Summary
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll um Immunzellen, eingebettet in eine dreidimensionale (3D) Kollagen-Matrix mit Licht-Blatt Mikroskopie zu visualisieren. Dieses Protokoll arbeitet auch wie Zellwanderung in 3D zu verfolgen. Dieses Protokoll kann für andere Arten von Aussetzung Zellen in der 3D Matrix eingesetzt werden.
Abstract
In Vivo, Aktivierung, Verbreitung und Funktion von Immunzellen, die alle auftreten in einer dreidimensionalen (3D) Umgebung, z. B. in Lymphknoten oder Gewebe. Up to Date verlassen sich die meisten in-vitro- Systeme auf zweidimensionale (2D) Oberflächen, wie z. B. Zellkultur Platten oder Deckgläsern. Um optimal mimischen physiologischen Bedingungen in Vitroverwenden wir eine einfache 3D Kollagen-Matrix. Kollagen gehört zu den wichtigsten Komponenten der extrazellulären Matrix (ECM) und wurde häufig verwendet, um 3D Matrizen darstellen. Für 3D-Bildgebung, wird die neu entwickelte Licht-Blatt-Mikroskopie-Technik (auch bezeichnet als einziges Flugzeug Beleuchtung Mikroskopie) mit hoher Geschwindigkeit, große Eindringtiefe, geringe Bleichen und Photozytotoxizität gekennzeichnet. Darüber hinaus ist Licht-Blatt Mikroskopie besonders vorteilhaft für Langzeitmessungen. Hier beschreiben wir einer optimierten Protokoll zum Einrichten und Verarbeiten von menschlichen Immunzellen, z.B. primären menschlichen zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) und natürlichen Killer (NK) Zellen in der 3D Kollagenmatrix für die Verwendung mit der Licht-Blatt-Mikroskopie für live Cell Imaging und feste Proben. Das Verfahren zur Bildaufnahme und Analyse der Zellwanderung werden vorgestellt. Ein besonderer Schwerpunkt ist gegeben, markieren Sie wichtige Schritte und Faktoren für die Probenvorbereitung und Analyse der Daten. Dieses Protokoll kann für andere Arten von Aussetzung Zellen in einer 3D Kollagenmatrix eingesetzt werden und beschränkt sich nicht auf Immunzellen.
Introduction
Die meisten wissen über Migration Zellen stammt aus 2D Experimente1,2,3, die sind in der Regel in einem Glas oder Kunststoff-Oberfläche der Kultur/Bildgebung durchgeführt Gericht. Eine physiologische Szenario erfordert jedoch in den meisten Fällen eine 3D Mikroumgebung, in denen die extrazelluläre Matrix (ECM) eine entscheidende Rolle spielt. ECM bietet die 3D-Struktur ätherischen um richtige Zellmorphologie beizubehalten nicht nur, sondern bietet auch überleben Signale oder direktionale Hinweise für eine optimale Funktion von vielen Zellen4,5 . Daher muss eine 3D-Umgebung Zellfunktionen und Verhalten in einem Umfeld besser reflektieren die physiologischen Zusammenhang besser zu identifizieren.
Im menschlichen Körper üben die meisten Zellen vor allem Immunzellen, ihre Funktionen unter einem 3D Szenario. Zum Beispiel aktivierte T-Zellen patrouillieren Gewebe auf der Suche nach Zielzellen, naive T-Zellen durchwandern Lymphknoten auf der Suche nach ihrem cognate Antigen-präsentierenden Zellen während, die Migrationsmodus und Maschinen an die entsprechenden extrazelluläre angepasst sind Umwelt,3,6,7. Das 3D Kollagen-Gel wurde weithin als ein etabliertes und gut charakterisierten 3D Zelle Kultur System8,9,10eingesetzt worden. Unsere bisherige Arbeit zeigt, dass die primären menschliche Lymphozyten sind sehr mobil und mit einer Durchschnittsgeschwindigkeit von rund 4,8 µm/min in einem 0,25 % Kollagen-basierten Matrix11zu migrieren. Neuordnung des Zytoskeletts spielt eine Schlüsselrolle in der Zelle Migration12. Sammeln Beweise zeigt, dass Lymphozyten gelten nicht nur einen einzigen Modus der Migration noch können zwischen bestimmten Migrationsverhalten in Abhängigkeit von der Lage, Mikroumgebung, Zytokine, chemotaktische Gradienten und extrazelluläre welche Melodie Signale die Wanderungsverhalten in unterschiedlicher Weise 3.
Immunzellen Funktionen und Verhalten, z. B. Migration, Vorwölbung Bildung oder vesikulärer Transport zuverlässig zu analysieren ist es von großem Vorteil in der Lage sein, Bilder in relativ großen Mengen 3D in einer schnellen und zuverlässigen Art und Weise zu erwerben. Für 3D-Bildgebung bietet die neu entwickelte Licht-Blatt-Mikroskopie-Technologie (auch bezeichnet als einziges Flugzeug Beleuchtung Mikroskopie) eine zufrieden stellende Lösung13,14. Während imaging Acquisition, wird eine statische Licht Dünnblech generiert, um die Probe beleuchten. Auf diese Weise auf die Fokusebene kann großflächig gleichzeitig beleuchtet werden, ohne die Zellen außerhalb der Ebene. Diese Funktion ermöglicht eine hohe Geschwindigkeit mit einem drastisch reduzierten Bleichen und Photozytotoxizität. In diesem Artikel beschreiben wir wie primäre menschliche Immunzellen mit Licht-Blatt Mikroskopie zu visualisieren und analysieren Sie die Migration in einem Szenario mit 3D.
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Protocol
Für diese Studie mit Menschenmaterial (Leukozyten Reduktion System Kammern von menschlichen Blutspendern) durchgeführten Forschungsarbeiten ist berechtigt, von der lokalen Ethikkommission (Erklärung von 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) und folgt den entsprechenden Richtlinien.
1. Vorbereitung des neutralisierten Kollagen Lösung (500 µL)
- Übertragen Sie 400 µL der Stammlösung gekühlte Kollagen (10,4 mg/mL) auf eine sterile 1,5 mL-Tube unter der Haube Zelle Kultur. Fügen Sie langsam 50 µL 10 X PBS (pH-Wert 7,0-7,3) zu 400 µL der Stammlösung gekühlte Kollagen gekühlt. Mischen Sie die Lösung durch sanft das Rohr mit Ziegeln zu decken.
Hinweis: Alle Schritte in Teil 1 sollte unter einer Zelle Kultur Kapuze erfolgen. - Fügen Sie 8 µL 0.1 M NaOH in 500 µL der Kollagen-Lösung von 1,1. um den pH-Wert auf 7,2-7,6 einstellen. Verwenden Sie pH-Teststreifen (pH-Bereich: 6-10) an den pH-Wert des Gemisches zu bestimmen.
Hinweis: Volumes variieren für verschiedene Chargen von Kollagen. NaOH Lösung muss langsam gemischt werden, um Luftblasen zu vermeiden. Die Mischung sollte auf dem Eis zu Kollagen Gelierung gehalten werden. - Fügen Sie 2 µL steriler DdH2O, das Endvolumen zu 500 µL. gut mischen und dieses Kollagen-Lösung (8,32 mg/mL) auf Eis oder bei 4 ° C bis zur weiteren Verwendung zu speichern.
Hinweis: Unter dieser Bedingung neutralisierte Kollagen kann verwendet werden für 24 h Aliquote werden nicht empfohlen, um Luftblasen zu vermeiden.
2. Probenvorbereitung für Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie mit Kapillaren
- Eindringmittel beschriften der lebenden Zellen mit der gewünschten primären Fluoreszenzfarbstoffen15 oder fluoreszierende Proteine11 wie zuvor beschrieben.
- Übertragen Sie 1 × 106 Zellen in eine sterile 1,5 mL-Tube unter einer Haube Zelle Kultur. Zentrifugieren der Röhre bei 200 X g für 8 min. verwerfen des Überstands und das Pellet in 200 µL Kulturmedium aufzuwirbeln.
Hinweis: Die Zelldichte von 5 × 106 Zellen/mL wird zur Visualisierung der menschlichen Immunzelle Migration, vor allem für zytotoxische T-Lymphozyten (CTL) und natürliche Killerzellen (NK) empfohlen. - Fügen Sie 85.9 µL neutralisierte Kollagen-Lösung von 1,3. in der Zellsuspension von 2,2. und richtig mischen, um eine Kollagen-Konzentration von 2,5 mg/mL zu erreichen. Lassen Sie die Zelle/Kollagen-Mischung auf dem Eis in der Haube.
Hinweis: Angenommen, die gewünschte Konzentration von Kollagen N mg/mL, neutralisiert das Volumen der Kollagen-Lösung (für 200 µL Zellsuspension) = 200 × N /(8.32-N) - Legen Sie als nächstes den passenden Kolben in der Kapillare (Innendurchmesser ~ 1 mm) bis der Kolben 1 mm aus der Kapillare ist. Befeuchten Sie den Kolben durch Eintauchen in Kulturmedium (Abbildung 1A).
Hinweis: Dieser Schritt könnte helfen, um Luftblasen zu verhindern, wenn die Kapillare in der Zelle/Kollagen-Mischung getaucht wird. Die Kapillare und den Kolben müssen nicht steril sein. - Tauchen Sie die Kapillare in der Zelle/Kollagen-Mix von 2,3. Ziehen Sie langsam den Kolben wieder für 10-20 mm (Abbildung 1 b). Wischen Sie die äußere Wand der Kapillare mit einem Papiertuch angefeuchtet mit 70 % Ethanol Spray, die verbleibende Kollagen-Lösung zu entfernen.
- Montieren Sie die Kapillare mit Knetmasse an der Innenwand einer 5 mL-Röhre und schieben Sie die Zelle/Kollagen-Mischung an den Rand der Kapillare (Abbildung 1).
- Halten Sie die Kapillare bei 37 ° C mit 5 % CO2 für 1 h für Kollagen-Polymerisation.
- Eine 5 mL-Tube das Kulturmedium (ca. 1-2 mL) hinzufügen. Drücken Sie vorsichtig die polymerisierten Kollagen-Rute, in das Medium zu etwa 3/4 des Kollagens hängen in das Medium (Abbildung 1).
- Halten Sie die Kapillare, wie diese, bei 37 ° C mit 5 % CO2 für ein weiteres 30 min, die Kollagen-Rute mit dem Medium equilibrate.
Hinweis: Danach kann der Kollagen-Stab in die Kapillare und kultivierten weitere vor der weiteren Verwendung zurückgezogen werden.
3. die Bildaufnahme mit Licht-Blatt Mikroskopie
- Montage der Probenkammer nach Anweisungen des Herstellers.
- Aktivieren Sie die Inkubation und das Mikroskop, die Probenkammer auf 37 ° C (für live Cell imaging nur) zu erhitzen.
- Legen Sie die Kapillare in der Probenkammer und suchen Sie die Probe um den Bereich von Interesse für die Bildaufnahme zu finden.
- Aktivieren Sie die entsprechenden Laser. Legen Sie die folgenden Einstellungen: laser-Power, Belichtungszeit, Schrittweite von Z-Stapel, Start- und Endposition des Z-Stack und das Zeitintervall für das live Cell Imaging.
Hinweis: zum Beispiel, das Beispiel in Abbildung 2 abgebildet war alle 40 s 6 h bei 37 ° C mit einer Schrittweite von 1 µm (Gesamtstärke: 538 µm). Die Laserleistung war 1 % mit einer Belichtungszeit von 30 ms die Pixelgröße bei X-y-Richtung 0,23 µm. - Starten Sie die Bildaufnahme.
4. automatische Tracking-Analyse
- Öffnen Sie die Datei-Konverter, klicken Sie auf Dateien hinzufügen wählen Sie die bildgebenden Datei(en) in der Software-Datei-Format (*.ims) umgewandelt werden. Klicken Sie auf Durchsuchen und wählen Sie einen Ordner für die konvertierten Dateien speichern. Klicken Sie auf Start alle.
- Öffnen Sie die Analysesoftware. Klicken Sie zu übertreffen. Gehen Sie auf Datei und klicken Sie auf Öffnen, dann wählen Sie die Image Datei analysiert werden.
Hinweis: Wenn die Datei groß ist dieser Schritt dauert. Dateien, die größer als 1 Terabyte (TB) sind nicht zu empfehlen für ein einziges Experiment als den Prozess so große Dateien sind höchst Rechenkapazität anspruchsvoll. - Klicken Sie auf hinzufügen neue Spots. Aktivieren Sie das Kontrollkästchen Prozess ganze Bild schließlich. Klicken Sie auf weiter.
- Geben Sie die Koordinaten für x und y (in Pixel), die Region von Interesse zu definieren. Geben Sie die Anzahl der Frames (Zeit und Z-Position) zu analysieren. Klicken Sie auf weiter.
- Wählen Sie den Ziel-Kanal, der zu verfolgenden Objekte enthält, in der Dropdown-Liste der Quellkanal. Geben Sie die geschätzte Xy Durchmesser (in µm). Klicken Sie auf weiter.
Hinweis: Geschätzte Xy Durchmesser beträgt der durchschnittliche Durchmesser in der X-y-Dimension von Objekten verfolgt werden. - Klicken Sie auf Qualität. Legen Sie einen Schwellenwert, in dem meisten Zellen (Objekte) eingeschlossen werden sollen. Klicken Sie auf weiter.
- Wählen Sie den gewünschten Algorithmus (Autoregressive Bewegung wird empfohlen). Geben Sie die maximale Entfernung (20 µm wird empfohlen) und die maximale Lückengröße (3 oder 2 wird empfohlen). Klicken Sie auf Prozess ganze Bild schließlich.
Hinweis: Max. Entfernung und Max. Größe der Lücke sind zwei Schwellen, Schienen zu brechen. Genauer gesagt, in zwei kontinuierliche Rahmen überschreitet die Distanz zwischen demselben Objekt max. Entfernung, dieses Objekt in dem späteren Bild als neues Objekt gelten. Manchmal während der Akquisition kann dasselbe Objekt für ein paar Frames verschwinden und wieder auftauchen. In diesem Fall nur dann, wenn dieses Objekt innerhalb der Max Lückengröße erscheint, es als das gleiche Objekt gelten. - Klicken Sie auf Filter-Typ und wählen Sie die Option zum Ausschließen von unerwünschter Spuren.
Hinweis: Dieser Schritt ist optional. - Klicken Sie auf weiter und klicken Sie dann auf Beenden.
Hinweis: Dieser Schritt dauert Stunden bis Tage, je nach Rechenleistung. - Klicken Sie auf Bearbeiten Tracks und wählen Sie Richtige Driftzu. Wählen Sie den entsprechenden Algorithmus (Translationale Drift wird empfohlen). Wählen Sie das gewünschte Ergebnis-Dataset-Größe (Neue Größe gleich aktuelle Größe wird empfohlen). Klicken Sie auf "OK".
Hinweis: Dieser Schritt ist nur erforderlich, wenn das Kollagen während der Bildaufnahme trieb. - Klick- Statistik und wählen Sie Konfigurieren der sichtbaren Statistiken Listenwerte. Überprüfen Sie die Optionen von Interesse sein (z. B. Koordinaten, Geschwindigkeit usw.) exportiert. Klicken Sie auf "OK".
- Klicken Sie auf Exportieren alle Statistiken auf Datei , und geben Sie den Dateinamen.
5. Fixierung und Immunfluoreszenz Färbung der Zellen im Kollagen Matrizen
- Übertragen Sie 1.000 µL 4 % Paraformaldehyd (PFA, mit PBS-Puffer) in eine 5 mL-Tube unter einer chemischen Kapuze.
Hinweis: PFA sollte auf Raumtemperatur ausgeglichen werden. - Tauchen Sie die Kapillare mit polymerisierten Kollagen von 2,9. in PFA-Lösung (für ~ 5 mm) und montieren Sie die Kapillare an der Innenwand der 5 mL-Tube mit Knetmasse (siehe Abbildung 1).
- Drücken Sie den Kolben vorsichtig, bis die Hälfte der Kollagen-Stange hängt in der PFA-Lösung (Abbildung 1). Halten Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 20 min.
- Ziehen Sie den Kolben um den Kollagen-Stab innerhalb der Kapillare zu erhalten. Nehmen Sie die Kapillare und verwerfen Sie PFA zu.
- Montieren Sie die Kapillare in ein frisches Gefäß und fügen Sie 1 mL PBS. Stellen Sie sicher, dass die Kapillare in die PBS eingetaucht ist.
- Drücken Sie den Kolben vorsichtig, bis die Hälfte der Kollagen-Stange hängt in der Lösung. Montieren Sie die Kapillare an der Innenwand mit Knetmasse.
- Halten Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 5 Minuten.
- 5.4 zu wiederholen. -5,7 für weitere 2 mal.
- Ziehen Sie den Kolben um den Kollagen-Stab innerhalb der Kapillare zu erhalten. PBS zu verwerfen. 1-2 mL blockiert/Permeabilisierung Puffer (PBS + 1 % BSA + 0,1 % nicht-ionische Tenside) in das Rohr zu übertragen und 5.6 zu wiederholen.
Hinweis: Die BSA (1 %) kann durch 5 % Serum des Tieres ersetzt werden, wie die sekundäre Ab in angesprochen wurde. - Halten Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 30-60 Minuten.
- Ziehen Sie den Kolben um den Kollagen-Stab innerhalb der Kapillare zu erhalten. Entsorgen Sie die Permeabilisierung Puffer. 200-500 µL Primärantikörper in blockieren/Permeabilisierung Puffer übertragen und scheidet den Stab in die Lösung.
- Halten Sie das Rohr bei Raumtemperatur für 1 h.
- Waschen Sie die Kollagen-Rute 3 Mal mit PBST (PBS + 0,1 % nicht-ionische Tenside) wie in 5.4 beschrieben. -5.8.
- Inkubieren Sie die Rute in sekundären Antikörper blockieren/Permeabilisierung Puffer für 1 h bei Raumtemperatur. Halten Sie es vor Licht.
- Waschen Sie die Kollagen-Rute 3 Mal mit PBS, wie in 5.4 beschrieben. -5.8.
- Ziehen Sie den Kolben um den Kollagen-Stab innerhalb der Kapillare zu erhalten. Bewahren Sie die Proben mit PBS-Puffer bis Bildgebung.
- Scannen Sie die Proben, wie unter 3 beschrieben.
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Representative Results
Protrusion Formation während der T-Zell-Migration ist ein sehr dynamischer Prozess, der Aktin angewiesen ist. Um Vorsprung Bildung der primären menschlichen CTL zu visualisieren, transfizierten wir vorübergehend ein mEGFP verschmolzen Protein Aktin-Zytoskeletts in CTL wie beschrieben vor11beschriften. Einen Tag nach Transfektion, wurden die Zellen in der Kollagenmatrix eingebettet. Bild-Stacks erworben wurden alle 40 s mit einer Schrittweite von 1 µm bei 37 ° C mit Licht-Blatt-Mikroskopie. Wie in Abbildung 2A und ergänzende Film 1, während der Migration, CTL Menschengestalt Zitrone-förmige große Vorsprünge, umsäumt von feinen Spindel-ähnliche Strukturen. In das Experiment gezeigt hier, nicht nur eine einzelne Zelle abgebildet war, sondern ein großes Volumen (450 x 450 x 538 µm3) (Abb. 2 b). So, die optische Qualität und Auflösung, die hier gezeigt wurden mit geringer Vergrößerung Zielsetzung erhalten (20 X / 1,0 DIC VIS-IR). Daher könnte die Auflösung mit höheren NA Zielen weiter verbessert werden.
Im Experiment gezeigt in Abbildung 2 und Film 1wurden CTLs automatisch verfolgt, wie in dem Protokoll Teil 4 beschrieben. Die Flugbahnen der CTL sind in Abbildung 2 bdargestellt. Zwei Parameter der Migration wurden analysiert: Geschwindigkeit und Ausdauer. Persistenz bezeichnet die Verschiebung dividiert durch die gesamte Streckenlänge. Die Analyse zeigt, dass die Mobilität der CTL sehr vielfältig in 3D ist: die Geschwindigkeiten reichen von 0,01-0,19 µm/s mit einer fast 20-fold Unterschied und die Ausdauer reicht von 0 - 0,7 (Abbildung 2). Bei Mäusen wurde berichtet, dass in Vivo interstitielle durchschnittliche Geschwindigkeit der Migration der T-Zellen 4 µm/min16Jahre alt war. Vor kurzem haben wir die durchschnittliche Geschwindigkeit des CTL 4-5 µm/min11 mit den in diesem Dokument beschriebenen Methoden werden festgelegt. Diese Ergebnisse zeigen, dass diese Licht-Blatt-Mikroskopie ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Zelle Verhalten, z. B. Zellwanderung und Zell-Zell-Interaktion zu visualisieren. In Vivo, viele Faktoren und einem inhomogenen ECM der komplexen Zusammensetzung einschließlich lösliche Faktoren, die Migration beeinflussen können werden T-Zell-Verhalten ändern.
Anwendung einer Kollagen-Matrix ist nicht beschränkt, Zellen zu leben. Fixierung und Immunostaining können auch in der Matrix durchgeführt werden. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für feste Proben in 3D Kollagen-Gel auf die endogene perforin1 (PFN1) und Actin waren voller Flecken. Die Probe wurde beleuchtet entweder aus einer einzigen Seite (einzelne Seite Beleuchtung) oder beidseitig (Dual Seite Beleuchtung). Wir beobachten, dass Zellen an verschiedenen Z-Positionen gleichmäßig gefärbt sind, darauf hinweist, dass in unserem Protokoll beschriebene Verfahren zufrieden stellend Eindringen von Antikörpern in Kollagen Gele erreichen. Noch wichtiger ist, nach Fixierung CTL die gleiche Morphologie wie in ausgestellt live Cell Imaging (Vergleiche Abbildung 3 und Abbildung 2 b), darauf hinweist, dass auch die Morphologie durch dieses Protokoll gepflegt wird. Darüber hinaus macht Beleuchtung aus dem einseitig oder beidseitig einen signifikanten Unterschied in der Qualität der Bilder nicht in der Brennebene. Wenn man bedenkt, dass der Laser mit dem Modus der einseitige Beleuchtung im Vergleich zu dual Seite Beleuchtung weniger Fläche ausgesetzt ist, empfiehlt sich eine einseitige Beleuchtung mehr.
Abbildung 1: Darstellung der Umgang mit Kapillaren während der Probenvorbereitung. Setzen Sie (A) den Kolben in die Kapillare und wie man den Kolben mit dem Kulturmedium nass. (B) ziehen Sie die Zelle/Kollagen-Mischung in die Kapillare. Montieren Sie (C) Kapillaren mit Modelliermasse. Der Kolben und der Kollagen-Stab werden in grauen und roten Feldern dargestellt. Behandeln Sie (D) Kollagen Rute für Gleichgewichtherstellung mit dem Kulturmedium oder Immunostaining. Der Kolben und der Kollagen-Stab werden in grauen und roten Feldern dargestellt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Tracking primären menschlichen CTL in 3D Kollagen und Visualisierung von Aktin Dynamik. (A) maximale Intensität Projektion von Aktin in primären menschlichen CTL. Aktin wurde in CTL als zuvor beschriebenen11bezeichnet. Ersten Tag post Transfektion von Zellen in 0,5 % Kollagen-Matrix eingebettet wurden. Eine repräsentative Zelle wird angezeigt. Maßstabsleisten sind 5 µm. feine Aktin Strukturen am Rande Vorsprung durch die Pfeilspitze markiert sind. (B) Bahnen der CTL für 6 h. Die Bahnen werden von der Software automatisiert verfolgt (Farbcode: blau = Start, rot = Ende des Tracks, 450 × 450 × 538 µm3 Volumen). Der Maßstab ist 50 µm. (C) Quantifizierung der Geschwindigkeit und Ausdauer. Ein Punkt steht für eine Zelle. Ergebnisse werden angezeigt, da ± SEM von 4 Spendern bedeuten. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Immunostaining des endogenen profilin1 (PFN1) und Actin in CD8+ T Zellen in der 3D Kollagenmatrix eingebettet. Primäre menschliche CD8+ T Zellen wurden in 0,25 % Kollagen eingebettet. Nach der PFA Fixierung war die Probe gefärbt, mit Anti-PFN1 (Orange) und Phalloidin (lila) und von Licht-Blatt Mikroskopie bei einer Schrittweite von 1 µm für ein Gesamtvolumen von 440 x 440 x 1.000 µm3visualisiert. Die Probe wurde beleuchtet entweder aus einer einzigen Seite (einzelne Seite Beleuchtung) oder beidseitig (Dual Seite Beleuchtung). Maximale Intensität Projektionen (MIP) aus 3D Rekonstruktion werden angezeigt. Der Maßstabsbalken sind 50 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Movie 1: Generation Vorsprünge während T Zellwanderung. Die Zelle, die im Film gezeigt wurde das Volumen, dargestellt in Abbildung 2Aentnommen. Zellen waren eingebettet in eine Kollagen-Matrix (0,5 %). Bilder erworben wurden alle 40 s 6 h bei 37 ° C mit Licht-Blatt-Mikroskopie. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
Die meisten in-vitro- Tests sind auf einer 2D Oberfläche, zum Beispiel in Petrischalen Zellkultur Platten oder auf Deckgläsern, durchgeführt, während in Vivo Zellen, vor allem Immunzellen, vor allem eine 3D Mikroumgebung erleben. Anzeichen dafür zeigt, dass Migrationsmuster von Immunzellen zwischen 2D und 3D Szenarien17unterscheiden. Die expressionsprofile von Tumorzellen unterscheiden sich darüber hinaus auch in 2D und 3D kultiviert Gewebe18,19,20. Daher, um am besten die physiologischen Bedingungen in Vitrozu simulieren, ist es von großem Vorteil in einem 3D Kontext, zum Beispiel in 3D Kollagen Matrizen Experimente durchführen. Die neu entwickelten Ansätze, insbesondere die Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie ermöglicht zuverlässige und reproduzierbare Experimente in 3D Matrix-Systeme unter kontrollierten Umweltbedingungen.
Im Gegensatz zu einer konventionellen Laserscanning-konfokale Mikroskopie, die ganze Sonde, mit Licht-Blatt-Mikroskopie erhellt, wird nur eine dünne Folie aus Laserlicht erzeugt, um Proben zu beleuchten. Die Erkennung Kamera ist senkrecht zur Ebene beleuchten. Aufgrund dieser Technik ist nur der Abschnitt in der Brennebene des Lasers ausgesetzt. Daher können Foto-Bleichen und Phototoxizität minimiert werden. Darüber hinaus im Vergleich zu Punkt-scanning-Mikroskopie, die Erfassungsrate wird drastisch verbessert, mit Licht-Blatt Mikroskopie (100 - 1,000-fold schneller) und das Signal-Rausch-Verhältnis ist auch gelindert. Kombiniert mit der Inkubation Kammer des Licht-Blatt Mikroskopie-Setup verwendet in diesem Papier dieses Mikroskop ist eine leistungsstarke Option für die Bildaufnahme 3D großvolumige mit minimierten Bleichen und Foto-Schäden über längere Zeiträume (mehrere Tage) unter Inkubator-Bedingungen.
Für die Probenvorbereitung mit 3D Kollagen-Matrix ist den kritischsten Punkt um Luftblasen zu vermeiden. Aufgrund seiner hohen Viskosität wenn Luftblasen, die Kollagen-Lösung eingeführt werden, ist es sehr schwierig, es aus der Lösung zu entfernen. Das Vorhandensein von Luftblasen induzieren kann Heterogenität der Polymerisation von Kollagen-Matrix; Darüber hinaus kann es den Weg des Lichtes, blockieren, die die Qualität der Bilder verringern würde. Daher bei der Übertragung oder mischen Sie die Kollagen-Lösung eine pipette muss sehr vorsichtig und nicht den letzten Tropfen in die PIPETTENSPITZE vertreiben. Darüber hinaus beginnt Kollagen bei Raumtemperatur langsam zu polymerisieren. So sollte zur Vermeidung Polymerisation vor dem Mischen der Lösung auch die Kollagen-haltige Rohre immer auf Eis gehalten werden.
Eine große Herausforderung begegnen wir bei der Einstellung von Licht-Blatt Mikroskopie ist Umgang mit Daten. Von Licht-Blatt Mikroskopie erzeugten Daten können leicht die Größe von 500 Gigabyte oder sogar mehrere Terabyte insbesondere für langfristige Experimente erreichen. Um diese Daten zu analysieren dauert mehrere Tage, manchmal bis zu einer Woche durch ein Arbeitsplatz mit hoher Rechenkapazität. Da die Größe der analysierten Bilder nicht kleiner ist als die ursprünglichen Daten kann die Kapazität des Speichers schnell ein limitierender Faktor für die Anwendung der Licht-Blatt Mikroskopie werden. Daher für Tracking-Experimente oder ggf. komplexe Bildanalyse empfiehlt es, die Dateigröße pro Experiment, um Werte zu begrenzen, die in einem angemessenen Zeitrahmen durch die verfügbaren Processing Units behandelt werden können.
Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie hier eingeführt hat einige Features, die die Ergebnisse beeinflussen könnten, wenn nicht sorgfältig behandelt. Die Nutzung der Kapillaren ist besonders vorteilhaft für eine barrierefreie Beleuchtung der Proben. Da der Kollagen-Stab in das Medium hängt, kann es vorkommen, das Kollagen Stab während der Bildaufnahme, vor allem für Langzeitmessungen driftet. Diese Drift muss korrigiert werden, um Fehlinterpretationen der Ergebnisse zu vermeiden. Natürlich gibt es andere Licht-Blatt Mikroskopie-Setups im Handel erhältlich auf dem Markt, die keine Kapillaren zu montieren Sie die Proben erfordern. Darüber hinaus bleibt mit der Licht-Blatt-Mikroskopie, neben der Tatsache, die im Vergleich zu den konventionellen Linie Scan konfokalen Mikroskopie Phototoxizität erheblich reduziert wurde, Phototoxizität ein Anliegen für langfristige bildgebenden21.
Abgesehen von Licht-Blatt-Mikroskopie gibt es andere Ansätze für die 3D Fluoreszenz-Bildgebung, unter der die meist angewandte konfokalen Mikroskopie, Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskopie und multiphoton Mikroskopie sind etabliert. In Bezug auf die Eindringtiefe konfokale und Weitfeld-Fluoreszenzmikroskopie liegen im ähnlichen Bereich, normalerweise beschränkt auf 100 nm22. Aufgrund der längeren Wellenlänge Licht für Multi-Photonen-Mikroskopie verwendet kann die Eindringtiefe in den Bereich von 0,5 - 1 mm23verbessert werden. Im Vergleich dazu kann die Größe der Multi-dimensionale Bilder erzeugt durch optische Aufteilung der Licht-Blatt Mikroskopie bis zu mehreren Millimetern24. In Bezug auf die laterale Auflösung zeigt ein elegant durchgeführten Experiment, dass Licht-Blatt-Mikroskopie bietet eine bessere dreidimensionale räumliche Auflösung im Vergleich zu konfokale Fluoreszenzmikroskopie in großen25Proben. Vor kurzem wurde Licht-Blatt Mikroskopie mit zwei-Photonen-Technik, die weiter verbessert die Eindringtiefe im Vergleich zu normalen einer Photonen-Licht-Blatt-Mikroskopie und ist zehnmal schneller als Scannen von Punkt zwei-Photonen-Mikroskopie kombiniert26.
In Anbetracht der 3D Matrix, die die Mikroarchitektur für Zellen, neben bovinen Kollagen bietet in diesem Dokument verwendeten gibt es viele andere Optionen, wie z. B. der extrazellulären Matrix (ECM) abgeleitet von Mauszellen Sarkom, Agarose, synthetischen Hydrogelen oder andere biokompatible polymerer Werkstoffe. Maus-Sarkom ECM ist eine Proteinmischung einschließlich Kollagen IV, Laminin, sowie zahlreiche Wachstumsfaktoren. Im Vergleich zu den synthetischen Materialien, biologische ECMs (Kollagen und Maus Sarkom ECM), auf der einen Seite präsentieren mehr physiologisch relevanten Kontext; aber auf der anderen Seite die Qualität und Zusammensetzung biologischer ECMs variieren zwischen Chargen und Unternehmen. Im Gegensatz dazu ist die Reproduzierbarkeit der synthetischen Materialien garantiert. Bemerkenswert ist, ist Feinabstimmung der biochemischen und mechanischen Eigenschaften, sowie die gewünschten Änderungen für synthetische Materialien, nicht aber für biologische ECMs10,27erlaubt.
Zusammenfassend lässt sich sagen in diesem Dokument beschriebenen wir ein Protokoll, um 3D Kollagen-Matrix für Zelle Biologie Experimente mit Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie und Gewusst wie: Einbetten primären menschlichen CTL in die 3D Kollagen-Matrix zu visualisieren und Analysieren von CTL Migration zu konstruieren. Wir haben die wichtigsten Punkte in der Probenvorbereitung, Bildaufnahme und der Analyse. Unsere Ergebnisse zeigen, dass die Bildung von hochdynamischen Vorsprünge und feine Aktin Strukturen durch Licht-Blatt Mikroskopie mit einer guten räumlich-zeitliche Auflösung sichtbar gemacht werden kann. Darüber hinaus ermöglicht das Analyse-Protokoll hier beschriebenen Zellen in objektiver und automatisierte Weise zuverlässig verfolgen. Diese Methode wird besonders vorteilhaft für die immunologische Forschung wie Mäuse und Menschen unterscheiden sich erheblich in vielen immunologischen Funktionen und Reaktivität auf Therapien28.
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Disclosures
Die Autoren erklären keine finanzielle oder kommerzielle Interessenkonflikt.
Acknowledgments
Wir danken dem Institut für klinische Hemostaseology und Transfusionsmedizin für die Bereitstellung von Spenderblut; Carmen Hässig und Cora Hoxha für ausgezeichnete technische Hilfe. Wir danken Jens Rettig (Universität des Saarlandes) für den modifizierten pMAX-Vektor, Roland Wedlich-Söldner (Universität Münster) für das original LifeAct-Ruby-Konstrukt und Christian Junker (Universität des Saarlandes) zur Erzeugung der LifeAct-mEGFP-Konstrukt. Dieses Projekt wurde gefördert vom Sonderforschungsbereich 1027 (Projekt A2, B.Q.) und 894 (Projekt A1, m.h.). Das Licht-Blatt-Mikroskop wurde finanziert durch die DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
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