Summary
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziare cellule staminali pluripotenti umane (hPSCs) in proteina di pancreas/duodeno homeobox 1+ (PDX1+) cellule per la generazione dei lignaggi del pancreas basano sulla crescita di monostrato di tipo non-Colonia di dissociato singole cellule. Questo metodo è adatto per la produzione di cellule derivate da hPSC omogenee, manipolazione genetica e di screening.
Abstract
Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-cellule pancreatiche derivate sono una promettente fonte di cellule per la medicina rigenerativa e una piattaforma per lo studio di processi di sviluppo umani. Diretto graduale differenziazione che ricapitola i processi inerenti allo sviluppo è uno dei principali modi per generare cellule pancreatiche compreso pancreas/duodeno homeobox proteina 1+ (PDX1+) cellule progenitrici del pancreas. Protocolli convenzionali avviano la differenziazione con piccole colonie poco dopo il passaggio. Tuttavia, nello stato di colonie o aggregati, le cellule sono inclini a eterogeneita ', che potrebbero ostacolare la differenziazione per PDX1+ cellule. Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziarsi hPSCs in PDX1+ cellule. Il protocollo consiste di quattro passi e avvia la differenziazione di singole cellule dissociate di semina. L'induzione di SOX17+ cellule endoderma definitivo è stata seguita dall'espressione di marcatori di tubo due intestino primitivo, HNF1β e HNF4α ed eventuale differenziazione in PDX1+ cellule. Il presente protocollo fornisce la gestione facile e può migliorare e stabilizzare l'efficienza di differenziazione di alcune linee di hPSC che precedentemente sono stati trovati per differenziare in modo inefficiente in endodermici lignaggi o PDX1+ cellule.
Introduction
Il pancreas è costituito principalmente da cellule esocrine ed endocrine, e sua disfunzione o sovraccarico provoca diverse malattie, come la pancreatite, diabete e cancro del pancreas. Per delucidare il pathogeny di fibrocalcolosa, è necessario analizzare il processo di sviluppo e la funzione delle cellule pancreatiche. Inoltre, per stabilire la terapia di supplementazione di cellule/tessuti è necessaria una fornitura di cellulari stabili con qualità robusta. Cellule staminali pluripotenti umane (hPSC)-cellule pancreatiche derivate sono una promettente fonte di cellule per questi scopi, e il protocollo di differenziazione verso le cellule del pancreas è stato intensamente studiato1,2,3, 4. Gli avanzamenti recenti nella generazione in vitro di cellule β del pancreas imitano la generazione di cellule β in adulto umano e queste cellule Visualizza efficacia terapeutica su impiantati in topi diabetici modello2,3. Inoltre, l'analisi delle cellule β generate dalle cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs) di sano di tipo 1 diabete paziente donatori ha rivelato nessuna differenza funzionale tra cui quando sotto stress5. Inoltre, i fenotipi di malattia sono stati riprodotti parzialmente in cellule pancreatiche indotte con iPSCs derivate dal paziente o hPSCs che harboring le mutazioni genetiche nello stesso sito come pazienti6,7.
Per generare le cellule pancreatiche da hPSCs, graduale differenziazione diretto che ricapitola i processi di sviluppo viene utilizzata. Il pancreas è derivato dallo strato endoderma dell'embrione precoce, che esprime il sesso che determina regione Y-box 17 (SOX17) e forkhead box A2 (FOXA2)8. Basato sugli studi del mouse, lo strato endodermico forma il tubo dell'intestino primitivo, che è contrassegnato dall'espressione dell'epatocita fattore nucleare 1 beta (Hnf1β) e dell'epatocita nucleare di fattore 4-alfa (Hnf4α). Il tubo dell'intestino primitivo si allunga e si sviluppa nell'apparato respiratorio, digerente e organi. Dopo l'allungamento, la zona posteriore del foregut diventa la regione pancreatica presuntiva, come indicato dall'espressione della proteina fattore trascrizionale pancreas/duodeno homeobox 1 (PDX1)8,9,10. Le parti dorsali e ventrali della PDX1+ gut tubo addensare a formare cime del pancreas, che sono segnati dalla co-espressione del pancreas trascrizione fattore 1 subunità alfa (PTF1A) e NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Questa espressione segna l'inizio morfologico dell'organogenesi pancreatica. Cellule pancreatiche endoderma, che sono componenti delle gemme del pancreas, formano una rete ramificata tubolare di strutture epiteliali12 e alla fine differenziarsi in cellule esocrine ed endocrine, tra cui β-cellule secernenti insulina e che secernono glucagone α-cellule. Espressione di PDX1 viene rilevato in primo luogo alla regione pancreatica presuntiva, che poi è osservata durante l'intero sviluppo del pancreas e Mostra la localizzazione di cellule β - e δ-9,13,14. Anche se il Pdx1+ zona delle cellule che non esprimono Ptf1a o Nkx6.1 differenzia in antrum gastrico, del duodeno, dei dotti biliari extrahepatic e alcune cellule intestinali a metà alla fine della fase di sviluppo in topi9, PDX1+ le cellule sono considerate i progenitori del pancreas nella fase iniziale dello sviluppo negli esseri umani.
Qui, presentiamo un protocollo dettagliato per differenziarsi hPSCs in PDX1+ cellule per la generazione dei lignaggi del pancreas. La differenziazione di iniziati di protocollo da semina dissociato celluli15,16,17. In genere, indifferenziato hPSCs sono mantenuti come colonie o aggregati cellulari in sospensione o in adesione. Di conseguenza, la maggior parte dei protocolli avviare la differenziazione poco dopo il passaggio. Tuttavia, nello stato di colonie o aggregati, le cellule sono inclini a eterogeneità spaziale e trascrizionale18,19,20,21,22, che potrebbero ostacolare la primo passo di differenziazione verso l'endoderma definitivo seguita da differenziazione inefficiente per PDX1+ cellule. Il presente protocollo può offrire maneggevolezza per migliorare e stabilizzare l'efficienza di differenziazione di alcune linee di hPSC che precedentemente sono stati trovati per differenziare inefficacemente endodermici lignaggi e PDX1+ cellule23, 24 , 25.
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Protocol
Gli esperimenti usando hPSCs sono stati approvati dal comitato etico del dipartimento di medicina e Graduate School of Medicine, Università di Kyoto.
1. preparazione dei materiali
Nota: Preparare tutti i terreni e reagenti per colture cellulari in ambiente sterile. Caldo a base di coltura a temperatura ambiente (TA) prima dell'uso. Medio per differenziazione viene utilizzata all'interno di 6 h a RT. dettagli dei reagenti elencati nella Tabella materiali.
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Differenziazione (Figura 1A)
- Stage 1A medio: trasferimento medium RPMI 1640 in una provetta utilizzando una pipetta. Aggiungere il supplemento senza siero, activina A, CHIR99021 e Y-27632 a una concentrazione di 1 x, 100 ng/mL, 3 μM e 10 μM, rispettivamente.
- Stage 1B medio: trasferimento medium RPMI 1640 in una provetta utilizzando una pipetta. Aggiungere il supplemento senza siero, activina A e CHIR99021 a una concentrazione di 1 x, 100 ng/mL, ≤ 1 μM, rispettivamente.
Nota: La concentrazione di CHIR99021 deve essere inferiore a Stage 1A medio e aggiunta non è necessaria, ma aumenta il numero di cellulare. - Stage 2 medio: medio di trasferimento migliorato MEM (iMEM) in una provetta utilizzando una pipetta. Aggiungere il supplemento privo di siero e il fattore di crescita dei cheratinociti (KGF) ad una concentrazione di 0,5 x e 50 ng/mL, rispettivamente.
- Stage 3 medio: mezzo di iMEM di trasferimento in una provetta utilizzando una pipetta. Aggiungere il supplemento senza siero, KGF, NOGGIN, 3-cheto-N-amminoetil-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) e acido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (TTNPB) mediante pipetta per concentrazioni di 0.5 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM e 10 nM, rispettivamente.
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Citometria a flusso (FCM)
- Permeabilizzazione/lavaggio 1X: trasferire l'acqua in un tubo mediante una pipetta. Aggiungere tampone di permeabilizzazione/lavaggio mediante una pipetta ad una concentrazione di 1 x.
- FCM soluzione bloccante: trasferire Permeabilization/lavaggio 1X in una provetta mediante una pipetta. Aggiungere asino siero mediante una pipetta ad una concentrazione del 2% (vol/vol).
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Immunostaining
- Soluzione bloccante: Phosphate-Buffered Saline (DPBS di trasferimento Dulbecco) in un tubo mediante una pipetta. Aggiungere siero asino e Triton X mediante pipetta a concentrazioni di 5% (vol/vol) e 0,4% (vol/vol), rispettivamente.
2. hPSC differenziazione ai progenitori di cellule/pancreatico posteriore del Foregut (PDX1 cellule+ )
Nota: Effettuare tutte le procedure usando tecniche sterili. hPSCs sono mantenuti su piastre da 6 pozzetti rivestite da un materiale di superficie sintetico per hPSCs con hPSC mezzo di manutenzione secondo le istruzioni17,26 del produttore. Quando le cellule di raggiungere confluency di 50-80% (stadio 0) li usano per differenziazione.
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Preparare della membrana dello scantinato piastre rivestite con matrice.
- Trasferimento 6 mL di RPMI 1640 (4 °C) in una provetta raffreddata a 4 °C sul ghiaccio. Aggiungere 2 mg di matrice della membrana basale (4 °C) con 1 mL-puntali per pipette raffreddato e mescolare bene di pipettaggio delicato per rendere la matrice della membrana basale di 0,33 mg/mL.
- Trasferire 2 mL di matrice della membrana basale diluito in ciascun pozzetto di piastre per colture cellulari a 6 pozzetti mediante una pipetta. Posizionare le piastre a 37 °C per 60-90 min in un'incubatrice. In seguito, tenere le piastre a temperatura ambiente fino all'utilizzo (all'interno di 3 h).
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L'hPSCs di semi e avviare la differenziazione di endoderma definitivo (1A tappa).
- Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di 0.5 mM acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) (RT) per pozzetto mediante pipetta per lavare l'hPSCs coltivati nelle piastre 6 pozzetti.
- Aspirare 0,5 mM EDTA e aggiungere 2 mL di 0.5 mM EDTA per pozzetto mediante pipetta. Incubare le piastre a 37 °C per 5 min.
- Aspirare 0,5 mM EDTA e aggiungere 1 mL di mezzo di manutenzione hPSC presso RT completati con 10 μM Y-27632 per bene dalla pipetta. Pipettare delicatamente ma rapidamente per soffiare via la cellule allegate sulle piastre e dissociare le cellule ragruppate in singole celle. Non bolla sospensione delle cellule durante il pipettaggio.
- Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga 50 mL contenente 4 mL di mezzo di manutenzione hPSC presso RT completati con 10 μM Y-27632. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare.
- Contare il numero di cellule in sospensione delle cellule usando la procedura di esclusione del Trypan Blue macchia.
- Mix 15 µ l di sospensione cellulare e 15 μL di Trypan blu in un tubo.
- Trasferire 10 μL della sospensione delle cellule diluita con Trypan Blue su cella contando diapositive in duplicato mediante una pipetta da 10 μL.
- Contare la cella numero con un contatore di cellule automatico e calcolare la densità delle cellule in sospensione delle cellule. Vitalità è di solito > 98%.
- Aliquotare la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga 50 mL a 1-1,5 x 106 cellule per pozzetto di piastre da 6 pozzetti (1-1.5 x 105 cellule/cm2).
- Centrifugare la provetta 50 mL a 200 x g per 5 min a RT.
- Aspirare il surnatante con una pipetta e risospendere le cellule con 1 mL di terreno di 1A fase (RT) per pozzetto. Delicatamente Pipettare la sospensione cellulare e aggiungere un altro 1 mL di mezzo di fase 1A (totale, 2 mL per pozzetto).
- Aspirare la matrice della membrana dello scantinato diluiti nei pozzetti delle piastre di coltura cellulare preparate al punto 2.1.2 mediante una pipetta μL 1.000. Procedere al passaggio successivo immediatamente.
- Delicatamente dispensare la sospensione di eritrociti nel passaggio 2.2.8 nuovamente. Immediatamente dopo la miscelazione, trasferire la sospensione cellulare (2 mL) in ciascun pozzetto di una piastra a 6 pozzetti. Coprire la piastra con un foglio di alluminio per proteggere la piastra dalla luce. Collocare la piastra nel banco pulito a temperatura ambiente per 10-15 min.
Nota: Non spostare la piastra dopo la semina. - Posizionare delicatamente la piastra in un 37 °C, 5% CO2 incubator (atmosfera umidificata) e cultura per 24 h.
Nota: Non agitare la piastra dopo la semina.
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Indurre la differenziazione in endoderma definitivo (fase 1B).
- Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS ai pozzetti mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta.
Nota: Per rimuovere eventuali cellule morte da strato monomolecolare, scuotere delicatamente la piastra prima di ogni aspirazione. - Aspirare il DPBS usato mediante una pipetta e aggiungere 4 mL di Stage 1B medio (37 °C) per pozzetto. Posizionare delicatamente la piastra nell'incubatore a 37 °C (atmosfera umidificata di 5% CO2) e cultura per 48 h.
- Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS al pozzo mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta.
Nota: Rimuovere le cellule morte dal monostrato di agitazione delicata prima di ogni aspirazione. - Aspirare il DPBS usate mediante pipetta e aggiungere 4 mL di Stage 1B medio (37 °C) per pozzetto. Posizionare delicatamente la piastra nell'incubatore (37 °C, atmosfera umidificata di 5% CO2) e cultura per 24 h.
- Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS ai pozzetti mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta.
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Indurre il differenziamento nel tubo dell'intestino primitivo (fase 2).
- Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS al pozzo mediante pipetta.
Nota: Rimuovere le cellule morte dal monostrato di agitazione delicata prima di ogni aspirazione. - Aspirare il DPBS usate mediante pipetta e aggiungere 4 mL di terreno di fase 2 (37 °C) per pozzetto. Posizionare la piastra nell'incubatore (37 °C, atmosfera umidificata di 5% CO2) e cultura per 4 giorni.
- Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS al pozzo mediante pipetta.
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Indurre il differenziamento in PDX1+ cellule (fase 3).
- Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS al pozzo mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta.
- Aspirare il DPBS usate mediante pipetta e aggiungere 4 mL di terreno di fase 3 (37 °C) per pozzetto. Posizionare la piastra nell'incubatore (37 °C, atmosfera umidificata di 5% CO2) e cultura per 3 giorni.
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Indurre la differenziazione in cellule endocrine del pancreas.
- Eseguire induzione di cellule NKX6.1+ (fase 4, per 8 giorni) seguita da induzione endocrina delle cellule (fase 5, per 12 giorni) con protocolli precedentemente descritti3,16,26. Caratterizzano e convalidare la differenziazione endocrina delle cellule di immunostaining e analisi quantitativa in tempo reale trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena (qRT-PCR).
Nota: Fare riferimento alla Toyoda et al.16 e Kimura et al.26 per dettagliate procedure sperimentali. Consultare la tabella 1 per sequenze primer utilizzate per analisi qRT-PCR.
- Eseguire induzione di cellule NKX6.1+ (fase 4, per 8 giorni) seguita da induzione endocrina delle cellule (fase 5, per 12 giorni) con protocolli precedentemente descritti3,16,26. Caratterizzano e convalidare la differenziazione endocrina delle cellule di immunostaining e analisi quantitativa in tempo reale trascrizione d'inversione della polimerasi reazione a catena (qRT-PCR).
3. citometria di flusso (FCM)
- Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di 0.5 mM EDTA al pozzo mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di 0,5 mM EDTA una volta.
Nota: Agitare la piastra delicatamente per rimuovere eventuali cellule morte dalle cellule dello strato monomolecolare prima di ogni aspirazione. - Per dissociare le cellule (circa 3-6 × 106 cellule per pozzetto), aggiungere 2 mL di 0,25% tripsina contenente 0,5 mM EDTA per pozzetto. Incubare le piastre a 37 °C per 5-10 min.
- Pipettare delicatamente ma rapidamente a dissociare le cellule di ragruppata in singole celle. Non bolla sospensione delle cellule durante il pipettaggio.
- Aggiungere 8-10 mL di terreno base (RPMI 1640 o iMEM, RT) contenente 0,5 x integratore privo di siero e 10 μM Y-27632 per bene e mescolare la sospensione cellulare. Trasferire la sospensione cellulare in una provetta da centrifuga.
- Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 min a RT.
- Aspirare il supernatante e risospendere le cellule con 2 mL di 0.5 mM EDTA (RT). Pipettare delicatamente la sospensione cellulare.
- Centrifugare la provetta a 300 x g per 5 min a RT.
- Aspirare il supernatante e risospendere le cellule con 100 μL di tampone di fissazione e permeabilizzazione per 106 cellule sotto una cappa. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare sotto una cappa. Tenere il tubo a temperatura ambiente per 30 min.
- Centrifugare la provetta a 400 x g per 5 min a RT.
- Aspirare il supernatante sotto un cofano e risospendere le cellule con 500 μL di soluzione di FCM blocco per 106 cellule. Pipettare delicatamente la sospensione cellulare. Tenere il tubo a temperatura ambiente per 30 min.
- Trasferire 50 μL della sospensione delle cellule in una provetta (circa 1 x 105 cellule). Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 100 µ l di anticorpo primario diluito (Vedi Tabella materiali) in FCM soluzione di blocco e incubare a 4 °C per > 16 h.
- Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min. eliminare il surnatante e risospendere le cellule con 180 μL di tampone di lavaggio/Perm 1x.
- Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 100 µ l di anticorpo secondario diluito (Vedi Tabella materiali) in FCM soluzione bloccante. Incubare le cellule a RT per 60 min o a 4 °C per > 16 h con protezione dalla luce.
- Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min. eliminare il surnatante e risospendere le cellule con 180 μL di tampone di lavaggio/Perm 1x.
- Centrifugare la provetta a 400 x g a RT per 5 min, rimuovere il supernatante e risospendere le cellule con 180 μL di siero asino 2% in DPBS.
- Filtrare la sospensione cellulare trasferendo un 5 ml provetta polistirolo con un filtro cella (rete di nylon 35 µm) e conservare a 4 °C con protezione dalla luce fino all'analisi.
- Analizzare una percentuale di cellule marcate positivamente da un cytometer di flusso27.
4. Immunostaining
- Aspirare il mezzo usato e aggiungere 2 mL di DPBS al pozzo mediante pipetta. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta.
Nota: Scuotere delicatamente la piastra per rimuovere eventuali cellule morte dalle cellule dello strato monomolecolare prima di ogni aspirazione. - Aggiungere 2 mL di paraformaldeide al 4% (PFA) (4 °C) per pozzetto mediante pipetta sotto una cappa. Tenere la piastra a 4 °C per 20 min.
- Rimuovere il PFA pipetta sotto una cappa. Aggiungere 2 mL di DPBS presso RT al pozzo mediante pipetta sotto una cappa. Ripetere l'aspirazione e l'aggiunta di DPBS una volta.
- Aggiungere 2 mL di soluzione bloccante per pozzetto e tenere la piastra a temperatura ambiente per 30 min.
- Aspirare la soluzione usata e aggiungere 1 mL di anticorpo primario (Vedi Tabella materiali) nella soluzione per pozzetto di blocco. Incubare a temperatura ambiente per 60 min o a 4 °C per > 16 h.
- Aspirare la soluzione usata, aggiungere 2 mL di DPBS contenente 0,4% Triton X-100 e incubare a + RT 10 min ripetere l'aspirazione, aggiunta di soluzione e incubazione una volta.
- Aspirare la soluzione usata e aggiungere 1 mL di anticorpo secondario (Vedi Tabella materiali) nella soluzione per pozzetto di blocco. Incubare a temperatura ambiente per 60 min con protezione dalla luce.
- Aspirare la soluzione usata, aggiungere 2 mL di DPBS contenente 0,4% Triton X-100 (RT) e incubare a temperatura ambiente per 5 min con protezione dalla luce. Ripetere l'aspirazione, aggiunta di soluzione e incubazione due volte.
- Prendere micrografie per esaminare l'efficacia di differenziazione sotto un microscopio di fluorescenza28.
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Representative Results
Moltiplicazione delle hiPSCs (585A129,30) sono condensati e formano un monostrato omogeneo (Figura 1B) che è adatto per differenziazione. HiPSCs indifferenziato (stadio 0) sono dissociate e ri-seminato come singole cellule a densità bassa delle cellule (1-1.5 x 105 cellule/cm2). Entro 1 h, le cellule sono attaccate alla piastra e iniziano a mostrare la protrusione. Il giorno 1, le cellule sono moltiplicate e ben distribuite per coprire l'80-90% della superficie. Durante la fase 1B, i contenuti multimediali visualizzati nuvoloso dovuto le cellule morte. La rimozione delle cellule morte è critica per differenziazione altamente efficiente, poiché le cellule morte probabile disturbano la sopravvivenza e la differenziazione delle cellule che si trovano sotto. Nei giorni 3-4, cellule formano un foglio monostrato omogeneo che può essere descritto come un aspetto di ciottoli. A questo punto, la maggior parte delle cellule interrompere esprimendo sesso che determina regione Y-box 2 (SOX2), un indicatore per le cellule non differenziate e invece esprimere un marcatore endoderma definitivo, SOX17, più del 90% (Figura 2A e B). La maggior parte SOX17+ cellule FOXA2 express (Figura 2A). A partire la differenziazione con un compromessi di densità cellulare inadeguato l'efficienza di differenziazione in questa fase (Figura 3). Alle fasi 2 e 3, si rilassa la morte delle cellule, e il mezzo usato non è come nuvoloso come è nella fase 1B. Le cellule esprimono i marcatori del tubo dell'intestino primitivo HNF1β e HNF4α (Figura 2) e infine esprimere un marcatore di progenitrici posteriore del foregut del pancreas, PDX1, superiore al 90% (Figura 2D ed E). Il PDX1+ induzione delle cellule è riproducibile in un'altra linea di hiPSC, 1231A3 31e una linea di hESC, KhES-3 32 (Figura 4). risultati di qRT-PCR l'espressione di mRNA di fase marker erano costanti con immunostaining (Figura 5A). L'espressione del mRNA di PDX1 è evidente nella fase 3 e aumenta notevolmente la postfazione.
PDX1+ cellule nelle fasi iniziali di sviluppo hanno la possibilità di differenziarsi in cellule non solo del pancreas ma anche all'antro gastrico, del duodeno, dei dotti biliari extrahepatic e una parte di intestino 9. Il potenziale di differenziazione in vitro generato PDX1+ alle cellule del pancreas possono essere valutate dalla cultura estesa con protocolli segnalati per endoderma del pancreas e del pancreas endocrino delle cellule3,16, 26. le espressioni di un marcatore pancreatico endoderma, NKX6.1e due indicatori endocrini del pancreas, insulinae GLUCAGONE, sono state osservate nei giorni 19 (fase 4) e 31 (fase 5), rispettivamente (Figura 5).
Figura 1: aspetto rappresentativo delle celle sotto graduale differenziazione. (A) A regime di differenziazione diretto da hPSCs a lignaggi del pancreas. I numeri tra parentesi indicano le concentrazioni (unità sono scritte qui sotto). (B) micrografie rappresentativo del campo luminoso di hiPSCs alle fasi chiave della cultura differenziazione. 585A1 hiPSCs erano dissociato come cellule singole e indotte a differenziarsi in endoderma definitivo, tubo dell'intestino primitivo e progenitrici posteriore del foregut del pancreas. I pannelli inferiori sono viste allargate dei pannelli superiori. RPMI, RPMI 1640; AA, activina (ng/mL); CH, CHIR99021 (ΜM); KGF (ng/mL); NOG, NOGGIN (ng/mL); CYC, cyclopamine 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl (μM); TTNPB, acido 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic (nM). Scala bar = 300 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: induzione rappresentante verso lignaggi del pancreas da hiPSCs. (A), la proporzione di SOX2–SOX17+ cellule analizzate tramite flusso cytometry prima differenziazione (stadio 0) e il giorno 4 (fase 1B). Indifferenziato hiPSCs (SOX2+SOX17–) sono stati differenziati in endoderma definitivo (SOX2–SOX17+). La maggior parte SOX17+ cellule co-espressi FOXA2. (B) micrografie immunofluorescente rappresentante il giorno 4 (fase 1B). Le celle fisse sono state macchiate per SOX17 (verde), SOX2 (rosso) e nuclei (blu). (C) rappresentante micrografie immunofluorescenti giorni 4 (fase 1B) e 8 (fase 2). Le celle fisse sono state macchiate per HNF1β (verde), HNF4α (rosso) ed i nuclei (blue). (D) la percentuale di cellule positive per PDX1, come analizzato tramite flusso cytometry giorni 4 (fase 1B) e 11 (fase 3). (E) rappresentante immunofluorescente micrografie di PDX1 (verde) e nuclei (blu) il giorno 11 (fase 3). Scala bar = 100 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: induzione rappresentante verso endoderma definitivo avviata dalle densità differenti delle cellule. (A) micrografie rappresentativo del campo luminoso delle cellule 1 h dopo la differenziazione. hiPSCs sono state dissociate come cellule singole e indotte a differenziarsi in endoderma definitivo alle densità differenti delle cellule (1-50 x 104/cm2). I pannelli inferiori sono viste allargate dei pannelli superiori. (B) la proporzione di SOX2–SOX17+ cellule analizzate tramite flusso cytometry prima differenziazione (stadio 0) e il giorno 4 (fase 1B). (C), la proporzione di PDX1+ cellule analizzate tramite flusso cytometry nei giorni 8 (fase 2) e 11 (fase 3). Scala bar = 300 μm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Induzione rappresentante verso PDX1+ cellule in hiPCSs e hESCs. Una linea di hiPSC, 1231A3 (A), e una linea di hESC, KhES-3 (B), sono stati differenziati per endoderma definitivo e PDX1+ cellule. La composizione delle cellule è stata analizzata tramite flusso cytometry. La proporzione di SOX2–SOX17+ cellule è stata analizzata prima differenziazione (stadio 0) e il giorno 4 (fase 1B). La proporzione di PDX1+ cellule è stata analizzata nei giorni 8 (fase 2) e 11 (fase 3). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: induzione rappresentante verso endoderma pancreatico e cellule endocrine. hiPSCs (585A1) sono stati differenziati in PDX1+ cellule. Le cellule sono state ulteriormente differenziate in endoderma pancreatico e cellule endocrine del pancreas con protocolli riportati3,16,26. (A) mRNA espressioni degli indicatori di fase sono state misurate da reazione a catena della polimerasi in tempo reale quantitativa (qRT-PCR). I dati sono stati normalizzati all'espressione di GAPDH e presentati come il fold-cambiamento nell'espressione genica rispetto al valore di picco. Si noti che PDX1 espressione è stata aumentata a > 20 volte da giorni 8 (fase 2) 11 (fase 3) e a > 100 volte da giorni 11 (fase 3) a 19 (fase 4). L'espressione nel pancreas umano adulto è indicato come Panc. SOX2, nero; SOX17, viola; HNF1β, marrone; HNF4α, arancione; PDX1, verde chiaro; NKX6.1, verde; Insulina, blu; GLUCAGONE, rosso. (B) micrografie immunofluorescente rappresentativo di un marcatore pancreatico endoderma, NKX6.1 (rosso), nei giorni 11 (fase 3) e 19 (fase 4). PDX1 (verde) e nuclei (blu) sono stati co-macchiati. (C) micrografie immunofluorescente rappresentativi di due produttori del pancreas endocrini, insulina (INS, verde) e glucagone (GCG, rosso), nei giorni 19 (fase 4) e 31 (fase 5). Nuclei (blu) erano co-macchiati. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome del gene | Sigla del gene | Forward primer | Reverse primer |
| gliceraldeide-3-fosfato deidrogenasi di te |
GAPDH | GAAGGTGAAGGTCGGAGTC | GAAGATGGTGATGGGATTTC |
| SRY-box 2 | SOX2 | AGTCTCCAAGCGACGAAAAA | TTTCACGTTTGCAACTGTCC |
| SRY-box 17 | SOX17 | CGCACGGAATTTGAACAGTA | TTAGCTCCTCCAGGAAGTGTG |
| HNF1 homeobox B | HNF1Β | CCTCTCCTCCAAACAAGCTG | TGTTGCCATGGTGACTGATT |
| Alfa di fattore nucleare 4 dell'epatocita | HNF4Α | GAGCTGCAGATCGATGACAA | TACTGGCGGTCGTTGATGTA |
| pancreatico e duodenale homeobox 1 | PDX1 | AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT | CACAGCCTCTACCTCGGAAC |
| NK6 homeobox 1 | NKX6.1 | ATTCGTTGGGGATGACAGAG | TGGGATCCAGAGGCTTATTG |
| glucagone | GCG | GAATTCATTGCTTGGCTGGT | CGGCCAAGTTCTTCAACAAT |
| insulina | INS | CTACCTAGTGTGCGGGGAAC | GCTGGTAGAGGGAGCAGATG |
Tabella 1: Primer per qPCR.
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Discussion
La generazione di PDX1+ cellule è composto da più passaggi; Pertanto, è fondamentale per il trattamento di cellule al momento opportuno. Tra i passaggi, l'efficienza di induzione dell'endoderma definitivo colpisce in gran parte l'efficienza finale induzione, possibilmente da interferenze provenienti da altre cellule lignaggio contaminanti (cioè, mesoderma ed ectoderma), che possono proliferare e/o secernono fattori che compromettere la differenziazione specifica. Se la proporzione di SOX17+ cellule è inferiore all'80% il giorno 4 (fase 1B), un'induzione efficiente per PDX1+ cellule rischia di essere compromessa.
Gli Stati non differenziati di hPSCs sono mantenuti come colonie o aggregati di cellule compattate. Tuttavia, metodi che iniziano la differenziazione da colonie o aggregati possono soffrire di eterogeneità, a causa di adesione delle cellule diverse e densità della Colonia, così come nel centro e periferia22, e perché le cellule sono in diverse fasi il ciclo cellulare25. D'altra parte, il nostro metodo inizia con singole cellule dissociate, che consente uno stato relativamente omogeneo di adesione delle cellule di singole cellule o densità delle cellule in ogni singola cella. In termini di maneggevolezza omogenea per ogni cella, i nostri metodi potrebbero essere più facili rispetto ad altri che iniziano con culture di Colonia o di aggregazione.
Anche se il nostro protocollo può essere usato per indurre PDX1+ cellule da più linee di hPSC, la differenziazione potrebbe ancora essere inefficiente. In tali casi, le differenze nello stato di adesione subito dopo la semina tra le linee di hPSC potrebbero essere la causa, e modifica della densità di semina potrebbe essere una soluzione33. Infatti, la figura 3 Mostra che inappropriato semina densità compromessi differenziamento in endoderma definitivo e PDX1+ cellule. È interessante notare che, la densità cellulare ottimale per PDX1+ induzione delle cellule era differente fra le popolazioni di cellule che raggiunto > 90% endoderma definitivo. Un'altra possibilità per differenziazione inefficiente è la condizione di scarsa manutenzione dell'hPSCs indifferenziate, che compromette la qualità di pluripotenza nonostante l'espressione di marcatori per lo stato indifferenziato. In questo caso, la cultura di espansione hPSC dovrebbe essere ricominciata da passaggio precoce congelati scorte o sub clonazione deve essere eseguita per ottenere hPSCs in condizioni adatte. In caso di inefficiente differenziazione nei giorni 8 (fase 2) o 11 (fase 3), la durata di queste operazioni deve essere ottimizzata. Sostenendo questa idea, la durata della fase 3 ha dimostrata critica per l'acquisizione di caratteristiche delle cellule di fase successive ed è cella linea-dipendente nel lignaggio del pancreas34.
La generazione di PDX1+ cellule è fondamentale per la generazione in vitro di cellule pancreatiche. PDX1 è funzionalmente essenziali per lo sviluppo del pancreas basato sulla conoscenza da topi Pdx1, che sono apancreatic35. Studi in vitro e in vivo l'impianto ha mostrato costantemente, derivata da hPSC PDX1+ cellule hanno la potenzialità di svilupparsi in tutti i componenti del pancreas, compreso esocrina ed endocrina delle cellule come cellule β del pancreas3,16 , 36 , 37. Pertanto, la generazione efficiente di PDX1+ cellule da hPSCs conduce ad un rifornimento stabile delle cellule del pancreas per l'istituzione della terapia con cellule β contro il diabete e la comprensione dello sviluppo del pancreas umano e malattie pancreatiche.
Le limitazioni di questo metodo sono legate al formato bidimensionale (2D) monostrato cultura, che non è adatto per alcuni tipi di cellule e la lavorazione delle celle. Negli ultimi anni, culture di tridimensionale (3D) sono state indicate per promuovere la generazione di cellule mature e tessuti, probabilmente a causa di che imita il microambiente in vivo. Ad esempio, le cellule β generate nelle culture 3D ma colture monostrato 2D non ha potuto raggiungere la capacità di secernere insulina in risposta al glucosio extracellulare livelli38.
Per utilizzare PDX1+ cellule per la generazione di tipi cellulari inerente allo sviluppo successivi, è importante spostare verso culture 3D, quali colture in sospensione di aggregati incorporati in una matrice extracellulare e aggregazione culture su un'aria-liquido interfaccia3 , 16 , 37. Inoltre, colture monostrato 2D richiedono più superficie per la coltivazione di colture in sospensione, causando limitazioni nella scalabilità. L'elaborazione di grandi quantità di cellule per uso commerciale richiede le modifiche come l'uso di microsfere. Allo stesso tempo, il presente metodo è adatto per lo screening dei fattori che inducono la differenziazione e l'esplorazione dei meccanismi molecolari di trasferimento genico.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato in parte sostenuto da finanziamenti della Japan Society per la promozione della scienza (JSPS) attraverso Scientific Research (C) (JSPS KAKENHI Grant Number15K09385 e 18 K 08510) al T.T. e sovvenzione per assegnisti di ricerca pagine JSP (Javaserver KAKENHI Grant numero 17J07622) di A.K. e l'Agenzia giapponese per la ricerca medica e sviluppo (AMED) attraverso la sua ricerca concedere "Core Center for iPS Cell ricerca, centro di ricerca rete per realizzazione di medicina rigenerativa" per K.O. Gli autori ringraziano il Dr. Peter Karagiannis per leggere il manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1,000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| RNase-free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
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