Summary
在这里, 我们提出了一个协议, 以可视化的免疫细胞嵌入在三维 (3D) 胶原基质中使用光片显微镜。该协议还阐述了如何在3D 中跟踪单元迁移。该协议可用于3D 矩阵中其他类型的悬浮单元。
Abstract
在体内, 免疫细胞的活化、增殖和功能都发生在三维 (3D) 环境中, 例如在淋巴结或组织中。迄今为止, 大多数体外系统依赖于二维 (2D) 表面, 如细胞培养板或盖玻片。为了最佳地模拟体外生理条件, 我们利用一个简单的3D 胶原基质。胶原蛋白是细胞外基质 (ECM) 的主要成分之一, 被广泛用于构成3D 矩阵。对于3D 成像, 最近开发的光片显微技术 (也称为单平面光照显微镜) 具有采集速度快、穿透深度大、漂白低、photocytotoxicity 等特点。此外, 光片显微镜对长期测量特别有利。在这里, 我们描述了一个优化的协议如何建立和处理人类免疫细胞,例如, 在3D 胶原基质中的主要人细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 和自然杀伤细胞 (NK), 用于活细胞成像的光片显微镜和固定样本。给出了图像采集和细胞迁移分析的步骤。特别着重强调了取样准备和数据分析的关键步骤和因素。该协议可用于其他类型的悬浮细胞在3D 胶原基质和不限于免疫细胞。
Introduction
大多数关于迁移细胞的知识来自2D 实验1,2,3, 通常是在玻璃或塑料表面进行的一种文化/成像皿。然而, 在大多数情况下, 生理场景需要3D 微环境, 其中胞外基质 (ECM) 起决定性作用。ECM 不仅提供了维持适当细胞形态所必需的3D 结构, 而且还为许多细胞4、5的最佳功能提供了生存信号或方向性提示。因此, 需要一个3D 的环境来更好地识别细胞的功能和行为在一个更好地反映生理环境的环境中。
在人体内, 大多数细胞特别是免疫细胞, 在3D 的情况下发挥作用。例如, 活化 t 细胞巡视组织寻找靶细胞, 天真的 t 细胞通过淋巴结迁移, 寻找其同源抗原呈现细胞, 在此期间, 迁移模式和机械适应相应的胞外环境3,6,7。3D 胶原凝胶已被广泛应用为一种成熟、特征良好的3D 细胞培养系统,8、9、10。我们以前的研究表明, 主要的人类淋巴细胞是高度流动的, 以平均速度迁移, 在0.25% 的胶原基基质11中, µm/分钟大约4.8。细胞骨架的重排在移植12中起关键作用。积累的证据表明, 淋巴细胞不应用只有单一的迁移模式, 但可以切换到特定的迁移行为, 取决于位置, 微环境, 细胞因子, 趋化梯度, 和细胞外信号, 调节迁移行为以不同的方式3。
为了可靠地分析免疫细胞的功能和行为, 例如, 迁移, 突起形成或水泡运输, 能够快速可靠地获取相对较大的3D 卷中的图像是很有好处的。对于3D 成像, 最近开发的光片显微技术 (也称为单平面照明显微镜) 提供了一个满意的解决方案13,14。在成像采集过程中, 生成一个薄的静态光片来照亮样品。这样, 在焦点平面上, 可以同时照亮大面积而不影响离平面单元。此功能使高采集速度与大幅降低漂白和 photocytotoxicity。本文介绍了如何使用光片显微镜对人体免疫细胞进行可视化, 以及如何分析3D 场景中的迁移。
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Protocol
为这项研究进行的研究与人的材料 (白细胞减少系统房间从人血液捐赠者) 由地方道德委员会授权 (声明从 16.4. 2015 (84/15;Rettig 博士教授)), 并遵循相应的指导方针。
1. 中性胶原蛋白溶液的制备 (500 µL)
- 将400µL 冷冻胶原蛋白溶液 (10.4 毫克/毫升) 转移到细胞培养罩下的无菌1.5 毫升管。慢慢加入50µL 冷冻 10x PBS (pH 7.0-7.3) 到400µL 的冷冻胶原蛋白溶液。通过轻轻地平铺管子来混合溶液。
注意: 1 部分的所有步骤都应该在细胞培养罩下完成。 - 添加8µL 0.1 米氢氧化钠成500µL 胶原溶液从1.1。将 pH 值调整为 7.2-7.6。使用 ph 值测试条 (ph 范围: 6-10) 来确定混合物的酸碱度。
注: 不同批次胶原蛋白的体积可能有所不同。氢氧化钠溶液必须缓慢混合以避免气泡。该混合物应保持在冰上, 以避免胶原凝胶。 - 添加2µL 的无菌 ddH2O 使最终体积为500µL. 拌匀, 并将此胶原蛋白溶液 (8.32 毫克/毫升) 储存在冰上或在4°c, 直到进一步使用。
注: 在这种情况下, 中性胶原蛋白可用于24小时整除数不建议避免气泡。
2. 用毛细血管制备光片荧光显微镜样品
- 荧光用所需的主要荧光染料15或荧光蛋白11 , 如前所述, 将感兴趣的活细胞标记出来。
- 将 1 x 106的细胞移植到细胞培养罩下的无菌1.5 毫升管中。离心管在 200 x g 8 分钟, 在200µL 培养基中丢弃上清和并用重悬颗粒。
注: 建议细胞密度为 5 x 106细胞/毫升的可视化人类免疫细胞迁移, 特别是对细胞毒性 T 淋巴细胞 (CTL) 和自然杀伤 (NK) 细胞。 - 从1.3 中添加85.9 µL 的中性胶原溶液。入细胞悬浮从2.2。并适当混合以达到2.5 毫克/毫升的胶原蛋白浓度。把细胞/胶原蛋白混合在冰盖上。
注: 假设所需的胶原蛋白浓度为 N 毫克/毫升, 中和的胶原蛋白溶液体积 (200 µL 细胞悬浮) = 200 x N/(8.32-n) - 接下来, 将匹配的柱塞放入毛细管 (内径 ~ 1 毫米), 直到柱塞是1毫米的毛细管。将柱塞浸入培养基中 (图 1A)。
注意: 这一步可以帮助防止气泡时, 毛细血管被浸入细胞/胶原蛋白混合。毛细管和柱塞不必是无菌的。 - 将毛细血管浸入细胞/胶原蛋白混合物中, 从2.3。慢慢拉回活塞 10-20 毫米 (图 1B)。用70% 乙醇喷雾湿润的纸巾擦拭毛细管的外壁, 除去剩下的胶原蛋白溶液。
- 安装在5毫升管内壁上的粘土的毛细管, 并推动细胞/胶原蛋白混合到毛细管的边缘 (图 1C)。
- 保持毛细管在37°c 与 5% CO2 1 h 为胶原聚合。
- 将培养基 (大约 1-2 毫升) 添加到5毫升管中。仔细按聚合的胶原棒出到中等到约3/4 的胶原蛋白挂在培养基 (图 1D)。
- 保持毛细血管, 像这样, 在37°c 与 5% CO2为另30分钟平衡胶原棒与培养基。
注: 之后, 胶原棒可以拉回毛细血管和进一步培养之前进一步使用。
3. 使用光片显微镜进行图像采集
- 根据制造商的指示装配样品室。
- 打开孵化和显微镜将样品室加热到37摄氏度 (仅用于活细胞成像)。
- 将毛细管放在样品室中, 找到样品, 找到感兴趣的区域进行图像采集。
- 激活相应的激光器。设置以下设置: 激光功率、曝光时间、z 堆栈的步长、z 堆栈的开始和结束位置以及活细胞成像的时间间隔。
注: 例如,图 2中的样本每四十年代成像6小时, 37 摄氏度, 步长为1µm (总厚度: 538 µm)。激光功率为 1%, 曝光时间为30毫秒. x y 方向的像素大小为0.23 µm。 - 开始图像采集。
4. 自动跟踪分析
- 打开文件转换器, 单击 "添加文件" 以选择要转换为软件文件格式 (*. ims) 的图像文件。单击 "浏览" 并选择一个文件夹以保存转换后的文件。单击 "全部启动"。
- 打开分析软件。单击 "超越"。转到 "文件", 然后单击 "打开", 然后选择要分析的图像文件。
注意: 如果文件大小很大, 此步骤可能需要时间。对于单个实验, 建议不要使用大于 1 tb (tb) 的文件, 因为此类大型文件的计算能力要求很高。 - 单击 "添加新点"。最后检查框过程整个图像。单击 "下一步"。
- 输入 x 和 y (像素) 的坐标以定义感兴趣的区域。输入要分析的帧数 (时间和 z 位置)。单击 "下一步"。
- 在源通道的下拉列表中, 选择包含要跟踪的对象的目标通道。输入估计的 xy 直径(µm)。单击 "下一步"。
注意: 估计 xy 直径是要跟踪的对象的 x y 维度的平均直径。 - 单击 "质量"。设置一个阈值, 其中大多数单元格 (对象) 应包括在内。单击 "下一步"。
- 选择所需的算法 (推荐自回归运动)。输入最大距离 (建议使用20 µm ), 最大间隙大小 (建议为3或 2)。最后单击 "处理整个图像"。
注意:最大距离和最大间隙大小是两个中断轨道的阈值。更具体地说, 在两个连续帧中, 当同一对象之间的距离超过最大距离时, 后面框架中的此对象将被视为新对象。有时在获取过程中, 同一对象可能会消失几个帧并再次出现。在这种情况下, 只有当此对象在最大间隙大小中重新出现时, 它才会被视为同一个对象。 - 单击 "筛选器类型", 然后选择排除不想要的曲目的选项。
注意: 此步骤是可选的。 - 单击 "下一步", 然后单击 "完成"。
注意: 根据计算性能的不同, 此步骤可能需要数小时的时间。 - 单击 "编辑曲目" 并选择 "正确漂移"。选择适当的算法 (建议平移漂移)。选择所需的结果数据集大小(建议使用与当前大小相等的新大小)。单击"确定"。
注意: 只有当胶原蛋白在图像采集过程中漂移时, 才需要这个步骤。 - 单击 "统计信息", 然后选择 "配置可见统计值列表"。检查要导出的兴趣选项 (如坐标、速度等)。单击"确定"。
- 单击 "将所有统计信息导出到文件" 并输入文件名。
5. 胶原蛋白基质中细胞的固定和免疫荧光染色
- 将1000µL 4% 多聚甲醛 (在 PBS 中的粉煤灰) 转换成5毫升管在化学罩下。
注: 粉煤灰应与室温保持平衡。 - 用聚合胶原蛋白从2.9 中浸出毛细管。成粉煤灰溶液 (约5毫米), 并安装在5毫升管内壁上的毛细管与建模粘土 (如图 1C所示)。
- 轻轻按压活塞, 直到一半的胶原棒挂在粉煤灰溶液中 (图 1D)。在室温下保持管20分钟。
- 拉回柱塞, 以获得毛细血管内的胶原棒。取出毛细管并丢弃粉煤灰。
- 将毛细管装入新鲜的管子中, 加入1毫升的 PBS。请确保毛细血管浸入 PBS 中。
- 轻轻按压活塞, 直到一半的胶原棒挂在溶液中。在内壁上装上毛细管以建模粘土。
- 在室温下保持管5分钟。
- 重复5.4。-5.7 又2次。
- 拉回柱塞, 以获得毛细血管内的胶原棒。丢弃 PBS。将 1-2 毫升的阻塞/通透缓冲器 (PBS + 1-% BSA + 0.1% 非离子表面活性剂) 转移到管内, 重复5.6。
注: BSA (1%) 可替换为5% 血清的动物的第二 Ab 被提出。 - 在室温下保持管 30-60 分钟。
- 拉回柱塞, 以获得毛细血管内的胶原棒。丢弃通透缓冲区。转移 200-500 µL 的主要抗体在阻塞/通透缓冲和驱逐杆到解决方案。
- 在室温下保持管1小时。
- 用 PBST (PBS + 0.1% 非离子表面活性剂) 清洗胶原棒3倍, 如5.4 所述。-5.8。
- 在室温下, 在阻断/通透缓冲液中培养1小时的二级抗体棒。不要光。
- 用 PBS 洗3次胶原棒, 如5.4 所述。-5.8。
- 拉回柱塞, 以获得毛细血管内的胶原棒。将样品保存在 PBS 中, 直到成像。
- 扫描样品, 如3所述。
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Representative Results
T 细胞移出过程中的突起形成是一个高度动态的过程, 是肌动蛋白依赖。为了可视化第一人 ctl 的突起形成, 我们瞬时转染了 mEGFP 融合蛋白, 以标记在 CTL 的肌动蛋白细胞骨架, 如前所述11。在转染后的某一天, 细胞被嵌入胶原基质中。图像栈是每四十年代获得的步骤大小1µm 在37°c 使用光片显微镜。如图 2A和辅助电影 1, 在迁移过程中, 人类 CTL 形成柠檬形的主要突起, 流苏状的细纺锤状结构。在这里所示的实验中, 不仅有一个单一的细胞被成像, 而且是一个大的体积 (450 x 450 x 538 µm3) (图 2B)。因此, 在这里显示的光学质量和分辨率是以低放大目标 (20X/1.0 DIC 为 IR) 获得的。因此, 通过更高的 NA 目标, 可以进一步改善该决议。
在图 2和电影 1中所示的实验中, CTLs 被自动跟踪, 如协议第4部分所述。在图 2B中描述了 CTL 的轨迹。分析了两种迁移参数: 速度和持久性。持久性定义为位移除以总轨道长度。分析表明, 在3D 中, CTL 的移动性非常多样: 速度范围从 0.01-0. 19 µm 与几乎20倍的差异, 持久性范围从 0-0.7 (图 2C)。据报道, 在小鼠体内间质迁移中 T 细胞的平均速度为4µm/分钟16。最近, 我们已经确定了 CTL 的平均速度为 4-5 µm/分钟11使用本文所描述的方法。这些结果表明, 光片显微镜是一个强有力的工具, 以可视化细胞的行为, 例如, 细胞迁移和细胞的相互作用。在体内, 许多因素和复杂成分的非均质 ECM (包括可影响迁移的可溶性因子) 会改变 T 细胞的行为。
胶原基质的应用不限于活细胞。固定和染色也可以在母体中进行。图 3显示了3D 胶原凝胶中固定样本的例子, 其中内源性 perforin1 (PFN1) 和肌动蛋白染色。样品从单面 (单面照明) 或两侧 (双侧照明) 照明。我们观察到, 在不同 z 位置的细胞均匀染色, 表明我们的协议中描述的程序达到令人满意的抗体渗透到胶原凝胶。更重要的是, 在固定的 CTL 表现出与活细胞成像相同的形态学 (比较图 3和图 2B), 表明这一方案也很好地维护了形态学。另外, 从单面或两侧的光照对焦平面的图像质量没有显著的影响。考虑到相对于双侧照明的单侧照明方式照射到激光器的面积较小, 建议采用单面照明。
图 1: 在样品准备过程中处理毛细血管的图示.(A)将柱塞放入毛细管中, 以及如何用培养基将柱塞润湿。(B)把细胞/胶原蛋白混合到毛细血管中。(C)使用建模粘土来安装毛细血管。柱塞和胶原棒分别在灰色和红色框中描述。(D)处理胶原棒, 以平衡培养基或染色。柱塞和胶原棒分别在灰色和红色框中描述。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 跟踪3D 胶原蛋白中的主要人体 CTL, 并可视化肌动蛋白动力学.(A)第一人 CTL 肌动蛋白的最大强度投射。肌动蛋白被标记在 CTL 如前所述11。第一天后转染细胞植入0.5% 胶原基质。显示一个代表性单元格。刻度条为5µm. 在突出边缘的细微肌动蛋白结构由箭头突出显示。(B) CTL 的轨道为6小时。轨迹被软件 automatedly 跟踪 (颜色代码: 蓝色 = 开始, 红色 = 轨道的结尾, 450 x 450 x 538 µm3容量)。刻度条为50µm. (C)量化速度和持久性。一个点代表一个单元格。结果以4个捐献者的平均扫描电镜显示。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 嵌入3D 胶原基质的 CD8+ T 细胞内源性 profilin1 (PFN1) 和肌动蛋白染色.主要的人 CD8+ T 细胞嵌入0.25% 胶原蛋白。在粉煤灰固定后, 样品被染色使用 anti-PFN1 (橙色) 和罗丹明 (紫色) 和可视化的光片显微镜在1µm 的总体积 440 x 440 x 1000 µm3。样品从单面 (单面照明) 或两侧 (双侧照明) 照明。显示3D 重建的最大强度投影 (MIP)。刻度条是50µm.请点击这里查看这个数字的大版本。
电影 1: T 细胞迁移过程中突起的产生.影片中显示的单元格取自图 2A所示的卷。细胞嵌在胶原基质中 (0.5%)。图像是每四十年代获得6小时在37°c 使用光片显微镜。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载.
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Discussion
大多数的体外检测是在2D 表面进行的, 例如细胞培养板、培养皿或盖玻片, 而在体内细胞, 特别是免疫细胞中, 大多经历了3D 微环境。新出现的证据显示, 免疫细胞的迁移模式在2D 和3D 方案17之间有所不同。此外, 肿瘤细胞的表达谱也不同于2D 和 3 d 培养组织18,19,20。因此, 为了更好地模拟体外生理条件, 在3D 环境下进行实验, 例如3D 胶原基质, 具有很大的优越性。新开发的方法, 特别是光片荧光显微镜, 在受控环境条件下, 能够在3D 矩阵系统中进行可靠和可重复的实验。
与传统的激光扫描共焦显微术, 照亮整个探头, 与光片显微镜, 只有一薄的激光光被产生照亮样品。检测摄像头与照明平面垂直。由于这种技术, 只有在焦平面上的部分暴露在激光。因此, 可以将光漂白和毒性最小化。此外, 与点扫描显微术相比, 采用光片显微镜 (100-1000 倍快) 的采集率大大提高, 信噪比也得到了改善。结合本论文所用的光片显微安装的孵化室, 本显微镜是一种强大的选择, 用于图像采集的大型3D 卷, 以最小的漂白和照片损伤的时间延长 (数天) 下孵化条件。
对于3D 胶原基质的样品制备, 最关键的一点是避免气泡。考虑到它的高粘度, 当气泡被引入到胶原溶液中, 很难从溶液中去除。气泡的存在会诱发胶原基质聚合的异质性;此外, 它可以阻挡光的路径, 这将降低图像的质量。因此, 当转移或混合胶原溶液时, 必须轻轻吸管, 不要排出吸管尖端的最后一滴。而且, 胶原蛋白在室温下开始慢慢聚合。因此, 在混合溶液之前, 要防止聚合, 应始终将含胶原的管子放在冰上。
我们在使用光片显微镜时遇到的一个重大挑战是数据处理。光片显微镜产生的数据可以很容易地达到 500 gb 甚至数 tb 的大小, 特别是用于长期实验。对这些数据进行分析需要几天时间, 有时由工作站计算能力很高。由于所分析图像的大小不比原始数据小, 所以存储容量很快就成为光片显微镜应用的限制因素。因此, 对于跟踪实验或如果需要复杂的图像分析, 强烈建议将每个实验的文件大小限制为可由可用的处理单元在合理的时间框架内处理的值。
本文介绍的光片荧光显微镜有一些特点, 如果不仔细处理, 可能会影响结果。利用毛细血管是特别有利的无障碍照明的样品。由于胶原棒挂在培养基中, 可能发生胶原棒漂移在图像采集, 特别是长期测量。必须纠正这种漂移, 以避免对结果的误解。当然, 市面上还有其他的光板显微镜设置, 不需要毛细血管来装样品。此外, 与光片显微镜, 除了事实相比, 传统的线扫描共焦显微镜毒性已经大大减少, 毒性仍然是一个关注长期成像21。
除了光片显微镜, 还有其他方法为3D 荧光成像, 其中主要应用是共焦显微镜, 广域荧光显微镜, 多光子显微镜。在穿透深度方面, 共焦和广域荧光显微镜位于类似的范围内, 通常限于 100 nm22。由于多光子显微镜使用的波长越长, 其穿透深度可提高到 0.5-1 毫米23的范围。相比之下, 光片显微镜光学切片所产生的多维图像的尺寸可达几毫米24。在横向分辨率方面, 一个优雅的实验表明, 光片显微镜提供了一个更好的三维空间分辨率相比, 共聚焦荧光显微镜在大样本25。近年来, 光片显微镜已与双光子技术相结合, 进一步提高了与普通光子光片显微镜相比的穿透深度, 比点扫描双光子显微镜26快十倍。
考虑到为细胞提供微体系结构的3D 矩阵, 除了本文所用的牛胶原蛋白外, 还有许多其他的选择, 如从小鼠肉瘤细胞、琼脂糖、合成水凝胶等衍生出的超细胞基质 (ECM)。生物相容高分子材料。小鼠肉瘤 ECM 是一种蛋白质混合物, 包括胶原 IV、层粘连蛋白以及多种生长因子。与合成材料、生物 ECMs (胶原蛋白和小鼠肉瘤 ECM) 相比, 一方面呈现出更具生理学意义的语境;但另一方面, 质量和组成生物 ECMs 可能不同批次和公司。相比之下, 合成材料的重现性更有保障。值得注意的是, 生物化学和机械性能的微调, 以及所需的修改, 是允许合成材料, 但不为生物 ECMs10,27。
总之, 本文介绍了用光片荧光显微镜构建细胞生物学实验3D 胶原基质的一种协议, 以及如何在3D 胶原基质中嵌入一个人 ctl 来可视化和分析 ctl 迁移。重点介绍了样品制备、图像采集和分析的要点。结果表明: 光片显微镜能较好地显示高动态突起和细小肌动蛋白结构的形成, 并具有良好的时空分辨率。此外, 这里描述的分析协议使我们能够以客观和自动化的方式可靠地跟踪细胞。这种方法对于人类免疫学研究特别有利, 因为小鼠和人类在许多免疫学功能和反应性方面有极大的差异28。
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Disclosures
提交人不申报任何金融或商业利益冲突。
Acknowledgments
我们感谢临床 Hemostaseology 和输血医学研究所提供献血者的血液;卡门 Hässig 和科拉恩维尔·霍查为优秀的技术帮助。我们感谢 Rettig (萨尔大学) 的修改 pMAX 矢量, 罗兰 Wedlich-Söldner (Muenster 大学) 为原 LifeAct-红宝石结构, 和基督教勇克 (萨尔大学), 以产生 LifeAct-mEGFP 结构。该项目由 Sonderforschungsbereich 1027 (项目 A2 到 B.Q.) 和 894 (项目 A1 M.H.) 提供资金。光片显微镜由 DFG (广州: 256/4 19-1 FUGG) 资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
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