Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול לקדם אינטגרציה transgene וייצור של מייסד העכברים הטרנסגניים עם יעילות גבוהה על ידי זריקה פשוטה של וקטור במרחב perivitelline של oocyte מופרית lentiviral.
Abstract
במשך כמעט 40 שנה, הזרקת הדנ א pronuclear מייצג את השיטה הרגילה כדי להפיק העכברים הטרנסגניים עם שילוב אקראי של transgenes. בדיקה שגרתית הוא מנוצל באופן נרחב ברחבי העולם ומתגורר הגבלה העיקריים שלה היעילות העניים של אינטגרציה transgene, וכתוצאה מכך תשואה נמוכה של מייסד חיות. רק אחוזים בודדים של בעלי חיים שנולד אחרי ההשתלה של oocytes מופרית מוזרק שילבו את transgene. לעומת זאת, וקטורים lentiviral הם כלים רבי-עוצמה עבור העברה גנטית אינטגרטיבית, השימוש שלהם כדי מגלי oocytes מופרית מאפשר הפקה יעילה במיוחד של מייסד העכברים הטרנסגניים עם תשואה ממוצעת מעל 70%. יתר על כן, כל זן העכבר יכול לשמש כדי לייצר חיים מהונדס, והוא penetrance הביטוי transgene גבוהה מאוד, מעל 80% עם lentiviral transgenesis בתיווך בהשוואה ל- DNA microinjection. גודל המקטע דנ א זה יכול להיות מטען על ידי וקטור lentiviral מוגבל ל 10 kb ומייצג המגבלה העיקרית של שיטה זו. שימוש פשוטה וקלה לביצוע הליך הזרקת מתחת zona pellucida של oocytes מופרית, יותר מ 50 מייסד בעלי חיים יכול להיות מיוצר בחצר מושב בודד של microinjection. השיטה היא מאוד מותאם לביצוע, ישירות במייסד חיות, רווח מהיר, אובדן של תפקוד לימודי או לאזורים דנ א גנומי מסך, ביכולתם לשלוט ולווסת ג'ין ביטוי ויוו.
Introduction
עבודתה החלוצית של גורדון. et al. 1980 הראה כי לאחר ההשתלה בעכברים pseudopregnant, דנ א פלסמיד הזרקה לתוך זכר pronuclei של oocytes מופרית ניתן תשואות ייצור הטרנסגניים חיות משולב פלסמיד DNA1. ההפגנה יונקים הטרנסגניים יכול להיווצר הייתה השפעה עצומה על מדעי החיים הכללית, פתיחת הדרך לשדות הרומן של המחקר הן עבור מדעי ביו translational מדעים בסיסיים. ארבע העשורים האחרונים, הפך ה-DNA microinjection אימון שגרתי. למרות מספר עצום של העכברים הטרנסגניים הופקו, השיטה הרגילה אינה שמישים לחלוטין עבור כל עכבר זנים ודורשת זמן רב בנשימה ובריכוז2,3. היישום שלה למינים אחרים נותר מאתגר4 , התשואה הכוללת של אינטגרציה transgene מוגבלת כמה אחוז בעלי חיים נולד ב5. בנוסף, היעילות של אינטגרציה transgene מייצג את הגורם המגביל המסביר את התשואה הכוללת המסכן של הזרקת הדנ א pronuclear. במובן זה, וקטורים ויראלי אינטגרטיבית הם הכלים היעילה ביותר כדי מטען לשלב את transgenes ואת ובכך יכול לספק אמצעי חדש להגביר משמעותית את התשואה אינטגרציה, המגבלה היחידה כל כך גודל transgene לא עולה על 10 kb6 .
מדומים מוקלד עם החלבון envelop וירוס Vesicular Stomatitis (VSV) lentiviral וקטורים הם כלי העברת הגנים pantropic ו אינטגרטיבית מאוד והוא יכול לשמש כדי מגלי מופרית oocytes7. Zona pellucida המקיפים את oocytes היא מכשול טבעי וירוס וצריך לעבור כדי לאפשר התמרה חושית עם הווקטורים lentiviral. חיות הטרנסגניים נוצרו על-ידי transducing oocytes מופרית לאחר קידוח מיקרו או הסרה של8, zona pellucida9. עם זאת, הזרקה מתחת zona pellucida בחלל perivitelline נראה כי השיטה הפשוטה ביותר כדי מגלי הביצים כפי שמתואר בתחילה על ידי לואיס ועמיתיו7.
הזרקת perivitelline של וקטורים lentiviral מאפשרת תפוקה גבוהה ייצור הטרנסגניים חיות מעל 70% של בעלי חיים נולד. תשואה כזו היא מעל 10-fold גבוה יותר מאשר התשואה הטובה ביותר זה יכולה להיות מושגת באמצעות תקן pronuclei DNA הזרקת7,10,11. בהקשר זה, מושב בודד של זריקות יפיק לפחות 50 הטרנסגניים המייסדים (F0). המספר הגדול של מייסדי הוא, לכן, תואם עם phenotyping של האפקט transgene מתבצע ישירות על עכברים F0 ללא צורך ליצור קווים העכבר מהונדס. יתרון זה מאפשר להקרנה מהירה של האפקט transgene, מותאם במיוחד לביצוע ויוו להפסד ורווח של מחקרים פונקציה בתוך שבועות. בנוסף, רכיבי ה-DNA תקינה יכולים גם להיות במהירות מוקרן למפות משפרי ומוטיבים DNA מחויב על ידי שעתוק גורמים11,12. עם זריקות pronuclear, transgenes בדרך כלל לשלב עותקים מרובים כמו ב לוקוס ייחודי. עם וקטורים lentiviral, אינטגרציה מתרחשת לוקוסים מרובים כעותק יחיד לכל לוקוס10,13. לכן, הריבוי של לוקוסים משולב הוא ככל הנראה קשור penetrance ביטוי גבוהה מאוד שנצפתה הטרנסגניים המייסדים, מה שהופך את המודל החדש שנוצר עמידים יותר.
חשוב, כאשר באמצעות הזרקת pronuclear של ה-DNA, ויזואליזציה של pronuclei במהלך ההליך הוא בהחלט נדרש. מגבלה טכנית זו מונעת את השימוש oocytes מופרית שמקורם במגוון גדול של זנים העכבר. לכן, הפקה של מודל הטרנסגניים מסוימים מסננים עבור אילו pronuclei הן בלתי נראות דורש את הייצור של בעלי חיים בגן זן מתירניות ואחריו בנשימה ובריכוז רצופים לפחות 10 כדי להעביר את transgene העכבר הרצוי זן. עם הזריקות וקטור lentiviral, שטח perivitelline גלוי תמיד ואת הזריקה אינה דורשת מיומנויות ספציפיות מאוד. לדוגמה, העכברים הטרנסגניים הנד/SCID אינן מתאימות pronuclei הזרקת הושגו עם זריקות וקטור ויראלי14.
. הנה, פרוטוקול מקיף מוצג כדי לאפשר ייצור פשוטה של העכברים הטרנסגניים באמצעות זריקות lentiviral וקטור במרחב perivitelline של העובר בשלב תא אחד. הביטוי Transgene נשלט עם כל אחד בכל מקום או תאים ספציפיים היזמים מתואר בפירוט.
PTrip ΔU3 עמוד השדרה lentiviral היה בשימוש במחקר זה15. וקטור זה מאפשר הפקת שכפול וקטורים lentiviral הפגום שבו הרצף U3 חלקית נמחק כדי להסיר U3 יזם פעילות ולהפיק וקטור (חטא) עצמית inactivating16. וקטור lentiviral מניות יוצרו על ידי תרביות תאים ארעית של תאים HEK-293T עם p8.91 כימוס פלסמיד (ΔVpr ΔVif ΔVpu ΔNef)6, קידוד ה גליקופרוטאין-G וירוס (VSV) vesicular stomatitis17, ו ΔU3 pTRIP את pHCMV-G וקטור recombinant. הנוהל מפורט ייצור מסופק שיטות משלימות.
הפקה של כייל נוגדנים גבוה וקטור lentiviral מניות מבוצעת בתנאים אבטחה ברמה II (BSL-2). זה נכון לגבי רוב transgenes חוץ oncogenes חייב להיות מיוצר BSL-3. לכן, ייצור בתנאים BSL-2 ברוב המקרים מספיקה. בנוסף, השימוש ואת הייצור מנותקים בדרך כלל עבור סוכנויות רגולציה הלאומית ביותר העוסקים אורגניזמים מהונדס גנטית (GMO). כמות מוגבלת של שכפול לא מוכשר חטא lentiviral וקטורים (מתחת µg 2 של חלבון p24 capsid) יכול לשמש בתנאים BSL-1 כפי שתואר על ידי הסוכנות הצרפתית GMO מסכים עם המלצות האיחוד האירופי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הליכים הכוללים עבודה בעלי חיים יש להשיג אישור אתית, קיבלו אישור מאת משרד הצרפתי של מחקר והוראה תחת מספר APAFIS #5094-20 v6 16032916219274 ו- 05311.02. המתקן ICM בעלי חיים PHENOPARC הוסמך על ידי משרד צרפתי החקלאות תחת המספר להסמכת B75 13 19. פרוטוקול הכולל מחייב ביצוע כל הליך בתוך מסגרת זמן מדויק המסוכמים באיור1.
1. בעלי חיים רכישה והכנת תרכובות בסיסי
- רכישה בעלי חיים
- להזמין 25 עיקור זכרים B6CBAF1/JRj כי הם 8 שבועות של גיל (דור F1 מ מקורי חוצה בין ♀C57Bl/6JRj ♂CBA/JRj).
הערה: לבודד זכרים עם ההגעה. זכרים שם. יכול להיות שימוש חוזר עבור שנה אחת לפחות.
לשנות את הכלובים כל 3 שבועות. - להזמין 50 נקבות B6CBAF1/JRj בגיל 10 שבועות, לשמור על מאגר של פחות 50 בעלי חיים.
- להזמין 10-15 C57BL/6JRj זכרים פורייה כי הם בגיל 8 שבועות.
- להזמין כ-30 נקבות C57BL/6JRj כי הם בגיל 4 שבועות.
- להזמין 25 עיקור זכרים B6CBAF1/JRj כי הם 8 שבועות של גיל (דור F1 מ מקורי חוצה בין ♀C57Bl/6JRj ♂CBA/JRj).
- המתת חסד והרדמה
- ההרדמה מבוצעת באמצעות אמצעי אחסון של 300μL קטמין/חריגות השירותים הווטרינריים מיקס, מוזרק intraperitoneally (קטמין במינון של משקל הגוף 150μg/g, חריגות השירותים הווטרינריים במינון של 0.15μg / g למשקל הגוף). חיות ממוקמים תחת חימום כרית כדי להתאים את טמפרטורת הגוף. בדוק את הרפלקסים על ידי צובט את הזנב של החיה לפני תחילת ההליך.
- המתת חסד בוצע על ידי נקע בצוואר הרחם. עריפה נכללה כשיטה משנית כדי לאשר את מותו של החיה. המתת חסד של עוברי בוצעה ע י עריפת ראשו.
הערה: בעת ההגעה, לאפשר חיות לפחות משבוע habituate למתקן (ללא טיפול או הזדווגות). חשוב לציין, כל זני העכבר כולל קווי הטרנסגניים יכול להיות מנוצל כמו פורייה זכרים ונקבות פורייה עבור superovulation. הבחירה של זן צריכה להיעשות בהתאם לדרישות של השאלה המדעית.
- הורמון הכנה
- להוסיף µL 910 מאגר PSMG (גונדוטרופין סרום מארה בהריון) לתוך מבחנה 1 PMSG lyophilized, להפוך 100 µL aliquots ו לאחסן ב-20 ° C.
הערה: כל aliquot מכיל 55 ממשק המשתמש עבור 11 עכברים. אף פעם לא שמור PMSG aliquots במשך יותר מ 2 שבועות לאחר השימוש הראשון. - הוסף מספר 2730 µL hCG (גונדוטרופין כוריוני אנושי) מאגר 1 lyophilized hCG המבחנה. להפוך 100 µL aliquots, ולאחסן ב-20 ° C.
הערה: כל aliquot מכיל 55 ממשק המשתמש עבור 11 עכברים.
- להוסיף µL 910 מאגר PSMG (גונדוטרופין סרום מארה בהריון) לתוך מבחנה 1 PMSG lyophilized, להפוך 100 µL aliquots ו לאחסן ב-20 ° C.
- הכנה hyaluronidase
- לשקם את מבחנה 1 של hyaluronidase עם 3 מ"ל של M2 מדיום כדי להשיג 10 מ"ג/מ"ל פתרון מניות 50 µL aliquots. אז החנות ב-20 ° C.
- הכנת כלי ניתוח
- לעקר כל כלי ניתוח באמצעות החיטוי.
2. superovulation של תורמים הנשי
- במתקן בבעלי חיים באמצעות 12 h יום - לילה מחזורים, להזריק PMSG בשעה 14:00 ביום-3. להזריק hCG ב AM יום-1, חבר עם זכרים פורייה רק לאחר הזרקת hCG.
- ביום-3, להוסיף 1 מ"ל של פתרון סטרילי של NaCl 0.9% 1 aliquot של 100 µL של PMSG (55 UI). מזריקים 10 נקבות C57BL/6JRj µL 100 intraperitoneally באמצעות מזרק ללא כל אמצעי אחסון מת.
הערה: כל עכבר מקבל 5 ממשק המשתמש של PMSG. - ביום-1, להוסיף 1 מ"ל של פתרון סטרילי של NaCl 0.9% 1 aliquot של µL 100 של hCG (55 UI). להזריק העכברים שקיבלו הזרקה PMSG עם 100 µL של hCG מדולל פתרון (5UI) intraperitoneally. השתמש מזרק ללא כל אמצעי אחסון מת. לבצע את הזריקה לאט ולא לחכות לפני הסרת את המחט כך הנוזל אינה דולפת.
הערה: כל עכבר יקבל 5 ממשק המשתמש של hCG. הזרקה של hCG צריכה להתבצע 46 h לאחר PMSG. - מקם כל נקבה C57BL/6JRj לכלוב של הזכר הרבעה ישירות לאחר הזרקת hCG.
- בדוק מהנרתיק פקקים בבוקרו של יום 0 ולהשתמש הנקבות חיובי כדי לאסוף את הביצים.
3. מכינים הנקבות Pseudopregnant B6CBAF1/jRj
- חבר אחד עיקור זכר יום לפני איסוף ביצים (יום-1) עם 2 נקבות B6CBAF1/JRj בשעה 17:00.
הערה: חשוב מאוד כדי להזדווג עם הנקבות הן שמקורן בכלובים שונים כדי למנוע סינכרון של מעגלי נשים. זה יהיה להגדיל את התשואה של קבלת תקעים הנרתיק. בנוסף, אל תוסיף הנקבה לכלוב הזכר שהשתנה בתוך היומיים האחרונים. היעילות של התנהגות הרבייה הזכר הוא גדל כאשר הכלוב מלוכלך.
4. הביצים אוסף
- הכנה
- להוסיף 1450 µL של M2 hyaluronidase פתרון מניות כדי להכין את הפתרון עובד hyaluronidase.
- במקום טיפה אחת של µL 100 של hyaluronidase הפתרון עובד לכל נקבה נהגה לייצר הביצים ב- 100 מ מ פטרי ולשמור בטמפרטורת החדר.
- להוסיף 500 µL של M16 לתוך בארות 4 צלחות. השתמש בארות 2 לפי סוג של lentiviral וקטורים זה להיות מוזרק: אחד טוב יכיל את הביצים מוזרק והשני אלה שאינם המוזרק. מקם את הצלחות טוב 4 בחממה ב 37 ° C עם אווירה של2 CO 5%.
- היכונו פיפטות איסוף וטיפול של העוברים.
- לרכך הנימים המטוקריט זכוכית (75 מ מ/60 µL) על-ידי סיבוב במרכז לאורך צינור נימי זכוכית קשה ב הלהבה.
- הסר את הנימים החום מהר ככל האפשר ולמשוך לקבל צינור בקוטר פנימי כ-300 מיקרומטר. למשוך לאורך צינור מקורר לקבל הפסקה מסודרת.
- לאסוף את oviducts.
- המתת חסד נקבות C57BL/6JRj על ידי נקע בצוואר הרחם בשעה 9:00 ביום 0. מוות אושר על ידי עריפת ראש.
הערה: שיטה זו המתת חסד אושרה על-ידי IACUC, עוקב אחר ההמלצות האירופית. - לבצע חתך אופקי גדול כדי לפתוח את חלל הבטן עם מספריים. Oviduct ממוקם בין הרחם השחלה.
- הסר את mesometrium ואת קרום נושאת כלי דם בולטים עם מלקחיים מעוקל.
- הפרד את oviduct מן השחלה עם מלקחיים מעוקל.
- השימוש מלקחיים מעוקל כמדריך לחתוך את oviduct מן השחלה בעזרת מספריים מעוגלים.
- משוך את oviduct, גזור מן הרחם במספריים מעוגלים.
התראה: אל תיגע ampulla נפוחות המכיל את הביצים. בצע את ההליך כולו באמצעות מכשירים סטריליים. - מניחים כל שנאספו oviducts M2 בינונית (35 מ מ תרבות תבשיל) בטמפרטורת החדר
- מקום 2 oviducts טיפת 100 µL באותו הפתרון עובד hyaluronidase (0.3 mg/mL).
- המתת חסד נקבות C57BL/6JRj על ידי נקע בצוואר הרחם בשעה 9:00 ביום 0. מוות אושר על ידי עריפת ראש.
- להסיר תאים תלולית מן הביצים.
- תחת stereomicroscope, השתמש 2 מזרקים אינסולין: להחזיק את oviduct הראשון והשני כדי לקרוע ampulla ומעוררים מופרית ביצים לתוך הפתרון עובד hyaluronidase.
- . קח את pipet זכוכית מוכן לאיסוף ביצים וחבר אותו לאורך צינור ומסנן 0.22 μm רכוב על פיו לרוקן את כל הביצים. לאסוף את כל הביצים ולשטוף אותם על ידי מעבר רצופים לתוך 6 טיפות µL 100 M2 בינוני שונים.
- המקום לרחוץ את הביצים לתוך חממה humidified 37 ° C עם אווירה של 5% CO2 בינוני M16.
5. ביצוע הזרקת סיליקון
- להשתמש דק עם קירות זכוכית צינורות קפילר (10-15 ס מ) עם מחוץ בקוטר של 1 מ מ, מהדק את נימי לתוך פולר micropipette אופקי.
הערה: באלו שלוחצים פיפטה ביותר אופקי, 3 פרמטרים יכול להיות מותאם: כוח חום, משיכת כוח וזמן השהיה בין חימום ומושך. כוונן פרמטרים אלה כדי להשיג שהזרקת pipets הדומה לזו המוצגים באיור 2A. עבור משתמשים באופן שגרתי מבצע DNA microinjection, השתמש בהגדרות סטנדרטי ולהתאים ההשהיה בין חימום ומושך כדי לשנות את הצורה הכללית של קצה פיפטה.
6. ביצוע אחזקות סיליקון
- השתמש על פיפטה שהזרקת כדי להכין את פיפטה אחזקות.
- לצרף על פיפטה שהזרקת microforge. חותכים את פיפטה עם microforge כדי לקבל טיפ סימטרית חדה של 80 עד 100 מיקרומטר קוטר. ואז פולנית הקצה עם חום על microforge כדי לקבל צורה עגולה סימטרית ללא שיחים חדה.
7. הכנת פיפטה זריקה המכילה את הווקטור Lentiviral
- Centrifuge התליה וקטור lentiviral ב 160 x g למשך 2 דקות הצניפה לעיתים קרובות נוכח במניות lentiviral קפואים הלכלוך.
- לשחזר את תגובת שיקוע והעבר אותו לתוך צינור 0.5 mL החדשה בכיתה II בטיחות בארון.
- העברת µL 1 של תגובת שיקוע פיפטה הזרקת שהוכן כפי שמתואר בשלב 5 באמצעות מיקרו-העובדים.
- הגדר את פיפטה הזרקת את הכלי המחזיק micromanipulator נכון. לחבר את pipet מחזיק micromanipulator השמאלי.
הערה: כייל התמרה חושית של וקטור lentiviral ישירות יקושרו היעילות של מייסד הייצור. על יעילות גבוהה (> 70%), השימוש וקטורים ויראלי עם כייל בטווח של 100 ננוגרם של חלבון p24 capsid/µL. כאשר כייל מבוטאת ביחידות התמרה חושית (טו), כייל צריך להיות מעל 109 טו/mL. וקטור lentiviral מניות חייב להיות מיוצר על ידי תרביות תאים ארעית של תאים 293T עם פלסמיד encapsidation p8.91, pHCMV-ג'י, קידוד vesicular stomatitis וירוס (VSV) גליקופרוטאין-G כפי שמתואר שיטות משלימות18.
8. מיקרו-הזרקה
- לוותר על µL 8 M2 בינוני במרכז דיכאון שקופית ומכסים בשמן פרפין אור (העובר נבדק) כדי למנוע התאיידות.
- מקום 20 ביצים לתוך הטיפה כמו לפחות התפזרו ככל האפשר.
התראה: אל תבצע בועות בעת הפקדת את העוברים. - ודא כי קצה פיפטה הזרקת פתוחה. אם לא, הקש על פיפטה הזרקה עם פיפטה מחזיק.
- להגדיר את microinjector למשך זמן ההזרקה של 20 s.
הערה: צמיגות של המתלה ויראלי מאפשר הדמיה ברורה של הפיזור של וקטור ויראלי במרחב perivitelline. הלחץ הזרקת צריך להיות מותאם כדי למלא את החלל כולו בתוך 20 s של זריקה, אשר מייצג את נפח של 10 עד 100 Pl. הזרקה בלחץ לא יעלה על 600 hPa. - האחות הביצית המופרית אחד המכיל גרעינים pro 2 ואת שתי גופות, קוטב עם פיפטה מחזיק תחת stereomicroscope.
- להחדיר את הביצה microinjector באמצעות הגדרות שמתואר 8.4, במרחב perivitelline.
התראה: אל תיגע קרום פלזמה עם הזרקת pipet. - להזריק כל הביצים זמין בקבוצות של 20 ביצים, למקם את הביצים מוזרק מיד במדיום M16 מחומם מראש לתוך החממה humidified 37 ° C עם אווירה של 5% CO2.
הערה: דגירה הביצים מוזרק למשך תקופה מינימלית של 30 דקות לאחר ההזרקה לפני העובר העברות.
9. העברת את העוברים אל הנקבות Pseudopregnant B6CBAF1/JRj
- בדוק תקע הזדווגות 16 h לאחר הזדווגות הנקבות B6CBAF1/JRj עם B6CBAF1/JRj סירוס זכרים. . לעשות את זה רק לפני תחילת האוסף ביצה
- היכונו פיפטות השרשת העובר מוזרק.
- להפוך פיפטות השרשת העוברים כמתואר עבור איסוף וטיפול עוברי (שלב 4.2). בחר פיפטות עם קוטר פנימי של-150 מיקרומטר עם חלק צר בסביבות 4-5 ס מ אורך.
הערה: המידע צריך להיות להבה מלוטש, על מנת לצמצם נזק אפשרי את הביצים או את oviduct.- למלא שמן פראפין קל (העובר נבדק) מעל הכתף פיפטה.
- האחות בועת אוויר קטן, ואז M2 בינוני ולבסוף בועת האוויר השני.
- לצייר את העוברים אחד מאחורי השני כדי למזער את הנפח הכולל של מדיום זה להיות מוזרק ב oviduct יחד עם העוברים.
- סיום על-ידי טעינת טיפה מאוד קטנה של שמן פראפין קל (העובר נבדק) של העובר על אחד רוחב.
התראה: להיות עדין תוך כדי טיפול על פיפטה.
- להפוך פיפטות השרשת העוברים כמתואר עבור איסוף וטיפול עוברי (שלב 4.2). בחר פיפטות עם קוטר פנימי של-150 מיקרומטר עם חלק צר בסביבות 4-5 ס מ אורך.
- השתלת.
- לעקר את כל הכלים.
- עזים ומתנגד הנקבה באמצעות זריקה בקרום הבטן של 300 μL של פתרון סטרילי 0.9% NaCl המכיל 150 μg לכל גרם של משקל הגוף של קטמין ו- 0.15 μg לכל גרם של משקל הגוף של חריגות השירותים הווטרינריים.
- לאמת את העומק של הרדמה על ידי צובט את הזנב של החיה עם מלקחיים, להזריק subcutaneouly 0.1 מ"ג/ק"ג של שיכוך כאב (הבופרנורפין) לפני תחילת ההליך.
- לגלח 2 ס מ משני צידי הגב לאורך חוט השדרה ברמה של הצלע האחרונה.
- הנח את העכבר הנשי על כרית החימום, בתוך שדה סטרילי. חתך חלון 2 ס"מ על 2 ס"מ באמצע הגב העכבר.
- להחיל פתרון חיטוי (10% Povidone יודיד) על העור, עושים חתך רוחבי 1 ס מ עם מספריים, לאחר מכן החלק את העור רוחבית עד השחלה (צבע כתום) מוצגת דרך הקיר הגוף.
- עושים חתך 5 מ מ לתוך הקיר הגוף מעל השחלה עם המספריים בסדר תחת מיקרוסקופ כירורגי דו-עינית.
- להרים משטח שמן עם המלחציים הבולדוג atraumatic ולמשוך את השחלה, את oviduct ואת החלק העליון של הרחם.
- דמיינו ampulla ולהפוך hemisection במספריים vannas קטע oviduct המקשרת את השחלה ampulla.
- להציג את פיפטה עובר העברה ולספק ביצים לתוך ampulla, ועוצרים בועת האוויר הראשון בפיפטה ההשתלה.
- חזור על הפעולות על oviduct השני.
- מקרוב את העור עם קטעי הפצע.
- המקום החיה בשחזור קאמרית (39 ° C, 30-60 דקות) עד ער לגמרי.
- חזור על הזרקת כאבים לאחר 12 שעות ו 48 שעות במקרה של סימנים של כאב או מצוקה.
- הסר את הפצע קליפים 7-10 ימים לאחר הניתוח.
- בדוק נקבות מושתל הריון לפי עקומת המשקל שלהם כל 3 ימים לאחר ההשתלה. עלייה משמעותית במשקל יכול להיות שנצפו 10 עד 12 יום לאחר ההשתלה, יהיה מעיד על הריון.
הערה: כל העוברים שיתפתח כאן רצון לייצג המייסדים הטרנסגניים בשם. ניתן לנתח את פנוטיפ של מייסדי אלה בשלבים התפתחותיים כלשהם או לאחר הלידה לפי השאלה המדעית לקשר הדור של החיות הטרנסגניים האלה.
10. genotyping הטרנסגניים המייסדים
- הכנת מאגר genotyping המכיל 10 מ מ טריס-HCl, pH 8; 5 מ"מ EDTA, pH 8.0 עם 0.2% מרחביות (w/v), 50 מ מ NaCl. לעקר את המאגר genotyping דרך מסנן מיקרומטר 0.22 ולאחסן בטמפרטורת החדר למשך מספר חודשים.
- במקום ממברנות extraembryonic (עבור עוברי) או חתיכה קטנה של זנב (לבעלי נולד ב) לתוך µL 500 של סינון genotyping מאגר ולהוסיף 15 µL של proteinase K (20 מ"ג/מ"ל). דגירה בין לילה-55 מעלות צלזיוס.
- Centrifuge את lysate ב 15,000 x g למשך 5 דקות ולאחר מכן להשתמש µL 1 של תגובת שיקוע עבור התגובה ה-PCR. ניתן לאחסן Lysate ב 4 מעלות צלזיוס למשך מספר חודשים.
- לבצע הגברה PCR של קטע של transgene אמצעי תגובה 20 µL המכיל מאגר x PCR 1, 1.5 mM MgCl2, 200 מיקרומטר של dNTPs, 0.2 µM של כל תחל PCR, 1 ממשק המשתמש של Taq DNA פולימראז 1 µL של כל מדגם מעוכל. כפקד שלילי, להשתמש µL 1 H2O. כפקד חיובית, להשתמש DNA מ פלסמיד וקטור lentiviral המכיל את transgene.
- גילוי של eGFP תיאר שימוש:
eGFP 5: פריימר לפנים ' GACCACATGAAGCAGCACGACTTCT 3'
eGFP תחל הפוכה: 5' TTCTGCTGGTAGTGGTCGGCGAGCT 3' - לבצע PCR הגברה thermocycler: 4 דקות ב 94 ° C ואחריו 35 מחזורי 1 דקות ב- 94 ° C, 1 דקות ב- 60 ° C, ו- 2 דקות ב- 72 מעלות צלזיוס.
- לטעון את המוצר PCR על ג'ל agarose 2% על מנת להמחיש 300 bp eGFP PCR מוצר כמופיע באיור 2B.
הערה: כל אדם מציג להקה PCR bp 300 שילבו את transgene eGFP, יכול להיחשב transgenics. - לנתח את הביטוי transgene בבעלי חיים מהונדס. לדוגמה, לבצע היסטולוגית ו immunostaining כמו מאויר באיורים איור 3 ו- 4 איור ותיאר בשיטות משלימות.
הערה: שניהם transgene ביטוי ניתוח וניתוח פנוטיפ צריכה להתבצע בשיטות הרלוונטי לפי השאלה המדעית העולמית.
11. כימות של העתקה Transgene מספר
- להכין דגימות די אן איי PCR כמותי.
- תמצית הדנ א (gDNA) מ K Proteinase lysate שהושגו בשלב 10.3 באמצעות ערכת מסחרי לפי הוראות יצרן.
- לכמת gDNA על ידי ספקטרופוטומטר ב 260 ננומטר.
- לדלל כל מדגם gDNA כדי ריכוז סופי 10 ng/µL.
- עבור כל דגימה, להכין 5 דילולים טורי (1:5) בתוך H2O להשיג צינורות 6 בריכוזים הבאים: 10 ng/µL, 2 ng/µL, 0.4 ng/µL, 0.08 ng/µL, 0.016 ng/µL ו- 0.0032 ng/µL
- מכינים את תערובת התגובה כמותיים PCR (qPCR).
- להכין את תערובת פריימר qPCR. עבור כל זוג פריימר להשתמש עבור qPCR, להוסיף 10 µL של פריימר לפנים (100 מיקרומטר פריימר מניות פתרון), µL 10 של פריימר הפוכה (100 מיקרומטר) ו- 80 µL של H2O.
הערה: כדי להגביר את eGFP, השתמש תחל קדימה TCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCA ו- TTGATGCCGTTCTTCTGCTTGTCG הפוך. Cdx2 הגן משמש מנרמל qPCR (2 עותקים בכל הגנום). לשימוש Cdx2 מנרמל תחל קדימה GCCAGGGACTATTCAAACTACAGG ו- GACTTCGGTCAGTCCAGCTATCTT הפוך - הכנת תערובות qPCR 2, אחד עם המיקס פריימר eGFP ואחד במיקס פריימר Cdx2. להכין תערובת qPCR מספיק כדי להגביר את דילולים 6 שבו כפילויות של כל gDNA. התגובה qPCR אחת מכילה 3.8 µL של H2O, 5 µL של ניאון ירוק 2 x תערובת התגובה ו- 0.2 µL של מיקס פריימר.
הערה: לכל הטרנסגניים שפן לבחון, 24 תגובות qPCR יבוצעו. תערובת התגובה ניתנת עבור מכונת 384 qPCR טוב. - עבור כל חיה לבדוק, להפיץ: בארות 12 עם 9 µL eGFP qPCR מיקס, בארות 12 עם 9 µL של Cdx2 qPCR מיקס. להוסיף 2 בארות המכיל את המיקס qPCR eGFP 1 µL של כל דילול gDNA ומערבבים 2 בארות המכיל את qPCR eGFP.
- חופשה 2 בארות עבור כל qPCR מערבבים את gDNA אשר היה להחליף ב- H2O כפקד שלילי.
- להכין את תערובת פריימר qPCR. עבור כל זוג פריימר להשתמש עבור qPCR, להוסיף 10 µL של פריימר לפנים (100 מיקרומטר פריימר מניות פתרון), µL 10 של פריימר הפוכה (100 מיקרומטר) ו- 80 µL של H2O.
- מקם את הצלחת היטב 384 במכונה qPCR ולהחיל את הפרוטוקול פועל הבאות: 10 דקות ב 95 ° C ואז 50 מחזורים של 10 s ב 95 ° C ו 1 דקות ב- 60 ° C.
- ניתוח נתונים. כל gDNA לבדוק, מגרש הערכים Ct כפונקציה של יומן הרישום של gDNA סה כ סכום (6 נקודות שבו כפילויות). להתאים את העקומה באמצעות רגרסיה ליניארית עם השיטה הפחות מרובע, לנחש את הערך Ct התואם נקודת החיתוך עם ציר y. השתמש בערכים Ct משוערים eGFP, את Cdx2 מנורמל כדי לחשב את המספר עותק eGFP ביחס Cdx2 (2 עותקים) באמצעות שיטה סטנדרטית 2ΔdCt 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
חיות הטרנסגניים נוצרו באמצעות פרוטוקול המוצג כאן. נציג תוצאות שניהם בכל מקום, ביטוי ספציפי transgene סוג התא מומחשים.
ביטוי המכונן של transgenes
היזמים בכל מקום הן כלי מחקר בסיסי כדי להביע את transgenes בצורה יעילה ומתמשכת. היזמים כאלה משמשים למגוון גדול מאוד של יישום במבחנה תא תרביות תאים כדי ויוו transgenesis בבעלי חיים קטנים וגדולים.
וקטורים lentiviral נבנו כדי לבטא את הגן כתב פלואורסצנטי ירוק (eGFP) תחת השליטה של האמרגן cytomegalovirus (CMV) או ללא הפרדות צבע האמרגן שחטיבתי בהתבסס על היתוך גרעיני של יזם אקטין את העוף, משפר את CMV. שני וקטורים lentiviral המיוצר (שיטות משלימות), כייל היה נחוש בתאים 293T היחידות התמרה חושית (טו) מבוסס על הביטוי eGFP. שני המבנים וקטור lentiviral הוזרקו במרחב perivitelline של oocytes מופרית-ריכוז של 109 טו/mL ועכברים מושתל ב מדומים בהריון הנשי. מושתל העוברים היו הבא שנאספו לפני הלידה genotyped על ידי ה-PCR לעקוב eGFP אינטגרציה. 73% (n = 22) ו- 83% (n = 32) של העוברים שנאספו היה משולב של transgene נגד הציטומגלו-וירוס, הבונה lentiviral חטיבתי, בהתאמה (טבלה 1). עוברי הטרנסגניים היו אז משרטוטי והמוכתמות חיסונית-עבור eGFP. כמופיע באיור3, רק eGFP פזורים תאים חיוביים הם נצפו עם האמרגן CMV (איור 3, לוח העליון) ואילו כל התאים הביע GFP כאשר יזם החטיבה שימשה (איור 3, האמצעי והתחתון לוחות).
עם מקדם החטיבה, 96% של העוברים הטרנסגניים שנאספו ubiquitously הביע את transgene eGFP (טבלה 1). למרות שני היזמים הם בכל מקום, רק המקדם חטיבתי היא היכולת לביטוי חזקים כונן transgene בתוך כל התאים. היזמים בכל מקום חלופי היו בשימוש כגון phosphoglycerate קינאז (PGK) ו- C-אוביקוויטין היזמים, הניבו תוצאות דומות כמו אלה שהושג עם האמרגן חטיבתי עם רמות נמוכות יותר ביטוי של eGFP (נתונים לא מוצג).
אין ויוו מיפוי האזורים גנומית רגולציה לבחון את רכיבי בקרה ספציפיים ברקמות.
עבור מספר רב של יישומים, ביטוי של transgenes באופן ספציפי תא בבעלי חיים הטרנסגניים נדרש. בנוסף, ייצור הטרנסגניים בעלי חיים יכול להיות אינסטרומנטלי מאוד למסך את היכולת של הרגולציה בשם גנומית שברי DNA כדי לשלוט תא ביטוי ספציפי של גן מסוים. לדוגמה, שימש lentiviral בתיווך ייצור הטרנסגניים בעלי החיים כדי למפות תאים ספציפיים משפרי פקד זה הביטוי 3 Neurogenin (Neurog3)11. Neurog3 היא גורם שעתוק סליל-לופ-סליל (bHLH) בסיס השולט את המחויבות של אבות הלבלב לקראת גורלו האנדוקרינית. בעכברים המוטנטים null Neurog3 , אין תאים האנדוקרינית הלבלב יכול להבדיל בין19. קטע דנ א 2.2 kb מקומי בין עמדות-5284 ו--3061 ביחס Neurog3 שעתוק להתחיל באתר היה משובטים לתוך וקטור lentiviral במעלה הזרם שהבטא גלובין מינימלי מקדם לביטוי נסיעה של eGFP מדווח כאמור תיאר 11. מבנה הבקרה באופן דומה נוצר על-ידי שיבוט רסיס intergenic 2.4 kb מקומי על העכבר כרומוזום 6 (chr6: 14237279-14239685 ביחס mm9 העכבר הגנום הרכבה) של עמוד השדרה lentiviral אותו. האזור גנומית הוא מקומי בתוך המדבר 1 מגה-בסיס גנטי רב בין הגנים Gpr85 ו- Ppp1r3a . וקטורים lentiviral כייל נוגדנים גבוה יוצרו הבא באמצעות בונה, בשם Neurog3- enh-eGFP וגם Chr6-eGFP.
שני וקטורים lentiviral נבנו והפיק (שיטות משלימות). מאז לא התאים לבטא Neurog3 היו זמין כעת, כייל טו לא היתה אפשרות לקבוע. לחלופין, כייל נמדדה כמו ריכוז חלבון p24 capsid. הווקטורים 2 היו מוזרק במרחב perivitelline של oocytes מופרית, שהושתלו בעכברים נקבה בהריון מדומים. העוברים מושתל נאספו ביום עובריים 14.5 (E14.5) כפי שלב התפתחותי זה מקביל לביטוי מקסימלי של Neurog3 בלבלב. העוברים היו הבא genotyped לעקוב eGFP אינטגרציה. 84% (n = 47) ו- 71% (n = 48) של העוברים שנאספו היה משולב של transgene עבור Neurog3- enh-eGFP ו- Chr6-eGFP lentiviral בונה בהתאמה (טבלה 1). עבור כל העובר, ניצן הלבלב היה גזור, למחלקה ואז לבצע immunostaining. 92% של Neurog3- enh-eGFP עוברי הטרנסגניים הביעו eGFP בלבלב כמופיע בחלונית העליונה איור 4 (נציג immunostaining). חשוב, הרוב המכריע של eGFP חיובי התאים היו גם Neurog3 לביטוי תאים (איור 4) המציין kb 2.2 Neurog3 enhancer הוא מסוגל להגביל את הביטוי eGFP בתוך האוכלוסייה תא Neurog3 . על-ידי האופוזיציה, הביע אף אחד העוברים Chr6-eGFP eGFP (איור 4 בתחתית החלונית, טבלה 1) מחוץ הלבלב או בלבלב. בנוסף, אין ביטוי חוץ רחמי eGFP נצפתה מחוץ הלבלב עוברי - enh-eGFP Neurog311.
עבור 4 הניסויים שהוצגו לעיל, תיאור כמותי מדויק של כל שלב של ההליך מוצגת בטבלה1. זה ממחיש את היעילות הכללית של ההליך. אכן, כאשר משווים את המספרים של בעלי חיים שנאספו לשלב את transgene עם מספר הביצים מוזרק, הכמות הכללית של ההליך הוא 44% בממוצע. התשואה אותה עם זריקה DNA pronuclear של מבנה המכיל את enhancer Neurog3 התמזגו לכתב בטא-galactosidase אינו עולה על 3.1%.
התמרה חושית של oocytes מופרית עם וקטור lentiviral מוביל אינטגרציה transgene כי יכול להתרחש בכל אתרי מספר10,13. המספר היחסי של transgene שילוב אתרים הוערכו באמצעות PCR כמותי על הדנ א (איור 5). כימות של אינטגרציה eGFP היה נקבע על-ידי ה-PCR כמותי (qPCR), מנורמל לג'ין Cdx2 הקיים ב- 2 עותקים בכל הגנום כפי שתואר לעיל11. המספר הממוצע של שילוב אתרים היה 19.36 ± 2.468 (S.E.M.), 9.537 ± 1.186 (S.E.M.) בעוברי המופקים Neurog3- enh-eGFP ובבניית Chr6-eGFP, בהתאמה. מעניין, שני וקטורים lentiviral המשמשים לייצור החיות האלה הציג titers ויראליות שונות. הריכוז של חלבון p24 capsid היו של 124 ng/µL Neurog3eGFP - enh וקטור של 52 ng/µL עבור הפקד וקטור Chr6-eGFP. סביר להניח כי ההבדל כייל נוגדנים כאלה להסביר ההבדל המשמעותי שנצפתה שילוב האתר מספרים בשתי אוכלוסיית עוברי הטרנסגניים (איור 5). הדבר מצביע על המספר הממוצע של שילוב אתרים שהושג באצוות של העכברים הטרנסגניים מייסד יכול להיות מאופנן באמצעות מניות ויראלי עם titers שונים.
חשוב, נצפתה שום זיקה בין הביטוי של eGFP ב Neurog3eGFP - enh הטרנסגניים העוברים את מספר העותקים transgene זה היו משולבים. במילים אחרות, עוברים משולב בודדת או מספר עותקים של transgene - enh-eGFP Neurog3באופן דומה נמצאו eGFP אקספרס בתאים חיובי Neurog3.
איור 1: תרשים זרימה של ההליך הכולל אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: הכנת את הזרקת המיקרו פיפטות ואת genotyping.
(א) ציורים סכמטי של פיפטות microinjection כדי להדגיש את ההבדלים העיקריים בין pipets המשמש דנ א או וקטור lentiviral זריקות. השאיר פאנל: הצורה הכללית של שני הסוגים פיפטה מצויר. המעגל מקווקו מסמן את האזור המורחב של קצה pipet. תמונות של העצות pipet מוצגים. שימו לב כי להזרקה lentiviral הטיפ צריך לשבור כמצוין עם הקו המנוקד והתמונה המתאימים. לוח נכון: דוגמה של הזרקת ביצה מגדיר עם pipet מחזיק השמאל, הביצית המופרית של הזרקת pipet או אחד בתוך pronucleus או במרחב perivitelline. גודל ברים = 50 מיקרומטר. ויזואליזציה (B) על agarose ג'ל של מוצר ה-PCR eGFP הוגדל מ- DNA גנומי חילוץ מעוברים שונים 8 (ליין 1-8). רק עוברי 1, 2, 3, 5, 6 ו- 8 היה משולב של transgene eGFP. הדנ א פלסמיד pTrip PGK-eGFP המשמש לייצור וקטור lentiviral שימש PCR בקרה חיובית. עבור הפקד שלילי, H2O החליף את ה-DNA בעקבות תגובות PCR. עם אמא: סמן משקל מולקולרי. bp = זוג בסיסים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: היזמים בכל מקום לנהוג ביטוי של הכתב eGFP עוברי מהונדס.
10 מיקרומטר הקפאה-סעיפים של העוברים הטרנסגניים היו מוכתמים להמחיש ביטוי eGFP (ירוק), גרעינים (כחול). העוברים שנוצרו עם האמרגן CMV lentiviral לבנות (תווית השמאלית העליונה) נאספו ב E11.5. העוברים שנוצרו עם חטיבתי יזם lentiviral הבונה (תווית השמאלי התחתון) נאספו ב E18.5. חמאת בוטנים: באד הלבלב, VSC: חוט השדרה הגחון, Vt: חוליה, Li: הכבד, Ms: שריר של רצועת בטן. גודל ברים = 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: תא ביטוי ספציפי של גן מדווח ב עוברי הטרנסגניים מונעת על ידי משפר Neurog3 . 10 מיקרומטר הקפאה-קטעים של בלוטות הלבלב E14.5 של העוברים הטרנסגניים היו מוכתמים להמחיש את הביטוי של Neurog3 (אדום), eGFP (ירוק), גרעינים (כחול) כפי שמתואר שיטות משלימות). Neurog3 ביטוי מפוזרת בלבלב. עוברים הטרנסגניים משולב - enh-eGFP את Neurog3לבנות eGFP אקספרס ורובם של תאים חיוביים eGFP Neurog3 חיובי (החלונית העליונה). העוברים שנוצרו עם הבונה Chr6-eGFP לא הבעת eGFP (פאנל התחתונה). גודל ברים = 50 מיקרומטר אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: היחסי עותק מספר משולב transgenes. כימות של אתרי אינטגרציה eGFP ביחס CDX2 ג'ין כמתואר בסעיף פרוטוקול. תיבת מגרש מ 25th ל75 האחוזון . הנקודות מייצגות העוברים הטרנסגניים שונים נוצרו. ההשוואה של אתרים transgenes משולב בין המבנה lentiviral שני היא שונה באופן משמעותי (אינטראקצית פרמטרית-t-test, p = 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
טבלה 1: דוח כמותי צעד אחר צעד במהלך ההליך מלאה. במהלך ההליך, כלל מספר ביציות או עוברים נספרו. העמודה הראשונה מייצגת את המספר הכולל של ביצים אוחזרו מן oviducts של נשים superovulated. רק ביצים עם נקה שתי גופות קוטב ו/או גלוי pronuclei הוזרקו מדווחים. לאחר הזרקה של כמה שעות בתרבות רק את הביצים מוזרק זה היו לא lysed ולא היה עם מורפולוגיה תקינה היו מושתלים. הבא המספר הכולל של עוברי שנאספו מן הנקבות pseudopregnant נספרים. לבסוף, העוברים היה משולב של transgene, ביטא. הכתבת מפורטים אחרונה בשתי העמודות. אותן תכונות מקבלים גם להשוואה עם הניסוי באמצעות הזרקת הדנ א pronuclei רגיל. כאן transgene הכיל את enhancer Neurog3 נהיגה ביטוי של גנים כתב בטא-galactosidase (Neurog3- enh-LacZ). אנא לחץ כאן כדי להוריד את הקובץ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הזרקה perivitelline של וקטורים lentiviral ב oocytes מופרית המתוארים כאן הביא ייצור הטרנסגניים עוברי הניב יותר מ 70% של העוברים הטרנסגניים ביחס המספר הכולל של עוברי שנאספו. תוצאה זו עולה בקנה אחד עם דיווחים קודמים, מדגימה יחודיות של הליך2,7,10,11,12. כאשר משווים את כל הנתונים המוצגים בטבלה 1, יכול להיות מודגשים התכונות החשובות. קודם כל, מספר הביצים מושתל תאמו כל הביצים מוזרק מורפולוגיה תקינה או היו לא lysed לאחר כמה שעות בתרבות. 93% ביצים מוזרק היו מושתלים רומז היעדרות כמעט מוחלטת של רעילות מהיר עקב ההזרקה של lentiviral וקטור במרחב perivitelline. המצב הוא שונה באופן דרמטי כאשר בוחנים הזרקת הדנ א מאז רק 44% מכלל הביצים מוזרק שרד, שהיו מושתלים. יתר על כן, היחס של העוברים שנאספו ביחס ביצים מושתל הוא זהה בין שני ההליכים, רומז לא החמירה רעילות לטווח ארוך של וקטורים lentiviral. שנית, כאשר לבטא את מספר העוברים משולבת של transgene ביחס מספר הביצים מוזרק כי התשואה הכללית היא יותר גבוהה פי 10 עם הזרקת וקטור lentiviral בהשוואה הזרקת הדנ א. הבדל 86-fold נמצא אפילו כאשר משווים את מספר העוברים לבטא transgene בין שני ההליכים באמצעות הבונה משפר אותו Neurog3.
חשוב, ייצור הטרנסגניים התשואה מופיע להיות תלויות של כייל התמרה חושית של הווקטורים lentiviral משומשים. במילים אחרות, וקטורים lentiviral מיוצר עם כייל מעל 109 טו/mL מספיקים להשיג תשואה גבוהה כל כך. כמתואר בסעיף פרוטוקול, שאמצעי האחסון מוזרק בחלל perivitelline בטווח של 10 עד 100 Pl. אמצעי אחסון זה יהווה 10 ל-100 חלקיקי lentiviral פעיל. לעומת זריקות רגיל pronuclei DNA, המספר הכולל של מייסד חיות שנוצר עם אותה כמות של בעלי חיים נולד הוא לפחות 10-fold גבוה יותר בעת השימוש וקטורים lentiviral. בנוסף, penetrance הביטוי של transgene גבוה ביותר עם פרוטוקול זה נצפתה שניהם עם בכל מקום, תא היזמים ספציפית למעט האמרגן CMV. התנגדות היזמים בכל מקום הסלולר, האמרגן CMV פעיל כיבוי מתילציה DNA20 , הוכח להיות לא מצליח לשמור על ביטוי ארוכות על התמרה חושית תאי גזע pluripotent21. זה יכול להסביר מספר מוגבל מאוד של eGFP לבטא תאים שנצפתה העוברים מהונדס. לכן, וקטורים lentiviral מותאמים היטב כדי לייצר הטרנסגניים חיות בה ביטוי של transgene נשלטת על ידי תוספת ספציפית תא. חשוב, ניתן להשתמש בפרוטוקול על המסך עבור משפר פעילות ויוו וכדי למצוא מפה שעתוק מקדם אתרי קישור בתוך אזורים רגולטוריות11,12. ניתן לבצע גישה זו הקרנה בקושי באמצעות תקן transgenesis. המספר הכולל של מייסד חיות צריך לבדוק את כל המבנים השונים ולהגיע מובהקות סטטיסטית ידרוש עשרות הפעלות הזרקת ואילו ניתן להשיג במהירות עם lentiviral transgenesis בתיווך.
אחד ההבדלים העיקריים בין הליך רגיל המבוססת על שיטת lentiviral שוכן השילוב transgene. באמצעות הזרקת pronuclear, transgenes לשלב באופן אקראי כמו עותקים מרובים ב- לוקוס ייחודי. אינטגרציה באמצעות וקטורים lentiviral, יכול להתרחש בכל מרובים לוקוסים (עותק אחד לכל לוקוס) מבלי להיות אקראי לחלוטין. על-ידי שיבוט שילוב אתרים באמצעות ליניארי הגברה מתווכת PCR (לאם-PCR), הקבוצה של Trono ד הראו כי transgenes לשלב מעדיפים כרומטין פתוח מחוזות הביצים13. הטיה שילוב שאין להתערב או לתרום הביטוי transgene ב העכברים הטרנסגניים. שילוב במהלך lentiviral התמרה חושית של העובר בשלב תא אחד מתרחשת כרומטין פתוח זה יהיה עדיין בתצורה פתוח מאוחר יותר במהלך הפיתוח או במבוגר.
בנוסף, בעת ניתוח מספרי עותק של transgenes משולב בבעלי חיים הדור הראשון (F0) או עוברי, וריאציה גדולה במספר transgene המשולב הוא ציין. במחקר זה, נמצאה ממוצע של 19 עותקים משולב עם הבונה Neurog3-enh-eGFP. מספר זה העתק גדול יכול לשקף רמות גבוהות של פסיפס. . Sauvain et al. ביצעתי נרחב חקר לוקוסים משולב בבעלי F0 שנוצר באמצעות שיטת בתיווך lentiviral המתוארים כאן13. הם עקבו 70 אתרים אינטגרציה בודדים בבעלי F0 11 ובחן את קצבי שידור עבור כל אתר מן העכברים הטרנסגניים F0 אל צאצאיהן F1. הקצב הכולל של שידור של 44% עבור הפרט transgene משולב עולה כי הם היו לרוב הוקמה גם לאחר שלב ה-S של תא אחד העוברים או לפני שלב S בשלב שני תאים. אכן, שילוב לפני שלב S ישדר את transgene משולב בשני לתאי הבת, תוך שילוב לאחר שלב S ישדר אותו לתא הבת היחידה. לכן, מידת פסיפס עבור בודדים transgenes המשולב הוא מינימלי העכברים הטרנסגניים מושגת באמצעות טכניקה זו. עוד מציין כי רוב אינטגרציה תתרחש בתוך ה 12 הראשון המתייחס הזמן הממוצע של ייצור של המחשוף הראשון בתנאים תרבות בשימוש. שילוב זה קינטי הוא עקבי עם המתואר עבור lentiviruses תאי T-הלימפה22.
חשוב, עם מספר גבוה של לוקוסים חושף transgenes משולב, יצירת קווים העכבר לא יהיה סביר. מספר המעברים הפרדת כל לוקוסים אלה יהיה גבוה במידה ניכרת. זה מייצג מגבלה חשובה אחת של שיטה זו, שבה יש להשתמש עבור מיון מהיר של תופעות transgene או עבור ניתוח בו זמנית של מספר transgenes. למרות זאת, עדיין ניתן ליצור קווים העכבר על ידי בחירת החיה F0 אלה עם המספר הנמוך ביותר משולב transgene עותק.
מאז התיאור הראשון של pronuclear ה-DNA הזרקת שיטה1, נעשו שיפורים זה לעקוף רבות החסרונות של ההליך הראשוני. הסט הראשון של שיפורים היה מבוסס על השילוב יישוב ב- לוקוס מדויק באמצעות אסטרטגיה המרת קלטות. הזרקת pronuclear מתבצעת באמצעות או CRE, היפוך או PhiC31 recombinases יחד עם קטע DNA אינטגרטיבית מלון loxP, והשפלתם או attB אתרים, בהתאמה. במצב זה, ה-DNA אינטגרטיבית מוחלף עם שבר משולב תמר מוקף עם אותו recombinase אתר מסוים23,24. למרות עד 60% של בעלי חיים בדור הראשון יכול להיות הטרנסגניים23 בשיטה כזו, המגבלות הקשורים בטכנולוגיה של הזרקת pronuclear עדיין להחיל. הסט השני של שיפור מבוסס על זריקות cytoplasmic של DNA מעגלי שני, אחד נושא השבר לשלב, דבר המאפשר ביטוי גם Tol225, transposases27 -26 או piggyBac היפהפייה הנרדמת. באמצעות שיטות אלה, תפוקה גבוהה מתקבלים (> 30%), אבל יותר חשוב, הזריקה cytoplasmic הוא קל לביצוע, עוקף את ההגבלות עקב הזרקת pronuclear כמו פרוטוקול מבוסס lentiviral. יתר על כן, שברי דנ א גדולים מאוד, כגון חיידקי מלאכותי כרומוזומים, יכול להיות משולב.
ברור כי lentiviral transgenesis בתיווך לא יחליף בתקן ולא ההליכים משופרת. עדיין בשיטה זו מייצגת כלי רב עוצמה עבור המודל החייתי מהירה ייצור ואפיון המפחית באופן משמעותי את הזמן הנדרש כדי ליצור מספר תקין של בעלי חיים עם ההשתנות לפחות גנטי. יתר על כן, טכנולוגיה זו ניתן להחיל ישירות כל זנים העכבר כולל לכל הטרנסגניים קווים. בנוסף, חשוב לציין כי הנוף הכללית של הדור של מודלים חדשניים עומד להשתנות עם התפתחות הטכנולוגיה CRISPR/Cas9 האחרונות. היום, זריקות pronuclear של חלבון Cas9 יחד עם מדריך RNA מאפשר ייצור של הגנום נערך מודלים בעלי חיים עם יעילות של 40%28. גישה זו יועיל במידה רבה השימוש lentiviral transgenesis בתיווך. אכן, השימוש וקטורים בלתי-אינטגרטיבית lentiviral29 transiently אקספרס Cas9 שני, מדריך RNAs יגרום עם הגדלת תנובת הייצור גבוהה יותר. שילוב הטכנולוגיות החדשות ביותר לייצר מודלים בעלי חיים רלוונטי וחזק ירוויחו קבוצות מחקר ביותר הבינלאומי מעורב לומד בפתוגנזה של המחלה וגישות טיפוליות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים יש אין ניגוד אינטרסים לחשוף.
Acknowledgments
אנו מודים Magali דומונט, מלוני רולנדו על קריאה ביקורתית של כתב היד ואת iVector Phenoparc ICM ליבות לקבלת סיוע טכני בארצות וקטור lentiviral הייצור של בעלי חיים דיור בהתאמה. עבודה זו נתמכה על ידי דה Translationnelles אינסטיטוט Hospitalo-Universitaire דה מדעי המח בפריז, IHU-A-ICM, Investissements d'Avenir ANR-10-IAIHU-06. יחסי ציבור קיבל מימון עבור פרנסז Langue de האגודה למזוג l'Etude du Diabète et des מחלות Métaboliques (ALFEDIAM), של האגודה לסוכרת נעורים משותפת / INSERM הענק.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PMSG 50UI | Sigma | G4527 | |
| hCG 5000UI | Sigma | CG5-1VL | |
| NaCl | Sigma | 7982 | |
| 100 mm petri dish | Dutsher | 353003 | |
| 4 wells Nunc dish | Dutsher | 56469 | IVF dish |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| M16 medium | Sigma | M7292 | |
| 0,22 µm Syringe filter | Dutsher | 146611 | |
| Hyaluronidase Enzyme 30mg | Sigma | H4272 | mouse embryo tested |
| Insulin serynge | VWR | 613-3867 | Terumo Myjector |
| Curved forceps | Moria | 2183 | |
| Curved scissors | Moria | MC26 | |
| Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes | Sigma | A5177-5EA | |
| Borosilicate glass capillaries | Harvard apparatus | GC 100-10 | |
| Horizontal micropipette puller | Narishige | PN-30 | |
| Microforge | Narishige | MF-900 | |
| Inverted microscope | Nikon | Transferman NK2 5188 | Hoffman modulation contrast illumination is required |
| Micromanipulator | Eppendorf | Celltram air | |
| Controler of holding pipet | Eppendorf | Femtojet | |
| Mineral oil | Sigma | M8410 | mouse embryo tested |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | Can be used to inject DNA or viral vectors |
| Dumont # 5 forceps | Moria | MC 40 | |
| vannas micro scissors | Moria | 9600 | |
| Isoflurane | centravet | ISO005 | ISO-VET 100% 250ml |
| ocrygel | centravet | OCR002 | |
| Povidone iodure | centravet | VET001 | vetedine 120ml |
| Buprenorphine | centravet | BUP002 | Buprecare 0,3Mg/ml 10ml |
| Tris-HCl | Sigma | T5941 | Trizma hydrochloride |
| EDTA | Sigma | E9884 | |
| SDS | Sigma | 436143 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | powder |
| proteinase K | Sigma | P2308 | |
| oneTaq kit | NEB | M0480L | |
| Primers | Eurogentec | ||
| Strip of 8 PCR tube | 4titude | 4ti-0781 | |
| 96 well thermal cycler | Applied Biosystems | 4375786 | Veriti |
| Genomic DNA mini kit | invitrogen | K1820-02 | |
| Nanodrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000C | |
| qPCR Master mix | Roche | 4887352001 | SYBR Green |
| Multiwell plate 384 | Roche | 5217555001 | |
| qPCR instrument 384 well | Roche | 5015243001 | LightCycler 480 |
References
- Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA. Proceedings of the National Academy of Science USA. 77 (12), 7380-7384 (1980).
- Bock, T. A., Orlic, D., Dunbar, C. E., Broxmeyer, H. E., Bodine, D. M. Improved engraftment of human hematopoietic cells in severe combined immunodeficient (SCID) mice carrying human cytokine transgenes. Journal of Experimental Medicine. 182 (6), 2037-2043 (1995).
- Miyakawa, Y., et al. Establishment of human granulocyte-macrophage colony stimulating factor producing transgenic SCID mice. British Journal of Haematology. 95 (3), 437-442 (1996).
- Hirabayashi, M., et al. A comparative study on the integration of exogenous DNA into mouse, rat, rabbit, and pig genomes. Experimental Animals. 50 (2), 125-131 (2001).
- Isola, L. M., Gordon, J. W. Transgenic animals: a new era in developmental biology and medicine. Biotechnology. 16, 3-20 (1991).
- Zufferey, R., Nagy, D., Mandel, R. J., Naldini, L., Trono, D. Multiply attenuated lentiviral vector achieves efficient gene delivery in vivo. Nature Biotechnology. 15 (9), 871-875 (1997).
- Lois, C., Hong, E. J., Pease, S., Brown, E. J., Baltimore, D. Germline transmission and tissue-specific expression of transgenes delivered by lentiviral vectors. Science. 295 (5556), 868-872 (2002).
- Ewerling, S., et al. Evaluation of laser-assisted lentiviral transgenesis in bovine. Transgenic Research. 15 (4), 447-454 (2006).
- Ritchie, W. A., Neil, C., King, T., Whitelaw, C. B. Transgenic embryos and mice produced from low titre lentiviral vectors. Transgenic Research. 16 (5), 661-664 (2007).
- Park, F. Lentiviral vectors: are they the future of animal transgenesis. Physiological Genomics. 31 (2), 159-173 (2007).
- van Arensbergen, J., et al. A distal intergenic region controls pancreatic endocrine differentiation by acting as a transcriptional enhancer and as a polycomb response element. PLoS One. 12 (2), e0171508 (2017).
- Friedli, M., et al. A systematic enhancer screen using lentivector transgenesis identifies conserved and non-conserved functional elements at the Olig1 and Olig2 locus. PLoS One. 5 (12), e15741 (2010).
- Sauvain, M. O., et al. Genotypic features of lentivirus transgenic mice. Journal of Virology. 82 (14), 7111-7119 (2008).
- Punzon, I., Criado, L. M., Serrano, A., Serrano, F., Bernad, A. Highly efficient lentiviral-mediated human cytokine transgenesis on the NOD/scid background. Blood. 103 (2), 580-582 (2004).
- Zennou, V., et al. The HIV-1 DNA flap stimulates HIV vector-mediated cell transduction in the brain. Nature Biotechnology. 19 (5), 446-450 (2001).
- Miyoshi, H., Blomer, U., Takahashi, M., Gage, F. H., Verma, I. M. Development of a self-inactivating lentivirus vector. Journal of Virology. 72 (10), 8150-8157 (1998).
- Yee, J. K., et al. A general method for the generation of high-titer, pantropic retroviral vectors: highly efficient infection of primary hepatocytes. Proceedings of the National Academy of Science USA. 91 (20), 9564-9568 (1994).
- Castaing, M., et al. Efficient restricted gene expression in beta cells by lentivirus-mediated gene transfer into pancreatic stem/progenitor cells. Diabetologia. 48 (4), 709-719 (2005).
- Gradwohl, G., Dierich, A., LeMeur, M., Guillemot, F. neurogenin3 is required for the development of the four endocrine cell lineages of the pancreas. Proceedings of the National Academy of Science USA. 97 (4), 1607-1611 (2000).
- Scharfmann, R., Axelrod, J. H., Verma, I. M. Long-term in vivo expression of retrovirus-mediated gene transfer in mouse fibroblast implants. Proceedings of the National Academy of Science USA. 88 (11), 4626-4630 (1991).
- Norrman, K., et al. Quantitative comparison of constitutive promoters in human ES cells. PLoS One. 5 (8), e12413 (2010).
- Vandegraaff, N., Kumar, R., Burrell, C. J., Li, P. Kinetics of human immunodeficiency virus type 1 (HIV) DNA integration in acutely infected cells as determined using a novel assay for detection of integrated HIV DNA. Journal of Virology. 75 (22), 11253-11260 (2001).
- Ohtsuka, M., et al. One-step generation of multiple transgenic mouse lines using an improved Pronuclear Injection-based Targeted Transgenesis (i-PITT). BMC Genomics. 16, 274 (2015).
- Tasic, B., et al. Site-specific integrase-mediated transgenesis in mice via pronuclear injection. Proceedings of the National Academy of Science USA. 108 (19), 7902-7907 (2011).
- Sumiyama, K., Kawakami, K., Yagita, K. A simple and highly efficient transgenesis method in mice with the Tol2 transposon system and cytoplasmic microinjection. Genomics. 95 (5), 306-311 (2010).
- Garrels, W., et al. Cytoplasmic injection of murine zygotes with Sleeping Beauty transposon plasmids and minicircles results in the efficient generation of germline transgenic mice. Biotechnology Journal. 11 (1), 178-184 (2016).
- Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
- Aida, T., et al. Cloning-free CRISPR/Cas system facilitates functional cassette knock-in in mice. Genome Biology. 16, (2015).
- Philippe, S., et al. Lentiviral vectors with a defective integrase allow efficient and sustained transgene expression in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Science USA. 103 (47), 17684-17689 (2006).
