Summary
Здесь мы представляем протокол для содействия интеграции трансген и основатель трансгенных мышей с высокой эффективности производства путем простой инъекции лентивирусные вектора в пространстве наблюдаться оплодотворенной яйцеклетки.
Abstract
Почти 40 лет pronuclear ДНК инъекций представляет собой стандартный метод для создания трансгенных мышей с случайных интеграции трансгенов. Такая обычная процедура широко используется во всем мире и его основное ограничение проживает в бедных эффективность интеграции трансген, что приводит к низкой урожайности основатель животных. Трансген включили только несколько процентов животных, родившихся после имплантации вводят оплодотворенных яйцеклеток. Напротив лентивирусные векторы являются мощными инструментами для переноса интегративной генов и их использование для передают оплодотворенной яйцеклетки позволяет высокоэффективное производство основателя трансгенных мышей с средняя урожайность выше 70%. Кроме того любой штамм мыши могут использоваться для производства трансгенных животных и пенетрантностью трансген выражение является чрезвычайно высокой, выше 80% с лентивирусные опосредованной трансгенез, по сравнению с ДНК микроинъекции. Размер фрагмента ДНК, которая может быть груз лентивирусные вектор ограничено 10 КБ и представляет собой главное ограничение этого метода. С помощью простой и легко выполнять процедуры инъекции под вителлинового оплодотворенных яйцеклеток, более чем 50 основатель животных могут быть произведены в одной сессии микроинъекции. Такой метод является очень приспособлены для выполнения непосредственно в основатель животных, быстрый выигрыш и потери функции исследований или геномной ДНК областей экрана для их способность контролировать и регулировать ген выражение в естественных условиях.
Introduction
Новаторскую работу Гордон et al. в 1980 году показал, что после имплантации в pseudopregnant мышей, плазмида ДНК инъекции в мужской pronuclei оплодотворенных яйцеклеток может принести производства трансгенных животных, которые интегрированы плазмида ДНК1. Демонстрация, что могут быть получены трансгенные млекопитающих оказали огромное воздействие на глобальные наук о жизни, открыв путь к Роман областях исследований, как для фундаментальных наук и трансляционная биомедицинских наук. В последние четыре десятилетия ДНК микроинъекции стало обычной практикой. Хотя огромное количество трансгенных мышей были произведены, стандартный метод не является полностью пригоден для всех штаммов мыши и требует много времени беккроссов2,3. Его применение в отношении других видов остается сложной4 и урожайность трансген интеграции ограничивается несколько процент род животных5. Кроме того эффективность интеграции трансген представляет сдерживающим фактором, который объясняет бедных урожайность pronuclear ДНК инъекции. В этой связи интегративной вирусных векторов являются наиболее эффективные инструменты для груза и интегрировать трансгенов и таким образом может предоставить новые средства для значительного увеличения урожайности интеграции, единственное ограничение в том, что размер трансген, который не может превышать 10 КБ6 .
Лентивирусные векторы псевдо-типизированных с конверт белков вируса везикулярного стоматита (ВСВ) являются инструментами передачи pantropic и высоко интегративной гена и может использоваться для передают оплодотворенных яйцеклеток7. Zona pellucida окружающих яйцеклеток является естественным вирус барьер и должен быть передан позволить трансдукция с лентивирусные векторы. Трансгенные животные были получены путем преобразования оплодотворенных яйцеклеток после микро бурение или удаление вителлинового8,9. Однако инъекции под вителлинового в пространстве наблюдаться, по-видимому, самый простой способ передавать оплодотворенные яйца как первоначально описано Лоис и коллеги-7.
Наблюдаться инъекции лентивирусные векторы позволяет высокие урожаи в производстве трансгенных животных, которые находятся выше 70% род животных. Такая доходность свыше 10 раз выше, чем лучший доходность, которая может быть достигнута с помощью стандартных pronuclei ДНК инъекций7,10,11. В этом контексте одной сессии инъекции создаст по меньшей мере 50 основатели трансгенное (F0). Таким образом, большое количество учредителей совместим с фенотипирование эффекта трансген, непосредственно над F0 мышей без необходимости создания трансгенные мыши линии. Это преимущество позволяет для быстрого скрининга трансген эффект и специально приспособлены для выполнения в vivo выгоды и потери функции исследований в течение недели. Кроме того регулирующие элементы ДНК можно также быстро проверяться на карте усилители и ДНК мотивы связаны факторы транскрипции11,12. С pronuclear инъекции трансгенов обычно интегрировать как несколько копий в уникальный Локус. С лентивирусные векторы интеграция происходит в нескольких локусов одну копию за Локус10,13. Таким образом множество интегрированных локусов скорее связаны с очень высокой выражение пенетрантностью, наблюдается в трансгенных учредителей, что делает новый сгенерированной модели более надежной.
Важно отметить, что при использовании pronuclear для инъекций ДНК, визуализация pronuclei во время процедуры абсолютно необходим. Это техническое ограничение предотвращает использование оплодотворенных яйцеклеток, происходящих из разнообразных штаммов мыши. Таким образом, производство трансгенных модели в определенном напрягаться, для которых pronuclei невидимый требует производства животных в разрешительной штамм следуют по крайней мере 10 последовательных беккроссов для передачи трансген в желаемой мыши штамм. С лентивирусные вектор инъекции наблюдаться пространства всегда видна и инъекции не требует узкоспециализированных навыков. В качестве примера NOD/SCID трансгенных мышей, которые не подходят для инъекций pronuclei были получены с вирусный вектор инъекции14.
Здесь всеобъемлющий протокол представляется простой производства трансгенных мышей с использованием инъекций лентивирусные вектора в пространстве наблюдаться одной ячейки стадии эмбриона. Трансген выражение, контролируемых либо с вездесущими или подробно описаны конкретные промоутеров ячейки.
PTrip ΔU3 лентивирусные костяк был использован в данном исследовании15. Этот вектор позволяет производить репликацию дефектных лентивирусные векторы, в которых последовательность U3 был частично удален чтобы удалить U3 промоутер активности и создания самостоятельной инактивирующего вектор (SIN)16. Лентивирусные вектор запасы были произведены переходных transfection клеток ГЭС 293T с p8.91 инкапсуляции плазмида (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, pHCMV-G кодирование гликопротеин G (ВСВ) вирус везикулярного стоматита17и pTRIP ΔU3 Рекомбинатные вектор. Процедура подробно производства предоставляется в качестве дополнительных методов.
Производство высокого титра лентивирусные вектор запасов осуществляется в условиях биобезопасности уровня II (BSL-2). Это верно для большинства трансгенов за исключением онкогенов, которые должны быть произведены в BSL-3. Таким образом производство в условиях BSL-2 в большинстве случаев достаточно. Кроме того использование и производство обычно отключены для большинства национальных регулирующих органов, занимающихся генетически модифицированных организмов (ГМО). Ограниченное количество некомпетентных ГРЕХ репликации лентивирусные векторы (ниже 2 мкг белка капсид p24) может использоваться в условиях BSL-1, как описано в ГИО французского Агентства согласился с рекомендациями Европейского союза.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, которые включают животных работы получили этические утверждения и было санкционировано французского министерства научных исследований и образования под номером #5094-20 APAFIS 16032916219274 v6 и 05311.02. ICM животных фонда PHENOPARC была аккредитована Министерством сельского хозяйства Франции под номером аккредитации B75 13 19. Общий протокол требует выполнения каждой процедуры в точные сроки, которая резюмируется в на рисунке 1.
1. животных покупки и подготовка основных соединений
- Покупка животных
- Порядка 25 вазэктомии самцов B6CBAF1/JRj, которые являются 8 недель возраста (поколения F1 от оригинала пересекает между ♀C57Bl/6JRj и ♂CBA/JRj).
Примечание: Изолировать мужчины по прибытии. Вазэктомии мужчины может быть повторно использован для по крайней мере один год.
Измените клетки каждые 3 недели. - Порядка 50 B6CBAF1/JRj самок, которые 10 недель возраста и сохранить пул по крайней мере 50 животных.
- Порядка 10-15 C57BL/6JRj плодородные мужчин, которые являются 8-недельного возраста.
- Порядка 30 C57BL/6JRj женщин, которые являются 4-недельного возраста.
- Порядка 25 вазэктомии самцов B6CBAF1/JRj, которые являются 8 недель возраста (поколения F1 от оригинала пересекает между ♀C57Bl/6JRj и ♂CBA/JRj).
- Анестезия и эвтаназии
- Анестезия осуществляется с помощью тома 300μL кетамин/Ксилазина смеси, вводили внутрибрюшинно (кетамин в дозе 150μg/г веса тела, Ксилазина в дозе 0.15μg / g массы тела). Животные помещены под грелку для регулировки температуры тела. Проверьте рефлексов, щипать хвост животного до начала процедуры.
- Эвтаназия была исполнена шейки матки дислокации. Обезглавливание была включена в качестве дополнительного способа подтвердить смерть животного. Эвтаназия эмбрионов была выполнена путем обезглавливания.
Примечание: По прибытии, позволяют животных минимум 1 неделя, чтобы приучать к фонду (без обработки или спаривания). Важно отметить, что любой мыши штаммов, включая трансгенных линий может быть использован как плодородные мужчин и плодородные женщин для суперовуляции. Выбор штамм должна производиться согласно требованиям научный вопрос.
- Гормональный препарат
- 910 мкл буфера PSMG (беременных Маре гонадотропина сыворотки) в 1 флакон лиофилизированных ГСЖК, сделать 100 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
Примечание: Каждый Алиготе содержит 55 UI для 11 мышей. Никогда не держите ГСЖК аликвоты для более чем 2 недели после первого использования. - Добавьте что 2730 мкл буфера ХГЧ (хорионического гонадотропина человека) в 1 лиофилизованные препараты ХГЧ во флаконе. Сделать 100 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
Примечание: Каждый Алиготе содержит 55 UI для 11 мышей.
- 910 мкл буфера PSMG (беременных Маре гонадотропина сыворотки) в 1 флакон лиофилизированных ГСЖК, сделать 100 мкл аликвоты и хранить при температуре от-20 ° C.
- Гиалуронидаза подготовка
- Растворить 1 флакон 3 мл среды м2 для получения 10 мг/мл, раствор и сделать 50 мкл аликвоты гиалуронидазы. Затем, хранить при температуре-20 ° C.
- Подготовка инструментов хирургии
- Простерилизуйте все хирургии инструменты, с помощью автоклава.
2. суперовуляции женщин-доноров
- В объекте животных, с использованием 12 h день - ночь циклы, придать ГСЖК на 2 вечера в день -3. Придать ХГЧ в 12 утра в день -1 и мат плодородные мужчин сразу после инъекции ХГЧ.
- В день -3, добавить 1 мл стерильного 0,9% раствора NaCl в 1 Алиготе 100 мкл ГСЖК (55 UI). Придать 10 C57BL/6JRj женщин с 100 мкл, внутрибрюшинно с помощью шприца без каких-либо мертвого объема.
Примечание: Каждая мышь будет получать 5 UI ГСЖК. - В день -1, добавить 1 мл стерильного 0,9% раствора NaCl в 1 Алиготе 100 мкл ХГЧ (55 UI). Придать мышей, которые получили внутрибрюшинно ГСЖК инъекции с 100 мкл разбавленного раствора ХГЧ (5UI). Используйте шприц без каких-либо мертвого объема. Выполнение инъекции медленно и ждать перед удалением иглы, таким образом, чтобы жидкость не утечки.
Примечание: Каждая мышь будет получать 5 UI ХГЧ. Инъекция ХГЧ должны быть выполнены 46 h после ГСЖК. - Место каждой девушки C57BL/6JRj в клетке мужчины стад непосредственно после инъекции ХГЧ.
- Проверьте вагинальных свечей в первой половине дня 0 и использовать позитивные женщины для сбора оплодотворенных яиц.
3. Подготовьте женщин Pseudopregnant B6CBAF1/jRj
- Мат вазэктомии мужчина за день до-коллекция-яйца (день -1) с 2 B6CBAF1/JRj суки в 5 вечера.
Примечание: Очень важно для спаривания самок, которые возникая от разных клетках чтобы избежать синхронизации циклов женщин. Это позволит увеличить урожайность получения вагинальных свечей. Кроме того не добавляйте женщина в клетке мужчины, что изменилось в течение последних 2 дней. Эффективность репродуктивного поведения самцу увеличивается, когда клетка грязный.
4. оплодотворенные яйца коллекции
- Подготовка
- Мкл 1450 м2 гиалуронидаза запасов решение подготовить рабочий раствор гиалуронидазы.
- Поместите одну каплю 100 мкл рабочего раствора гиалуронидаза одну женщину, используемой для производства оплодотворенные яйца в 100 мм Петри блюдо и держать при комнатной температуре.
- Добавьте 500 мкл M16 плиты 4 скважины. Используйте 2 скважины на тип лентивирусные векторы, которые будут вводиться: один будет содержать вводят яйца и другие те не вводили. Место 4 хорошо пластины в инкубаторе при 37 ° C с 5% CO2 атмосферой.
- Подготовьте пипетки для сбора и обработки эмбрионов.
- Смягчить стеклянные капилляры гематокрит (75 мм/60 мкл), вращающийся центр жесткий стеклянные капиллярные трубки в пламени.
- Удаление капилляров от жары как можно быстрее и потяните, чтобы получить трубки с внутренним диаметром около 300 µm. тянуть на охлаждением труб для получения аккуратные перерыв.
- Собирайте яйцеводов.
- Усыпить C57BL/6JRj самок на шейки матки дислокации в 9 утра в день 0. Смерть подтверждена обезглавливание.
Примечание: Этот метод эвтаназии был одобрен IACUC и соответствует европейским рекомендациям. - Выполните большой горизонтальный разрез открыть брюшной полости с ножницами. Маточных труб расположен между матки и яичника.
- Удаление mesometrium и мембраны, перевозящих видных кровеносных сосудов с изогнутой щипцами.
- Отделяйте маточных труб от яичника с изогнутой щипцами.
- Изогнутый пинцет можно используйте в качестве руководства сократить маточных труб из яичника с помощью изогнутые ножницы.
- Вытяните маточных труб и вырезать из матки с изогнутые ножницы.
Предостережение: Не прикасайтесь опухшие ампула, содержащий оплодотворенных яиц. Выполните всю процедуру с использованием стерильных инструментов. - Поместите все собранные яйцеводов в среде м2 (35 мм культуры блюдо) при комнатной температуре
- Место 2 яйцеводов же падения 100 мкл гиалуронидаза рабочего раствора (0,3 мг/мл).
- Усыпить C57BL/6JRj самок на шейки матки дислокации в 9 утра в день 0. Смерть подтверждена обезглавливание.
- Удаление ячеек кучевые из оплодотворенных яиц.
- Под стереомикроскопом, используйте 2 инсулиновые шприцы: первый провести маточных труб и вторая изорвать ампула и разогнать оплодотворенные яйца в рабочий раствор гиалуронидазы.
- Возьмите подготовленные стеклянные пипетки для сбора яиц и подключить его к трубе и 0,22 мкм фильтр, установленный на мундштук, чтобы удалить все яйца. Собрать все яйца и мыть их путем последовательных проход в 6 различных капли µL 100 м2 среды.
- Место промывают оплодотворенные яйца в инкубатор увлажненные 37 ° C с атмосферой 5% CO2 в среде M16.
5. делать инъекции пипетки
- Использование тонкостенных стеклянные капиллярные трубки (10-15 см длиной) с внешним диаметром 1 мм и зажим этот капилляр в горизонтальных микропипеткой съемник.
Примечание: В наиболее горизонтальных пипеткой пулеры застежки молнии, 3 параметры можно регулировать: тепловой энергии, потянув силы и время задержки между Отопление и вытягивать. Настройте эти параметры для получения инъекций пипец, которые напоминает представленному на рисунке 2A. Для пользователей, которые регулярно выполняют микроинъекции ДНК используйте стандартные параметры и настроить задержку между Отопление и вытягивать чтобы изменить глобальный форму кончика пипетки.
6. Создание холдинга пипетки
- Использование инъекций пипеткой подготовить проведение пипеткой.
- Прикрепите впрыскивая пипетки к microforge. Вырежьте пипетку с microforge для получения острый кончик симметрично диаметром 80 до 100 мкм. Тогда польский кончик с тепла на microforge для получения симметричной круглой формы без острых изгороди.
7. Подготовка инъекции пипетки, содержащие лентивирусные вектор
- Центрифуга лентивирусные вектор подвеска на 160 x g за 2 мин до Пелле мусора часто присутствуют в замороженных лентивирусные запасов.
- Восстановить супернатант и перенести его в новой 0,5 мл трубку в класс безопасности II кабинета.
- Передача 1 мкл супернатант инъекции пипетки, подготовленный, как описано в шаге 5, с помощью микро погрузчик.
- Установите инъекции пипетки на держателе инструмент правой микроманипулятор. Подключение к левой микроманипулятор накапайте Холдинг.
Примечание: Титр трансдукции лентивирусные вектора будет прямо коррелировала с эффективностью производства основатель. Для высокой эффективности (> 70%), использование вирусных векторов с титр в диапазоне 100 нг p24 капсульных белков/мкл. Когда титр выражается как трансдукции единиц (ту), титр должна быть выше 109 ту/мл. Лентивирусные вектор запасы должны быть произведены переходных transfection клеток 293T с p8.91 encapsidation плазмиды, pHCMV-G, кодирование везикулярного стоматита вирус (ВСВ) гликопротеин G, как описано в дополнительные методы18.
8. микро инъекций
- Лунки 8 мкл среды м2 в центре крышки и депрессии слайд с легкими парафинового масла (зародыш испытания) чтобы избежать испарения.
- Место 20 яйца в падение как наименее разошлись как можно скорее.
Предупреждение: Не делайте пузырей при сдаче на хранение эмбрионов. - Убедитесь, что открыт кончиком пипетки инъекции. Если нет, то нажмите инъекции пипетку с пипеткой Холдинг.
- Набор microinjector для инъекций время 20 s.
Примечание: Вязкость вирусный подвеска позволяет четкие визуализации дисперсии вирусный вектора в пространстве наблюдаться. Давление впрыска следует скорректировать для того, чтобы заполнить все пространство в пределах 20 s инъекция, которая представляет объем от 10 до 100 pL. Давление впрыска не должна превышать 600 гПа. - Аспирационная одного оплодотворенная яйцеклетка, которая содержит 2 pro ядер и 2 полярные органов с пипеткой Холдинг под стереомикроскопом.
- Придать яйцо с microinjector, с помощью параметров, описанных в 8.4, в пространстве наблюдаться.
Предостережение: Не прикасайтесь к плазматической мембраны с инъекций пипетки. - Внедрить все оплодотворенные яйца в пакетах 20 яиц и вводят яйца сразу в предварительно нагретой среде M16 в инкубатор увлажненные 37 ° C с атмосферой 5% CO2.
Примечание: Инкубируйте яйца вводят минимум 30 мин после инъекции перед переводы эмбриона.
9. перенос эмбрионов в B6CBAF1/JRj Pseudopregnant женщин
- Проверьте совокупления вилка 16 h после спаривания самок B6CBAF1/JRj с B6CBAF1/JRj вазэктомии мужчины. Сделать это непосредственно перед запуском коллекции яйцо.
- Подготовьте имплантации пипеток вводят эмбриона.
- Сделайте пипетки имплантации эмбрионов, как описано для сбора и обработки эмбрионов (шаг 4.2). Выберите пипетки с внутренним диаметром около 150 мкм с узкой части около 4-5 см в длину.
Примечание: Наконечник должен быть пламени, полированные, с тем чтобы уменьшить возможный ущерб яйца или маточных труб.- Заполните с легкими парафинового масла (зародыш испытания) чуть выше плеча пипеткой.
- Аспирационная небольшой воздушный пузырь, а затем м2 среднего и, наконец, второй воздушный пузырь.
- Составить эмбрионов один позади друг друга, чтобы свести к минимуму общий объем среднего, которые будут вводиться в маточных труб вместе с эмбрионов.
- Завершить загрузку очень маленькая капля света парафинового масла (зародыш испытания) шириной около одного эмбриона.
Предупреждение: Будьте нежны пока регулирующ пипеткой.
- Сделайте пипетки имплантации эмбрионов, как описано для сбора и обработки эмбрионов (шаг 4.2). Выберите пипетки с внутренним диаметром около 150 мкм с узкой части около 4-5 см в длину.
- Перенос эмбрионов.
- Простерилизуйте все инструменты.
- Анестезировать самка с помощью внутрибрюшинного введения 300 мкл стерильного 0,9% раствора NaCl, содержащий 150 мкг / г веса тела кетамина и 0,15 мкг / г веса тела Ксилазина.
- Проверка глубины анестезии, щипать хвост животного с щипцами и придать subcutaneouly 0,1 мг/кг обезболивающее (бупренорфин) до начала процедуры.
- Бритье 2 см по обе стороны спины вдоль спинного мозга на уровне последнего ребра.
- Место женщины мыши на грелку и в поле стерильным. Вырежьте 2 см x 2 см окно в середине спины мыши.
- Применить антисептическим раствором (10% повидон йодид) на коже и сделать поперечный разрез 1 см с ножницами, а затем слайд кожи сбоку до тех пор, пока завязи (оранжевый цвет) видна через стенку тела.
- Сделайте 5 мм разрез в стенке тело чуть выше яичника с тонкой ножницами под Микроскоп бинокулярный хирургического.
- Подобрать жировой ткани с атравматической бульдог зажим и вытащить яичников, маточных труб и в верхней части матки.
- Визуализировать ампула и сделать гемисекция ножницами беззаботными в сегменте маточных труб, которая связывает завязи ампула.
- Ввести передачи эмбриона пипетки и доставить яйца в ампула, останавливаясь на первый воздушный пузырь в пипетку имплантации.
- Повторите процедуру на втором маточных труб.
- Заделывают кожи с раной клипов.
- Место животного в восстановлении камеры (39 ° C, 30-60 мин) до полностью проснуться.
- Повторите обезболивающее инъекции через 12 ч и 48 часов в случае признаков боли или страданий.
- Удалите клипы рану 7-10 дней после операции.
- Проверьте имплантированных самок для беременности, следуя их вес кривой каждые 3 дня после имплантации. Значительного веса можно наблюдать 10-12 дней после имплантации и будет свидетельствовать для беременности.
Примечание: Все эмбрионы, которые будут развиваться здесь будет представляют предполагаемого трансгенных учредителей. Фенотип этих учредителей могут быть проанализированы на любой стадии развития или после рождения согласно научный вопрос связан с поколения этих трансгенных животных.
10. генотипирования трансгенных основатели
- Подготовить генотипирования буфер, содержащий 10 мм трис-HCl, рН 8; 5 мм ЭДТА, рН 8,0 с 0,2% SDS (w/v), 50 мм NaCl. Стерилизовать генотипирования буфера через фильтр 0,22 мкм и хранить при комнатной температуре в течение нескольких месяцев.
- Положите extraembryonic мембран (для эмбрионов) или кусочек хвоста (для род животных) в 500 мкл отфильтрованных генотипирования буфера и мкл 15 протеиназы K (20 мг/мл). Инкубируйте на ночь при 55 ° C.
- Центрифуга lysate на 15000 x g 5 минут, а затем использовать 1 мкл супернатант для реакции PCR. Lysate может храниться при температуре 4 ° C на несколько месяцев.
- Выполните амплификации PCR фрагмента трансген 20 мкл реакции тома, содержащего 1 x PCR буфера, MgCl 1,5 мм2, 200 мкм дНТФ, 0,2 мкм каждого праймеры PCR, 1 UI полимеразы дна Taq и 1 мкл каждого переваривается образца. Как отрицательный контроль используйте 1 мкл H2O. Как позитивный элемент управления используйте ДНК из лентивирусные вектор плазмиды, содержащие трансген.
- Для обнаружения eGFP описано использование:
eGFP вперед грунтовка: 5' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3'
eGFP вспять грунтовка: 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3' - Выполнять амплификации PCR в Термоциклер: 4 мин на 94 ° C, после чего 35 циклов 1 мин на 94 ° C, 1 мин при 60 ° C и 2 мин при 72 ° C.
- Загрузите продукт PCR на 2% гель агарозы для того, чтобы визуализировать 300 bp eGFP продукт PCR как показано на рисунке 2B.
Примечание: Все лица, показаны 300 группа ПЦР bp интегрировали eGFP трансген и может рассматриваться как мутация. - Анализируйте трансген выражение в трансгенных животных. Например, выполнить гистологические и иммуноокрашивания, как показано на рис. 3 и рис. 4 и описал в дополнительных методов.
Примечание: Оба трансген выражение и анализ фенотипа должны выполняться с помощью соответствующих методов, согласно глобальный научный вопрос.
11. Количественная оценка числа трансген копирования
- Подготовка образцов ДНК для количественного PCR.
- Экстракт геномной ДНК (геномная ДНК) от lysate протеиназы K, полученного на шаге 10.3 с использованием коммерческих комплекта согласно инструкциям производителя.
- Количественно геномная ДНК методом спектрофотометрии на 260 Нм.
- Развести каждого геномная ДНК образца до конечной концентрации 10 нг/мкл.
- Для каждого образца, подготовить 5 серийных разведений (1:5) в H2O получить 6 трубок в следующих концентрациях: 10 нг/мкл, 2 нг/мкл, 0,4 нг/мкл, 0,08 нг/мкл, 0,016 нг/мкл и 0.0032 нг/мкл
- Подготовьте количественные микс реакции PCR (ПЦР).
- Подготовьте грунт смесь для ПЦР. Для каждой пары праймера для ПЦР, добавить 10 мкл вперед праймера (Стоковый раствор грунтовки 100 мкм), 10 мкл обратного праймера (100 мкм) и 80 мкл H2O.
Примечание: Для того чтобы усилить eGFP, используйте вперед TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA и обратить вспять TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG грунтовки. Ген Cdx2 используется как нормализация для ПЦР (2 копий на геном). Для Cdx2 нормализатор использовать вперед GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG и обратный GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT грунтовки - Готовить 2 смеси ПЦР, один с eGFP смеси праймера и один с Cdx2 грунтовка микс. Подготовьте достаточно смеси ПЦР для усиления 6 разведений в дубликаты каждого геномная ДНК. Один ПЦР-реакции содержит 3,8 мкл H2O, 5 мкл флуоресцентный зеленый 2 x реакция смеси и 0,2 мкл смеси праймера.
Примечание: Для каждого трансгенных животных для тестирования, будет производиться 24 реакций ПЦР. Смесь реакции предоставляется для 384 хорошо ПЦР машины. - Для каждого животного, тестирование, распространение: 12 скважин с 9 мкл eGFP смеси ПЦР и 12 скважин с 9 мкл Cdx2 смеси ПЦР. 1 мкл каждого разведения геномная ДНК, 2 скважины, содержащие смесь ПЦР eGFP и 2 скважины, содержащие смесь ПЦР eGFP.
- Отпуск 2 скважин для каждого ПЦР смешать в котором геномная ДНК была заменить H2O как отрицательный контроль.
- Подготовьте грунт смесь для ПЦР. Для каждой пары праймера для ПЦР, добавить 10 мкл вперед праймера (Стоковый раствор грунтовки 100 мкм), 10 мкл обратного праймера (100 мкм) и 80 мкл H2O.
- Поместите 384 хорошо пластину в машину ПЦР и применять следующие работает протокол: 10 мин при 95 ° C 50 циклов 10 s при 95 ° C и 1 мин при 60 ° C.
- Анализ данных. Для каждого геномная ДНК для тестирования участок Ct значения как функция журнала геномная ДНК общего количества (6 очков в дубликатов). Соответствовать кривой с использованием линейной регрессии методом наименее квадратных и экстраполировать Ct значение, соответствующее точки пересечения с осью y. Используйте экстраполированных значений Ct eGFP и нормализованных Cdx2 для вычисления числа eGFP копирования по отношению к Cdx2 (2 копии), используя стандартный 2ΔdCt метод11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Трансгенных животных были получены с помощью протокола, представленные здесь. Представитель приводит оба повсеместно и проиллюстрированы выражения конкретных трансген типа ячейки.
Учредительный выражение трансгенов
Вездесущие промоутеров являются фундаментальные исследования инструменты выразить трансгенов в устойчивой и эффективной основе. Для очень большое разнообразие приложения от в vitro transfection клетки в vivo трансгенез в мелких и крупных животных используются такие промоутеров.
Лентивирусные векторы были построены выразить Зеленый флуоресцентный Репортер ген (eGFP) под контролем промоутер цитомегаловирусом (CMV) или композитный промоутер, ЦАГ основаны на слияние промоутер актина курица и усилитель ЦМВ. Обе лентивирусные векторы были производства (дополнительные методы) и титр определялся в 293T клетки как трансдукции единиц (ту) на основе eGFP выражения. Обе конструкции лентивирусные вектор вводили в пространстве наблюдаться оплодотворенной яйцеклетки в концентрации 109 ту/мл и имплантированный в псевдо-беременных самок мышей. Имплантированных эмбрионов были далее собраны незадолго до рождения и генотипируемого методом ПЦР следовать eGFP интеграции. 73% (n = 22) и 83% (n = 32) собранных эмбрионов интегрированы трансген для ЦМВ и CAG лентивирусные конструкции, соответственно (Таблица 1). Трансгенные эмбрионы были затем секционного и иммуно витражи для eGFP. Как показано на рисунке 3, только рассеянного eGFP позитивные клетки наблюдаются с ЦМВ промоутер (рис. 3, верхней панели), тогда как все клетки выразил GFP, когда использовался CAG промоутер (рис. 3, средней и нижней панели).
С CAG промоутер 96% собранных трансгенной эмбриона повсеместно выразил eGFP трансген (Таблица 1). Хотя оба промоутеров являются вездесущими, только CAG промоутер состоянии привода надежные выражение трансген во всех клетках. Альтернативные повсеместно промоутеров были использованы как phosphoglycerate киназы (ПГК) и убиквитин C промоутеров и дали аналогичные результаты как те, которые получены с CAG промоутер с более низкими уровнями выражение eGFP (данные не показаны).
В естественных условиях Отображение регулирования геномной регионов для тестирования элементов конкретного управления ткани.
Для большого числа приложений требуется выражение трансгенов в ячейку определенным образом в трансгенных животных. Кроме того создание трансгенных животных может быть весьма способствовать экран предполагаемого регулирования геномной ДНК фрагментов способность контролировать конкретные выражения ячейки данного гена. В качестве примера лентивирусные опосредованной производства трансгенных животных используется для сопоставления клеток конкретных усилителей этого элемента управления выражение Neurogenin 3 (Neurog3)11. Neurog3 является основой Спираль-петля-спираль (bHLH) транскрипционный фактор, который управляет приверженность поджелудочной железы прародителей к судьбе эндокринной. В Neurog3 null мутантных мышей эндокринных клеток в поджелудочной железе не могут дифференцировать19. Фрагмент ДНК 2.2 КБ, локализованные между позициями,-5284 и-3061 по отношению к транскрипции Neurog3 запустить сайт был клонирован в лентивирусные вектор вверх по течению бета Глобин минимальный промоутер диск выражение гена репортера eGFP как описано 11. конструкцию управления аналогичным образом генерируемые клонирования 2,4 КБ intergenic локализуются на мыши хромосома 6 (chr6: 14237279-14239685 относительно mm9 мыши генома Ассамблеи) в том же лентивирусные магистрали. Этот регион геномной локализуется в пределах 1 мега база длинные гена пустыни, между Gpr85 и Ppp1r3a генов. Высокий титр лентивирусные векторы далее были произведены с помощью конструкций и именованные Neurog3- enh-eGFP и Chr6-eGFP.
Обе лентивирусные векторы были построены и производства (дополнительные методы). Поскольку никакие клетки, выражая Neurog3 в настоящее время имеются, титр ту не удалось определить. Кроме того титр была измерена как концентрация белка капсид p24. 2 векторов были вводят в пространстве наблюдаться оплодотворенных яйцеклеток и имплантации в псевдо-беременных самок мышей. Имплантированных эмбрионов были собраны на эмбриональных день 14,5 (E14.5), как этой стадии развития соответствует максимальной выражение Neurog3 в поджелудочной железе. Эмбрионы были далее генотипируемого следовать eGFP интеграции. 84% (n = 47) и 71% (n = 48) собранных эмбрионов интегрированы трансген для Chr6-eGFP лентивирусные конструкциями и Neurog3- enh-eGFP соответственно (Таблица 1). Для каждого эмбриона поджелудочной бутон был расчлененный и затем секционного для выполнения иммуноокрашивания. 92% Neurog3- enh-eGFP трансгенной эмбриона выразил eGFP в поджелудочной железе, как показано на рисунке 4 верхней панели (представитель иммуноокрашивания). Важно отметить, что подавляющее большинство eGFP положительные клетки были также выражая клетки Neurog3 (рис. 4), указывая, что 2.2 КБ Neurog3 усилитель способен ограничивать выражение eGFP внутри популяции клеток Neurog3 . Оппозиция ни один из Chr6-eGFP эмбрионов выразил eGFP (Рисунок 4 нижней панели и Таблица 1) в поджелудочной железе или за пределы поджелудочной железы. Кроме того выражение eGFP не внематочная было отмечено за пределы поджелудочной железы в Neurog3- enh-eGFP эмбрионов11.
Для 4 экспериментов, представленные выше точное количественное описание каждого шага процедуры представлены в таблице 1. Это иллюстрирует глобальной эффективности процедуры. Действительно при сравнении количества собранных животных, которые интегрированы с номером вводят оплодотворенные яйца трансген, глобальный урожайность процедуры-44% в среднем. Доходность же с pronuclear ДНК инъекции конструкции, содержащую Улушитель Neurog3, сливается с бета галактозидазы репортер не превышает 3,1%.
Трансдукция оплодотворенных яйцеклеток с вектором лентивирусные приводит к интеграции трансген, которые могут произойти в нескольких сайтов10,13. Относительное количество трансген интеграции сайтов были оценены с помощью количественной ПЦР на геномной ДНК (рис. 5). Количественная оценка eGFP интеграции был определяется количественным PCR (ПЦР) и нормализуется Cdx2 ген, который присутствует в 2 копий на генома как описано выше11. Среднее количество сайтов интеграции был 19.36 ± 2.468 (S.E.M.) и 9.537 ± 1.186 (S.E.M.) в эмбрионы, полученные Neurog3- enh-eGFP и конструкции Chr6-eGFP, соответственно. Интересно, что два лентивирусные векторы, используется для производства этих животных представлены различные вирусные титры. Концентрация белка капсид p24 124 нг/мкл для Neurog3- enh-eGFP вектора и 52 нг/мкл для элемента управления Chr6-eGFP вектора. Это наиболее вероятно, что такая разница титр будет приходиться значительная разница наблюдается в интеграции сайта чисел в обоих населения трансгенных эмбрионов (рис. 5). Это предполагает, что среднее количество сайтов интеграции, полученные в пакете основатель трансгенных мышей может модуляции с помощью вирусного запасов с различными титры.
Важно отметить, что нет прямой корреляции было отмечено между выражением eGFP в Neurog3- enh-eGFP трансгенной эмбриона и количество копий трансген, которые были интегрированы. Другими словами эмбрионов, которые включены один или несколько копий Neurog3- enh-eGFP трансген аналогичным образом оказались Экспресс eGFP позитивных клетках Neurog3.
Рисунок 1: схема общей процедуры Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: Подготовка микро инъекции пипетки и генотипирования.
(A) схематические чертежи микроинъекции дозаторов, чтобы подчеркнуть основные различия между пипетки для ДНК или инъекции лентивирусные вектор. Левая панель: Общая форма обоих типов дозаторов рисуется. Пунктирной окружности подчеркивает увеличенной области кончика пипетки. Также представлены фотографии советы пипетки. Обратите внимание, что для лентивирусные инъекций наконечник должен быть сломанной как указано пунктирной линией и соответствующее изображение. Правая панель: пример внедрения яйцо, установка с Холдинг накапайте слева, оплодотворенная яйцеклетка и инъекции накапайте либо в один пронуклеусами или в пространстве наблюдаться. Масштаб баров = 50 µm. Визуализация (B) на геле агарозы eGFP ПЦР продукта усиливается от геномной ДНК, извлеченные из 8 различных эмбрионов (переулок 1-8). Трансген eGFP включила только эмбрионов, 1, 2, 3, 5, 6 и 8. PTrip ДНК плазмиды ПГК eGFP, используемые для производства лентивирусные вектор был использован как положительный контроль ПЦР. Для отрицательного контроля H2O заменил ДНК в реакции PCR. MWM: маркер молекулярного веса. BP = база пара. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Повсеместно промоутеров диск выражение eGFP репортер в трансгенной эмбриона.
10 мкм крио секций трансгенных эмбрионов были витражи для визуализации eGFP выражение (зеленый) и ядра (синий). Эмбрионов, созданных с ЦМВ промоутер лентивирусные построить (верхняя левая метка) были собраны в E11.5. Эмбрионов, созданные с помощью CAG промоутер лентивирусные конструкции (нижний левый метка) были собраны в E18.5. Pb: поджелудочной железы бутон, VSC: вентральной спинного мозга, Vt: позвонки, Li: печень, Ms: мышцы живота пояса. Масштаб баров = 50 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: Ячейку конкретное выражение гена репортера в трансгенной эмбриона управляется усилитель Neurog3 . 10 мкм крио секций E14.5 поджелудочной железы почки трансгенной эмбриона окрашивали визуализировать выражение Neurog3 (красный), eGFP (зеленый) и ядра (синий), как описано в дополнительные методы). Neurog3 выражение разбросаны в поджелудочной железе. Трансгенные эмбрионов, которые интегрированы Neurog3- enh-eGFP построить Экспресс eGFP, и большинство eGFP позитивных клеток Neurog3 положительным (верхняя группа). Эмбрионов, созданных с помощью Chr6-eGFP конструкции были не выражая eGFP (Нижняя панель). Масштаб баров = 50 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: относительная копия количество комплексных трансгенов. Количественная оценка eGFP интеграции сайтов по отношению к CDX2 гена, как описано в разделе протокол. Блочная диаграмма от 25-го до 75-й процентили. Точки представляют различные трансгенных эмбрионов, которые были созданы. Сравнение сайтов трансгенов интегрированы между двумя лентивирусные конструкций значительно отличается (неспаренный параметрический t тест, p = 0,001). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Таблица 1: шаг за шагом количественного отчета во время полной процедуры. В ходе процедуры были подсчитаны общее количество яиц и эмбрионов. Первый столбец представляет общее количество яиц, которые были извлечены из яйцеводов суперовулированных самок. Только яйца с очистить 2 полярные органов и/или видимой pronuclei вводили сообщается. После инъекции и через несколько часов в культуре были имплантированы только вводили яйца, которые не были лизированы и нормальной морфологии. Следующая подсчитывается общее количество эмбрионов, которые были собраны от pseudopregnant самок. Наконец в двух последних столбцах перечислены эмбрионов, которые интегрированы трансген и выразил корреспонденту. Те же функции также приведены для сравнения с эксперимент с использованием стандартных pronuclei ДНК инъекции. Здесь трансген содержал Neurog3 усилитель вождения экспрессии гена бета галактозидазы репортер (Neurog3- enh-LacZ). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Наблюдаться инъекции лентивирусные векторы в оплодотворенных яйцеклеток, описанные здесь в результате производства трансгенных эмбрионов, которые принесли более чем 70% эмбрионов трансгенных относительно общее количество собранных эмбрионов. Этот результат согласуется с предыдущими докладами и является примером специфика процедуры2,7,10,,1112. При сравнении все данные, представленные в таблице 1, важные функции могут быть выделены. Во-первых количество яиц, имплантированных соответствует всем вводят яйца, которые нормальной морфологии или не были лизированы после нескольких часов в культуре. 93% вводят яйца были имплантированы, предлагая почти полное отсутствие быстрого токсичности с инжекцией лентивирусные вектора в пространстве наблюдаться. Ситуация резко отличается, при рассмотрении ДНК инъекции, поскольку только 44% вводят яиц выжил и были имплантированы. Кроме того соотношение собранных эмбрионов относительно имплантированных яйца идентичен между двумя процедурами, предложив не усугубляется долгосрочной токсичности лентивирусные векторы. Во-вторых при выражении количество эмбрионов, которые интегрированы трансген относительно количества закачиваемой яйца глобальной урожайности более чем в 10 раз выше с лентивирусные вектор инъекций по сравнению с ДНК инъекций. 86-fold разница даже нашли при сравнении количества эмбрионов, выражая трансген между двумя процедурами с использованием этой же конструкции усилитель Neurog3.
Важно отметить, что трансгенные производства доходность, по-видимому, зависимых трансдукции титра антител используемых лентивирусные векторы. Другими словами, лентивирусные векторы производится с титр выше 109 ту/мл достаточно для получения такой высокой доходности. Как описано в разделе протокол, введенный объем в пространстве наблюдаться находится в диапазоне от 10 до 100 pL. Этот объем будет представлять 10-100 активных лентивирусные частиц. По сравнению со стандартной pronuclei ДНК инъекции общее количество животных основателя создается с тем же количеством род животных по крайней мере в 10 раз выше при использовании лентивирусные векторы. Кроме того выражение пенетрантностью трансген чрезвычайно высока с этот протокол и было отмечено как с повсеместным и клеточной конкретных промоутеров за исключением промоутер ЦМВ. Оппозиция сотовой повсеместно промоутеров промоутер ЦМВ активно завершите метилирование ДНК20 и было показано, чтобы быть не в состоянии поддерживать долгосрочные выражение после трансдукции в плюрипотентных стволовых клеток21. Это могло бы объяснить очень ограниченное количество eGFP, выражая клеток наблюдается в трансгенной эмбриона. Таким образом лентивирусные векторы хорошо приспособлены для производства трансгенных животных, в которых выражение трансген контролируется клеток конкретных усилитель. Важно отметить, что протокол может использоваться экран для enhancer деятельность в естественных условиях и найти карту транскрипции сайтов связывания фактор в нормативной области11,12. Этот скрининг подход вряд ли может производиться с использованием стандартных трансгенез. Общее количество животных основатель, необходимо проверить все различные конструкции и достигали статистической значимости потребует десятки инъекции сессий, тогда как оно может быть получено быстро с лентивирусные опосредованной трансгенез.
Одним из основных различий между стандартной процедуре и метод на основе лентивирусные проживает в трансген интеграции. С помощью pronuclear инъекции, трансгенов случайным образом интегрировать как несколько копий в уникальный Локус. С помощью лентивирусные векторы, интеграция может произойти в нескольких локусов (один экземпляр на Локус) не будучи строго случайным. Клонирование интеграции сайтов с использованием линейного усиления при посредничестве ПЦР (LAM-PCR), группы D. Наконец показал, что трансгенов интегрировать преференциально в регионах открытые хроматина оплодотворенных яиц13. Предвзятости интеграции не должна вмешиваться или способствовать трансген выражение у трансгенных мышей. Интеграция во время лентивирусные трансдукции в одну ячейку стадии эмбриона происходит в открытых хроматина, который не может быть по-прежнему в открытой конфигурации позже во время разработки или в взрослых.
Кроме того при анализе копии количество комплексных трансгенов в первого поколения животных (F0) или эмбрионы, большие различия в количество комплексных трансген наблюдается. В этом исследовании, был найден в среднем 19 интегрированный копий с помощью Neurog3-enh-eGFP конструкции. Этот большой копии номер может отражать высокий уровень мозаичностью. Sauvain et al. провели обширное исследование комплексной локусов в F0 животных, созданных с помощью лентивирусные опосредованного метода описано здесь13. Они последовали 70 отдельных интеграции сайтов в 11 F0 животных и изучил тарифы передачи для каждого сайта от F0 трансгенных мышей их потомства F1. Общий показатель передачи 44% для индивидуальных комплексных трансген свидетельствует о том, что они чаще всего были созданы, либо после S-фаза одной клетки эмбрионов или до этапа S на стадии Двухкамерные. Действительно интеграции до S-фаза передаст комплексной трансген для обоих дочь клеток, при интеграции после того, как S-фаза передаст его дочь только одну ячейку. Таким образом степень мозаичностью для отдельных интегрированных трансгенов минимальна у трансгенных мышей, полученные через этот метод. Это далее указывает, что большинство интеграции будет происходить в течение первых 12 ч, соответствующее среднее время производства первого расщепления в условиях используется культура. Эта интеграция кинетическая соответствует описанному для lentiviruses в T-лимфоидных клеток22.
Главное с большое количество локусов, обнажая комплексной трансгенов, создание мыши линии не будет разумной. Количество переходов для разделения этих локусов бы значительно высоким. Это представляет собой одно важное ограничение этого метода, который должен использоваться для быстрого скрининга трансген эффектов или для одновременного анализа нескольких трансгенов. Тем не менее мыши линии все еще может устанавливаться, выбрав из F0 животного те с номером копии низкие комплексной трансген.
С момента первого описания pronuclear ДНК инъекционного метода1внесены улучшения, что обойти многие из недостатков первоначальной процедуры. Первый набор усовершенствований была основана на целенаправленной интеграции в точных локус, используя стратегию обмена кассеты. Pronuclear инъекция производится с использованием либо CRE, сальто или PhiC31 recombinases вместе с интегративной фрагмент ДНК рядом с loxP, ФРТ или attB сайтов, соответственно. В этой ситуации интегративной ДНК осуществляется обмен с интегрированной фрагмент, окруженный с определенного сайта же рекомбиназа,23,,24. Хотя до 60% первого поколения животных может быть трансгенных23 с помощью такого метода, по-прежнему применяются ограничения, связанные с технологией pronuclear инъекции. Второй набор улучшения основана на цитоплазматической инъекции две круговые ДНК, один перевозящих фрагмента, чтобы интегрировать и одно разрешение выражение либо Tol225, Спящая красавица26 или piggyBac27 transposases. С помощью этих методов, получены высокие урожаи (> 30%), но что более важно, цитоплазматических инъекция легко выполнить и обходит ограничения из-за pronuclear инъекции как лентивирусные на основе протокола. Кроме того очень больших фрагментов ДНК, таких как бактериальных искусственных хромосом, могут быть интегрированы.
Ясно, что лентивирусные опосредованной трансгенез не заменит стандарта ни усовершенствованных процедур. Еще этот метод представляет собой мощный инструмент для быстрой животную модель производства и характеристика как она значительно уменьшает необходимое время для создания надлежащего числа животных с наименее генетическая изменчивость. Кроме того эта технология может применяться непосредственно к все мыши штаммов, включая любые трансгенных линий. Кроме того важно отметить, что глобальный ландшафт поколения Роман животных моделей может измениться с недавней разработкой технологии ТРИФОСФАТЫ/Cas9. Сегодня pronuclear инъекции Cas9 белка, а также руководство РНК позволяет редактировать производства генома животных моделях эффективность 40%28. Этот подход во многом выиграют от использования лентивирусные опосредованной трансгенез. Действительно использование29 -интеграционных лентивирусные векторы временно выразить обе Cas9 и руководство РНК может привести к еще более высокие урожаи производства. Сочетание новейших технологий для получения актуальной и надежной Животные модели выиграет большинство международных исследовательских групп, участвующих в изучении патогенеза заболевания и терапевтические подходы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы имеют никакого конфликта интересов раскрыть.
Acknowledgments
Мы благодарим Магали Дюмон и Роландо Мелони для критических чтении рукописи и iVector и Phenoparc ядер ICM для оказания технической помощи в производстве лентивирусные вектор и животных жилья соответственно. Эта работа была поддержана нейронаук де Hospitalo-Университетский институт Translationnelles de Paris, IHU-A-ICM, будущее Investissements АНР-10-IAIHU-06. P.R. получил финансирование ассоциации де Langue Française pour l'Etude du Diabète et des Maladies Métaboliques (ALFEDIAM) и совместных JDRF / INSERM гранта.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
| hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
| NaCl | Sigma | 7982 | |
| 100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
| 4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| 0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
| Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
| Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
| Curved forceps | Moria | 2183 | |
| Curved scissors | Moria | MC26 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
| Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
| Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
| Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
| Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
| vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
| Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
| ocrygel | centravet | OCR002 | |
| Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
| Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| SDS | Sigma | 436143 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | powder |
| proteinase K | Sigma | P2308 | |
| oneTaq kit | NEB | M0480L | |
| Primers | Eurogentec | ||
| Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
| 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
| Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
| Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
| qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |
References
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
- Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
- Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
- Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
- van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
- Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
- Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
- Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
- Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
- Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
- Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
- Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
- Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
- Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
- Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
- Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
- Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
- Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
- Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
- Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).
