Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for at differentiere humane pluripotente stamceller (hPSCs) i bugspytkirtlen/duodenum HOXD protein 1+ (PDX1+) celler for generation af pancreas lineages baseret på ikke-koloni type éncellelag vækst af adskilles enkelt celler. Denne metode er velegnet til producerer homogene hPSC-afledte celler, genmanipulation og screening.
Humane pluripotente stamceller (hPSC)-afledte pancreas celler er en lovende celle kilde for regenerativ medicin og en platform til at studere menneskelige udviklingsprocesser. Trinvis instrueret differentiering, der sammenfatter udviklingsprocesser er en af de vigtigste måder at generere pancreas celler herunder bugspytkirtlen/duodenum HOXD protein 1+ (PDX1+) i bugspytkirtlen stamceller. Konventionelle protokoller indlede differentiering med små kolonier kort efter passage. Men i tilstanden af kolonier eller aggregater, celler er tilbøjelige til at heterogeneities, som kan hæmme differentiering til PDX1+ celler. Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for at differentiere hPSCs i PDX1+ celler. Protokollen består af fire trin og initierer differentiering af seeding dissocierede enkelt celler. Induktion af SOX17+ endelige endoderm celler blev efterfulgt af udtryk for to primitive gut tube markører, HNF1β og HNF4α og eventuel differentiering i PDX1+ celler. Denne protokol giver nem håndtering og kan forbedre og stabilisere differentiering effektiviteten af nogle hPSC linjer, der fandtes tidligere for at differentiere ineffektivt i endodermal lineages eller PDX1+ celler.
Bugspytkirtlen består hovedsageligt af eksokrine og endokrine celler, og dens dysfunktion eller overbelastning forårsager adskillige sygdomme som betændelse i bugspytkirtlen, diabetes og kræft i bugspytkirtlen. For at belyse pathogeny af pancreatopathy, er det nødvendigt at analysere den udviklingsmæssige proces og funktion i bugspytkirtlen celler. Derudover kræves en stabil celle forsyning med robust kvalitet at etablere celler/væv tilskud terapi. Humane pluripotente stamceller (hPSC)-afledte pancreas celler er en lovende celle kilde til disse formål, og differentiering protokol mod pancreas celler har været intensivt undersøgt1,2,3, 4. Seneste fremskridt inden for den in vitro-generation celleområde, pancreas β efterligne generation af β-celler i voksen menneskelige, og disse celler Vis terapeutiske virkning efter implantation i diabetisk model mus2,3. Derudover viste analyse af β celler genereret fra den inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) af sunde og type 1 diabetes patienten donorer ingen funktionelle forskelle, herunder når under stress5. Derudover er sygdom fænotyper blevet delvist gengivet i induceret i bugspytkirtlen celler med patienten-afledte iPSCs eller hPSCs husly genetiske mutationer i samme sted som patienter6,7.
Du kan generere i bugspytkirtlen celler fra hPSCs ved bruges trinvis styret differentiering, der sammenfatter udviklingsprocesser. Bugspytkirtlen er afledt fra endoderm lag af den tidlige embryon, som udtrykker sex bestemmelse af regionen Y-box 17 (SOX17) og forkhead boks A2 (FOXA2)8. Baseret på undersøgelser, mus, danner det endodermal lag primitive gut tube, som er præget af udtryk for hepatocyt nukleare faktor 1-beta (Hnf1β) og hepatocyt nukleare faktor 4-alpha (Hnf4α). Primitive gut tube elongates og udvikler sig til respiratorisk apparater, fordøjelseskanalen og organer. Efter strækforlængelse, posterior foregut område bliver regionen formodede i bugspytkirtlen som præget af udtryk for transcriptional faktor bugspytkirtlen/duodenum HOXD protein 1 (PDX1)8,9,10. De dorsale og ventrale dele af PDX1+ gut tube tykkere til form i bugspytkirtlen knopper, som er præget af fælles udtryk af bugspytkirtlen transskription faktor 1 subunit alpha (PTF1A) og NK6 HOXD 1 (NKX6.1)8,11. Dette udtryk markerer den morfologiske begyndelse i bugspytkirtlen organogenesis. Pancreas endoderm celler, som er komponenter af pancreas knopper, danner et forgrenet rørformede netværk af epitelial strukturer12 og i sidste ende udvikle sig til eksokrine og endokrine celler, herunder insulin-secernerende β-celler og Glucagon-secernerende α-cellerne. Udtryk for PDX1 registreres første ved den formodede pancreas region, som er så observeret gennem hele pancreas udvikling, og viser lokalisering til β-δ-cellerne og9,13,14. Selv om Pdx1+ celle-området, der ikke udtrykker Ptf1a eller Nkx6.1 differentierer i mavens antrum, duodenum, ekstrahepatisk galdegang og nogle tarmcellerne på midten til sent udviklingstrin i mus9, PDX1+ stamfaderen til bugspytkirtlen betragtes som celler den udviklingsmæssige tidligt i mennesker.
Vi præsenterer her, en detaljeret protokol for at differentiere hPSCs i PDX1+ celler for generation af pancreas lineages. Protokollen indviede differentiering af såning dissocieres enkelt celler15,16,17. Generelt, udifferentierede hPSCs vedligeholdes som kolonier eller celle aggregater i suspension eller vedhæftning. Som et resultat, indlede de fleste protokoller differentiering kort efter passaging. Dog i tilstanden af kolonier eller aggregater, celler er tilbøjelige til rumlige og transcriptional heterogeneities18,19,20,21,22, der kunne hæmme den første differentiering skridt mod endelige endoderm efterfulgt af ineffektive differentiering til PDX1+ celler. Denne protokol kan tilbyde nem håndtering for at forbedre og stabilisere differentiering effektivitet af nogle hPSC linjer, der fandtes tidligere for at differentiere ineffektivt at endodermal slægter og PDX1+ celler23, 24 , 25.
Generation af PDX1+ celler består af flere trin; Derfor er det kritisk at behandle celler på et passende tidspunkt. Blandt skridt, endelige endoderm induktion effektivitet i høj grad påvirker den endelige induktion effektivitet, muligvis af interferens fra andre forurenende slægt celler (dvs. mesoderm og ectoderm), der kan formere sig og/eller udskiller faktorer, der forstyrre specifikke differentiering. Hvis andelen af SOX17+ celler er lavere end 80% på dag 4 (etape 1B), en effektiv induktion…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet i en del af finansiering fra Japan samfundet for fremme videnskab (JSP’ER) gennem Scientific Research (C) (JSP’ER KAKENHI Grant Number15K09385 og 18 K 08510) til T.T. og licensbetaling for JSP’ER forskningsstipendiater (JSP’ER KAKENHI Grant antallet 17J07622) til A.K. og Japan Agency for medicinalforskning og udvikling (AMED) gennem sin forskning give “Core Center for iPS Cell Research, Research Center netværk for realisering af regenerativ medicin” til K.O. Forfatterne takke Dr. Peter Karagiannis for læsning af manuskript.
3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
Filter Tip, 1000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
Latex Examination Gloves | Adachi | ||
MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
Microtube | Watoson | 131-515CS | |
Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
Nanodeop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
Rnase-Free Dnase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
Rneasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
Y-27632 | Wako | 251-00514 |