैं । ओवीडक्ट गर्भाशय और अंडाशय के बीच स्थित है ।
    3. mesometrium और घुमावदार संदंश के साथ प्रमुख रक्त वाहिकाओं ले जाने झिल्ली निकालें ।
    4. ओवीडक्ट को अंडाशय से घुमावदार संदंश से अलग कर दीजिये ।
    5. घुमावदार कैंची का उपयोग अंडाशय से ओवीडक्ट में कटौती करने के लिए एक गाइड के रूप में वक्र संदंश का उपयोग करें ।
    6. ओवीडक्ट को खींचकर घुमावदार कैंची से गर्भाशय से काट लें ।
      चेतावनी: सूजन कलसा कि निषेचित अंडे शामिल नहीं टिकते । पूरी प्रक्रिया बाँझ उपकरणों का उपयोग कर प्रदर्शन.
    7. सभी एकत्र oviducts M2 मध्यम (३५ mm कल्चर डिश) में कमरे के तापमान पर प्लेस
    8. जगह 2 oviducts में ही १०० µ एल ड्रॉप ऑफ hyaluronidase वर्किंग सॉल्यूशन (०.३ mg/
  4. निषेचित अंडे से मेघपुंज कोशिकाओं को हटा दें ।
    1. एक stereomicroscope के तहत, 2 इंसुलिन सीरिंज का उपयोग करें: पहले एक ओवीडक्ट और दूसरा एक पकड़ करने के लिए कलसा आंसू और hyaluronidase काम समाधान में निषेचित अंडे फैलाने के लिए ।
    2. अंडे इकट्ठा करने के लिए तैयार गिलास प्लास्टिक ले लो और यह टयूबिंग और एक ०.२२ माइक्रोन फिल्टर करने के लिए कनेक्ट सभी अंडे महाप्राण करने के लिए मुखपत्र पर मुहिम शुरू की । सभी अंडे ले लीजिए और M2 मध्यम के १०० µ एल के 6 अलग बूंदों में उत्तराधिकारी मार्ग से उन्हें धोने ।
    3. प्लेस humidified ३७ ° c मशीन में 5% सह M16 मध्यम में2 के वातावरण के साथ धोया निषेचित अंडे ।

5. इंजेक्शन पिपेट बनाना

  1. 1 मिमी के एक बाहर व्यास के साथ पतली दीवारों कांच केशिका टयूबिंग (10-15 सेमी लंबे) का प्रयोग करें और क्षैतिज micropipette खींचने में इस केशिका दबाना ।
    नोट: सबसे क्षैतिज पिपेट खींचने में, 3 मापदंडों समायोजित किया जा सकता है: गर्मी बिजली, खींच शक्ति और हीटिंग और पुलिंग के बीच समय देरी । चित्रा 2aमें प्रस्तुत एक के जैसा होता है कि pipets इंजेक्शन प्राप्त करने के लिए इन मापदंडों को समायोजित करें । उपयोगकर्ताओं के लिए है कि नियमित रूप से डीएनए microinjection प्रदर्शन कर रहे हैं, मानक सेटिंग्स का उपयोग करें और हीटिंग के बीच देरी को समायोजित और पिपेट टिप के वैश्विक आकार बदलने के लिए खींच ।

6. होल्डिंग पिपेट बनाना

  1. होल्डिंग पिपेट तैयार करने के लिए एक इंजेक्शन पिपेट का प्रयोग करें ।
  2. एक microforge के लिए एक इंजेक्शन पिपेट संलग्न । microforge के साथ पिपेट कट १०० µm व्यास के लिए ८० के एक तेज सममित टिप प्राप्त करने के लिए । फिर तेज बचाव के बिना एक सममित गोल आकार प्राप्त करने के लिए microforge पर गर्मी के साथ टिप पॉलिश ।

7. Lentiviral वेक्टर युक्त इंजेक्शन पिपेट की तैयारी

  1. १६० एक्स जी पर lentiviral वेक्टर निलंबन के लिए 2 गोली मलबे के लिए मिनट अक्सर जमे हुए lentiviral शेयरों में मौजूद ।
  2. supernatant पुनर्प्राप्त करें और यह एक नया ०.५ एमएल ट्यूब में एक वर्ग द्वितीय सुरक्षा कैबिनेट में स्थानांतरण ।
  3. एक माइक्रो-लोडर का उपयोग कर चरण 5 में वर्णित के रूप में तैयार एक इंजेक्शन पिपेट के लिए supernatant के 1 µ एल स्थानांतरण.
  4. सही micromanipulator के इंस्ट्रूमेंट होल्डर पर इंजेक्शन पिपेट सेट करें । होल्डिंग प्लास्टिक को बाएं micromanipulator से कनेक्ट करें ।
    नोट: lentiviral वेक्टर के transduction titer को सीधे संस्थापक उत्पादन की प्रभावकारिता से संबद्ध किया जाएगा । उच्च प्रभावकारिता के लिए (> 70%), p24 कैप्सिड प्रोटीन की १०० एनजी की सीमा में एक titer के साथ वायरल वैक्टर का उपयोग करें/µ एल जब titer को transduction यूनिट्स (tu) के रूप में व्यक्त किया जाता है तो titer 109 मं/एमएल से ऊपर होना चाहिए । Lentiviral वेक्टर स्टॉक 293T कोशिकाओं के क्षणिक अभिकर्मक के साथ पी 8.91 encapsidation प्लाज्मिड, pHCMV-जी, एंकोडिंग vesicular stomatitis वायरस (VSV) ग्लाइकोप्रोटीन-g के रूप में पूरक विधियों18में वर्णित द्वारा उत्पादित किया जाना चाहिए ।

8. माइक्रो इंजेक्शन

  1. एक अवसाद स्लाइड के केंद्र में M2 माध्यम के 8 µ एल वितरण और प्रकाश आयल तेल (भ्रूण परीक्षण) के साथ वाष्पीकरण से बचने के लिए कवर ।
  2. ड्रॉप में 20 अंडे प्लेस के रूप में सबसे कम संभव के रूप में फैलाया ।
    सावधानी: भ्रूण जमा करते समय बुलबुले न बनाएं ।
  3. सुनिश्चित करें कि इंजेक्शन पिपेट की नोक खुली है । यदि नहीं, तो पकड़े पिपेट के साथ इंजेक्शन पिपेट पर टैप करें ।
  4. 20 एस के एक इंजेक्शन समय के लिए microinjector सेट करें ।
    नोट: वायरल निलंबन की चिपचिपाहट perivitelline अंतरिक्ष में वायरल वेक्टर के फैलाव के स्पष्ट दृश्य की अनुमति देता है । इंजेक्शन दबाव के क्रम में समायोजित किया जाना चाहिए के लिए इंजेक्शन के 20 एस, जो 10 से १०० pL के एक खंड का प्रतिनिधित्व करता है के भीतर पूरे अंतरिक्ष को भरने के लिए । इंजेक्शन दबाव ६०० hPa से अधिक नहीं होना चाहिए ।
  5. महाप्राण एक निषेचित अंडा कि stereomicroscope के तहत पकड़े पिपेट के साथ 2 प्रो नाभिक और 2 ध्रुवीय निकायों शामिल हैं ।
  6. microinjector के साथ अंडे सुई ८.४ में वर्णित सेटिंग्स का उपयोग कर, perivitelline अंतरिक्ष में ।
    चेतावनी: इंजेक्शन प्लास्टिक के साथ प्लाज्मा झिल्ली स्पर्श नहीं है ।
  7. 20 अंडे के बैचों में उपलब्ध सभी निषेचित अंडे इंजेक्षन और 5% CO2के एक वातावरण के साथ humidified ३७ ° c मशीन में पूर्व गरम M16 माध्यम में तुरंत इंजेक्शन अंडे जगह है ।
    नोट: भ्रूण स्थानांतरण से पहले इंजेक्शन के बाद 30 मिनट की एक ंयूनतम के लिए इंजेक्शन अंडे की मशीन ।

9. B6CBAF1/JRj Pseudopregnant मिहला में भ्रूणों का अंतरण

  1. जांच शयन प्लग 16 B6CBAF1/JRj महिलाओं के साथ संभोग के बाद एच B6CBAF1/JRj पुरुष नसबंदी नर । यह सिर्फ अंडा संग्रह शुरू करने से पहले ।
  2. इंजेक्शन भ्रूण के लिए आरोपण पिपेट तैयार करते हैं ।
    1. भ्रूण को एकत्रित करने और संभालने के लिए बताए गए भ्रूणों के लिए आरोपण पिपेट (स्टेप ४.२) बनाएं । के बारे में एक आंतरिक व्यास के साथ पिपेट का चयन करें लगभग १५० µm लंबाई में 4-5 सेमी के आसपास एक संकीर्ण भाग के साथ ।
      नोट: टिप लौ पॉलिश किया जाना चाहिए, ताकि अंडे या ओवीडक्ट के लिए संभव नुकसान को कम करने के लिए ।
      1. बस पिपेट कंधे से ऊपर प्रकाश आयल तेल (भ्रूण परीक्षण) के साथ भरें ।
      2. महाप्राण एक छोटे से हवा बुलबुला, तो M2 मध्यम, और अंत में एक दूसरे हवा बुलबुला ।
      3. ऊपर भ्रूण एक दूसरे के पीछे एक को आकर्षित करने के लिए मध्यम कि भ्रूण के साथ साथ ओवीडक्ट में इंजेक्ट किया जाएगा की कुल मात्रा को कम ।
      4. प्रकाश आयल तेल की एक बहुत छोटी बूंद (भ्रूण परीक्षण) के बारे में एक भ्रूण की चौड़ाई का लदान करके समाप्त करें ।
        सावधानी: पिपेट को संभालते समय कोमलता बरतें ।
  3. भ्रूण हस्तांतरण ।
    1. सभी उपकरणों निष्फल ।
    2. Anesthetize ३०० बाँझ NaCl ०.९% μg के शरीर के वजन के जी के प्रति g १५० Ketamine और ०.१५ μg के शरीर के वजन के प्रति ग्राम के μL युक्त समाधान की एक intraperitoneal इंजेक्शन का उपयोग कर मादा ।
    3. संदंश के साथ पशु की पूंछ चुटकी द्वारा संज्ञाहरण की गहराई की जाँच करें और प्रक्रिया शुरू करने से पहले एनाल्जेसिक (Buprenorphine) के subcutaneouly 0.1 मिलीग्राम/
    4. पिछले रिब के स्तर पर रीढ़ की हड्डी के साथ पीठ के दोनों किनारों पर 2 सेमी दाढ़ी ।
    5. एक हीटिंग पैड पर और एक बाँझ क्षेत्र में महिला माउस प्लेस । वापस माउस के बीच में एक 2 सेमी x 2 सेमी विंडो काटें ।
    6. त्वचा पर एक एंटीसेप्टिक समाधान (10% Povidone आयोडाइड) लागू करें और एक 1 सेमी अनुप्रस्थ चीरा कैंची के साथ बनाने के लिए, फिर त्वचा को बाद में स्लाइड जब तक अंडाशय (नारंगी रंग) शरीर की दीवार के माध्यम से दिखाई दे रहा है ।
    7. सिर्फ एक दूरबीन शल्य माइक्रोस्कोप के तहत ठीक कैंची के साथ अंडाशय के ऊपर शरीर की दीवार में एक 5 मिमी चीरा बनाओ ।
    8. एक atraumatic बुलडॉग दबाना के साथ वसा पैड उठाओ और अंडाशय, ओवीडक्ट और गर्भाशय के ऊपर खींच ।
    9. कलसा कल्पना और ओवीडक्ट खंड है कि कलसा को अंडाशय लिंक पर vannas कैंची के साथ एक hemisection बनाते हैं ।
    10. हस्तांतरण भ्रूण पिपेट परिचय और कलसा में अंडे देने, आरोपण पिपेट में पहली हवा बुलबुला पर रोक ।
    11. दूसरी ओवीडक्ट पर कार्यविधि को दोहराएँ ।
    12. घाव क्लिप के साथ त्वचा को बंद करें ।
    13. पूरी तरह से जाग जब तक वसूली चैंबर (३९ ° c, 30-60 मिनट) में पशु प्लेस ।
    14. दोहराने के बाद एनाल्जेसिक इंजेक्शन 12 एच और ४८ ज दर्द या संकट के संकेत के मामले में ।
    15. घाव क्लिप निकालें 7-10 दिनों सर्जरी के बाद ।
    16. प्रत्यारोपण के बाद हर 3 दिन उनके वजन वक्र का पालन करके गर्भावस्था के लिए प्रत्यारोपित महिलाओं की जांच करें । एक महत्वपूर्ण वजन प्रत्यारोपण के बाद 10 से 12 दिनों के लिए मनाया जा सकता है और गर्भावस्था के लिए संकेत दिया जाएगा ।
      नोट: सभी भ्रूण है कि यहां का विकास होगा ख्यात ट्रांसजेनिक संस्थापकों का प्रतिनिधित्व करेंगे । इन संस्थापकों के phenotype का विश्लेषण इन ट्रांसजेनिक पशुओं की पीढ़ी से जुड़े वैज्ञानिक प्रश्न के अनुसार किसी भी विकासात्मक अवस्था या जन्म के बाद ही किया जा सकता है.

10. Genotyping ट्रांसजेनिक संस्थापक

  1. 10 मिमी Tris-एचसीएल, पीएच 8 युक्त genotyping बफर तैयार; 5 मिमी EDTA, ०.२% एसडीएस (डब्ल्यू/वी), ५० mm NaCl के साथ पीएच ८.० । एक ०.२२ µm फिल्टर और कई महीनों के लिए कमरे के तापमान पर स्टोर के माध्यम से genotyping बफर निष्फल ।
  2. extraembryonic झिल्ली डाल (भ्रूण के लिए) या पूंछ का छोटा टुकड़ा (जंम जानवरों के लिए) में ५०० µ फ़िल्टर genotyping बफर के एल और जोड़ें 15 µ एल के proteinase K (20 मिलीग्राम/एमएल) । ५५ डिग्री सेल्सियस पर रात भर गर्मी ।
  3. 5 मिनट के लिए १५,००० x g पर lysate केंद्रापसारक और फिर पीसीआर प्रतिक्रिया के लिए supernatant के 1 µ एल का उपयोग करें । Lysate कई महीनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित किया जा सकता है ।
  4. एक 20 µ एल प्रतिक्रिया मात्रा में transgene के एक टुकड़े की पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन 1x पीसीआर बफर, १.५ मिमी MgCl2, २०० µ मीटर की dNTPs, प्रत्येक पीसीआर प्राइमरों के ०.२ µ मीटर, Taq डीएनए पोलीमरेज़ के 1 यूआई और प्रत्येक पचता नमूना के 1 µ एल. ऋणात्मक नियंत्रण के रूप में, H2O के 1 µ l का उपयोग करें । एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में, transgene युक्त lentiviral वेक्टर प्लाज्मिड से डीएनए का उपयोग करें ।
  5. eGFP वर्णित उपयोग का पता लगाने के लिए:
    eGFP आगे प्राइमर: 5 ' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3 '
    eGFP रिवर्स प्राइमर: 5 ' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3 '
  6. एक thermocycler में पीसीआर प्रवर्धन प्रदर्शन: ९४ ° c पर 4 मिनट ९४ ° c, 1 मिनट में ६० ° c, और ७२ डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट में 1 मिनट के ३५ चक्र के बाद ।
  7. 2% agarose जेल पर पीसीआर उत्पाद लोड करने के लिए एक ३०० बीपी eGFP पीसीआर उत्पाद की कल्पना के रूप में चित्रा बी1 में सचित्र ।
    नोट: ३०० बीपी पीसीआर बैंड दिखा सभी व्यक्तियों eGFP transgene एकीकृत किया है और transgenics के रूप में माना जा सकता है ।
  8. ट्रांसजेनिक पशुओं में transgene अभिव्यक्ति का विश्लेषण करें । उदाहरण के लिए, ऊतकवैज्ञानिक और immunostaining के रूप में चित्रा 3 और चित्रा 4 में सचित्र प्रदर्शन और पूरक तरीकों में वर्णित है ।
    नोट: दोनों transgene अभिव्यक्ति विश्लेषण और phenotype विश्लेषण वैश्विक वैज्ञानिक प्रश्न के अनुसार उचित तरीकों का उपयोग किया जाना चाहिए ।

11. ठहराव की Transgene कॉपी संख्या

  1. मात्रात्मक पीसीआर के लिए डीएनए नमूने तैयार करें ।
    1. निकालने जीनोमिक डीएनए (gDNA) Proteinase K lysate में प्राप्त से १०.३ कदम में एक वाणिज्यिक किट का उपयोग कर निर्माता निर्देश के अनुसार ।
    2. २६० एनएम पर spectrophotometry द्वारा gDNA यों ।
    3. एक 10 एनजी/µ एल अंतिम एकाग्रता के लिए प्रत्येक gDNA नमूना पतला ।
    4. प्रत्येक नमूने के लिए, तैयार 5 सीरियल कमजोरियां (1:5) एच2में निंनलिखित सांद्रता में 6 ट्यूबों प्राप्त करने के लिए हे: 10 एनजी/µ एल, 2 एनजी/µ एल, ०.४ एनजी/µ एल, ०.०८ एनजी/µ एल, ०.०१६ एनजी/µ एल और ०.००३२ एनजी/µ एल
  2. मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) रिएक्शन मिक्स तैयार करें ।
    1. qPCR के लिए प्राइमरी मिक्स तैयार करें । प्रत्येक प्राइमरी जोड़ी के लिए qPCR के लिए उपयोग करने के लिए, आगे प्राइमर के 10 µ एल जोड़ें (१०० µ एम प्राइमर स्टॉक समाधान), रिवर्स प्राइमर के 10 µ एल (१०० µ मीटर) और ८० µ एल के एच2ओ ।
      नोट: eGFP बढ़ाना, आगे TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA और रिवर्स TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG प्राइमरों का उपयोग करें । Cdx2 जीन qPCR (जीनोम प्रति 2 प्रतियां) के लिए सामांय के रूप में प्रयोग किया जाता है । Cdx2 सामांयीकरण के लिए आगे GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG और रिवर्स GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT प्राइमरों का उपयोग करें
    2. तैयार 2 qPCR घोला जा सकता है, eGFP प्राइमर मिश्रण और Cdx2 प्राइमरी मिश्रण के साथ एक के साथ एक । प्रत्येक gDNA के डुप्लीकेट में 6 कमजोरियां बढ़ाना पर्याप्त qPCR मिश्रण तैयार करें । एक qPCR प्रतिक्रिया ३.८ µ एल एच2ओ, फ्लोरोसेंट हरी 2x प्रतिक्रिया मिश्रण के 5 µ एल और प्राइमरी मिश्रण के ०.२ µ एल शामिल हैं ।
      नोट: परीक्षण करने के लिए प्रत्येक ट्रांसजेनिक पशु के लिए, 24 qPCR प्रतिक्रियाओं का प्रदर्शन किया जाएगा । प्रतिक्रिया मिश्रण एक ३८४ अच्छी तरह से qPCR मशीन के लिए प्रदान की जाती है ।
    3. प्रत्येक पशु के लिए परीक्षण, वितरित: 12 कुओं के साथ 9 µ l के eGFP qPCR मिश्रण और 12 कुओं के साथ 9 µ l के Cdx2 qPCR मिश्रण. eGFP qPCR मिश्रण और eGFP qPCR मिश्रण युक्त 2 कुओं से युक्त 2 कुओं के लिए प्रत्येक gDNA कमजोर पड़ने के 1 µ एल जोड़ें ।
    4. प्रत्येक qPCR मिश्रण के लिए 2 कुओं को छोड़ दें जिसमें gDNA को एच2ओ की जगह नेगेटिव कंट्रोल के रूप में किया गया ।
  3. qPCR मशीन में ३८४ अच्छी तरह से थाली रखें और निम्नलिखित चल रहे प्रोटोकॉल लागू करें: 10 मिनट में ९५ ° c तो ५० चक्र के 10 एस पर ९५ ° c और 1 मिनट में ६० ° c.
  4. डेटा का विश्लेषण करें । प्रत्येक gDNA के लिए परीक्षण, कुल gDNA राशि (डुप्लिकेट में 6 अंक) के लॉग के एक समारोह के रूप में सीटी मूल्यों प्लॉट । वक्र रेखीय प्रतीपगमन के साथ कम से वर्ग विधि का उपयोग कर फ़िट करें और एक्सट्रपलेशन सीटी मान के साथ इसी अवरोधन करने के लिए y अक्ष । eGFP के लिए extrapolated सीटी मानों का उपयोग करें और सामान्यीकृत Cdx2 मानक 2Cdx2 विधि11का उपयोग करते हुए ΔdCt (2 प्रतिलिपियाँ) के सापेक्ष eGFP प्रतिलिपि संख्या की गणना करने के लिए ।

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Representative Results

ट्रांसजेनिक पशु यहां प्रस्तुत प्रोटोकॉल का उपयोग कर उत्पंन किया गया । प्रतिनिधि परिणाम दोनों सर्वव्यापी और कोशिका प्रकार विशिष्ट transgene अभिव्यक्ति सचित्र हैं ।

transgenes के गठन की अभिव्यक्ति

सर्वव्यापी प्रवर्तकों को निरंतर और कुशल ढंग से transgenes व्यक्त करने के लिए आधारभूत अनुसंधान उपकरण हैं. इस तरह के प्रवर्तकों से आवेदन की एक बहुत बड़ी विविधता के लिए उपयोग किया जाता है इन विट्रो सेल अभिकर्मक में vivo transgenesis में छोटे और बड़े जानवर हैं ।

Lentiviral वैक्टर ग्रीन फ्लोरोसेंट रिपोर्टर जीन (eGFP) या तो cytomegalovirus (सीएमवी) प्रमोटर या समग्र प्रमोटर सीएजी चिकन actin प्रमोटर और सीएमवी बढ़ाने के फ्यूजन पर आधारित के नियंत्रण के तहत व्यक्त करने के लिए निर्माण किया गया । दोनों lentiviral वैक्टर (पूरक तरीके) का उत्पादन किया गया और titer 293T कोशिकाओं में eGFP अभिव्यक्ति के आधार पर transduction इकाइयों (टू) के रूप में निर्धारित किया गया था । दोनों lentiviral वेक्टर construction perivitelline अंतरिक्ष में निषेचित अंडाणुओं की एकाग्रता पर 109 मं/एमएल और छद्म गर्भवती महिला चूहों में प्रत्यारोपित किया गया । प्रत्यारोपित भ्रूण अगले बस जंम से पहले एकत्र किए गए और genotyped पीसीआर द्वारा eGFP एकीकरण का पालन करें । ७३% (n = 22) और ८३% (n = 32) एकत्र भ्रूण के सीएमवी और सीएजी lentiviral निर्माण के लिए transgene एकीकृत था, क्रमशः (तालिका 1) । ट्रांसजेनिक भ्रूण तो खोदी गई और इंयूनो-eGFP के लिए दाग पड़ गए. के रूप में चित्रा 3में सचित्र, केवल बिखरे हुए eGFP सकारात्मक कोशिकाओं सीएमवी प्रमोटर के साथ मनाया जाता है (चित्रा 3, शीर्ष पैनल) जबकि सभी कोशिकाओं GFP व्यक्त जब सीएजी प्रमोटर (चित्रा 3, मध्य और नीचे पैनलों) का इस्तेमाल किया गया था ।

सीएजी प्रमोटर, एकत्र ट्रांसजेनिक भ्रूण के ९६% के साथ बैरे eGFP transgene (तालिका 1) व्यक्त की है । हालांकि दोनों प्रवर्तक सर्वव्यापी हैं, लेकिन केवल सीएजी प्रवर्तक सभी कोशिकाओं में transgene की मजबूत अभिव्यक्ति को ड्राइव करने में सक्षम है । वैकल्पिक सर्वव्यापी प्रवर्तकों ऐसे phosphoglycerate कळेनासे (PGK) और ubiquitin-सी प्रवर्तकों के रूप में इस्तेमाल किया और eGFP के निचले अभिव्यक्ति स्तर के साथ सीएजी प्रमोटर के साथ प्राप्त लोगों के रूप में इसी तरह के परिणाम (डेटा दिखाया नहीं) थे ।

वीवो में ऊतक विशिष्ट नियंत्रण तत्वों का परीक्षण करने के लिए विनियामक जीनोमिक क्षेत्रों का मानचित्रण ।

अनुप्रयोगों की एक बड़ी संख्या के लिए, ट्रांसजेनिक पशुओं में एक कोशिका विशेष तरीके से transgenes की अभिव्यक्ति की आवश्यकता है । इसके अलावा, ट्रांसजेनिक पशुओं की पीढ़ी अत्यधिक ख्यात विनियामक जीनोमिक डीएनए टुकड़े की क्षमता स्क्रीन करने के लिए एक दिया जीन के सेल विशिष्ट अभिव्यक्ति नियंत्रण वाद्य हो सकते हैं । एक उदाहरण के रूप में, ट्रांसजेनिक पशुओं के lentiviral मध्यस्थता उत्पादन सेल विशिष्ट बढ़ाने कि नियंत्रण Neurogenin 3 (Neurog3) अभिव्यक्ति11नक्शा करने के लिए इस्तेमाल किया गया था. Neurog3 एक आधार है कुण्डली-पाश-कुण्डली (bHLH) प्रतिलेखन कारक जो अग्नाशय progenitors की प्रतिबद्धता को नियंत्रित करता है । Neurog3 नल उत्परिवर्ती चूहों में, अग्ंयाशय में कोई अंत में स्रावी कोशिकाओं19अंतर कर सकते हैं । एक २.२ kb डीएनए अंश-५२८४ और-३०६१ Neurog3 प्रतिलेखन प्रारंभ साइट के सापेक्ष एक lentiviral वेक्टर नदी के ऊपर एक बीटा ग्लोबिन ंयूनतम प्रमोटर एक eGFP रिपोर्टर की अभिव्यक्ति ड्राइव के रूप में पहले वर्णित में क्लोन किया गया 11. एक नियंत्रण निर्माण इसी lentiviral रीढ़ में माउस 6 (chr6: mm9 माउस जीनोम विधानसभा के सापेक्ष 14237279-14239685) पर स्थानीयकृत २.४ kb intergenic टुकड़ा क्लोनिंग द्वारा उत्पंन किया गया था । इस जीनोमिक क्षेत्र Gpr85 और Ppp1r3a जीन के बीच एक 1 मेगा आधार लंबे जीन रेगिस्तान के भीतर स्थानीयकृत है । उच्च titer lentiviral वैक्टर अगले दोनों के निर्माण का उपयोग कर उत्पादन किया गया और नाम Neurog3-ेंअ-eGFP और Chr6-eGFP ।

दोनों lentiviral वैक्टर का निर्माण और उत्पादन किया गया (पूरक तरीके) । चूंकि वर्तमान में Neurog3 व्यक्त कक्ष उपलब्ध नहीं थे, इसलिए टू titer का निर्धारण नहीं किया जा सका । वैकल्पिक रूप से, titer p24 कैप्सिड प्रोटीन की एकाग्रता के रूप में मापा गया था । 2 वैक्टर निषेचित अंडाणुओं के perivitelline अंतरिक्ष में इंजेक्शन और छद्म गर्भवती मादा चूहों में प्रत्यारोपित किया गया । प्रत्यारोपित भ्रूण भ्रूण दिवस १४.५ (ई 14.5) में एकत्र किए गए इस विकास के चरण के रूप में अग्ंयाशय में Neurog3 के अधिक से अधिक अभिव्यक्ति से मेल खाती है । भ्रूण eGFP एकीकरण का पालन करने के लिए अगले genotyped थे । ८४% (n = 47) और ७१% (n = 48) एकत्र भ्रूण के लिए transgene को एकीकृत किया था Neurog3-ेंअ-eGFP और Chr6-eGFP lentiviral का निर्माण क्रमशः (तालिका 1) । प्रत्येक भ्रूण के लिए अग्नाशय की कली को विच्छेदित किया गया और फिर immunostaining प्रदर्शन करने के लिए खोदी गई । Neurog3-ेंअ-eGFP ट्रांसजेनिक भ्रूण का ९२% अग्न्याशय में eGFP व्यक्त के रूप में चित्रा 4 शीर्ष पैनल में सचित्र (प्रतिनिधि immunostaining) । महत्वपूर्ण बात, eGFP सकारात्मक कोशिकाओं के विशाल बहुमत भी कोशिकाओं को व्यक्त Neurog3 थे (चित्रा 4) यह दर्शाता है कि २.२ kb Neurog3 बढ़ाने Neurog3 सेल जनसंख्या के भीतर eGFP अभिव्यक्ति को प्रतिबंधित करने में सक्षम है. विरोध करके, Chr6-eGFP भ्रूण में से कोई भी eGFP (चित्रा 4 नीचे पैनल और तालिका 1) अग्ंयाशय या अग्न्याशय के बाहर में व्यक्त की है । इसके अलावा, eGFP की कोई अस्थानिक अभिव्यक्ति Neurog3में अग्ंयाशय के बाहर मनाया गया-ेंअ-eGFP भ्रूण11।

4 ऊपर प्रस्तुत प्रयोगों के लिए, प्रक्रिया के प्रत्येक चरण का एक सटीक मात्रात्मक विवरण तालिका 1में प्रस्तुत किया जाता है । यह प्रक्रिया की वैश्विक प्रभावकारिता दिखाता है । वास्तव में, जब एकत्र पशुओं की संख्या है कि एकीकृत नंबर के साथ transgene की तुलना निषेचित अंडे इंजेक्ट, प्रक्रिया के वैश्विक उपज के औसत में ४४% है । एक Neurog3 बढ़ाने बीटा-galactosidase रिपोर्टर से जुड़े निर्माण के एक परमाणु डीएनए इंजेक्शन के साथ ही उपज ३.१% से अधिक नहीं है ।

एक lentiviral वेक्टर के साथ निषेचित अंडाणुओं के Transduction transgene एकीकरण की ओर जाता है जो एकाधिक साइट्स पर10,13हो सकता है । transgene एकीकरण साइटों की सापेक्ष संख्या जीनोमिक डीएनए (चित्रा 5) पर मात्रात्मक पीसीआर का उपयोग मूल्यांकन किया गया । eGFP एकीकरण के ठहराव मात्रात्मक पीसीआर (qPCR) द्वारा निर्धारित किया गया था और Cdx2 जीन है कि पहले11वर्णित के रूप में प्रति जीनोम 2 प्रतियां में मौजूद है के लिए सामान्यीकृत । एकीकरण स्थलों की औसत संख्या १९.३६ ± २.४६८ (S.E.M.) और ९.५३७ ± १.१८६ (S.E.M.) Neurog3-ेंअ-eGFP और Chr6-eGFP निर्माण, क्रमशः से उत्पंन भ्रूण में था । दिलचस्प है, इन जानवरों का उत्पादन करने के लिए इस्तेमाल दो lentiviral वैक्टर अलग वायरल titers प्रस्तुत किया । p24 कैप्सिड प्रोटीन की एकाग्रता Neurog3-ेंअ-eGFP वेक्टर के लिए १२४ एनजी/µ एल के थे और नियंत्रण µ-Chr6 वेक्टर के लिए ५२ एनजी/eGFP एल के । यह सबसे अधिक संभावना है कि इस तरह के titer अंतर ट्रांसजेनिक भ्रूण (चित्रा 5) की दोनों जनसंख्या में एकीकरण साइट संख्या में मनाया महत्वपूर्ण अंतर के लिए खाते में होगा । यह पता चलता है कि एकीकरण के संस्थापक ट्रांसजेनिक चूहों के एक बैच में प्राप्त साइटों की औसत संख्या अलग titers के साथ वायरल शेयरों का उपयोग करके संग्राहक जा सकता है ।

महत्वपूर्ण बात, Neurog3में eGFP की अभिव्यक्ति के बीच कोई सीधा संबंध नहीं देखा गया-ेंअ-eGFP ट्रांसजेनिक भ्रूण और transgene प्रतियां कि एकीकृत किया गया की संख्या । दूसरे शब्दों में, भ्रूण है कि या तो एक या Neurog3-ेंअ-eGFP transgene की एकाधिक प्रतियां एकीकृत इसी तरह eGFP सकारात्मक कोशिकाओं में Neurog3 व्यक्त पाया गया ।

Figure 1
चित्रा 1: समग्र प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: माइक्रो इंजेक्शन पिपेट और genotyping की तैयारी.
(एक) microinjection पिपेट के योजनाबद्ध चित्र डीएनए या lentiviral वेक्टर इंजेक्शन के लिए इस्तेमाल pipets के बीच मुख्य अंतर को उजागर करने के लिए । बायां फलक: दोनों पिपेट प्रकारों की समग्र आकृति तैयार की गई है । धराशायी सर्कल प्लास्टिक टिप के बढ़े हुए क्षेत्र पर प्रकाश डाला गया । प्लास्टिक सुझावों के चित्र भी प्रस्तुत किए गए हैं. ध्यान दें कि lentiviral इंजेक्शन के लिए टिप के रूप में बिंदीदार रेखा और इसी तस्वीर के साथ संकेत दिया टूट जाने की जरूरत है । सही पैनल: बाईं ओर पकड़े प्लास्टिक के साथ अंडा इंजेक्शन सेटिंग का उदाहरण, निषेचित अंडा और इंजेक्शन प्लास्टिक एक नाभिक में या perivitelline अंतरिक्ष में या तो । स्केल बार्स = ५० µm. (ख) eGFP पीसीआर के agarose जेल पर दृश्य जीनोमिक डीएनए से प्रवर्धित 8 अलग भ्रूण (लेन 1 से 8) निकाले गए । केवल भ्रूण 1, 2, 3, 5, 6 और 8 eGFP transgene एकीकृत किया था । डीएनए प्लाज्मिड pTrip PGK-eGFP के लिए इस्तेमाल किया lentiviral वेक्टर उत्पादन पीसीआर सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया था । नेगेटिव कंट्रोल के लिए एच2ओ ने पीसीआर रिएक्शन में डीएनए की जगह ली । MWM: आणविक वजन मार्कर । बीपी = आधार युग्म । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: सर्वव्यापी प्रवर्तकों ट्रांसजेनिक भ्रूण में eGFP रिपोर्टर की अभिव्यक्ति ड्राइव ।
10 µm क्रायो-ट्रांसजेनिक भ्रूण के वर्गों eGFP अभिव्यक्ति (हरा) और नाभिक (नीला) कल्पना करने के लिए दाग थे । सीएमवी प्रवर्तक lentiviral निर्माण (ऊपर बाएं लेबल) के साथ उत्पंन भ्रूण e 11.5 पर एकत्र किए गए थे । सीएजी प्रमोटर lentiviral (नीचे बाएं लेबल) के साथ उत्पंन भ्रूण ई 18.5 में एकत्र किए गए । पंजाब: अग्नाशय कली, VSC: ventral रीढ़ की हड्डी, वीटी: बांस, ली: जिगर, एमएस: पेट बेल्ट की मांसपेशी । स्केल बार्स = ५० µm कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: ट्रांसजेनिक भ्रूण में रिपोर्टर जीन के सेल विशिष्ट अभिव्यक्ति Neurog3 बढ़ाने से प्रेरित है । 10 µm क्रायो-ट्रांसजेनिक भ्रूण के 14.5 अग्नाशय कलियों ई के वर्गों Neurog3 (लाल), eGFP (हरा) और नाभिक (नीला) के रूप में पूरक तरीकों में वर्णित की अभिव्यक्ति की कल्पना दाग थे) । Neurog3 अभिव्यक्ति अग्न्याशय में बिखरा हुआ है । ट्रांसजेनिक भ्रूण है कि एकीकृत Neurog3-ेंअ-eGFP का निर्माण एक्सप्रेस eGFP और eGFP सकारात्मक कोशिकाओं के अधिकांश Neurog3 सकारात्मक (शीर्ष पैनल) हैं । Chr6-eGFP निर्माण के साथ उत्पंन भ्रूण व्यक्त eGFP (नीचे पैनल) नहीं थे । स्केल बार्स = ५० µm कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: एकीकृत transgenes की सापेक्ष प्रति संख्या । प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित CDX2 जीन के सापेक्ष eGFP एकीकरण स्थलों की ठहराव. बॉक्स प्लॉट २५th से ७५वाँ शतमक. डॉट्स अलग ट्रांसजेनिक भ्रूण है कि उत्पंन किया गया प्रतिनिधित्व करते हैं । दो lentiviral constructs के बीच transgenes एकीकृत स्थलों की तुलना काफी अलग है (ख़राब पैरामीट्रिक टी परीक्षण, पी = ०.००१) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Table
तालिका 1: चरण द्वारा चरण मात्रात्मक रिपोर्ट पूर्ण प्रक्रिया के दौरान। प्रक्रिया के दौरान, अंडे या भ्रूण की कुल संख्या को गिना गया । पहला कॉलम अंडे कि superovulated महिलाओं के oviducts से प्राप्त किए गए थे की कुल संख्या का प्रतिनिधित्व करता है । स्पष्ट 2 ध्रुवीय निकायों और/या दिखाई pronuclei के साथ ही अंडे इंजेक्शन थे और रिपोर्ट कर रहे हैं । इंजेक्शन और संस्कृति में कुछ घंटे के बाद केवल अंडे कि लीजड ड नहीं थे और एक सामांय आकृति विज्ञान प्रत्यारोपित किया गया था । अगले भ्रूण है कि pseudopregnant महिलाओं से एकत्र किए गए की कुल संख्या गिनी जाती हैं । अंत में, भ्रूण है कि transgene एकीकृत किया था और रिपोर्टर पिछले दो कॉलम में सूचीबद्ध हैं । एक ही विशेषताएं मानक pronuclei डीएनए इंजेक्शन का उपयोग कर एक प्रयोग के साथ तुलना के लिए भी दिया जाता है । यहां transgene Neurog3 बढ़ाने एक बीटा-galactosidase रिपोर्टर जीन (Neurog3-ेंअ-LacZ) की अभिव्यक्ति ड्राइविंग निहित है । कृपया यहां क्लिक करें इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए ।

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Discussion

निषेचित अंडाणुओं में lentiviral वैक्टर के perivitelline इंजेक्शन यहां वर्णित ट्रांसजेनिक भ्रूण है कि एकत्र भ्रूण की कुल संख्या के सापेक्ष ट्रांसजेनिक भ्रूण के ७०% से अधिक उपज के उत्पादन के परिणामस्वरूप । यह परिणाम पिछले रिपोर्ट के संगत है और कार्यविधि2,7,10,11,12की विशिष्टता को मिसाल है । तालिका 1में प्रस्तुत सभी डेटा की तुलना करते समय, महत्वपूर्ण सुविधाओं को हाइलाइट किया जा सकता है. सबसे पहले, प्रत्यारोपित अंडे की संख्या सभी अंडे कि एक सामांय आकृति विज्ञान था या संस्कृति में कुछ घंटों के बाद लीजड ड नहीं थे इंजेक्शन से मेल खाती है । इंजेक्शन अंडे का ९३% perivitelline अंतरिक्ष में lentiviral वेक्टर के इंजेक्शन के कारण तेजी से विषाक्तता के एक लगभग पूर्ण अनुपस्थिति का सुझाव प्रत्यारोपित किया गया । स्थिति नाटकीय रूप से अलग है जब डीएनए इंजेक्शन पर विचार के बाद से ही इंजेक्शन अंडे के ४४% बच गया था और प्रत्यारोपित किया गया । इसके अलावा, एकत्र भ्रूण का अनुपात प्रत्यारोपित अंडे के सापेक्ष दो प्रक्रियाओं के बीच समान है, lentiviral वैक्टर के कोई गहरा दीर्घकालिक विषाक्तता का सुझाव । दूसरा, जब भ्रूण की संख्या है कि एकीकृत अंडे इंजेक्शन की संख्या के सापेक्ष transgene वैश्विक उपज से अधिक 10 बार lentiviral वेक्टर इंजेक्शन के साथ डीएनए इंजेक्शन की तुलना में अधिक है व्यक्त । एक ८६-गुना अंतर भी पाया जाता है जब दो ही Neurog3 बढ़ाने का उपयोग कर प्रक्रियाओं के बीच transgene व्यक्त भ्रूण की संख्या की तुलना का निर्माण ।

महत्वपूर्ण बात यह है कि ट्रांसजेनिक उत्पादन उपज का उपयोग lentiviral वैक्टर के transduction titer के आश्रित होने लगता है । दूसरे शब्दों में, lentiviral वैक्टर 109 मं/एमएल के ऊपर एक titer के साथ उत्पादित इस तरह के उच्च उपज प्राप्त करने के लिए पर्याप्त हैं । प्रोटोकॉल अनुभाग में वर्णित के रूप में, perivitelline स्थान में इंजेक्ट किया गया वॉल्यूम 10 से १०० pL की श्रेणी में है । यह मात्रा 10 से १०० सक्रिय lentiviral कणों का प्रतिनिधित्व करेगी । मानक pronuclei डीएनए इंजेक्शन की तुलना में, जन्मे जानवरों की एक ही राशि के साथ उत्पन्न संस्थापक जानवरों की कुल संख्या lentiviral वैक्टर का उपयोग करते समय कम से कम 10 गुना अधिक है. इसके अलावा, transgene की अभिव्यक्ति penetrance इस प्रोटोकॉल के साथ अत्यंत उच्च है और सीएमवी प्रमोटर के अपवाद के साथ सर्वव्यापी और कोशिका विशिष्ट प्रवर्तकों के साथ दोनों मनाया गया । विरोध करके सेलुलर सर्वव्यापी प्रवर्तकों, सीएमवी प्रमोटर सक्रिय रूप से डीएनए मिथाइल20 से बंद है और pluripotent स्टेम सेल21में transduction पर दीर्घकालिक अभिव्यक्ति बनाए रखने में असमर्थ होने के लिए दिखाया गया है । यह eGFP व्यक्त कोशिकाओं ट्रांसजेनिक भ्रूण में मनाया की बहुत सीमित संख्या समझा सकता है । इसलिए, lentiviral वैक्टर अच्छी तरह से ट्रांसजेनिक जानवरों में जो एक transgene की अभिव्यक्ति एक सेल विशिष्ट बढ़ाने के द्वारा नियंत्रित किया जाता है का उत्पादन करने के लिए अनुकूलित कर रहे हैं । महत्वपूर्ण बात, प्रोटोकॉल vivo में बढ़ाने गतिविधि के लिए स्क्रीन करने के लिए और विनियामक क्षेत्रों11,12के भीतर नक्शा प्रतिलेखन कारक बंधन साइटों को खोजने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस जांच दृष्टिकोण शायद ही मानक transgenesis का उपयोग किया जा सकता है । संस्थापक जानवरों की कुल संख्या के लिए सभी विभिंन निर्माणों का परीक्षण और सांख्यिकीय महत्व तक पहुंचने इंजेक्शन सत्र के दर्जनों की आवश्यकता होगी, जबकि यह lentiviral मध्यस्थता transgenesis के साथ तेजी से प्राप्त किया जा सकता है की जरूरत है ।

मानक प्रक्रिया और lentiviral आधारित विधि के बीच मुख्य अंतर में से एक transgene एकीकरण में रहता है । परमाणु इंजेक्शन का प्रयोग, transgenes एक अद्वितीय लोकस में कई प्रतियां के रूप में बेतरतीब ढंग से एकीकृत । lentiviral वैक्टर का उपयोग करना, एकीकरण कई loci पर हो सकता है (लोकस प्रति एक प्रति) सख्ती यादृच्छिक किया जा रहा बिना. एकीकरण रैखिक प्रवर्धन मध्यस्थता पीसीआर (लाम-पीसीआर) का उपयोग कर साइटों क्लोनिंग द्वारा, Trono के समूह ने दिखाया है कि transgenes निषेचित अंडे13के खुले क्रोमेटिन क्षेत्रों में तरजीही एकीकृत । एकीकरण पूर्वाग्रह हस्तक्षेप या ट्रांसजेनिक चूहों में transgene अभिव्यक्ति में योगदान नहीं करना चाहिए । एकीकरण lentiviral transduction के दौरान एक सेल स्टेज में भ्रूण के दौरान खुले क्रोमेटिन में होता है कि नहीं हो सकता है अभी भी खुला विंयास में बाद में विकास के दौरान या वयस्क में ।

इसके अलावा, जब पहली पीढ़ी के पशुओं में एकीकृत transgenes की प्रतिलिपि संख्या का विश्लेषण (F0) या भ्रूण, एकीकृत transgene की संख्या में एक बड़ी भिंनता मनाया जाता है । इस अध्ययन में Neurog3-ेंअ-eGFP के निर्माण के साथ औसतन 19 एकीकृत प्रतियां मिलीं । यह बड़ी प्रति संख्या मोज़ेक के उच्च स्तर को प्रतिबिंबित सकता है । Sauvain एट अल. lentiviral मध्यस्थता विधि के साथ उत्पंन F0 पशुओं में एकीकृत loci के एक व्यापक अध्ययन किया है13यहां वर्णित है । वे 11 F0 पशुओं में ७० व्यक्तिगत एकीकरण साइटों का पालन किया और F0 ट्रांसजेनिक चूहों से प्रत्येक साइट के लिए उनके F1 संतति के लिए संचरण की दरों की जांच की । व्यक्तिगत एकीकृत transgene के लिए ४४% के संचरण की समग्र दर का पता चलता है कि वे सबसे अधिक बार एक कोशिका भ्रूण के एस चरण के बाद या दो सेल चरण में एस चरण से पहले या तो स्थापित किया गया । दरअसल, एकीकरण एस चरण से पहले दोनों बेटी कोशिकाओं को एकीकृत transgene संचारित होगा, जबकि एस चरण के बाद एकीकरण यह केवल एक बेटी सेल को हस्तांतरित होगा । इस प्रकार, व्यक्तिगत एकीकृत transgenes के लिए मोज़ेक की डिग्री ट्रांसजेनिक चूहों इस तकनीक के माध्यम से प्राप्त में कम है । यह आगे यह इंगित करता है कि सबसे अधिक एकीकरण पहले 12 में प्रयुक्त संस्कृति की स्थिति में पहली दरार के उत्पादन का औसत समय के अनुरूप एच के भीतर हो जाएगा । इस एकीकरण काइनेटिक टी लसीकावत् कोशिकाओं22में lentiviruses के लिए वर्णित एक के साथ संगत है ।

महत्वपूर्ण बात, loci baring एकीकृत transgenes की एक उच्च संख्या के साथ, माउस लाइनों की स्थापना उचित नहीं होगा । इन सभी loci को पृथक करने के लिए क्रॉसिंगों की संख्या काफी अधिक होगी. यह इस विधि है कि या तो transgene प्रभाव की तेजी से स्क्रीनिंग के लिए या एकाधिक transgenes के एक साथ विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए की एक महत्वपूर्ण सीमा का प्रतिनिधित्व करता है । फिर भी, माउस लाइनों F0 पशु सबसे कम एकीकृत transgene कॉपी संख्या के साथ लोगों से चयन करके अभी तक स्थापित किया जा सकता है ।

परमाणु डीएनए इंजेक्शन विधि1का पहला विवरण के बाद से, सुधार किया गया है कि प्रारंभिक प्रक्रिया की खामियों के कई दरकिनार । सुधार का पहला सेट एक सटीक लोकस में लक्षित एकीकरण के आधार पर एक कैसेट विनिमय रणनीति का प्रयोग किया गया । परमाणु इंजेक्शन या तो CRE, फ्लिप या PhiC31 recombinases एक एकीकृत डीएनए loxP, FRT या attB साइटों, क्रमशः के साथ पार्श्व के साथ एक साथ प्रयोग किया जाता है । इस स्थिति में, समेकित डीएनए एक एकीकृत एक ही recombinase विशिष्ट साइट23,24के साथ पार्श्व टुकड़ा के साथ विमर्श किया है । पहली पीढ़ी के पशुओं के ६०% तक हालांकि इस तरह की विधि का उपयोग कर23 ट्रांसजेनिक जा सकता है, परमाणु इंजेक्शन की तकनीक से जुड़ी सीमाएं अभी भी लागू होते हैं । सुधार का दूसरा सेट दो परिपत्र डीएनए के cytoplasmic इंजेक्शन पर आधारित है, एक टुकड़ा ले जाने के लिए एकीकृत और एक या तो Tol225की अभिव्यक्ति की अनुमति, सो सौंदर्य26 या piggyBac27 transposases । इन तरीकों का प्रयोग, उच्च पैदावार प्राप्त कर रहे है (> 30%), लेकिन अधिक महत्वपूर्ण बात, cytoplasmic इंजेक्शन प्रदर्शन करने के लिए आसान है और lentiviral आधारित प्रोटोकॉल के रूप में परमाणु इंजेक्शन के कारण प्रतिबंध दरकिनार । इसके अलावा, बहुत बड़े डीएनए टुकड़े, जीवाणु कृत्रिम गुणसूत्रों के रूप में, एकीकृत किया जा सकता है ।

यह स्पष्ट है कि lentiviral मध्यस्थता transgenesis मानक और न ही सुधार प्रक्रियाओं की जगह नहीं होगी । अभी भी इस विधि तेजी से पशु मॉडल के उत्पादन और लक्षण वर्णन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण का प्रतिनिधित्व करता है के रूप में यह काफी कम आनुवंशिक परिवर्तनशीलता के साथ पशुओं की उचित संख्या उत्पंन करने के लिए आवश्यक समय कम कर देता है । इसके अलावा, इस तकनीक को सीधे किसी भी ट्रांसजेनिक लाइनों सहित सभी माउस उपभेदों के लिए लागू किया जा सकता है । इसके अलावा, यह उल्लेख है कि उपंयास पशु मॉडल की पीढ़ी के वैश्विक परिदृश्य के बारे में CRISPR/Cas9 प्रौद्योगिकी के हाल के विकास के साथ बदलने के लिए महत्वपूर्ण है । आज, गाइड आरएनए के साथ साथ Cas9 प्रोटीन के परमाणु इंजेक्शन ४०%28की प्रभावकारिता के साथ जीनोम संपादित पशु मॉडलों के उत्पादन की अनुमति देता है । इस दृष्टिकोण lentiviral मध्यस्थता transgenesis के उपयोग से काफी हद तक लाभ हो सकता है. दरअसल, गैर एकीकृत lentiviral वैक्टर29 का उपयोग करने के लिए क्षणिक दोनों Cas9 और गाइड RNAs एक्सप्रेस भी उच्च उत्पादन पैदावार में परिणाम सकता है । नवीनतम प्रौद्योगिकियों के संयोजन प्रासंगिक और मजबूत पशु मॉडल का उत्पादन करने के लिए सबसे अंतरराष्ट्रीय अनुसंधान रोग रोगजनन और चिकित्सीय दृष्टिकोण का अध्ययन में शामिल समूहों को फायदा होगा ।

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Disclosures

लेखकों के हित का खुलासा करने का कोई विरोध नहीं है.

Acknowledgments

हम iVector वेक्टर उत्पादन और पशु आवास में तकनीकी सहायता के लिए क्रमशः पांडुलिपि और Phenoparc और आईसीएम lentiviral कोर के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए Magali Dumont और Rolando Meloni धंयवाद । इस काम के द्वारा समर्थित था Institut Hospitalo-Universitaire de तंत्रिका विज्ञान Translationnelles de पेरिस, इहु-A-आईसीएम, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06 । P.R. एसोसिएशन डे Langue फ़्रांसेज़ नमुने l'Etude ड्यू Diabète एट डेस विकृतियों Métaboliques (ALFEDIAM) और एक संयुक्त JDRF/INSERM अनुदान के लिए धन प्राप्त किया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PMSG 50UI Sigma G4527
hCG 5000UI Sigma CG5-1VL
NaCl Sigma 7982
100 mm petri dish Dutsher 353003
4 wells Nunc dish Dutsher 56469 IVF dish
M2 medium Sigma M7167
M16 medium Sigma M7292
0,22 µm Syringe filter Dutsher 146611
Hyaluronidase Enzyme 30mg Sigma H4272 mouse embryo tested
Insulin serynge VWR 613-3867 Terumo Myjector
Curved forceps Moria 2183
Curved scissors Moria MC26
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma A5177-5EA
Borosilicate glass capillaries Harvard apparatus GC 100-10
Horizontal micropipette puller Narishige PN-30
Microforge Narishige MF-900
Inverted microscope Nikon Transferman NK2 5188 Hoffman modulation contrast illumination is required
Micromanipulator Eppendorf Celltram air
Controler of holding pipet Eppendorf Femtojet
Mineral oil Sigma M8410 mouse embryo tested
Microinjector Eppendorf Femtojet Can be used to inject DNA or viral vectors
Dumont # 5 forceps Moria MC 40
vannas micro scissors Moria 9600
Isoflurane centravet ISO005 ISO-VET 100% 250ml
ocrygel centravet OCR002
Povidone iodure centravet VET001 vetedine 120ml
Buprenorphine centravet BUP002 Buprecare 0,3Mg/ml 10ml
Tris-HCl Sigma T5941 Trizma hydrochloride
EDTA Sigma E9884
SDS Sigma 436143
NaCl Sigma S7653 powder
proteinase K Sigma P2308 
oneTaq kit NEB M0480L
Primers Eurogentec
Strip of 8 PCR tube 4titude 4ti-0781
96 well thermal cycler Applied Biosystems 4375786 Veriti
Genomic DNA mini kit invitrogen K1820-02
Nanodrop 2000 Thermo Scientific ND-2000C 
qPCR Master mix Roche 4887352001 SYBR Green 
Multiwell plate 384 Roche 5217555001
qPCR instrument 384 well Roche 5015243001 LightCycler 480

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References

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आनुवंशिकी अंक १४० Lentiviral वैक्टर ट्रांसजेनिक चूहों निषेचित अंडाणुओं के transduction एकीकृत जीन हस्तांतरण perivitelline अंतरिक्ष में इंजेक्शन सर्वव्यापी प्रवर्तकों सेल विशिष्ट बढ़ाने
ट्रांसजेनिक चूहों के Lentiviral मध्यस्थता उत्पादन: संस्थापकों के प्रत्यक्ष अध्ययन के लिए एक सरल और अत्यधिक कुशल विधि
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Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., … More

Dussaud, S., Pardanaud-Glavieux, C., Sauty-Colace, C., Ravassard, P. Lentiviral Mediated Production of Transgenic Mice: A Simple and Highly Efficient Method for Direct Study of Founders. J. Vis. Exp. (140), e57609, doi:10.3791/57609 (2018).

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