Summary
نقدم هنا، بروتوكولا لتصور الخلايا المناعية جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الكولاجين (3D) ثلاثي الأبعاد باستخدام ضوء ورقة الفحص المجهري. ويفصل هذا البروتوكول أيضا كيفية تعقب الهجرة الخلية في 3D. ويمكن استخدام هذا البروتوكول لأنواع أخرى من الخلايا تعليق في مصفوفة ثلاثية الأبعاد.
Abstract
في فيفووالتنشيط وانتشار ووظيفة كل الخلايا المناعية تحدث في بيئة (3D) ثلاثي الأبعاد، على سبيل المثال في الغدد الليمفاوية أو الأنسجة. حتى الآن، تعتمد معظم أنظمة في المختبر على ثنائي الأبعاد (2D) السطوح، مثل لوحات زراعة الخلايا أو كوفيرسليبس. لتقليد أمثل الظروف الفسيولوجية في المختبر، فنحن نستخدم مصفوفة الكولاجين 3D بسيطة. الكولاجين هو أحد المكونات الرئيسية للمصفوفة خارج الخلية (ECM)، وقد استخدمت على نطاق واسع لتشكل مصفوفة ثلاثية الأبعاد. لتصوير ثلاثي الأبعاد، ظهرت التكنولوجيا المتقدمة مؤخرا ورقة الضوء مجهرية (المشار إليها أيضا كطائرة واحدة إضاءة مجهرية) مع اكتساب عالية السرعة وعمق اختراق كبير وتبيض منخفضة وفوتوسيتوتوكسيسيتي. وعلاوة على ذلك، ورقة الخفيفة الميكروسكوب مفيد خاصة لقياس المدى الطويل. هنا يصف لنا بروتوكولا أمثل كيفية إعداد والتعامل مع الخلايا المناعية البشرية، مثل الابتدائي البشرية السامة للخلايا T لمفاوية (CTL) وخلايا القاتل الطبيعي (ناغورني كاراباخ) في المصفوفة الكولاجين 3D للاستخدام مع ورقة الضوء مجهرية لتصوير الخلايا الحية و نماذج ثابتة. وترد الإجراءات المتعلقة بالحصول على الصور وتحليل الهجرة الخلية. ويرد تركيز بصفة خاصة لتسليط الضوء على الخطوات الحاسمة وعوامل لإعداد العينات وتحليل البيانات. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لأنواع أخرى من الخلايا تعليق في مصفوفة الكولاجين ثلاثي الأبعاد، ولا يقتصر على الخلايا المناعية.
Introduction
معظم المعارف حول ترحيل الخلايا يأتي من تجارب 2D1،2،3، التي تجري عادة في الزجاج أو سطح البلاستيك الثقافة/التصوير الطبق. ومع ذلك، يتطلب سيناريو فسيولوجية، في معظم الحالات، المكروية 3D، الذي المصفوفة خارج الخلية (ECM) يلعب دوراً حاسما. إدارة المحتوى في المؤسسة ليس فقط يوفر هيكل ثلاثي الأبعاد الأساسية للحفاظ على مورفولوجيا الخلايا السليمة ولكن يقدم أيضا إشارات البقاء على قيد الحياة أو إشارات الاتجاه الأداء الأمثل للعديد من الخلايا4،5 . ولذلك، مطلوب بيئة ثلاثية الأبعاد تحديد أفضل الوظائف الخلوية والسلوك في بيئة أفضل مما يعكس السياق الفسيولوجية.
في الجسم البشري، ومعظم الخلايا خاصة الخلايا المناعية، ممارسة وظائفهم بموجب سيناريو 3D. على سبيل المثال، تنشيط خلايا تي دوريات الأنسجة البحث عن الخلايا الهدف، وترحيل السذاجة تي الخلايا عن طريق الغدد الليمفاوية في البحث عن خلاياها المشابهة مستضد-عرض خلالها وضع الهجرة والآلات يتم تكييفها للمقابلة خارج الخلية البيئة3،،من67. جل الكولاجين 3D قد استخدمت على نطاق واسع كخلية 3D راسخة وجيدة تتسم ثقافة نظام8،9،10. أعمالنا السابقة يظهر أن الخلايا الليمفاوية البشرية الأولية كثيري التنقل والهجرة بسرعة متوسط من حوالي 4.8 ميكرومتر/دقيقة في مصفوفة المستندة إلى الكولاجين 0.25%11. إعادة ترتيب cytoskeleton دوراً رئيسيا في هجرة الخلية12. تتراكم الأدلة تبين أن الخلايا الليمفاوية لا تنطبق إلا في وضع واحد للهجرة حتى الآن يمكنك التبديل بين سلوك معين الهجرة اعتماداً الموقع، المكروية، السيتوكينات، والتدرجات chemotactic، وخارج الخلية الإشارات التي تصل قيمتها المهاجرة من السلوك في طرق مختلفة 3.
لتحليل موثوق وظائف الخلايا المناعية والسلوك، على سبيل المثال، الهجرة، وتشكيل نتوء أو النقل حويصلية، أنها ميزة كبيرة لتكون قادرة على الحصول على الصور بأحجام كبيرة نسبيا 3D بطريقة سريعة وموثوق بها. ويوفر التكنولوجيا المتقدمة مؤخرا ورقة الضوء مجهرية (المشار إليها أيضا كطائرة واحدة إضاءة مجهرية) لتصوير ثلاثي الأبعاد،13،حل مرض14. أثناء التصوير اقتناء، يتم إنشاء ورقة خفيفة ثابتة رقيقة لإلقاء الضوء على العينة. وبهذه الطريقة، على متن الطائرة التركيز، يمكن مضيئة مساحة كبيرة في وقت واحد دون التأثير على الخلايا خارج الطائرة. تمكن هذه الميزة بسرعة اقتناء عالية مع انخفاض شديد تبيض وفوتوسيتوتوكسيسيتي. في هذه الورقة، ونحن تصف كيفية تصور الخلايا المناعية البشرية الأولية باستخدام ضوء ورقة الفحص المجهري وكيفية تحليل الهجرة في سيناريو 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
البحوث التي أجريت لهذه الدراسة مع المواد البشرية (الكريات البيض دوائر نظام الحد من المتبرعين بالدم البشري) وقد أذنت لجنة الأخلاقيات المحلية (إعلان من 16.4.2015 (84/15؛ الأستاذ الدكتور رتيغ-Stürmer)) وفيما يلي المبادئ التوجيهية المناظرة.
1-إعداد حل معادلتها الكولاجين (500 ميليلتر)
- نقل 400 ميليلتر الكولاجين المبردة حل الأسهم (10.4 ملغم/مل) إلى أنبوب معقم 1.5 مل تحت غطاء الثقافة الخلية. ببطء بإضافة 50 ميليلتر من المبرد 10 x PBS (pH 7.0-7.3) إلى 400 ميليلتر من حل الأسهم الكولاجين المبردة. مزيج الحل قبل التبليط الأنبوب بلطف.
ملاحظة: جميع الخطوات في الجزء 1، وينبغي أن يتم تحت غطاء ثقافة خلية. - إضافة 8 ميليلتر من 0.1 M هيدروكسيد الصوديوم في 500 ميليلتر من الحل الكولاجين من 1.1. لضبط درجة الحموضة إلى 7.2-7.6. استخدام شرائط اختبار درجة الحموضة (الأس الهيدروجيني النطاق: 6-10) لتحديد قيمة pH الخليط.
ملاحظة: قد تختلف أحجام لمجموعات مختلفة من الكولاجين. وقد حل هيدروكسيد الصوديوم لتكون مختلطة ببطء لتجنب فقاعات الهواء. ينبغي أن يوضع هذا الخليط على الجليد لتجنب جيليشن الكولاجين. - إضافة 2 ميليلتر من ddH العقيمة2س جعل وحدة التخزين النهائي إلى 500 ميليلتر. مزيج جيد وتخزين هذا الحل الكولاجين (8.32 مغ/مل) على الجليد أو عند 4 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
ملاحظة: تحت هذا الشرط، الكولاجين معادلتها يمكن استخدامها ل 24 h. لا ينصح مختبرين لتجنب فقاعات الهواء.
2-نموذج إعداد Fluorescence الضوء-ورقة الفحص المجهري باستخدام الشعيرات الدموية
- فلوريسسينتلي تسمية الخلايا الحية من اهتمام بالأصباغ الفلورية الأساسي المطلوب15 أو بروتينات الفلورسنت11 كما هو موضح سابقا.
- نقل 1 × 106 خلايا في أنبوب معقم 1.5 مل تحت غطاء ثقافة خلية. الطرد المركزي الأنبوب في ز 200 x للدقيقة 8 تجاهل المادة طافية وريسوسبيند بيليه في 200 ميليلتر من مستنبت.
ملاحظة: يوصي بكثافة الخلية 5 × 106 خلايا/مل للتصور للهجرة الخلية المناعية البشرية، خاصة بالنسبة اللمفاويات T السامة للخلايا (CTL) والخلايا القاتلة الطبيعية (ناغورني كاراباخ). - إضافة ميليلتر 85.9 الحل الكولاجين معادلتها من 1.3. في تعليق خلية من 2.2. والمزيج بشكل صحيح للوصول إلى تركيز الكولاجين من 2.5 ملغ/مل. اترك هذا المزيج خلية/الكولاجين على الجليد في غطاء محرك السيارة.
ملاحظة: لنفترض أن المطلوب تركيز الكولاجين ن مغ/مل، تحييد الحجم محلول الكولاجين (لتعليق خلية ميليلتر 200) = 200 × ن/(8.32-N) - المقبل، وضع المكبس مطابقة شعري (القطر الداخلي ~ 1 مم) حتى 1 مم من شعري المكبس. ويت المكبس بغمس في الثقافة المتوسطة (الشكل 1A).
ملاحظة: يمكن أن تساعد هذه الخطوة منع فقاعات الهواء عندما يتم انخفض شعري في مزيج خلية/الكولاجين. لم يكن لديك الشعرية والمكبس أن تكون عقيمة. - وتراجع شعري في مزيج خلية/الكولاجين من 2.3. ببطء سحب المكبس مرة أخرى عن 10-20 ملم (الشكل 1B). مسح الجدار الخارجي لشعري بمنشفة ورقية مبلل برذاذ الإيثانول 70% لإزالة الحل الكولاجين المتبقية.
- جبل شعري مع نمذجة الطين على الجدار الداخلي لأنبوب 5 مل ودفع هذا المزيج خلية/الكولاجين إلى حافة الشعرية (الشكل 1).
- الحفاظ شعري في 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لح 1 للكولاجين البلمرة.
- إضافة الثقافة المتوسطة (حوالي 1-2 مل) إلى أنبوب 5 مل. اضغط قضيب الكولاجين مبلمرة بها بعناية في المتوسط إلى حوالي 3/4 الكولاجين شنقاً في الأجل المتوسط (الشكل 1).
- تبقى الشعرية، مثل هذه، على 37 درجة مئوية مع 5% CO2 لآخر 30 دقيقة حجته على قضيب الكولاجين مع المتوسط.
ملاحظة: بعد ذلك، رود الكولاجين يمكن سحب مرة أخرى إلى الشعرية ومثقف آخر قبل استخدامها مرة أخرى.
3-صورة اقتناء استخدام الضوء-ورقة الفحص المجهري
- الجمعية قاعة العينة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.
- قم بتشغيل في الحضانة والمجهر لتسخين غرفة العينة إلى 37 درجة مئوية (بالنسبة للخلية الحية التصوير فقط).
- شعري في قاعة عينة وتحديد موقع عينة لإيجاد مجال الاهتمام للحصول على الصور.
- تنشيط laser(s) المقابلة. تعيين الإعدادات التالية: ليزر للسلطة، وزمن التعرض للضوء، خطوة-حجم المكدس z، وبداية ونهاية الموقف z-المكدس، والفاصل الزمني لتصوير الخلايا الحية.
ملاحظة: على سبيل المثال، العينة في الشكل 2 تم تصويرها كل 40 ثانية ح 6 في 37 درجة مئوية مع خطوة-حجم 1 ميكرومتر (مجموع سمك: ميكرومتر 538). وكان قوة الليزر 1% مع وقت تعرض للسيدة 30 حجم بكسل في اتجاه x-y ميكرومتر 0.23. - ابدأ الحصول على الصور.
4-تتبع التحليل الآلي
- فتح الملف المحول، انقر فوق إضافة ملفات اختيار ملفات التصوير ليتم تحويلها إلى تنسيق ملف برنامج (*.ims). انقر فوق استعراض ، وحدد مجلد الذي تريد حفظ الملفات المحولة. انقر فوق بدء تشغيل كافة.
- فتح برنامج التحليل. انقر فوق تجاوز. انتقل إلى الملف وانقر فوق فتح، ثم اختر ملف التصوير يتم تحليلها.
ملاحظة: إذا كان حجم الملف كبير هذه الخطوة قد يستغرق الوقت. ملفات أكبر من 1 تيرابايت (TB) لا ينصح لتجربة واحدة كالعملية مثل هذه الملفات الكبيرة هي القدرة الحسابية عاليا مطالبين. - انقر فوق إضافة مواقع جديدة. تحقق من مربع العملية كامل الصورة أخيرا. انقر فوق التالي.
- أدخل إحداثيات x و y (بكسل) لتعريف منطقة الاهتمام. أدخل عدد الإطارات (الوقت والموقف z) لتحليل. انقر فوق التالي.
- قم بتحديد القناة المستهدفة، التي تحتوي على كائنات لتعقب، في القائمة المنسدلة قناة المصدر. أدخل المقدرة xy القطر (ميكرومتر). انقر فوق التالي.
ملاحظة: xy يقدر قطرها هو قطر متوسط في البعد س ص للكائنات لتعقب. - انقر فوق جودة. ولقد حددت عتبة، معظم الخلايا (كائنات) التي ينبغي أن تدرج. انقر فوق التالي.
- اختيار خوارزمية المطلوبالحركة أوتوريجريسيفي (مستحسن). أدخل المسافة كحد أقصى20 ميكرومتر (مستحسن)، وحجم الفجوة ماكس (3 أو 2 هو مستحسن). انقر فوق الصورة كامل عملية أخيرا.
ملاحظة: المسافة ماكس و الحد الأقصى لحجم الفجوة عتبات اثنين للخروج من المسارات. وبشكل أكثر تحديداً، في إطارين المستمر عندما يتجاوز المسافة بين نفس الكائن مسافة ماكس، هذا الكائن في الإطار لاحقاً سينظر ككائن جديد. في بعض الأحيان من خلال اقتناء، قد تختفي إطارات قليلة نفس الكائن وتظهر مرة أخرى. في هذه الحالة، إلا عندما يظهر هذا الكائن داخل الحد الأقصى لحجم الفجوة، سيتم اعتبار نفس الكائن. - انقر فوق نوع عامل التصفية واختر خيار استبعاد المسارات غير مرغوب فيها.
ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية. - انقر فوق التالي ومن ثم انقر فوق إنهاء.
ملاحظة: هذه الخطوة يمكن أن يستغرق ساعات حتى أيام اعتماداً على أداء الكمبيوتر. - انقر فوق تحرير المسارات واختر الانجراف الصحيح. حدد الخوارزمية المناسبةالانجراف متعدية الجنسيات (مستحسن). حدد المطلوب نتيجة Dataset الحجم (الحجم الجديد مساوياً "الحجم الحالي" مستحسن). انقر فوق "موافق".
ملاحظة: هذه الخطوة فقط المطلوبة عند الكولاجين جنحت أثناء الحصول على الصور. - انقر فوق إحصائيات واختر قائمة قيم إحصاءات تظهر تكوين. تحقق من خيارات المصلحة أن يكون تصدير (مثلاً إحداثيات والسرعة وهلم جرا). انقر فوق "موافق".
- انقر فوق تصدير جميع الإحصاءات إلى الملف وقم بإدخال اسم ملف.
5-التثبيت والفلوره تلطيخ الخلايا في مصفوفات الكولاجين
- نقل 1,000 ميليلتر من بارافورمالدهيد 4% (منهاج العمل، في برنامج تلفزيوني) في أنبوب 5 مل تحت غطاء كيميائية.
ملاحظة: ينبغي أن يكون متوازنا منهاج عمل بيجين إلى درجة حرارة الغرفة. - تراجع شعري مع الكولاجين مبلمرة من 2.9. إلى حل منهاج العمل (ل ~ 5 مم) وجبل شعري على الجدار الداخلي للأنبوبة 5 مل مع نمذجة الطين (كما هو موضح في الشكل 1).
- اضغط المكبس بلطف حتى نصف قضيب الكولاجين هو معلق في حل منهاج العمل (الشكل 1). إبقاء الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
- سحب المكبس للحصول على قضيب الكولاجين داخل شعري. إخراج الشعرية وتجاهل منهاج عمل بيجين.
- جبل شعري في أنبوب جديد وإضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني. تأكد من أن الشعرية هي مغمورة في برنامج تلفزيوني.
- اضغط المكبس بلطف حتى نصف قضيب الكولاجين هو معلق في الحل. جبل شعري على الجدار الداخلي مع نمذجة الطين.
- إبقاء الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- كرر 5.4. -5.7 لآخر 2 مرات.
- سحب المكبس للحصول على قضيب الكولاجين داخل شعري. تجاهل برنامج تلفزيوني. نقل 1-2 مل من حجب permeabilization المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني + جيش صرب البوسنة 1-% 0.1% الفاعل غير الأيونية) في الأنبوب وكرر 5.6.
ملاحظة: يمكن استبدال جيش صرب البوسنة (1%) بالمصل 5% الحيوان Ab الثانوي قد أثيرت في. - إبقاء الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 30-60 دقيقة.
- سحب المكبس للحصول على قضيب الكولاجين داخل شعري. تجاهل المخزن المؤقت بيرميبيليزيشن. نقل 200-500 ميليلتر من جسم الأولية في المخزن المؤقت لمنع بيرميبيليزيشن ويطرد القضيب في الحل.
- إبقاء الأنبوب في درجة حرارة الغرفة ح 1.
- أغسل رود الكولاجين 3 مرات مع ببست (برنامج تلفزيوني + الفاعل غير الأيونية نسبته 0.1 في المائة) كما هو موضح في 5-4. -5.8.
- احتضان القضيب في جسم الثانوية في حجب permeabilization المخزن المؤقت لح 1 في درجة حرارة الغرفة. الحفاظ عليه من الضوء.
- أغسل رود الكولاجين 3 مرات مع برنامج تلفزيوني كما هو موضح في 5-4. -5.8.
- سحب المكبس للحصول على قضيب الكولاجين داخل شعري. الاحتفاظ العينات في برنامج تلفزيوني حتى التصوير.
- مسح العينات كما هو موضح في 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تشكيل نتوء أثناء الهجرة الخلية T هو عملية ديناميكية للغاية، واكتين تعتمد. تصور تشكيل نتوء CTL البشرية الأساسية، ونحن transfected عابر بروتين ميجفب تنصهر بتسمية cytoskeleton أكتين في CTL كما هو موضح قبل11. تعداء، بعد يوم واحد من الخلايا تم تضمينها في مصفوفة الكولاجين. رصات الصور اقتنيت كل 40 s مع خطوة-حجم 1 ميكرومتر في 37 درجة مئوية باستخدام ضوء ورقة الفحص المجهري. كما هو مبين في الشكل 2 ألف و التكميلية الفيلم 1، أثناء الهجرة، شكل CTL الإنسان نتوءات الرئيسية على شكل الليمون، مهدب بهياكل تشبه المغزل غرامة. في التجربة المعروضة هنا، ليس فقط واحدة تم تصويرها خلية واحدة فقط ولكن حجم كبير (450 × 450 × 538 ميكرومتر3) (الشكل 2). وهكذا، تم الحصول على الجودة البصرية والقرار المعروض هنا ذات هدف تضخم منخفضة (20 س/1.0 DIC تجاه الأشعة تحت الحمراء). ولذلك، يمكن زيادة تحسين القرار مع أهداف نا أعلى.
في هذه التجربة هو مبين في الشكل 2 و 1 الفيلم، تم تعقبها CTLs تلقائياً كما هو موضح في البروتوكول جزء 4. ويرد في الشكل 2مسارات CTL. حللت معلمتين من الهجرة: السرعة والثبات. ويعرف استمرار تشريد مقسوماً على طول المسار الكلي. ويبين التحليل أن تنقل CTL متنوعة جداً في 3D: السرعات تتراوح بين 0.01-0.19 ميكرومتر/s مع وجود فرق برنامج تقريبا، ويتراوح 0-استمرار 0.7 (الشكل 2). أفيد في الفئران أنه في فيفو الهجرة فراغي متوسط سرعة خلايا تي 4 ميكرومتر في الدقيقة16. في الآونة الأخيرة، لقد حددنا متوسط سرعة CTL لتكون 4-5 ميكرومتر في الدقيقة11 باستخدام الأساليب الموضحة في هذه الورقة. هذه النتائج تثبت أن الفحص المجهري ورقة الضوء أداة قوية لتصور سلوك الخلية، على سبيل المثال، الخلية الهجرة والتفاعل خلية خلية. في فيفو، العديد من العوامل ومن إدارة المحتوى في المؤسسة غير متجانسة من تركيبة معقدة بما في ذلك القابلة للذوبان من العوامل التي يمكن أن تؤثر على الهجرة سوف تعديل سلوك الخلية T.
لا يقتصر تطبيق مصفوفة الكولاجين العيش الخلايا. يمكن أيضا إجراء التثبيت وإيمونوستينينج في المصفوفة. ويبين الشكل 3 مثال على عينات ثابتة في جل الكولاجين 3D، في التي perforin1 الذاتية (PFN1) وتم الأكتين الملون. كانت مضاءة العينة أما من جانب واحد (واحد إلى الإضاءة الجانبية) أو من كلا الجانبين (إضاءة الجانب المزدوج). ونلاحظ أن الخلايا في z-مواقف مختلفة ملطخة بالتساوي، مشيراً إلى أن الإجراءات المذكورة في البروتوكول لنا تحقيق اختراق مرضية من الأجسام المضادة في الهلام الكولاجين. الأهم من ذلك، بعد تثبيت CTL معارضها مورفولوجية نفسه كما هو الحال في العيش تصوير الخلية (قارن الشكل 3 و الشكل 2B)، مما يدل أيضا المورفولوجيا أيضا الإبقاء على بموجب هذا البروتوكول. وبالإضافة إلى ذلك، لا تجعل الإضاءة من جانب واحد أو من كلا الجانبين اختلاف كبير في جودة الصور في المستوى البؤري. وبالنظر إلى أن أقل منطقة معرضة الليزر مع وضع إنارة جانب واحد مقارنة بإضاءة الجانب المزدوج، ينصح أكثر إنارة وحيدة الجانب.
رقم 1: رسم توضيحي لمعالجة الشعيرات الدموية خلال إعداد عينة- (أ) وضع المكبس الشعرية وكيفية الرطب المكبس مع المتوسط الثقافة. (ب) سحب المزيج خلية/الكولاجين إلى شعري. (ج) جبل الشعيرات الدموية باستخدام الطين النمذجة. ويرد المكبس وقضيب الكولاجين في مربعات رمادية وحمراء، على التوالي. (د) التعامل مع رود الكولاجين للموازنة مع متوسط الثقافة أو إيمونوستاينينج. ويرد المكبس وقضيب الكولاجين في مربعات رمادية وحمراء، على التوالي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تتبع CTL البشرية الأولية في الكولاجين ثلاثية الأبعاد وتصور ديناميات أكتين- (أ) الحد الأقصى كثافة الإسقاط من الأكتين في CTL البشرية الأساسية. وكان يسمى أكتين في CTL كما هو موضح سابقا11. بعد يوم واحد تعداء الخلايا كانت جزءا لا يتجزأ من مصفوفة الكولاجين 0.5%. يظهر الخلية ممثل واحد. أشرطة مقياس غرامة أكتين هياكل ميكرومتر. 5 على حافة نتوء يلقي الضوء على رأس السهم. (ب) مسارات CTL ح 6. يتم تعقب المسارات أوتوماتيدلي بواسطة البرنامج (لون رمز: الأزرق = البدء، أحمر = نهاية المسار، 450 × 450 × 538 ميكرومتر المجلد3 ). هو شريط مقياس 50 ميكرومتر. (ج) التحديد الكمي للسرعة والثبات. ويمثل نقطة واحدة خلية واحدة. يتم إظهار النتائج كما يعني ± ووزارة شؤون المرأة من المانحين 4. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: إيمونوستينينج profilin1 الذاتية (PFN1) واكتين في CD8+ تي الخلايا المضمنة في مصفوفة 3D الكولاجين. CD8 البشرية الأولية+ تي الخلايا كانت جزءا لا يتجزأ من الكولاجين 0.25%. بعد تثبيت منهاج عمل بيجين كان الملون العينة باستخدام مكافحة--PFN1 (برتقالي) وفالويدين (أرجواني) وتصور بالفحص المجهري الضوء-ورقة بحجم خطوة من 1 ميكرومتر لإجمالي حجم 440 × 440 × 1,000 ميكرومتر3. كانت مضاءة العينة أما من جانب واحد (واحد إلى الإضاءة الجانبية) أو من كلا الجانبين (إضاءة الجانب المزدوج). تظهر الإسقاطات أقصى شدتها (MIP) من إعادة البناء ثلاثي الأبعاد. هي أشرطة مقياس 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الفيلم 1: جيل نتوءات أثناء الهجرة الخلية تي- الخلية تظهر في الفيلم مأخوذة من وحدة التخزين هو مبين في الشكل 2 ألف. كانت الخلايا المضمنة في مصفوفة الكولاجين (0.5%). الصور تم الحصول عليها كل 40 s ح 6 في 37 درجة مئوية باستخدام ضوء ورقة الفحص المجهري. من فضلك انقر هنا لمشاهدة هذا الفيديو. (انقر بالزر الأيمن التحميل.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تنفذ معظم فحوصات في المختبر على سطح ثنائي الأبعاد، على سبيل المثال في خلية ثقافة لوحات، أطباق بتري، أو في كوفيرسليبس، بينما في فيفو الخلايا، لا سيما الخلايا المناعية، تجربة معظمه المكروية 3D. ظهور أدلة تبين أن أنماط الهجرة من الخلايا المناعية تختلف بين 2D و 3D سيناريوهات17. وعلاوة على ذلك، كما تختلف ملامح التعبير للخلايا السرطانية في 2D و 3D استزراع الأنسجة18،،من1920. ولذلك، لمحاكاة أفضل الظروف الفسيولوجية في المختبر، أنها لميزة كبيرة للقيام بتجارب في سياق ثلاثية الأبعاد، على سبيل المثال في مصفوفات الكولاجين 3D. تمكن نهج وضعت حديثا، على وجه الخصوص، مجهرية ورقة الضوء الفلورية، تجارب موثوقة واستنساخه في نظم مصفوفة ثلاثية الأبعاد في ظل الظروف البيئية التي تسيطر عليها.
على النقيض من تقليدية مسح ليزر [كنفوكل] الفحص المجهري الذي ينير التحقيق كله، مع ورقة الضوء مجهرية، يتم إنشاؤها فقط ورقة رقيقة من ضوء الليزر لإلقاء الضوء على عينات. الكشف عن الكاميرا عمودي على الطائرة مضيئة. نظراً لهذا الأسلوب، يتعرض القسم فقط في المستوى البؤري الليزر. ولذلك، يمكن تقليل تبييض الصورة والضيائيه. وبالإضافة إلى ذلك، مقارنة بمسح نقطة الفحص المجهري، معدل اقتناء تتعزز جذريا مع ورقة الضوء مجهرية (100-أسرع 1,000-fold) وهي أيضا تحسن نسبة الإشارة إلى الضجيج. جنبا إلى جنب مع غرفة الحضانة لإعداد ورقة الخفيفة الميكروسكوب المستخدمة في هذه الورقة هذا المجهر خياراً قويا لاقتناء كميات كبيرة ثلاثية الأبعاد مع تبيض مصغر الصورة وصور-الضرر على مدى فترات طويلة من الوقت (عدة أيام) تحت شروط الحاضنة.
لإعداد نموذج مع مصفوفة 3D الكولاجين، النقطة الحرجة معظم تجنب فقاعات الهواء. نظراً لأن اللزوجة عالية، عندما يتم إدخال فقاعات الهواء إلى الحل الكولاجين أنه من الصعب جداً إزالتها من الحل. وجود فقاعات الهواء يمكن أن يستحث التغايرية بلمرة لمصفوفة الكولاجين؛ وباﻹضافة إلى ذلك، فإنه يمكن منع مسار الضوء، والتي سوف يقلل من جودة الصور. ولذلك، عند نقل أو مزيج الكولاجين حل واحد يجب أن "الماصة؛" جداً بلطف وعدم طرد آخر قطره في تلميح ماصة. وعلاوة على ذلك، يبدأ الكولاجين بلمرة ببطء في درجة حرارة الغرفة. وهكذا، لمنع البلمرة قبل الاختلاط الحل جيد، الأنابيب المحتوية على الكولاجين دائماً يوضع على الجليد.
أحد التحديات الكبيرة التي نواجهها في توظيف الضوء-ورقة الفحص المجهري معالجة البيانات. البيانات التي تنتجها الورقة الخفيفة الميكروسكوب يمكن الوصول بسهولة إلى حجم 500 غيغا بايت أو حتى عدة تيرابايت، وبخاصة لإجراء التجارب على المدى الطويل. لتحليل هذه البيانات يستغرق عدة أيام، في بعض الأحيان تصل إلى أسبوع قبل محطة عمل مع حساب عالية القدرة. قدرة التخزين بسرعة نظراً لحجم الصور تم تحليلها ليس أصغر من البيانات الأصلية يمكن أن تصبح عاملاً مقيداً لتطبيق الفحص المجهري الورقة الضوء. ولذلك، لتجارب التعقب أو إذا كانت هناك حاجة إلى تحليل الصور المعقدة المستحسن جداً للحد من حجم الملف كل تجربة للقيم التي يمكن التعامل معها في غضون فترة زمنية معقولة بوحدات المعالجة المتاحة.
وقد مجهرية الفلورية الضوء-ورقة عرض هنا في بعض الميزات التي قد تؤثر على النتائج إذا لم يتم التعامل معها بعناية. الاستفادة من الشعيرات الدموية مفيد خاصة لإنارة العينات خالية من العوائق. ما هو معلق على قضيب الكولاجين في الأجل المتوسط، قد يحدث أن رود الكولاجين الانجرافات أثناء الحصول على الصور، خاصة بالنسبة للقياسات الطويلة الأجل. وقد هذا الانجراف تصويب لتجنب سوء فهم النتائج. وبطبيعة الحال، هناك أخرى مجهرية الورقة الضوء على الأجهزة المتاحة تجارياً في السوق، والتي لا تتطلب الشعيرات الدموية لتحميل العينات. وعلاوة على ذلك، مع ورقة الضوء مجهرية، إلى جانب حقيقة أن الخط التقليدي الفحص المجهري [كنفوكل] لالضيائيه قد انخفض إلى حد كبير، بالمقارنة مع الضيائية لا يزال مصدر قلق ل التصوير الطويلة الأجل21.
وبصرف النظر عن الفحص المجهري ورقة الضوء، هناك نهج أخرى لتصوير 3D الأسفار، بينها معظمهم التطبيقية هي مجهرية [كنفوكل] مجهرية الأسفار واسع المجال والفحص المجهري مولتيفوتون. من حيث عمق الاختراق، تكمن مجهرية الأسفار [كنفوكل] وواسع المجال في نطاق مماثل، تقتصر عادة على 100 نانو متر22. سبب ضوء الطول الموجي الأطول تستخدم للفحص المجهري الفوتونات المتعددة، يمكن تعزيزه عمق الاختراق على المجموعة من 0.5-1 ملم23. وبالمقارنة، يمكن أن يكون حجم الصور متعددة الأبعاد الناتجة عن تقطيع الضوئية من الضوء-ورقة الفحص المجهري عدة ملليمترات24كحد أقصى. فيما يتعلق بالقرار الأفقي، تبين تجربة أنيقة المؤداة هذا الضوء-ورقة الفحص المجهري يوفر أفضل قرار المكاني ثلاثي الأبعاد مجهرية الأسفار [كنفوكل] في كبيرة بالمقارنة مع عينات25. في الآونة الأخيرة، اقترن تقنية فوتون اثنين، مما يحسن عمق تغلغل عادية واحدة فوتون الضوء-ورقة الفحص المجهري بالمقارنة مع زيادة وأسرع بعشر مرات من نقطة الفحص المجهري اثنين-فوتون الضوء-ورقة الفحص المجهري26.
إذ تضع في اعتبارها مصفوفة 3D يوفر الهيكل الجزئي للخلايا، بالإضافة إلى الكولاجين البقري واستخدمت في هذه الورقة، وهناك العديد من الخيارات الأخرى، مثل مصفوفة خارج الخلوية (ECM) المشتقة من الخلايا ساركومه الماوس، [اغروس]، الهلاميات المائية الاصطناعية أو غيرها المواد البوليمرية متوافق حيويا. ماوس ساركومه ECM خليط بروتين بما في ذلك الرابع الكولاجين، لامينين، فضلا عن العديد من عوامل النمو. مقارنة بالمواد الاصطناعية، ECMs البيولوجية (ساركومه الكولاجين والماوس إدارة المحتوى في المؤسسة)، من ناحية، يقدم سياقا أكثر فسيولوجيا ذات صلة؛ ولكن من ناحية أخرى، نوعية وتشكيله قد تختلف ECMs البيولوجية بين المجموعات والشركات. وفي المقابل، مكفول أكثر إمكانية تكرار نتائج المواد الاصطناعية. بشكل ملحوظ، صقل الخصائص الكيميائية الحيوية والميكانيكية، فضلا عن التعديلات المطلوبة، يسمح للمواد الاصطناعية، ولكن ليس للبيولوجي ECMs10،27.
في موجز، نحن في هذه الورقة وصف بروتوكول لبناء مصفوفة 3D الكولاجين لتجارب بيولوجيا الخلية باستخدام الفلورية الضوء-ورقة الفحص المجهري، وكيفية تضمين CTL البشرية الأساسية في مصفوفة 3D الكولاجين لتصور وتحليل الهجرة CTL. نحن أبرز النقاط الرئيسية في إعداد العينات، والحصول على الصور، والتحليل. وتظهر النتائج التي توصلنا إليها أنه يمكن تصور تشكيل نتوءات شديد الحيوية والهياكل أكتين غرامة بالضوء-ورقة الفحص المجهري مع قرار جيد الزمانية المكانية. وعلاوة على ذلك، بروتوكول تحليل الموصوفة هنا تمكننا من تعقب الخلايا في طريقة مؤتمتة موضوعية وموثوق بها. سوف تكون هذه الطريقة مفيدة خاصة للبحوث المناعية البشرية كالفئران والبشر تختلف اختلافاً كبيرا في العديد من الوظائف المناعية ومفاعليه إلى العلاجات28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب يعلن عدم تضارب المصالح المالية أو التجارية.
Acknowledgments
ونحن نشكر معهد "هيموستاسيولوجي السريرية" والطب نقل الدم لتقديم التبرع بالدم؛ كارمن Hässig وكورا خوجا للحصول على مساعدة تقنية ممتازة. ونحن نشكر ينس رتيغ (جامعة سارلاند) لناقل بماكس المعدلة، رولاند ويدليتش-المرتزقة (جامعة موينستر) لبناء ليفيكت-روبي الأصلي، وكريستيان يونكر (جامعة سارلاند) لتوليد بنية ليفيكت-ميجفب. مولت هذا المشروع سونديرفورشونجسبيريتش 1027 (المشروع A2 إلى B.Q.) و 894 (المشروع A1 إلى M.H.). مجهر الضوء-ورقة كانت تمولها DFG (GZ: فوغ أنست 256/4 19-1).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
- Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
- Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
- Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
