Summary

Efficiënte generatie van alvleesklier/twaalfvingerige darm Homeobox eiwit 1+ Posterior voordarm/Pancreatic voorlopercellen van hPSCs in hechting culturen

Published: March 27, 2019
doi:

Summary

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) in de alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1+ (PDX1+) cellen voor de generatie van de alvleesklier lineages op basis van de niet-kolonie type enkelgelaagde groei van afzonderlijke cellen los. Deze methode is geschikt voor het produceren van homogene hPSC-afgeleide cellen, genetische manipulatie en screening.

Abstract

Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide pancreatic cellen zijn een veelbelovende bron van de cel voor regeneratieve geneeskunde en een platform om menselijke ontwikkelings processen te bestuderen. Stapsgewijs geregisseerd differentiatie die ontwikkelings processen recapituleert is een van de belangrijkste manieren om het genereren van pancreatic cellen, met inbegrip van de alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1+ (PDX1+) alvleesklier voorlopercellen. Conventionele protocollen starten de differentiatie met kleine kolonies kort na de passage. Echter, in de Braziliaanse deelstaat kolonies of geaggregeerd, cellen zijn gevoelig voor heterogeniteiten, die zouden kunnen de differentiatie naar PDX1 belemmeren+ cellen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van hPSCs in PDX1+ cellen. Het protocol bestaat uit vier stappen en initieert de differentiatie door seeding gedissocieerde afzonderlijke cellen. De inductie van SOX17+ definitieve endoderm cellen werd gevolgd door de expressie van twee primitieve gut buis markeringen, HNF1β en HNF4α en eventuele differentiatie in PDX1+ cellen. Dit protocol biedt eenvoudige bediening kan verbeteren en stabiliseren van de efficiëntie van de differentiatie van hPSC regels die eerder werden gevonden om te differentiëren inefficiënt in endodermal lineages of PDX1+ cellen.

Introduction

De alvleesklier bestaat voornamelijk uit exocrine en endocriene cellen, en zijn dysfunctie of overbelasting veroorzaakt verschillende ziekten, zoals diabetes, pancreatitis en alvleesklierkanker. Om het verhelderen van de pathogeny van pancreatopathy, is het noodzakelijk om te analyseren de ontwikkelingstoxiciteit proces en functie van cellen van de alvleesklier. Daarnaast is de levering van een stabiele cel met robuuste kwaliteit vereist om de cellen/weefsels suppletie therapie. Menselijke pluripotente stamcellen (hPSC)-afgeleide pancreatic cellen zijn een veelbelovende cel bron voor deze doeleinden, en het protocol van de differentiatie naar pancreatic cellen is intensief bestudeerde1,2,3, 4. Recente vooruitgang in de in vitro generatie van cellen van de alvleesklier β bootsen de generatie van de β-cellen in menselijke volwassene, en deze cellen Toon therapeutische werking na implantatie in diabetische model muizen2,3. Bovendien, bleek het onderzoek van de β-cellen gegenereerd op basis van de geïnduceerde pluripotente stamcellen (iPSCs) van gezonde en type 1 diabetes patiënt donoren geen functionele verschillen waaronder wanneer stress5. Ziekte fenotypen hebben bovendien gedeeltelijk weergegeven in geïnduceerde pancreatic cellen met patiënt afkomstige iPSCs of hPSCs herbergen genetische mutaties in dezelfde site als de patiënten6,7.

Voor het genereren van pancreatic cellen uit hPSCs, wordt stapsgewijze gestuurde differentiatie die ontwikkelings processen recapituleert gebruikt. De alvleesklier is afgeleid van de endoderm laag van het vroege embryo, die spreekt van geslacht bepalen regio Y-vak 17 (SOX17) en forkhead vak A2 (FOXA2)8. Op basis van de studies van de muis, vormt de endodermal laag de primitieve gut buis, die wordt gekenmerkt door de uitdrukking van de hepatocyte nucleaire factor 1-beta (Hnf1β) en hepatocyte nucleaire factor 4-alpha (Hnf4α). De primitieve gut buis kieuwopeningenvorm en ontwikkelt zich tot de respiratoire toestellen, maagdarmkanaal en organen. Na de rek, de achterste voordarm gebied wordt de vermoedelijke alvleesklier regio, zoals aangegeven door de expressie van het transcriptionele factor alvleesklier/twaalfvingerige darm homeobox eiwit 1 (PDX1)8,9,10. De dorsale en ventrale delen van de PDX1+ gut buis dikker aan formulier alvleesklier toppen, die worden gekenmerkt door de co uitdrukking van alvleesklier transcriptie factor 1 subeenheid alpha (PTF1A) en NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Deze expressie is de morfologische begin van alvleesklier organogenese. Alvleesklier endoderm cellen, die onderdelen van de alvleesklier toppen, vormen een vertakte buisvormige netwerk van epitheliale structuren12 en uiteindelijk in exocrine en endocriene cellen, met inbegrip van de β-cellen insuline-afscheidende onderscheiden en glucagon-afscheidende α-cellen. Uitdrukking van PDX1 wordt eerst gedetecteerd bij de vermoedelijke alvleesklier regio, die vervolgens wordt waargenomen gedurende de gehele ontwikkeling van de alvleesklier, en toont localization voor β – en δ-cellen9,13,14. Hoewel de Pdx1+ cel gebied dat doet niet express Ptf1a of Nkx6.1 onderscheidt in het antrum maag, twaalfvingerige darm, extrahepatic gal duct en sommige intestinale cellen in de midden tot late stadium van ontwikkeling in muizen9, PDX1+ cellen worden beschouwd als van de progenitoren van de alvleesklier de vroeg developmental stadium bij de mens.

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol te differentiëren van hPSCs in PDX1+ cellen voor de generatie van de alvleesklier geslachten. Het protocol initieert differentiatie door zaaien losgekoppeld afzonderlijke cellen15,16,17. In het algemeen, ongedifferentieerde hPSCs worden onderhouden als kolonies of cel aggregaten in suspensie of in hechting. Dientengevolge, starten de meeste protocollen de differentiatie kort na passaging. Echter, in de Braziliaanse deelstaat kolonies of geaggregeerd, cellen zijn gevoelig voor ruimtelijke en transcriptionele heterogeniteiten18,19,20,21,22, die zouden kunnen belemmeren de eerste stap van de differentiatie naar definitieve endoderm gevolgd door inefficiënte differentiatie naar PDX1+ cellen. Dit protocol kan bieden gemakkelijk te hanteren om te verbeteren en stabiliseren van de efficiëntie van de differentiatie van hPSC regels die eerder werden gevonden om te differentiëren inefficiënt aan endodermal geslachten en PDX1+ cellen23, 24 , 25.

Protocol

Experimenten met behulp van de hPSCs werden goedgekeurd door de ethische commissie van de afdeling van de geneeskunde en de Graduate School of Medicine, Kyoto University. 1. voorbereiding van de materialen Opmerking: Alle media en reagentia voorbereiden op celcultuur in een steriele omgeving. Opwarmen basis voedingsbodems tot kamertemperatuur (RT) vóór gebruik. Medium voor differentiatie wordt gebruikt binnen 6 uur op RT. Details va…

Representative Results

Teeltmateriaal hiPSCs (585A129,30) zijn gecondenseerd en vormen een homogene enkelgelaagde (figuur 1B), die is geschikt voor differentiatie. Niet-gedifferentieerdeproductie hiPSCs (fase 0) zijn losgekoppeld en opnieuw agarvoedingsbodem als afzonderlijke cellen op lage cel dichtheden (1-1,5 x 105 cellen/cm2). Binnen 1 uur, de cellen zijn gekoppeld aan de plaat en beginnen te tonen uitsteeksel. Op dag 1, zijn de c…

Discussion

De generatie van PDX1+ cellen bestaat uit meerdere stappen; Daarom is het essentieel voor het behandelen van cellen op het juiste moment. Onder de trappen, de efficiëntie van de inductie van definitieve endoderm grotendeels is van invloed op de efficiëntie van de laatste inductie, eventueel door interferentie van andere contaminerende lineage cellen (dat wil zeggen, mesoderm en ectoderm), die kan verspreiden en/of afscheiden factoren die specifieke differentiatie verstoren. Als het aandeel van de SOX17+…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de financiering uit de Society van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS) via Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 en 18 K 08510) T.T. en Grant-in-Aid voor JSPS Research Fellows (JSPS KAKENHI Grant nummer 17J07622) A.K. en het Japan Agency voor medisch onderzoek en ontwikkeling (AMED) door middel van haar onderzoek toekennen “Core Center for iPS celonderzoek, Research Center netwerk voor realisatie van regeneratieve geneeskunde” K.O. De auteurs bedanken Dr. Peter Karagiannis voor het lezen van het manuscript.

Materials

3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine Toronto Research Chemicals K171000 CYC
4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid Santa Cruz Biotechnology SC-203303 TTNPB
50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes Thermo Fisher Scientific 339652
Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] Abcam Ab76541 Anti-CDX2, × 1/1000 dilution
B-27 Supplement (50 ×) Thermo Fisher Scientific 17504-044 Serum-free supplement
BD FACSAria II Cell Sorter BD Biosciences For flow cytometry
Biomedical freezer SANYO MDF-U538 For -30 °C storing
Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber BIO-RAD 1450011 Counting slide glass
CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR Greiner bio-one 657165 For differentiation culture/6-well plate
Centrifuge TOMY AX-310 For cell culturing
Centrifuge TOMY MX-305 For RT-qPCR
CHIR99021 Axon Medchem Axon 1386
CLEAN BENCH SHOWA KAGAKU  S-1601PRV Clean bench
Corning CellBIND 6-well plate Corning 3335 For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate
Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced Corning 354230 Basement membrane matrix
Corning Synthemax II-SC Substrate Corning 3535 For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs
Cryostat Leica Leica CM1510 S For immunostaining of aggregates.
Cytofix/Cytoperm Kit Becton Dickinson 554714 Perm/Wash buffer is  Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer.
Dako pen Dako S2002 For immunostaining of aggregates
dNTP mix (10 mM) Thermo Fisher Scientific 18427-088 For RT-qPCR
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A11055 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10036 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10040 Secondary antibody, × 1/500 dilution
Donkey Serum Merck Millipore S30 Donkey serum
D-PBS(-) without Ca or Mg Nacalai tesque 14249-95 DPBS
Essential 8 Medium Thermo Fisher Scientific A1517001 For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium
Falcon 5mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer
Filter Tip, 1000 µL Watoson 124-1000S Use together with pipettes
Filter Tip, 20 µL Watoson 124-P20S Use together with pipettes
Filter Tip, 200 µL Watoson 124-P200S Use together with pipettes
Fluorescence Microscope Keyence BZ-X700 For immunostaining
Forma Steri-Cycle CO2 incubator Thermo Fisher Scientific 370A Incubator
HNF-1β Antibody (C-20) Santa Cruz Biotechnology sc-7411 Anti-HNF1β, × 1/200 dilution
HNF-4α Antibody (H-171) Santa Cruz Biotechnology sc-8987 Anti-HNF4α, × 1/200 dilution
Hoechst 33342 Thermo Fisher Scientific H3570 For nucleus staining, × 1/200 dilution
Human Pancreas Total RNA Ambion AM7954 For RT-qPCR
Human PDX-1/IPF1 Antibody R&D Systems AF2419 Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution
Human SOX17 Antibody R&D Systems AF1924 Anti-SOX17, × 1/200 dilution
Improved MEM Zinc Option medium Thermo Fisher Scientific 10373-017 iMEM
Incubation chamber Cosmo Bio 10DO For immunostaining of aggregates
Latex Examination Gloves Adachi
MAS coated slide glass Matsunami Glass 83-1881 For immunostaining of aggregates
MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific 4346907 For RT-qPCR
Microscope Olympus CKX41N-31PHP For cell culturing
Microtube Watoson 131-515CS
Monoclonal Anti-α-Fetoprotein SIGMA A8452 Anti-AFP, × 1/200 dilution
Nanodeop 8000 Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Oligo dT FASMAC Custom made Oligo  For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT"
Paraformaldehyde, powder Nacalai tesque 26126-54 PFA, fixative, diluted in DPBS
Pharmaceutical refrigerator SANYO MPR-514 For 4 °C storing
PIPETMAN P  GILSON Pipette
Recombinant Human KGF/FGF-7 R&D Systems 251-KG KGF
Recombinant Human Noggin PeproTech 120-10C NOGGIN
Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A R&D Systems 338-AC Activin A
ReverTra Ace (100 U/μL) TOYOBO TRT-101 For RT-qPCR
Rnase-Free Dnase Set (50) QIAGEN 79254 For RT-qPCR
Rneasy Mini Kit QIAGEN 74104 For RT-qPCR
RPMI 1640 with L-Gln Nacalai tesque 30264-85 RPMI 1640
Sealing Film for Real Time Takara NJ500 For RT-qPCR
Serological pipettes 10 mL Costar/Corning 4488 For cell culturing
Serological pipettes 25 mL Costar/Corning 4489 For cell culturing
Serological pipettes 5 mL Costar/Corning 4487 For cell culturing
Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb Cell signaling 3579S Anti-SOX2, × 1/200 dilution
StepOnePlus Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Sucrose Nacalai tesque 30406-25 For immunostaining of aggregates
TB Green
Premix Ex Taq II 
Takara RR820B For RT-qPCR
TC20 Automated Cell Counter BIO-RAD 1450101J1 Automatic cell counter
Tissue-Tek OCT compound 4583  Sakura Finetechnical 4583 For immunostaining of aggregates
Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters Sakura Finetechnical 4566 For immunostaining of aggregates
Triton X-100 Nacalai tesque 35501-15
Trypan Blue BIO-RAD 1450021
Ultracold freezer SANYO MDF-U33V For -80 °C storing
UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 Thermo Fisher Scientific 15575-038 Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA
Veriti Thermal Cycler Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific For RT-qPCR
Y-27632 Wako 251-00514

References

  1. D’Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
  2. Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
  3. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  4. Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
  5. Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
  6. Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
  7. Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from ‘induced pluripotent stem cells’ of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
  8. Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
  9. Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
  10. Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
  11. Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
  12. Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
  13. Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
  14. Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
  15. Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
  16. Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
  17. Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
  18. Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
  19. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  20. Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
  21. Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
  22. Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
  23. Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
  24. Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
  25. Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
  26. Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
  27. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
  28. Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
  29. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  30. Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
  31. Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson’s disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
  32. Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
  33. Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
  34. Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
  35. Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
  36. Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
  37. Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
  38. Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).

Play Video

Cite This Article
Toyoda, T., Kimura, A., Tanaka, H., Osafune, K. Efficient Generation of Pancreas/Duodenum Homeobox Protein 1+ Posterior Foregut/Pancreatic Progenitors from hPSCs in Adhesion Cultures. J. Vis. Exp. (145), e57641, doi:10.3791/57641 (2019).

View Video