Summary
Her presenterer vi en detaljert protokoll for å skille menneskelig pluripotent stamceller (hPSCs) i bukspyttkjertelen/tolvfingertarmen homeobox protein 1+ (PDX1+) celler for generering av bukspyttkjertelen overleveringslinjer basert på ikke-kolonien type monolayer av dissosiert enkeltceller. Denne metoden er egnet for produksjon av homogene hPSC-avledet celler, genetisk manipulasjon og screening.
Abstract
Menneskelige pluripotent stilk cellen (hPSC)-avledede bukspyttkjertelen celler er en lovende celle kilde for regenerativ medisin og en plattform å studere human utviklingsprosesser. Trinnvis rettet differensiering som viser utviklingsprosesser er en av de viktigste måtene å generere bukspyttkjertelen celler inkludert bukspyttkjertelen/tolvfingertarmen homeobox protein 1+ (PDX1+) bukspyttkjertelen progenitor celler. Konvensjonelle protokoller starte differensiering med små kolonier kort tid etter passering. Men i delstaten colonies eller aggregater, celler er utsatt for heterogeneities, som kan hemme differensiering å PDX1+ celler. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å skille hPSCs i PDX1+ celler. Protokollen består av fire trinnene og starter differensiering av seeding dissosiert enkeltceller. Induksjon av SOX17+ definitive endoderm celler ble etterfulgt av uttrykk for to primitive gut tube markører, HNF1β og HNF4α og eventuell differensiering inn PDX1+ celler. Nåværende protokollen gir enkel håndtering og kan forbedre og stabilisere differensiering effektiviteten av noen hPSC linjer som tidligere ble funnet for å skille ineffektivt endodermal linjene eller PDX1+ celler.
Introduction
Bukspyttkjertelen består hovedsakelig av exocrine og endokrine celler, og dens dysfunksjon eller overbelastning fører flere sykdommer, for eksempel pankreatitt, diabetes og kreft i bukspyttkjertelen. For å klargjøre pathogeny av pancreatopathy, er det nødvendig å analysere utviklingsprosess og funksjon av bukspyttkjertelen celler. I tillegg er en stabil celle forsyning med robuste kvalitet nødvendig å etablere cellen/vev kosttilskudd terapi. Menneskelige pluripotent stilk cellen (hPSC)-avledede bukspyttkjertelen celler er en lovende celle-kilde til disse formålene, og differensiering protokollen mot bukspyttkjertelen celler har vært intenst studerte1,2,3, 4. Nylige fremskritt i bukspyttkjertelen β celler i vitro generasjon etterligne generering av β celler i voksen menneskelige og disse cellene Vis terapeutiske effekten på implantasjon i diabetiker modell mus2,3. I tillegg avdekket analyse av β celler generert fra indusert pluripotent stamceller (iPSCs) av sunn og type 1 diabetes pasient givere ingen funksjonell forskjell inkludert når under stress5. Videre har sykdom fenotyper blitt delvis gjengitt i indusert bukspyttkjertelen celler med pasient-avledede iPSCs eller hPSCs skjuler genetiske mutasjoner i samme område som pasienter6,7.
Vil generere bukspyttkjertelen celler fra hPSCs, brukes gradvis rettet differensiering som viser utviklingsprosesser. Bukspyttkjertelen er avledet fra endoderm laget av tidlig embryoet, som uttrykker sex bestemme regionen Y-boksen 17 (SOX17) og forkhead for A2 (FOXA2)8. Basert på undersøkelsene vi musen, danner det endodermal laget primitive gut røret, som er preget av uttrykk for hepatocyte kjernefysiske faktor 1-beta (Hnf1β) og hepatocyte kjernefysiske faktor 4-alpha (Hnf4α). Den primitive gut elongates og utvikler i luftveiene apparater, fordøyelseskanal og organer. Etter elongation, bakre foregut området blir presumptive bukspyttkjertelen regionen, som preget av uttrykk for transcriptional faktor bukspyttkjertelen/tolvfingertarmen homeobox protein 1 (PDX1)8,9,10. Rygg- og ventrale deler av PDX1+ gut tube tykne til skjemaet bukspyttkjertelen knopper, som er preget av co uttrykk for bukspyttkjertelen transkripsjon faktor 1 delenhet alpha (PTF1A) og NK6 homeobox 1 (NKX6.1)8,11. Denne uttrykket markerer morfologiske starten av bukspyttkjertelen organogenesen. Bukspyttkjertelen endoderm celler, som er komponenter av bukspyttkjertelen knopper, danner et forgrenet rørformede nettverk epithelial strukturer12 og til slutt skille ut exocrine og endokrine cellene, inkludert insulin sekresjon β-celler og glukagon-sekresjon α-celler. Uttrykk for PDX1 er oppdaget først på presumptive bukspyttkjertelen regionen, som deretter observeres under hele bukspyttkjertelen utviklingen, og viser lokaliseringen å β - og ses-celler9,13,14. Selv om Pdx1+ celle området som ikke uttrykker Ptf1a eller Nkx6.1 skiller den gastriske antrum, tolvfingertarmen, extrahepatic galle duct og noen intestinal celler på midten sent Stadium i utviklingen i mus9PDX1+ celler anses progenitors av bukspyttkjertelen på det tidlige utviklingen scenen hos mennesker.
Her presenterer vi en detaljert protokoll for å skille hPSCs i PDX1+ celler for generering av bukspyttkjertelen overleveringslinjer. Protokollen starter differensiering av seeding dissosiert enkeltceller15,16,17. Vanligvis vedlikeholdes udifferensierte hPSCs som kolonier eller cellen aggregater i suspensjon eller vedheft. Som et resultat, starte de fleste protokollene differensiering etter passaging. Men i delstaten colonies eller aggregater, celler er utsatt for romlige og transcriptional heterogeneities18,19,20,21,22, som kan hemme den første differensiering skritt mot definitive endoderm etterfulgt av ineffektiv differensiering til PDX1+ celler. Nåværende protokollen kan tilby enkel håndtering for å forbedre og stabilisere differensiering effektiviteten av noen hPSC linjer som tidligere ble funnet for å skille ineffektivt å endodermal linjene og PDX1+ celler23, 24 , 25.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Eksperimenter ved hjelp av hPSCs ble godkjent av den etiske komiteen av Institutt for indremedisin og Graduate School of Medicine, Kyoto University.
1. forberedelse av materialer
Merk: Forberede all media og reagenser cellekultur i et sterilt miljø. Varm opp base kultur medier til romtemperatur (RT) før bruk. Medium for differensiering brukes innen 6 h RT. detaljer om reagenser er oppført i Tabellen for materiale.
-
Differensiering (figur 1A)
- Scenen 1A medium: overføre RPMI 1640 medium i et rør med en pipette. Legge til serum-free supplement, activin A, CHIR99021 og Y-27632 i en konsentrasjon av 1 x, 100 ng/mL, 3 μM og 10 μM, henholdsvis.
- Trinn 1B medium: overføre RPMI 1640 medium i et rør med en pipette. Legg den serum-free supplement, activin A og CHIR99021 til en konsentrasjon av 1 x 100 ng/mL, ≤1 μM, henholdsvis.
Merk: Konsentrasjonen av CHIR99021 bør være lavere enn i scenen 1A medium, og tillegg er ikke nødvendig, men det øker celle nummer. - Trinn 2 middels: overføring forbedret MEM (iMEM) medium i et rør med en pipette. Legge til serum-free supplement og keratinocyte vekstfaktor (KGF) i en konsentrasjon på 0,5 x og 50 ng/mL, henholdsvis.
- Etappe 3 middels: overføring iMEM medium i et rør med en pipette. Legg den serum-free supplement, KGF, NOGGIN, 3-Keto-N-aminoethyl-N'- aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (CYC) og 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic syre (TTNPB) av Pipetter til konsentrasjoner av 0.5 x, 50 ng/mL, 100 ng/mL, 0,5 μM og 10 nM, henholdsvis.
-
Flowcytometri (FCM)
- 1 x Permeabilization/vaskebuffer: overføre vann inn i et rør av en pipette. Legge til Permeabilization/vaskebuffer etter en pipette i en konsentrasjon av 1 x.
- FCM blokkerer løsning: overføre 1 x Permeabilization/vaskebuffer i et rør av en pipette. Legge til esel serum etter en pipette i en konsentrasjon på 2% (vol/vol).
-
Immunostaining
- Blokkerer løsning: overføring Dulbecco Phosphate-Buffered saltvann (DPBS) inn i et rør av en pipette. Legge til esel serum og Triton X av pipette konsentrasjoner av 5% (vol/vol) og 0,4% (vol/vol), henholdsvis.
2. hPSC differensiering til bakre Foregut celler/Pancreatic Progenitors (PDX1+ celler)
Merk: Utfør alle prosedyrer som bruker sterilt teknikker. hPSCs vedlikeholdes på 6-vel platene belagt med syntetisk overflate materiale for hPSCs med hPSC vedlikehold medium i henhold til produsentens instruksjoner17,26. Når celler 50-80% confluency (scenen 0) bruke dem for differensiering.
-
Forberede kjelleren membran matrix-belagte plater.
- Overføre 6 mL av RPMI 1640 (4 °C) inn i et rør kjølt ned til 4 °C på is. Legg 2 mg av kjelleren membran matrix (4 °C) med avkjølt 1 mL-pipette-spisser og bland godt av mild pipettering å gjøre 0,33 mg/mL kjelleren membran matrise.
- Overføre 2 mL utvannet kjelleren membran matrise i hver brønn av 6-vel celle kultur plater av en pipette. Plass platene på 37 °C i 60-90 min i en inkubator. Etterpå holde platene på RT til bruk (innen 3 h).
-
Frø av hPSCs og starte differensiering å endelig endoderm (scenen 1A).
- Sug opp den brukte mediet og legge 2 mL 0,5 mM ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) (RT) per brønn av pipette å vaske hPSCs kultivert i 6-vel platene.
- Sug opp 0,5 mM EDTA og legge 2 mL 0,5 mM EDTA per brønn av pipette. Inkuber platene på 37 °C i 5 min.
- Sug opp 0,5 mM EDTA og legge til 1 mL av hPSC vedlikehold medium RT supplert med 10 μM Y-27632 per godt av pipette. Pipetter forsiktig, men raskt å blåse ut tilknyttede celler på platene og å distansere klumpet seg celler i enkeltceller. Ikke boble celle suspensjon under pipettering.
- Overføre celle suspensjon i et 50 mL sentrifuge rør som inneholder 4 mL hPSC vedlikehold medium på RT supplert med 10 μM Y-27632. Pipetter forsiktig celle suspensjon.
- Beregne celle i cellen suspensjon å Trypan blå flekken utelukkelse fremgangsmåten.
- Mix-15 μL celle fjæring og 15 μL Trypan blå i et rør.
- Overfør 10 μL celle suspensjon fortynnet med Trypan blå på cellen teller lysbilder i duplikat av en 10 μL pipette.
- Telle cellen med en automatisk celle teller og beregne celle tettheten i cellen suspensjon. Levedyktighet er vanligvis > 98%.
- Aliquot celle suspensjon i et 50 mL sentrifuge rør på 1-1,5 x 106 celler per brønn av 6-vel plater (1-1,5 x 105 celler/cm2).
- Sentrifuge 50 mL tube 200 x g på RT i 5 min.
- Sug opp nedbryting bruker en pipette og resuspend cellene med 1 mL av scenen 1A medium (RT) per brønn. Forsiktig Pipetter celle suspensjon og legge en annen 1 mL av scenen 1A medium (totalt, 2 mL per brønn).
- Sug opp utvannet kjelleren membran matrisen i brønnene av celle kultur platene utarbeidet i trinn 2.1.2 av en 1000 μL pipette. Gå videre til neste trinn umiddelbart.
- Pipetter forsiktig celle suspensjon i trinn 2.2.8 igjen. Umiddelbart etter blanding, overføre celle suspensjon (2 mL) i hver brønn av en 6-vel plate. Dekk platen med en aluminiumsfolie å beskytte platen fra lys. Plass platen i ren benken på RT for 10-15 min.
Merk: Ikke Flytt platen etter seeding. - Forsiktig plassere platen i en 37 °C, 5% CO2 inkubator (fuktet atmosfære) og kultur for 24 timer.
Merk: Ikke riste platen etter seeding.
-
Indusere differensiering inn definitive endoderm (trinn 1B).
- Sug opp den brukte mediet og legge 2 mL DPBS fordelt ved pipette. Gjenta aspirasjon og tillegg av DPBS en gang.
Merk: For å fjerne døde celler fra monolayer, forsiktig risting platen før hver aspirasjon. - Sug opp den brukte DPBS av en pipette, og Legg 4 mL av trinn 1B medium (37 °C) per brønn. Forsiktig plassere platen i 37 °C inkubator (fuktet atmosfæren på 5% CO2) og kultur for 48 timer.
- Sug opp den brukte mediet og legge 2 mL DPBS til brønnen av pipette. Gjenta aspirasjon og tillegg av DPBS en gang.
Merk: Fjerne døde celler fra monolayer av mild risting før hver aspirasjon. - Sug opp den brukte DPBS av pipette, og Legg 4 mL av trinn 1B medium (37 °C) per brønn. Forsiktig plassere platen i inkubator (37 °C, fuktet atmosfæren på 5% CO2) og kultur for 24 timer.
- Sug opp den brukte mediet og legge 2 mL DPBS fordelt ved pipette. Gjenta aspirasjon og tillegg av DPBS en gang.
-
Indusere differensiering inn i primitive gut røret (trinn 2).
- Sug opp den brukte mediet og legge 2 mL DPBS til brønnen av pipette.
Merk: Fjerne døde celler fra monolayer av mild risting før hver aspirasjon. - Sug opp den brukte DPBS av pipette, og Legg 4 mL fase 2 middels (37 °C) per brønn. Plass platen i inkubatoren (37 °C, fuktet atmosfæren på 5% CO2) og kultur for 4 dager.
- Sug opp den brukte mediet og legge 2 mL DPBS til brønnen av pipette.
-
Indusere differensiering inn PDX1+ celler (trinn 3).
- Sug opp den brukte mediet og legge 2 mL DPBS til brønnen av pipette. Gjenta aspirasjon og tillegg av DPBS en gang.
- Sug opp den brukte DPBS av pipette, og Legg 4 mL Stage 3 middels (37 °C) per brønn. Plass platen i inkubatoren (37 °C, fuktet atmosfæren på 5% CO2) og kultur for 3 dager.
-
Indusere differensiering i bukspyttkjertelen endokrine celler.
- Utføre NKX6.1+ celle induksjon (trinn 4, 8 dager) etterfulgt av endokrine celle induksjon (trinn 5, for 12 dager) med tidligere beskrevet protokoller3,16,26. Karakterisere og validere endokrine celledifferensiering av immunostai- og kvantitative sanntid omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (qRT-PCR) analyse.
Merk: Se Toyoda et al.16 og Kimura et al.26 for detaljert eksperimentelle prosedyrer. Se tabell 1 for primer sekvenser brukes for qRT PCR analyse.
- Utføre NKX6.1+ celle induksjon (trinn 4, 8 dager) etterfulgt av endokrine celle induksjon (trinn 5, for 12 dager) med tidligere beskrevet protokoller3,16,26. Karakterisere og validere endokrine celledifferensiering av immunostai- og kvantitative sanntid omvendt transkripsjon polymerase kjedereaksjon (qRT-PCR) analyse.
3. flowcytometri (FCM)
- Sug opp den brukte mediet og legge 2 mL 0,5 mM EDTA til brønnen av pipette. Gjenta aspirasjon og tillegg av 0,5 mM EDTA én gang.
Merk: Riste platen forsiktig for å fjerne døde celler fra monolayer cellene før hver aspirasjon. - Å distansere cellene (ca 3-6 × 106 celler per brønn), legge til 2 mL 0,25% Trypsin som inneholder 0,5 mM EDTA per brønn. Inkuber platene på 37 °C i 5-10 min.
- Pipetter forsiktig men raskt å distansere klumpet seg celler i enkeltceller. Ikke boble celle suspensjon under pipettering.
- Legge til 8-10 mL base medium (RPMI 1640 eller iMEM, RT) som inneholder 0.5 x serum-free supplement og 10 μM Y-27632 per godt og bland celle suspensjon. Overføre celle suspensjon i en sentrifuge rør.
- Sentrifuge røret på 300 x g ved RT i 5 min.
- Sug opp nedbryting og resuspend cellene med 2 mL 0,5 mM EDTA (RT). Pipetter forsiktig celle suspensjon.
- Sentrifuge røret på 300 x g ved RT i 5 min.
- Sug opp nedbryting og resuspend cellene med 100 μL fiksering og permeabilization buffer per 106 celler under en hette. Pipetter forsiktig celle suspensjon under en hette. Holde røret på RT for 30 min.
- Sentrifuge røret på 400 x g ved RT i 5 min.
- Sug opp nedbryting under hette og resuspend cellene med 500 μL FCM blokkerer løsning per 106 celler. Pipetter forsiktig celle suspensjon. Holde røret på RT for 30 min.
- Overføre 50 μL av cellen suspensjon slik (ca 1 x 105 celler). Sentrifuge røret på 400 x g ved RT for 5 min. Fjern nedbryting og resuspend cellene med 100 μL utvannet primære antistoff (se Tabell for materiale) i FCM blokkerer løsning og ruge på 4 °C for > 16 h.
- Sentrifuge røret på 400 x g ved RT 5 min. fjerne nedbryting og resuspend cellene med 180 μL 1 x Perm/vaskebuffer.
- Sentrifuge røret på 400 x g ved RT for 5 min. Fjern nedbryting og resuspend cellene med 100 μL utvannet sekundære antistoff (se Tabell for materiale) i FCM blokkerer løsning. Inkuber cellene på RT for 60 min eller 4 °C for > 16 timer med beskyttelse mot lyset.
- Sentrifuge røret på 400 x g ved RT 5 min. fjerne nedbryting og resuspend cellene med 180 μL 1 x Perm/vaskebuffer.
- Sentrifuge røret på 400 x g ved RT for 5 min. Fjern nedbryting og resuspend cellene med 180 μL 2% esel serum i DPBS.
- Filtrere celle suspensjon etter overføring på en 5 mL rundt bunnen polystyren rør med en celle sil (35 µm nylon maske) og på 4 °C beskyttelse fra lys til analysen.
- Analysere en andel av positivt farget celler ved en flyt cytometer27.
4. Immunostaining
- Sug opp den brukte mediet og legge 2 mL DPBS til brønnen av pipette. Gjenta aspirasjon og tillegg av DPBS en gang.
Merk: Forsiktig risting platen for å fjerne døde celler fra monolayer cellene før hver aspirasjon. - Legge til 2 mL 4% paraformaldehyde (PFA) (4 °C) per brønn av pipette under en hette. Holde platen på 4 °C for 20 min.
- Fjerne PFA ved pipette under en hette. Legge 2 mL DPBS på RT til brønnen av pipette under en hette. Gjenta aspirasjon og tillegg av DPBS en gang.
- Legg 2 mL blokkerer løsning per brønn og holde platen på RT i 30 min.
- Sug opp den brukte løsningen og legge 1 mL av primære antistoff (se Tabell for materiale) i blokkering løsning per brønn. Ruge på RT for 60 min eller 4 °C for > 16 h.
- Sug opp den brukte løsningen, legge 2 mL DPBS med 0,4% Triton X-100 og Inkuber på RT for 10 min. Gjenta aspirasjon, løsning og inkubasjon én gang.
- Sug opp den brukte løsningen og legge 1 mL av sekundær antistoff (se Tabell for materiale) i blokkering løsning per brønn. Ruge på RT for 60 min beskyttelse mot lyset.
- Sug opp den brukte løsningen, legge 2 mL DPBS med 0,4% Triton X-100 (RT) og Inkuber på RT i 5 min med beskyttelse mot lyset. Gjenta aspirasjon, løsning og inkubasjon to ganger.
- Ta micrographs å undersøke differensiering effektiviteten under en fluorescens mikroskop28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Overfører hiPSCs (585A129,30) er kondensert og danner en homogen monolayer (figur 1B) som passer for differensiering. Udifferensierte hiPSCs (scenen 0) er atskilt og re seeded som enkeltceller på lav celle tettheter (1-1,5 x 105 celler/cm2). Innen 1 h, cellene er knyttet til plate og begynne å vise protrusion. På dag 1, er cellene proliferated og godt fordelt for å dekke 80-90% av arealet. Under trinn 1B vises mediet skyet på grunn av døde celler. Fjerning av døde celler er avgjørende for svært effektiv differensiering siden døde celler sannsynligvis forstyrre overlevelse og differensiering av celler liggende under. På dager 3-4, danner cellene en homogen monolayer ark som kan beskrives som en brosteinsbelagt utseende. På dette punktet, de fleste cellene stopp uttrykke sex bestemme regionen Y-boks 2 (SOX2), en markør for udifferensierte celler, og i stedet uttrykke en definitiv endoderm markør, SOX17, mer enn 90% (figur 2A og B). De fleste SOX17+ celler uttrykke FOXA2 (figur 2A). Starter differensiering med en upassende celle tetthet kompromisser differensiering effektiviteten på dette trinnet (Figur 3). På trinn 2 og 3, celledød slapper og brukte mediet er ikke så skyet som i trinn 1B. Celler uttrykke primitive gut tube markørene HNF1β og HNF4α (figur 2C) og til slutt express bakre foregut/bukspyttkjertelen stamfar merketråd, PDX1, mer enn 90% (figur 2D og E). PDX1+ celle induksjon er reproduserbare i en hiPSC linje, 1231A3 31og en hESC linje, KhES-3 32 (Figur 4). qRT PCR resultater fra mRNA uttrykket for scenen var konsekvent med immunostaining (figur 5A). MRNA uttrykk for PDX1 er tydelig på Stage 3 og øker vesentlig etterord.
PDX1+ cellene på tidlig i utviklingen etapper har potensial til å skille ut ikke bare bukspyttkjertelen celler men også gastrisk antrum, tolvfingertarmen, extrahepatic galle duct og en del av tarmen 9. Differensiering potensialet i i vitro generert PDX1+ cellene i bukspyttkjertelen celler kan bli vurdert av utvidet kultur med rapporterte protokoller for bukspyttkjertelen endoderm og bukspyttkjertelen endokrine cellene3,16, 26. av merketråd bukspyttkjertelen endoderm, NKX6.1og to bukspyttkjertelen endokrine markører, INSULINog GLUKAGON, ble observert på dager 19 (trinn 4) og 31 (trinn 5), henholdsvis (figur 5).
Figur 1: representant utseendet til cellene under gradvis differensiering. (A) A ordningen rettet differensiering fra hPSCs å bukspyttkjertelen overleveringslinjer. Tallene i parentes viser konsentrasjoner (enheter er skrevet nedenfor). (B) representant lysende felt micrographs av hiPSCs på nøkkeltrinn differensiering kultur. 585A1 hiPSCs var avstand som enkeltceller og overtalt til å skille ut definitive endoderm, primitive gut rør og bakre foregut/bukspyttkjertelen stamfar. Den nedre paneler er forstørret visninger av den øvre panelene. RPMI, RPMI 1640; AA, activin en (ng/mL); LM, CHIR99021 (ΜM); KGF (ng/mL); NOG NOGGIN (ng/mL); CYC, 3-Keto-N-aminoethyl-N'-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine (μM); TTNPB, 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic syre (nM). Skalere barer = 300 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: representant induksjon mot bukspyttkjertelen linjen fra hiPSCs. (A) andelen av SOX2-SOX17+ celler analysert av flowcytometri før differensiering (scenen 0) og på dag 4 (trinn 1B). Udifferensierte hiPSCs (SOX2+SOX17-) var differensiert i definitive endoderm (SOX2-SOX17+). De fleste SOX17+ celler co uttrykt FOXA2. (B) representant micrographs immunofluorescent på dag 4 (trinn 1B). Fast cellene var farget for SOX17 (grønn), SOX2 (rød) og kjerner (blå). (C) representant micrographs immunofluorescent på dager 4 (trinn 1B) og 8 (trinn 2). Fast cellene var farget for HNF1β (grønn), HNF4α (rød) og kjerner (blå). (D) andelen celler positivt for PDX1, som analyseres av flowcytometri på dager 4 (trinn 1B) og 11 (trinn 3). (E) representant micrographs immunofluorescent PDX1 (grønn) og kjerner (blå) på dag 11 (trinn 3). Skalere barer = 100 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: representant induksjon mot definitive endoderm startet fra ulike celle tettheter. (A) representant lysende felt micrographs celler 1t etter differensiering. hiPSCs avstand som enkeltceller og overtalt til å skille ut definitive endoderm på ulike celle tettheter (1-50 x 104/cm2). Den nedre paneler er forstørret visninger av den øvre panelene. (B) andelen av SOX2-SOX17+ celler analysert av flowcytometri før differensiering (scenen 0) og på dag 4 (trinn 1B). (C) andelen PDX1+ celler analysert av flowcytometri på dager 8 (trinn 2) og 11 (trinn 3). Skalere barer = 300 μm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Representant induksjon mot PDX1+ celler i hiPCSs og hESCs. En hiPSC linje, 1231A3 (A), og en hESC linje, KhES-3 (B), var differensiert definitive endoderm og PDX1+ celler. Cellen sammensetningen ble analysert av flowcytometri. Andelen av SOX2-SOX17+ celler ble analysert før differensiering (scenen 0) og på dag 4 (trinn 1B). Andelen PDX1+ celler ble analysert på dager 8 (trinn 2) og 11 (trinn 3). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: representant induksjon mot bukspyttkjertelen endoderm og endokrine celler. hiPSCs (585A1) var differensiert i PDX1+ celler. Cellene ble videre differensiert i bukspyttkjertelen endoderm og bukspyttkjertelen endokrine celler med rapporterte protokoller3,16,26. (A) mRNA uttrykk for scenen ble målt med kvantitative sanntids polymerasekjedereaksjons (qRT-PCR). Dataene ble normalisert GAPDH uttrykk og presentert som fold-endring i genuttrykk i forhold til toppverdien. Merk at PDX1 uttrykket ble økt på > 20-fold fra dager 8 (trinn 2) til 11 (fase 3) og > 100-fold dager 11 (fase 3) til 19 (trinn 4). Uttrykket i voksen menneskelige bukspyttkjertelen vises som Panc. SOX2, svart. SOX17, lilla; HNF1β, brun; HNF4α, oransje; PDX1, lys grønn; NKX6.1, grønt; INSULIN, blå. GLUCAGON, rød. (B) representant micrographs immunofluorescent på en bukspyttkjertelen endoderm markør, NKX6.1 (rød), på dager 11 (fase 3) og 19 (trinn 4). PDX1 (grønn) og kjerner (blå) var co farget. (C) representant micrographs immunofluorescent to bukspyttkjertelen endokrine beslutningstakere, insulin (INS, grønn) og glukagon (GCG, rød), på dager 19 (trinn 4) og 31 (trinn 5). Kjerner (blå) var co farget. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Gene navn | Gene symbol | Fremover primer | Omvendt primer |
| glyceraldehyde-3-phospha te dehydrogenase |
GAPDH | GAAGGTGAAGGTCGGAGTC | GAAGATGGTGATGGGATTTC |
| SRY-boks 2 | SOX2 | AGTCTCCAAGCGACGAAAAA | TTTCACGTTTGCAACTGTCC |
| SRY esken 17 | SOX17 | CGCACGGAATTTGAACAGTA | TTAGCTCCTCCAGGAAGTGTG |
| HNF1 homeobox B | HNF1Β | CCTCTCCTCCAAACAAGCTG | TGTTGCCATGGTGACTGATT |
| hepatocyte kjernefysiske faktor 4 alpha | HNF4Α | GAGCTGCAGATCGATGACAA | TACTGGCGGTCGTTGATGTA |
| bukspyttkjertelen og duodenalsår homeobox 1 | PDX1 | AGCAGTGCAAGAGTCCCTGT | CACAGCCTCTACCTCGGAAC |
| NK6 homeobox 1 | NKX6.1 | ATTCGTTGGGGATGACAGAG | TGGGATCCAGAGGCTTATTG |
| glucagon | GCG | GAATTCATTGCTTGGCTGGT | CGGCCAAGTTCTTCAACAAT |
| insulin | MODULER | CTACCTAGTGTGCGGGGAAC | GCTGGTAGAGGGAGCAGATG |
Tabell 1: Primere for qPCR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Generering av PDX1+ celler består av flere trinn; Derfor er det avgjørende å behandle celler på riktig tidspunkt. Blant trinnene, induksjon effektiviteten definitive endoderm i stor grad påvirker siste induksjon effektiviteten, muligens av interferens fra andre forurensende avstamning celler (dvs. mesoderm og ektoderm), som kan spre og/eller skiller faktorer som forstyrre bestemt differensiering. Hvis andelen SOX17+ celler er lavere enn 80% på dag 4 (trinn 1B), en effektiv induksjon til PDX1+ celler er sannsynlig.
Udifferensierte stater hPSCs vedlikeholdes som kolonier eller aggregater av komprimerte celler. Imidlertid kan metoder starter differensiering fra colonies eller aggregater lide av heterogenitet, på grunn av ulike celleadhesjon og tetthet i kolonien, slik som i de center og periferi22, og fordi cellene er på forskjellige stadier i cellen syklus25. På den annen side, starter vår metoden med dissosiert enkeltceller, som gjør en relativt homogene tilstand av celleadhesjon enkeltceller eller cellen tetthet i hver enkelt celle. I homogene behandling for hver celle, kan våre metoder være enklere enn andre som starter med koloni eller aggregering kulturer.
Selv om våre protokollen kan brukes å indusere PDX1+ celler fra flere hPSC linjer, differensiering fremdeles være ineffektiv. I slike tilfeller forskjeller i vedheft state rett etter seeding blant hPSC linjene kan være årsaken og endring av seeding tetthet kan være en løsning33. Faktisk Figur 3 viser at upassende seeding celle tetthet kompromisser differensiering inn definitive endoderm og PDX1+ celler. Interessant, optimal celle tetthet for PDX1+ celle induksjon var annerledes blant celle populasjoner som oppnådd > 90% definitive endoderm. En annen mulighet for ineffektiv differensiering er dårlig vedlikehold tilstand udifferensierte hPSCs, som kompromitterer kvaliteten på pluripotency tross uttrykk for markører for udifferensierte staten. I dette tilfellet hPSC ekspansjon kultur skal bli gjenopptatt fra tidlig passering frosset aksjer eller sub kloning skal utføres for å få hPSCs i riktig forhold. Ved ineffektiv differensiering på dager 8 (trinn 2) eller 11 (trinn 3), skal varigheten av disse trinnene optimaliseres. Støtter denne ideen, varigheten av Stage 3 har vist seg avgjørende for å anskaffe senere stadium celle egenskaper og celle linje-avhengige i bukspyttkjertelen avstamning34.
Generering av PDX1+ celler er avgjørende for i vitro generasjon av bukspyttkjertelen celler. PDX1 er funksjonelt viktig for bukspyttkjertelen utvikling basert på kunnskap fra Pdx1 null mus, som er apancreatic35. Konsekvent i vitro og in vivo implantasjon studier viste hPSC-avledet PDX1+ celler har potensial til å utvikle seg til alle bukspyttkjertelen komponenter, inkludert exocrine og endokrine cellene som bukspyttkjertelen β celler3,16 , 36 , 37. dermed effektiv generering av PDX1+ celler fra hPSCs fører til en stabil bukspyttkjertelen celle tilførsel for etablering av β cellen terapi mot diabetes og forståelse av menneskelig bukspyttkjertelen utvikling og bukspyttkjertelen sykdommer.
Begrensningene i denne metoden er knyttet til todimensjonal (2D) monolayer kultur format, som ikke er egnet for noen celletyper og cellen behandling. De siste årene, har tredimensjonale (3D) kulturer vist seg å fremme generasjonen av eldre celler og vev, sannsynligvis mimicking den i vivo microenvironment. For eksempel β celler generert i 3D kulturer, men ikke 2D monolayer kulturer kan oppnå muligheten til å skille ut insulin svar på ekstracellulære glukose nivå38.
Bruker PDX1+ celler for generering av developmentally senere celletyper, er det viktig å skifte til 3D kulturer, for eksempel suspensjon kulturer av aggregater innebygd i en ekstracellulær matrix og samlet kulturer på en luft-flytende grensesnitt3 , 16 , 37. I tillegg 2D monolayer kulturer krever mer areal for dyrking enn suspensjon kulturer, begrense skalerbarhet. Behandling av store mengder celler for kommersiell bruk krever modifikasjoner som bruk av microbeads. Samtidig er den nåværende metoden egnet for screening av differensiering-inducing faktorer og utforskning av molekylære mekanismer av genoverføring.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet var støttes delvis av finansiering fra Japan Society for det fremme av vitenskap (JSPER) gjennom Scientific Research (C) (Javaserver KAKENHI Grant Number15K09385 og 18 K 08510) T.T. og Grant-in-Aid for stipendiater for JSP (Javaserver KAKENHI bevilgning nummer 17J07622) AK og Japan Direktoratet for medisinsk forskning og utvikling (AMED) gjennom sin forskning gi "Core Center for iPS forskning, Research Center nettverk for realisering av regenerativ medisin" K.O. Forfatterne takker Dr. Peter Karagiannis for å lese manuskriptet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3-Keto-N-aminoethyl-N′-aminocaproyldihydrocinnamoyl cyclopamine | Toronto Research Chemicals | K171000 | CYC |
| 4-[(E)-2-(5,6,7,8-Tetrahydro-5,5,8,8-tetramethyl-2-naphthalenyl)-1-propenyl]-benzoic acid | Santa Cruz Biotechnology | SC-203303 | TTNPB |
| 50 mL Conical Sterile Polypropylene Centrifuge Tubes | Thermo Fisher Scientific | 339652 | |
| Anti-CDX2 antibody [EPR2764Y] | Abcam | Ab76541 | Anti-CDX2, × 1/1000 dilution |
| B-27 Supplement (50 ×) | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | Serum-free supplement |
| BD FACSAria II Cell Sorter | BD Biosciences | For flow cytometry | |
| Biomedical freezer | SANYO | MDF-U538 | For -30 °C storing |
| Cell Counting Slides for TC10/TC20 Cell Counter, Dual-Chamber | BIO-RAD | 1450011 | Counting slide glass |
| CELL CULTURE MULTIWELL PLATE, 6 WELL, PS, CLEAR | Greiner bio-one | 657165 | For differentiation culture/6-well plate |
| Centrifuge | TOMY | AX-310 | For cell culturing |
| Centrifuge | TOMY | MX-305 | For RT-qPCR |
| CHIR99021 | Axon Medchem | Axon 1386 | |
| CLEAN BENCH | SHOWA KAGAKU | S-1601PRV | Clean bench |
| Corning CellBIND 6-well plate | Corning | 3335 | For feeder-free culture of hPSCs/6-well plate |
| Corning Matrigel Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced | Corning | 354230 | Basement membrane matrix |
| Corning Synthemax II-SC Substrate | Corning | 3535 | For feeder-free culture of hPSCs/synthetic surface material for hPSCs |
| Cryostat | Leica | Leica CM1510 S | For immunostaining of aggregates. |
| Cytofix/Cytoperm Kit | Becton Dickinson | 554714 | Perm/Wash buffer is Permeabilization/Wash buffer. Cytofix/Cytoperm buffer is fixation and permeabilization buffer. |
| Dako pen | Dako | S2002 | For immunostaining of aggregates |
| dNTP mix (10 mM) | Thermo Fisher Scientific | 18427-088 | For RT-qPCR |
| Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A11055 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10040 | Secondary antibody, × 1/500 dilution |
| Donkey Serum | Merck Millipore | S30 | Donkey serum |
| D-PBS(-) without Ca or Mg | Nacalai tesque | 14249-95 | DPBS |
| Essential 8 Medium | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | For feeder-free culture of hPSCs/hPSC maintenance medium |
| Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | 5 mL round bottom polystyrene tube with cell strainer |
| Filter Tip, 1,000 µL | Watoson | 124-1000S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 20 µL | Watoson | 124-P20S | Use together with pipettes |
| Filter Tip, 200 µL | Watoson | 124-P200S | Use together with pipettes |
| Fluorescence Microscope | Keyence | BZ-X700 | For immunostaining |
| Forma Steri-Cycle CO2 incubator | Thermo Fisher Scientific | 370A | Incubator |
| HNF-1β Antibody (C-20) | Santa Cruz Biotechnology | sc-7411 | Anti-HNF1β, × 1/200 dilution |
| HNF-4α Antibody (H-171) | Santa Cruz Biotechnology | sc-8987 | Anti-HNF4α, × 1/200 dilution |
| Hoechst 33342 | Thermo Fisher Scientific | H3570 | For nucleus staining, × 1/200 dilution |
| Human Pancreas Total RNA | Ambion | AM7954 | For RT-qPCR |
| Human PDX-1/IPF1 Antibody | R&D Systems | AF2419 | Anti-PDX1, goat IgG, × 1/200 dilution |
| Human SOX17 Antibody | R&D Systems | AF1924 | Anti-SOX17, × 1/200 dilution |
| Improved MEM Zinc Option medium | Thermo Fisher Scientific | 10373-017 | iMEM |
| Incubation chamber | Cosmo Bio | 10DO | For immunostaining of aggregates |
| Latex Examination Gloves | Adachi | ||
| MAS coated slide glass | Matsunami Glass | 83-1881 | For immunostaining of aggregates |
| MicroAmp Fast 96-well Reaction Plate | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | 4346907 | For RT-qPCR |
| Microscope | Olympus | CKX41N-31PHP | For cell culturing |
| Microtube | Watoson | 131-515CS | |
| Monoclonal Anti-α-Fetoprotein | SIGMA | A8452 | Anti-AFP, × 1/200 dilution |
| Nanodrop 8000 | Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Oligo dT | FASMAC | Custom made Oligo | For RT-qPCR of sequence is "TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT" |
| Paraformaldehyde, powder | Nacalai tesque | 26126-54 | PFA, fixative, diluted in DPBS |
| Pharmaceutical refrigerator | SANYO | MPR-514 | For 4 °C storing |
| PIPETMAN P | GILSON | Pipette | |
| Recombinant Human KGF/FGF-7 | R&D Systems | 251-KG | KGF |
| Recombinant Human Noggin | PeproTech | 120-10C | NOGGIN |
| Recombinant Human/Mouse/Rat Activin A | R&D Systems | 338-AC | Activin A |
| ReverTra Ace (100 U/μL) | TOYOBO | TRT-101 | For RT-qPCR |
| RNase-free DNase Set (50) | QIAGEN | 79254 | For RT-qPCR |
| RNeasy Mini Kit | QIAGEN | 74104 | For RT-qPCR |
| RPMI 1640 with L-Gln | Nacalai tesque | 30264-85 | RPMI 1640 |
| Sealing Film for Real Time | Takara | NJ500 | For RT-qPCR |
| Serological pipettes 10 mL | Costar/Corning | 4488 | For cell culturing |
| Serological pipettes 25 mL | Costar/Corning | 4489 | For cell culturing |
| Serological pipettes 5 mL | Costar/Corning | 4487 | For cell culturing |
| Sox2 (D6D9) XP Rabbit mAb | Cell signaling | 3579S | Anti-SOX2, × 1/200 dilution |
| StepOnePlus | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Sucrose | Nacalai tesque | 30406-25 | For immunostaining of aggregates |
| TB Green Premix Ex Taq II |
Takara | RR820B | For RT-qPCR |
| TC20 Automated Cell Counter | BIO-RAD | 1450101J1 | Automatic cell counter |
| Tissue-Tek OCT compound 4583 | Sakura Finetechnical | 4583 | For immunostaining of aggregates |
| Tissue-Tek Cryomold Molds/Adapters | Sakura Finetechnical | 4566 | For immunostaining of aggregates |
| Triton X-100 | Nacalai tesque | 35501-15 | |
| Trypan Blue | BIO-RAD | 1450021 | |
| Ultracold freezer | SANYO | MDF-U33V | For -80 °C storing |
| UltraPure 0.5M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher Scientific | 15575-038 | Dilute with DPBS to prepare 0.5 mM EDTA |
| Veriti Thermal Cycler | Applied Biosystems/Thermo Fisher Scientific | For RT-qPCR | |
| Y-27632 | Wako | 251-00514 |
References
- D'Amour, K. A., et al. Production of pancreatic hormone-expressing endocrine cells from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 24 (11), 1392-1401 (2006).
- Pagliuca, F. W., et al. Generation of functional human pancreatic beta cells in vitro. Cell. 159 (2), 428-439 (2014).
- Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
- Kondo, Y., Toyoda, T., Inagaki, N., Osafune, K. iPSC technology-based regenerative therapy for diabetes. Journal of Diabetes Investigation. 9 (2), 234-243 (2017).
- Millman, J. R., et al. Generation of stem cell-derived beta-cells from patients with type 1 diabetes. Nature Communications. 7, 11463 (2016).
- Zeng, H., et al. An Isogenic Human ESC Platform for Functional Evaluation of Genome-wide-Association-Study-Identified Diabetes Genes and Drug Discovery. Cell Stem Cell. 19 (3), 326-340 (2016).
- Hosokawa, Y., et al. Insulin-producing cells derived from 'induced pluripotent stem cells' of patients with fulminant type 1 diabetes: Vulnerability to cytokine insults and increased expression of apoptosis-related genes. Journal of Diabetes Investigation. , (2017).
- Jennings, R. E., et al. Development of the human pancreas from foregut to endocrine commitment. Diabetes. 62 (10), 3514-3522 (2013).
- Jorgensen, M. C., et al. An illustrated review of early pancreas development in the mouse. Endocrine Reviews. 28 (6), 685-705 (2007).
- Jensen, J. Gene regulatory factors in pancreatic development. Developmental Dynamics. 229 (1), 176-200 (2004).
- Hald, J., et al. Generation and characterization of Ptf1a antiserum and localization of Ptf1a in relation to Nkx6.1 and Pdx1 during the earliest stages of mouse pancreas development. Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 56 (6), 587-595 (2008).
- Villasenor, A., Chong, D. C., Henkemeyer, M., Cleaver, O. Epithelial dynamics of pancreatic branching morphogenesis. Development. 137 (24), 4295-4305 (2010).
- Serup, P., et al. The homeodomain protein IPF-1/STF-1 is expressed in a subset of islet cells and promotes rat insulin 1 gene expression dependent on an intact E1 helix-loop-helix factor binding site. Biochemical Journal. 310 (Pt 3), 997-1003 (1995).
- Riedel, M. J., et al. Immunohistochemical characterisation of cells co-producing insulin and glucagon in the developing human pancreas. Diabetologia. 55 (2), 372-381 (2012).
- Mae, S. I., et al. Monitoring and robust induction of nephrogenic intermediate mesoderm from human pluripotent stem cells. Nature Communications. 4, 1367 (2013).
- Toyoda, T., et al. Cell aggregation optimizes the differentiation of human ESCs and iPSCs into pancreatic bud-like progenitor cells. Stem Cell Research. 14 (2), 185-197 (2015).
- Toyoda, T., et al. Rho-Associated Kinases and Non-muscle Myosin IIs Inhibit the Differentiation of Human iPSCs to Pancreatic Endoderm. Stem Cell Reports. 9 (2), 419-428 (2017).
- Chen, K. G., Mallon, B. S., McKay, R. D., Robey, P. G. Human pluripotent stem cell culture: considerations for maintenance, expansion, and therapeutics. Cell Stem Cell. 14 (1), 13-26 (2014).
- Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
- Nguyen, Q. H., et al. Single-cell RNA-seq of human induced pluripotent stem cells reveals cellular heterogeneity and cell state transitions between subpopulations. Genome Research. 28 (7), 1053-1066 (2018).
- Narsinh, K. H., et al. Single cell transcriptional profiling reveals heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Journal of Clinical Investigation. 121 (3), 1217-1221 (2011).
- Rosowski, K. A., Mertz, A. F., Norcross, S., Dufresne, E. R., Horsley, V. Edges of human embryonic stem cell colonies display distinct mechanical properties and differentiation potential. Scientific Reports. 5, 14218 (2015).
- Torres-Padilla, M. E., Chambers, I. Transcription factor heterogeneity in pluripotent stem cells: a stochastic advantage. Development. 141 (11), 2173-2181 (2014).
- Cahan, P., Daley, G. Q. Origins and implications of pluripotent stem cell variability and heterogeneity. Nature Reviews Molecular and Cell Biology. 14 (6), 357-368 (2013).
- Chetty, S., et al. A simple tool to improve pluripotent stem cell differentiation. Nature Methods. 10 (6), 553-556 (2013).
- Kimura, A., et al. Small molecule AT7867 proliferates PDX1-expressing pancreatic progenitor cells derived from human pluripotent stem cells. Stem Cell Research. 24, 61-68 (2017).
- Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. Journal of Visualized Experiments. (91), e52010 (2014).
- Honvo-Houeto, E., Truchet, S. Indirect Immunofluorescence on Frozen Sections of Mouse Mammary Gland. Journal of Visualized Experiments. (106), (2015).
- Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
- Kajiwara, M., et al. Donor-dependent variations in hepatic differentiation from human-induced pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Science U S A. 109 (31), 12538-12543 (2012).
- Kikuchi, T., et al. Human iPS cell-derived dopaminergic neurons function in a primate Parkinson's disease model. Nature. 548 (7669), 592-596 (2017).
- Suemori, H., et al. Efficient establishment of human embryonic stem cell lines and long-term maintenance with stable karyotype by enzymatic bulk passage. Biochemical and Biophysical Research Communication. 345 (3), 926-932 (2006).
- Gage, B. K., Webber, T. D., Kieffer, T. J. Initial cell seeding density influences pancreatic endocrine development during in vitro differentiation of human embryonic stem cells. PLoS One. 8 (12), e82076 (2013).
- Nostro, M. C., et al. Efficient generation of NKX6-1+ pancreatic progenitors from multiple human pluripotent stem cell lines. Stem Cell Reports. 4 (4), 591-604 (2015).
- Jonsson, J., Carlsson, L., Edlund, T., Edlund, H. Insulin-promoter-factor 1 is required for pancreas development in mice. Nature. 371 (6498), 606-609 (1994).
- Kelly, O. G., et al. Cell-surface markers for the isolation of pancreatic cell types derived from human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 29 (8), 750-756 (2011).
- Hohwieler, M., et al. Human pluripotent stem cell-derived acinar/ductal organoids generate human pancreas upon orthotopic transplantation and allow disease modelling. Gut. 66 (3), 473-486 (2017).
- Takeuchi, H., Nakatsuji, N., Suemori, H. Endodermal differentiation of human pluripotent stem cells to insulin-producing cells in 3D culture. Scientific Reports. 4, 4488 (2014).
