Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Lys-ark mikroskopi for tre-dimensionelle visualisering af Human immun celler

Published: June 13, 2018 doi: 10.3791/57651
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biophysics, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), School of Medicine, Saarland University

Summary

Vi præsenterer her, en protokol for at visualisere immunceller indlejret i en tre-dimensionelle (3D) kollagen matrix ved hjælp af lys-ark mikroskopi. Denne protokol også uddyber hvordan man spore celle migration i 3D. Denne protokol kan være ansat af andre former for affjedring celler i den 3D matrix.

Abstract

In vivo, aktivering, spredning og funktionen af immun celler alle forekomme i en tre-dimensionelle (3D) miljø, for eksempel i lymfeknuder eller væv. Op til dato stole de fleste in vitro- systemer på todimensionelle (2D) overflader, såsom cellekultur plader eller coverslips. Til optimalt efterligne fysiologiske tilstande i vitrobenytter vi en simpel 3D kollagen matrix. Kollagen er et af de vigtigste bestanddele af ekstracellulære matrix (ECM) og har været meget anvendt til at udgøre 3D matricer. For 3D imaging, er den nyligt udviklede lys-ark mikroskopi teknologi (også kaldet enkelt fly belysning mikroskopi) featured med høje anskaffelses hastighed, stor indtrængningsdybde, lav blegning og fototoksicitet. Desuden er lys-ark mikroskopi særligt fordelagtigt for langsigtet måling. Her vi beskriver en optimeret protokol, hvordan til at oprette og håndtere humane immun celler, fx primære menneskelige cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) og natural killer (NK) celler i 3D kollagen matrix til brug med lys-ark mikroskopi for levende celle imaging og faste prøver. Proceduren for image erhvervelse og analyse af celle migration er præsenteret. Særligt fokus er givet at fremhæve kritiske trin og faktorer til forberedelse af prøver og dataanalyse. Denne protokol kan være ansat af andre former for affjedring celler i en 3D kollagen matrix og er ikke begrænset til immunceller.

Introduction

De fleste viden om overflytning celler kommer fra 2D eksperimenter1,2,3, som foregår normalt i et glas eller plastik overfladen af en kultur/imaging parabol. En fysiologisk scenario kræver dog i de fleste tilfælde, en 3D mikromiljø, hvori den ekstracellulære matrix (ECM) spiller en afgørende rolle. ECM ikke blot giver 3D-struktur er væsentlige for at opretholde ordentlig celle morfologi, men tilbyder også overlevelse signaler eller retningsbestemt stikord til en optimal funktion af mange celler4,5 . Et 3D-miljø er derfor påkrævet til bedre identificere cellulære funktioner og adfærd i et miljø, som bedre afspejler den fysiologiske kontekst.

I den menneskelige krop udøve de fleste celler især immunceller, deres funktioner under en 3D scenario. For eksempel, aktiverede T celler patruljere væv søger target-cellerne, naive T celler vandrer gennem lymfeknuder i søgen efter deres beslægtet antigen-præsenterer celler hvor overførselstilstanden og maskiner er tilpasset til de tilsvarende ekstracellulære miljø3,6,7. 3D kollagen gel har været udbredt som en veletableret og godt karakteriseret 3D celle kultur system8,9,10. Vores tidligere arbejde viser, at primære humane lymfocytter er meget mobile og overflytte ved en gennemsnitlig hastighed på omkring 4,8 µm/min med en 0,25% kollagen-baserede matrix11. Omlægning af cytoskeleton spiller en central rolle i celle migration12. Akkumulere beviser viser, at lymfocytter gælder ikke kun en enkelt transportform migration endnu kan skifte mellem visse migration opførsel afhængigt af placering, mikromiljø, cytokiner, kemotaktisk forløb, og ekstracellulære signalerer, hvilken melodi det vandrende adfærd i forskellige måder 3.

Til at pålideligt analysere immun cellefunktioner og adfærd, for eksempel, migration, fremspring dannelse eller vesikulær transport, er det af stor fordel at kunne erhverve billeder i forholdsvis stor 3D diskenheder på en hurtig og pålidelig måde. For 3D imaging giver nyligt udviklede lys-ark mikroskopi teknologi (også kaldet enkelt fly belysning mikroskopi) en tilfredsstillende løsning13,14. Under imaging erhvervelse, genereres en statisk lys tyndplade skal belyse prøven. På denne måde, i fokus flyet, belyst et stort område samtidigt uden at påvirke de off-plane celler. Denne funktion giver mulighed for en høj erhvervelse hastighed med en drastisk reduceret blegning og fototoksicitet. I dette papir beskriver vi hvordan man visualisere primære human immun celler ved hjælp af lys-ark mikroskopi og hvordan man kan analysere migration i en 3D scenario.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forskning udført for denne undersøgelse med det menneskelige materiale (leukocyt reduktion system kamre fra menneskelige bloddonorer) er godkendt af den lokale etiske komité (erklæring fra 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) og følger retningslinjerne for tilsvarende.

1. forberedelse af neutraliseret kollagen løsning (500 µL)

  1. Overføre 400 µL af kølet kollagen stamopløsning (10.4 mg/mL) til en sterile 1,5 mL tube under celle kultur hætte. Tilsættes langsomt 50 µL af kølet 10 x PBS (pH 7,0-7.3) til 400 µL af kølet kollagen stamopløsning. Bland opløsningen af forsigtigt flisebelægning røret.
    Bemærk: Alle trinene i Del1 bør foregå under en celle kultur hætte.
  2. Tilføje 8 µL af 0,1 M NaOH i 500 µL af opløsningen kollagen fra 1.1. Sådan justeres til pH 7,2-7.6. Bruge pH test strips (pH interval: 6-10) til at bestemme pH-værdien i blandingen.
    Bemærk: Diskenheder kan variere for forskellige partier af kollagen. NaOH opløsning har skal blandes langsomt for at undgå luftbobler. Blandingen skal holdes på is at undgå kollagen gellation.
  3. Tilføj 2 µL sterilt ddH2O til at foretage den endelige rumfang 500 µL. Bland godt og gemme denne kollagen løsning (8,32 mg/mL) på is eller ved 4 ° C indtil videre anvendelse.
    Bemærk: Under denne betingelse, neutraliseret kollagen kan bruges for 24 h. delprøver er ikke anbefales at undgå luftbobler.

2. prøveforberedelse til lys-ark Fluorescens mikroskopi ved hjælp af kapillærer

  1. Fluorescently mærke de levende celler af interesse med den ønskede primære fluorescerende farvestoffer15 eller fluorescerende proteiner11 som tidligere beskrevet.
  2. Overføre 1 × 106 af celler ind i en sterile 1,5 mL rør under en celle kultur hætte. Der centrifugeres tube på 200 x g i 8 min. Fjern supernatanten og resuspenderes i 200 µL af næringssubstratet.
    Bemærk: Celle tætheden af 5 × 106 celler/mL anbefales til visualisering af human immun celle migration, især for cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) og naturlige dræberceller (NK).
  3. Tilføje 85,9 µL af neutraliseret kollagen løsning fra 1.3. i cellesuspension fra 2.2. og bland ordentligt for at nå en kollagen koncentration af 2,5 mg/mL. Forlade celle/kollagen mix på is i hætten.
    Bemærk: Antag, at den ønskede koncentration af kollagen er N mg/mL, mængden af neutraliseret kollagen løsning (for 200 µL cellesuspension) = 200 × N /(8.32-N)
  4. Næste, sætte den matchende stemplet i kapillar (indre diameter ~ 1 mm) indtil stemplet er 1 mm ud af kapillar. Våd stemplet ved dypning i næringssubstratet (figur 1A).
    Bemærk: Dette trin kunne bidrage til at undgå luftbobler, når kapillar er dyppet i celle/kollagen mix. Kapillær og stemplet behøver ikke at være steril.
  5. Dyppe kapillar i celle/kollagen mix fra 2.3. Langsomt trække stemplet tilbage for 10-20 mm (figur 1B). Tør den ydre væg af kapillar med et stykke køkkenrulle fugtet med 70% ethanol spray til at fjerne de resterende kollagen løsning.
  6. Montere kapillær med modeling ler på indersiden af en 5 mL tube og skubbe celle/kollagen mix til kanten af kapillar (figur 1 c).
  7. Holde kapillar ved 37 ° C med 5% CO2 for 1 h for kollagen polymerisering.
  8. Tilføje næringssubstratet (omkring 1-2 mL) til en 5 mL tube. Omhyggeligt tryk polymeriseret kollagen stangen ud i medium til omkring 3/4 af kollagen hængende i medium (fig. 1 d).
  9. Holde kapillar som denne, ved 37 ° C med 5% CO2 for en anden 30 min til Reagensglasset kollagen stangen med mediet.
    Bemærk: Bagefter, kollagen stangen kan trækkes tilbage til kapillær og kulturperler yderligere før yderligere brug.

3. billede erhvervelse ved hjælp af lys-ark mikroskopi

  1. Forsamling i prøve salen efter fabrikantens anvisninger.
  2. Tænd inkubationen og mikroskop til at varme i prøve salen til 37 ° C (for levende celle imaging kun).
  3. Placer kapillar i prøve salen og Find prøve for at finde området af interesse for image erhvervelse.
  4. Aktiver den tilsvarende laser(s). Angive følgende indstillinger: laser power, eksponeringstid, trin-størrelsen af z-stack, start- og position af z-stak, og tidsintervallet for levende celle billeddannelse.
    Bemærk: For eksempel, eksemplet i figur 2 var afbildet hver 40 s i 6 timer ved 37 ° C med en trin-størrelse på 1 µm (samlet tykkelse: 538 µm). Laser power var 1% med en eksponeringstid for 30 ms. pixelstørrelse på x-y-retningen er 0,23 µm.
  5. Start billede erhvervelse.

4. automatiseret sporing analyse

  1. Åbn fil konverteren, klik på Tilføj filer for at vælge den billeddiagnostiske fil(er) omdannes til software-filformat (*.ims). Klik på Gennemse og vælge en mappe til at gemme de konverterede filer. Klik på Start alle.
  2. Åbn analyse software. Klik på overgå. Gå til fil og klik på Åbnog derefter vælge filen tænkelig der skal analyseres.
    Bemærk: Hvis filstørrelsen er store dette trin kan tage tid. Filer større end 1 Terabyte (TB) er ikke anbefalet til et enkelt eksperiment som processen sådanne store filer er meget beregningsmæssige kapacitet krævende.
  3. Klik på Tilføj ny steder. Marker afkrydsningsfeltet Proces hele billedet endelig. Klik på næste.
  4. Indtast koordinater x og y (i pixel) til at definere området af interesse. Indtast antallet af billeder (tid og z-position) til at analysere. Klik på næste.
  5. Vælg målkanal, som indeholder objekterne, der skal spores, på rullelisten Kildekanal. Angiv anslået xy Diameter (i µm). Klik på næste.
    Bemærk: Anslået xy diameter er den gennemsnitlige diameter i x-y-dimension af objekter, der skal spores.
  6. Klik på kvalitet. Indstille en tærskel, hvor de fleste af cellerne (objekter) skal medtages. Klik på næste.
  7. Vælg den ønskede algoritme (Autoregressive Motion anbefales). Angiv den max afstand (20 µm anbefales) og max hul størrelse (3 eller 2 anbefales). Klik på proces hele billede endelig.
    Bemærk: Max afstand og Max hul størrelse er to tærskelværdier bryde spor. Mere specifikt i to sammenhængende rammer vil når afstanden mellem de samme objekt overstiger Max afstanden, dette objekt i rammen senere blive betragtet som et nyt objekt. Nogle gange under købet, kan det samme objekt forsvinde for et par frames og dukke op igen. I dette tilfælde kun når dette objekt igen inden for Max hul størrelse, vil det blive betragtet som det samme objekt.
  8. Klik på Filtertype og vælge muligheden for at udelukke uønsket spor.
    Bemærk: Dette trin er valgfrit.
  9. Klik på næste , og klik derefter på Udfør.
    Bemærk: Dette trin kan tage timer til dage afhængigt af arbejder med computer arbejdsindsats.
  10. Klik på Rediger spor og vælge Korrekte Drift. Vælg den passende algoritme (Translationel Drift anbefales). Vælg den ønskede Resultat datasæt størrelse (Ny størrelse lig med aktuelle størrelse anbefales). Klik på OK.
    Bemærk: Dette trin er kun påkrævet, når kollagen gledet under image erhvervelse.
  11. Klik på statistik og vælge Konfigurere listen af synlige statistik værdier. Tjek eksporteret indstillingerne af interesse at være (fx koordinater, hastighed og så videre). Klik på OK.
  12. Klik på Eksporter alle statistikker til fil og indtaste filnavnet.

5. fiksering og immunfluorescens farvning af celler i kollagen matricer

  1. Overføre 1.000 µL af 4% PARAFORMALDEHYD (PFA, i PBS) ind i et 5 mL rør under en kemisk hætte.
    Bemærk: PFA bør være afbalanceret til stuetemperatur.
  2. Dyp kapillær med polymeriseret kollagen fra 2.9. i PFA løsning (for ~ 5 mm) og montere kapillar på indersiden af 5 mL tube med modeling clay (som vist i figur 1 c).
  3. Tryk stemplet forsigtigt, indtil halvdelen af kollagen stangen hængende i PFA løsning (figur 1 d). Holde røret ved stuetemperatur i 20 min.
  4. Trække sig tilbage i stemplet for at få kollagen rod inde kapillar. Tag kapillær og kassér PFA.
  5. Montere kapillar ind i en frisk rør og tilsættes 1 mL PBS. Sørg for, at kapillar er nedsænket i PBS.
  6. Tryk stemplet forsigtigt, indtil halvdelen af kollagen stangen hængende i løsningen. Montere kapillar på den indre væg med modeling ler.
  7. Holde røret ved stuetemperatur i 5 min.
  8. Gentag 5.4. -5,7 til en anden 2 gange.
  9. Trække sig tilbage i stemplet for at få kollagen rod inde kapillar. Kassér PBS. Overføre 1-2 mL af blokering/permeabilization buffer (PBS + 1-% BSA + 0,1% nonionisk overfladeaktivt stof) ind i røret og Gentag 5.6.
    Bemærk: BSA (1%) kan erstattes af 5% serum fra dyr af dyret den sekundære Ab blev rejst i.
  10. Holde røret ved stuetemperatur i 30-60 min.
  11. Trække sig tilbage i stemplet for at få kollagen rod inde kapillar. Kassere permeabilization buffer. Overføre 200-500 µL af det primære antistof i blokerer/permeabilization buffer og ekskluderer stangen i løsning.
  12. Holde røret ved stuetemperatur i 1 time.
  13. Vask kollagen stangen 3 gange med PBST (PBS + 0,1-% nonionisk overfladeaktivt stof), som beskrevet i 5.4. -5.8.
  14. Inkuber stang i sekundær antistof i blokerer/permeabilization buffer i 1 time ved stuetemperatur. Holde det fra lys.
  15. Vask kollagen stangen 3 gange med PBS, som beskrevet i 5.4. -5.8.
  16. Trække sig tilbage i stemplet for at få kollagen rod inde kapillar. Holde prøverne i PBS indtil billeddannelse.
  17. Skan prøver som beskrevet i 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fremspring dannelse under T-celle migration er en yderst dynamisk proces, som er actin afhængige. For at visualisere fremspring dannelsen af primær humane Tillidsliste, transfekteret vi forbigående en mEGFP af smeltet protein til at mærke actin cytoskelettet i CTL som beskrevet før11. En dag efter Transfektion, blev cellerne integreret i kollagen matrix. Billedstakke blev erhvervet hver 40 s med en trin-størrelse på 1 µm ved 37 ° C ved hjælp af lys-ark mikroskopi. Som vist i figur 2A og supplerende film 1, under overflytningen, humane Tillidsliste form citron-formet større fremspring, omkranset af fine spindel-lignende strukturer. I forsøget vist her, ikke kun en enkelt celle var afbildet, men en stor mængde (450 x 450 x 538 µm3) (figur 2B). Således, den optiske kvalitet og opløsning vist her var fremstillet med en lav forstørrelse mål (20 X / 1,0 DIC VIS IR). Derfor, beslutningen kan forbedres yderligere med højere NA mål.

I forsøget vist i figur 2 og film 1, blev CTLs automatisk sporet som beskrevet i Del4-protokollen. Baner af CTL er afbildet i figur 2B. To parametre af migration blev analyseret: hastighed og vedholdenhed. Persistens er defineret som den forskydning, divideret med den totale længde. Analysen viser, at mobilitet af CTL er meget forskellige i 3D: hastigheder varierer fra 0,01-0,19 µm/s med en næsten 20-fold forskel, og vedholdenhed spænder fra 0 - 0,7 (figur 2 c). Det blev rapporteret i mus, i vivo interstitiel migration gennemsnitlige hastighed af T-celler var 4 µm/min.16. For nylig, har vi fastlagt den gennemsnitlige hastighed af CTL til at være 4-5 µm/min11 ved hjælp af de metoder, der er beskrevet i denne hvidbog. Disse resultater viser, at lys-ark mikroskopi er et kraftfuldt værktøj til at visualisere celle opførsel, for eksempel celle migration og cell-celle interaktion. In vivo, mange faktorer og en ikke-homogen ECM af komplekse sammensaetning herunder opløselige faktorer, der kan påvirke migration vil ændre T-celle adfærd.

Anvendelse af en kollagen matrix er ikke begrænset til levende celler. Fiksering og immunfarvning kan også udføres i matrixen. Figur 3 viser et eksempel på fast prøver i 3D kollagen gel, i hvilke endogene perforin1 (PFN1) og aktin var plettet. Prøven blev oplyst enten fra en enkelt side (Single side belysning) eller fra begge sider (Dual side belysning). Vi observerer, at farves celler ved forskellige z-positioner jævnt, der angiver, at procedurerne i vores protokol opnå tilfredsstillende penetration af antistoffer i kollagen geler. Vigtigere er, efter fiksering CTL udstillede den samme morfologi som i live celle imaging (Sammenlign figur 3 og figur 2B), der angiver, at også morfologi er godt vedligeholdt af denne protokol. Belysning fra en enkelt side eller begge sider gør desuden ikke en væsentlig forskel i kvaliteten af billeder på brændplanet. I betragtning af at mindre område er udsat for laser med tilstanden af enkelt side belysning i forhold til dual side belysning, er enkelt side belysning mere anbefales.

Figure 1
Fig. 1: Illustration af håndtering kapillærer under prøveforberedelse. (A) sætte stemplet i kapillær og sådan våd stemplet med substratet. (B) trække celle/kollagen mix til kapillar. (C) Mount kapillærer ved hjælp af modellering ler. Stemplet og kollagen stangen er afbildet i grå og røde kasser, henholdsvis. (D) håndtere kollagen stang ækvilibrering med næringssubstratet eller immunfarvning. Stemplet og kollagen stangen er afbildet i grå og røde kasser, henholdsvis. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: Tracking primære humane Tillidsliste i 3D kollagen og visualisere actin dynamics. (A) maksimal intensitet projektion af actin i primære menneskelige CTL. Aktin blev mærket i CTL som tidligere beskrevet11. Dag ét indlæg Transfektion celler blev integreret i 0,5% kollagen matrix. Én repræsentant celle er vist. Skala barer er 5 µm. Fine actin strukturer frontviden fremspring er fremhævet ved pilespidsen. (B) baner af CTL til 6 h. Baner som automatedly spores af softwaren (farvekode: blå = start, rød = slutningen af sporet, 450 × 450 × 538 µm3 bind). Skalalinjen er 50 µm. (C) kvantificering af hastighed og vedholdenhed. Et dot repræsenterer én celle. Resultaterne er vist som mener ± SEM fra 4 donorer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Immunfarvning af endogene profilin1 (PFN1) og aktin i CD8+ T celler indlejret i 3D kollagen matrix. Primære menneskelige CD8+ T celler var indlejret i 0,25% kollagen. Efter PFA fiksering var prøven farves ved hjælp af anti-PFN1 (orange) og phalloidin (lilla) og visualiseret ved lys-ark mikroskopi på en skridt-størrelse på 1 µm for en samlet maengde paa 440 x 440 x 1.000 µm3. Prøven blev oplyst enten fra en enkelt side (Single side belysning) eller fra begge sider (Dual side belysning). Maksimale intensitet fremskrivninger (MIP) fra 3D rekonstruktion er vist. Skala barer er 50 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Movie 1
Movie 1: Generation af fremspring under T-celle migration. Cellen vist i filmen blev taget fra den mængde, der er vist i figur 2A. Celler var indkapslet i en kollagen matrix (0,5%). Billeder blev erhvervet hver 40 s i 6 timer ved 37 ° C ved hjælp af lys-ark mikroskopi. Venligst klik her for at se denne video. (Højreklik for at hente.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De fleste in vitro- assays er udført på en 2D overflade, for eksempel i cellekultur plader, petriskåle eller på coverslips, i vivo celler, især immunceller, har for det meste en 3D mikromiljø. Nye beviser viser, at migrationsmønstre af immunceller varierer mellem 2D- og 3D-scenarier17. Desuden er udtrykket profiler af tumorceller er også forskellige i 2D - og 3D-kulturperler væv18,19,20. Derfor bedst simulere fysiologiske tilstande i vitro, er det en stor fordel at udføre eksperimenter i en 3D sammenhæng, for eksempel i 3D kollagen matricer. De nyudviklede fremgangsmåder, især lys-ark Fluorescens mikroskopi, giver mulighed for pålidelige og reproducerbare eksperimenter i 3D matrix systemer under kontrollerede miljøbetingelser.

I modsætning til en konventionel laser-scanning Konfokal mikroskopi, som belyser hele sonden, med lys-ark mikroskopi, genereres kun en tynd plade af laserlys til at belyse prøver. Registrering af kameraet er vinkelret lysende. På grund af denne teknik er kun afsnittet på brændplanet udsat for laseren. Derfor, foto-blegning og fototoksicitet kan minimeres. Desuden, i forhold til punkt-scanning mikroskopi, erhvervelse sats er drastisk forbedret med lys-ark mikroskopi (100 - 1.000-fold hurtigere) og signal / støj-forhold er også forbedret. Kombineret med inkubation kammer af lys-ark mikroskopi installationen bruges i dette papir denne mikroskop er en kraftfuld mulighed for image erhvervelse af store 3D diskenheder med minimeret blegning og foto-skader over længere perioder af tid (flere dage) under kuvøse betingelser.

For prøveforberedelse med 3D kollagen matrix er det mest kritiske punkt at undgå luftbobler. I betragtning af dens høj viskositet, når luftbobler er introduceret til kollagen løsning er det meget svært at fjerne det fra løsningen. Tilstedeværelsen af luftbobler kan fremkalde heterogenitet polymerisering af kollagen matrix; Derudover kan det blokere vej af lys, hvilket ville mindske kvaliteten af billeder. Derfor, når overføre eller blande kollagen løsning man skal afpipetteres meget forsigtigt og ikke udvise den sidste dråbe i pipette tip. Derudover begynder kollagen at langsomt polymerisere ved stuetemperatur. Således, for at undgå polymerisering før blandingsopløsning godt, kollagen-holdige rørene skal altid holdes på is.

En stor udfordring, vi møder i ansætte lys-ark mikroskopi er datahåndtering. De data, der er genereret af lys-ark mikroskopi kan nemt nå størrelsen på 500 GB eller endnu flere terabyte, navnlig for langsigtet eksperimenter. Tager flere dage, nogle gange op til en uge af en arbejdsplads med høj beregning kapacitet til at analysere disse data. Da størrelsen af analyseret billeder ikke er mindre end den oprindelige data kan storage kapacitet hurtigt blive en begrænsende faktor for anvendelsen af lys-ark mikroskopi. Derfor, for tracking eksperimenter eller hvis komplekse billedanalyse er nødvendig er det stærkt anbefales at begrænse filstørrelsen pr. eksperiment til værdier, der kan håndteres inden for en rimelig tidsramme af de tilgængelige forarbejdningsenheder.

Lys-ark Fluorescens mikroskopi indført i her har nogle funktioner, som kan påvirke resultaterne, hvis det ikke håndteres forsigtigt. Udnyttelsen af kapillærer er særligt fordelagtigt for et barrierefrit belysning af prøverne. Da kollagen stangen er hængende i mediet, kan det ske, at kollagen rod driver under image erhvervelse, især for langsigtet måling. Denne afdrift der skal korrigeres for at undgå fejlfortolkning af resultaterne. Selvfølgelig, er der andre lys-ark mikroskopi opsætninger kommercielt tilgængelige på markedet, som ikke kræver kapillærer at montere prøverne. Desuden med lys-ark mikroskopi, foruden det faktum, at sammenlignet med den konventionelle linje scanning konfokalmikroskopi fototoksicitet er blevet væsentligt reduceret, forbliver fototoksicitet stadig en bekymring for langsigtet imaging21.

Bortset fra lys-ark mikroskopi, der er andre tilgange til 3D fluorescens imaging, blandt hvilke den mest anvendte er Konfokal mikroskopi, wide-felt Fluorescens mikroskopi og multiphoton mikroskopi. Med hensyn til indtrængningsdybde, Konfokal og wide-felt Fluorescens mikroskopi ligge i samme række, normalt begrænset til 100 nm22. På grund af den længere bølgelængde lys udnyttet til multi foton mikroskopi, kan dens indtrængningsdybde forbedres til rækken af 0,5 - 1 mm23. Sammenligning kan af multi-dimensionelle billeder genereret med optisk skæring af lys-ark mikroskopi størrelse være op til flere millimeter24. I forhold til laterale opløsning viser en elegant udført eksperiment, at lys-ark mikroskopi giver en bedre tre-dimensionelle rumlige opløsning i forhold til Konfokal Fluorescens mikroskopi i store prøver25. For nylig, lys-ark mikroskopi er blevet kombineret med to-foton teknik, som yderligere forbedrer indtrængningsdybde i forhold til normale én foton lys-ark mikroskopi og ti gange hurtigere end punkt-scanning to-foton mikroskopi26.

I betragtning af 3D matrix, der indeholder mikro-arkitektur til celler, udover bovine kollagen jeg brugte i dette papir, er der mange andre muligheder, såsom ekstra-cellulære matrix (ECM) stammer fra mus sarkom celler, agarosegelelektroforese, syntetisk hydrogels eller andre biokompatibelt polymere materialer. Mus sarkom ECM er et protein blanding herunder kollagen IV, laminin samt adskillige vækstfaktorer. Sammenlign med de syntetiske materialer, biologiske ECMs (kollagen og mus sarkom ECM), på den ene side fremlægge en mere fysiologisk relevante kontekst; men på den anden side kvalitet og sammensaetning biologiske ECMs kan variere mellem partier og virksomheder. Derimod er reproducerbarhed af syntetiske materialer mere garanteret. Bemærkelsesværdigt, finjustering af biokemiske og mekaniske egenskaber, samt ønskede ændringer, er tilladt for syntetiske materialer, men ikke for biologiske ECMs10,27.

Sammenfattende, i dette papir beskrevet vi en protokol for at konstruere 3D kollagen matrix for celle biology eksperimenter ved hjælp af lys-ark Fluorescens mikroskopi, og hvor hen til indkapsle primære humane Tillidsliste i 3D kollagen matrix til at visualisere og analysere CTL migration. Vi fremhævet de centrale punkter i prøveforberedelse, image erhvervelse og analyse. Vores resultater viser, at dannelsen af højdynamiske fremspring og fine actin strukturer kan visualiseres ved lys-ark mikroskopi med en god spatiotemporelle opløsning. Derudover analyse protokollen beskrevet her gør os i stand til pålideligt spore celler i en objektiv og automatiseret måde. Denne metode vil være særligt fordelagtige for menneskelige immunologiske forskning som mus og mennesker adskiller sig væsentligt i mange immunologiske funktioner og reaktivitet på terapier28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen økonomiske eller kommercielle interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Institut for klinisk Hemostaseology og Transfusion medicin for at give donor blod; Carmen Hässig og Cora Hoxha for fremragende teknisk hjælp. Vi takker Jens Rettig (Saarland Universitet) for den modificerede pMAX vektor, Roland Wedlich-Söldner (University Muenster) for de oprindelige LifeAct-Ruby konstruktion og Christian Junker (Saarland Universitet) til at generere LifeAct-mEGFP-konstruktionen. Dette projekt blev finansieret af Sonderforschungsbereich 1027 (projekt A2 til B.Q.) og 894 (M.H. projekt A1). Lys-ark mikroskopet blev finansieret af DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibricol, bovine collagen solution Advanced Biomatrix  #5133-20ML Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution Merck 1091381000 for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose Affymetrix 32821-10GM Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit Thermo Fisher 11348D Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation Thermo Fisher 11132D Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2 Thermo Fisher PHC0023 Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit Lonza V4XP-30XX Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG Abcam ab124904 IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin Thermo Fisher A22284 IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain Thermo Fisher C10045 Fluorescent cell label
Tween 20 Sigma P1379-250mL IF
Triton X-100 Eurobio 018774 IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline Thermo Fisher 14190250 IF
Bovine serum albumin Sigma A9418-100G IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit Thermo Fisher A-11011 IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) Zeiss N.A.
Cell culture hood Thermo Fisher HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i  Thermo Fisher N.A.
Centrifuge 5418 and 5452 Eppendorf N.A.
Pippettes Eppendorf 3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips VWR 89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tubes Sarstedt  62.554.002
Capillaries 50 µL VWR (Brand) 613-3373 Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries VWR (Brand) BRND701934 "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips Merck 1095430001 to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes BD Z230723 ALDRICH Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) Play-Doh N.A.
Imaris file converter Bitplane available at http://www.bitplane.com  Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) Bitplane available at http://www.bitplane.com  Analysis of 3D and 4D imaging data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
  2. Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
  3. Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
  4. Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
  5. Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
  6. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
  7. Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
  10. Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
  11. Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
  12. Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
  13. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
  14. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  15. Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
  16. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  17. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
  18. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  19. Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
  20. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
  21. Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  22. Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
  23. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  24. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  25. Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
  26. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  27. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  28. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).

Tags

Immunologi og infektion sag 136 lys-ark mikroskopi enkelt fly belysning mikroskopi human immun celler natural killer celler cytotoksiske T-lymfocytter celle tracking 3D imaging levende celle imaging celle fiksering i kollagen
Lys-ark mikroskopi for tre-dimensionelle visualisering af Human immun celler
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoppmeyer, R., Zhao, R., Hoth, M., … More

Schoppmeyer, R., Zhao, R., Hoth, M., Qu, B. Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells. J. Vis. Exp. (136), e57651, doi:10.3791/57651 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter