Summary
Burada, bağışıklık hücreleri ışık sayfalık mikroskobu kullanarak üç boyutlu (3D) kolajen dizey içinde gömülü görselleştirmek için bir iletişim kuralı mevcut. Bu iletişim kuralı da hücre göç 3D iz sürmeyi ayrıntılandırdığı. Bu iletişim kuralı 3D Matris hücrelerinde süspansiyon diğer türleri için istihdam edilebilir.
Abstract
Vivo, harekete geçirmek, yayılması ve bağışıklık hücreleri tüm fonksiyonu bir ortamında üç boyutlu (3D), örneğin lenf düğümleri veya doku oluşur. Tarihe kadar iki boyutlu (2D) yüzeyler, hücre kültürü plakaları veya coverslips gibi çoğu vitro sistemde güveniyor. En iyi şekilde kopyalama fizyolojik şartlarda vitroiçin biz basit 3D kollajen matris kullanmaktadır. Kollajen hücre dışı matriks (ECM) ana bileşenlerini ve yaygın olarak 3B matrisleri oluşturmak için kullanılan. 3D görüntüleme için (tek uçak aydınlatma mikroskobu da bilinir) son zamanlarda gelişmiş ışık sayfalık mikroskobu teknoloji yüksek satın alma hızı, büyük penetrasyon derinliği, düşük beyazlatma ve photocytotoxicity bulunmamaktadır. Ayrıca, ışık sayfalık mikroskobu özellikle uzun vadeli ölçüm için avantajlıdır. Burada nasıl ayarlamak ve insan bağışıklık hücreleri, Örneğin birincil insan sitotoksik T lenfositler (CTL) işlemek en iyi duruma getirilmiş bir protokolü açıklar ve doğal öldürücü (NK) hücreleri canlı hücre görüntüleme için ışık sayfalık mikroskobu ile kullanım için 3D kollajen matris ve sabit örnekleri. Resim alma ve çözümleme hücre göç prosedürü sunulmaktadır. Belirli bir odak kritik adımlar ve numune hazırlama ve veri analizi için etkenler vurgulamak için verilir. Bu iletişim kuralı bir 3D kollajen Matris hücrelerinde süspansiyon diğer türleri için istihdam ve bağışıklık hücreleri için sınırlı değildir.
Introduction
Geçiş hakkında birçok bilgi hücreleri gelir üzerinden 2D deneyleri1,2,3, hangi normal bir cam veya plastik yüzey bir kültür/görüntüleme yapılmaktadır çanak. Ancak, fizyolojik bir senaryo, çoğu durumda, hücre dışı matriks (ECM) belirleyici bir rol oynayan bir 3D microenvironment gerektirir. ECM sadece uygun hücre morfolojisi korumak için 3D yapısı temel sağlar ama aynı zamanda yaşam sinyalleri veya bir en uygun birçok hücre4,5 / işlemesi için yön ipuçları sunmaktadır. Bu nedenle, bir 3D çevre hücresel işlevler ve davranış fizyolojik içeriği daha iyi yansıtan bir ortamda daha iyi tanımlamak için gereklidir.
İnsan vücudunda en hücreleri özellikle bağışıklık hücreleri, onların işlevler'in altında bir 3D senaryo uygulamayın. Örneğin, aktive T hücreleri hedef hücreler için arama doku devriye, saf T hücreler lenf düğümleri sırasında geçiş modu ve makine ekstraselüler karşılık gelen için adapte olmuşlardır soydaş antijen sunan hücreler için arama üzerinden göç çevre3,6,7. 3D kollajen jel yaygın bir iyi kurulmuş ve iyi karakterize 3D hücre kültür sistemi8,9,10kullanılmıştır. Önceki çalışmalarımız birincil insan lenfosit son derece mobil ve yaklaşık 4.8 µm/dk % 0.25 kollajen tabanlı matris11' deki ortalama bir hızda geçiş gösterir. Sitoiskeleti düzenlenmesi Hücre geçiş12içinde önemli bir rol oynar. Kanıt biriken lenfosit göç sadece tek bir mod geçerli değildir henüz yer, microenvironment, sitokinler, kemotaktik degradeler bağlı olarak bazı geçiş davranışı arasında geçiş yapabilirsiniz ve ekstraselüler hangi melodi sinyalleri gösterir göçmen davranış farklı yolu 3.
Bağışıklık hücre fonksiyonları ve davranış, örneğin, göç, çıkıntı oluşumu veya veziküler ulaşım, güvenilir bir şekilde çözümlemek için görüntüleri nispeten büyük 3B cilt olarak hızlı ve güvenilir bir şekilde elde edebilmek için büyük avantaj taşımaktadır. 3D görüntüleme için tatmin edici bir çözüm13,14(tek uçak aydınlatma mikroskobu da bilinir) son zamanlarda gelişmiş ışık sayfalık mikroskobu teknoloji sunmaktadır. Edinme görüntüleme sırasında ince bir statik hafif levha örnek aydınlatmak için oluşturulur. Bu şekilde, odak düzlem üzerinde geniş bir alanda aynı anda uçak-hücreleri etkilemeden aydınlatılmış. Bu özellik, bir büyük ölçüde azaltılmış ağartma ve photocytotoxicity ile bir yüksek satın alma hızı sağlar. Bu yazıda, birincil insan bağışıklık hücreleri ışık sayfalık mikroskobu kullanarak görselleştirmek ve 3D senaryosunda geçiş analiz anlatan.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada insan malzeme (lökosit azaltma sistem odaları insan kan bağış) ile yürütülen araştırma Yerel Etik Komitesi (bildirim 16.4.2015 (84/15; dan tarafından yetki Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) ve karşılık gelen kuralları izler.
1. hazırlanması etkisiz kollajen çözüm (500 µL)
- Soğutulmuş kollajen hisse senedi çözüm (10.4 mg/mL) 400 µL hücre kültür başlık altında bir steril 1,5 mL tüp aktarın. Yavaş yavaş, 50 µL 10 x (pH 7,0-7,3) PBS'ye soğutulmuş kollajen hisse senedi çözüm 400 µL soğutulmuş ekleyin. Çözüm yavaşça tüp fayans tarafından karıştırın.
Not: Bölüm 1 tüm adımları bir hücre kültür başlık altında yapılmalıdır. - 0.1 M NaOH 8 µL 1.1--dan kolajen çözüm 500 µL ekleyin. pH 7.2-7,6 için ayarlamak için. PH Ölçüm Çubuğu Strip kullanın (pH Aralığı: 6-10) karışımı pH değerini belirlemek için.
Not: Birimleri kollajen farklı gruplar için farklı olabilir. Yavaş yavaş hava kabarcıklarını önlemek için karışık olması NaOH çözümü vardır. Karışım kollajen jelleşme önlemek için buz üstünde tutulmalıdır. - 2 eklemek son hacim 500 µL. için yapmak için steril GKD2O µL iyice karıştırın ve bu kollajen çözüm (8.32 mg/mL) buz üzerinde veya 4 ° C'de daha fazla kullanmak kadar saklamak.
Not: Bu durum altında etkisiz kollajen kullanılabilir için 24 h hava kabarcıklarını önlemek için Aliquots tavsiye edilmez.
2. numune hazırlama için kılcal kullanarak ışık sayfalık floresans mikroskobu
- Fluorescently istenen birincil floresan boyalar15 veya floresan proteinler11 ilgi canlı hücreleri daha önce açıklandığı gibi etiketleyin.
- 1 × 106 hücre hücre kültür başlık altında bir steril 1,5 mL tüp içine aktarın. 200 x g 8 dk. atmak için de tüp süpernatant santrifüj kapasitesi ve Pelet kültür orta 200 µL içinde resuspend.
Not: 5 × 106 hücre/mL hücre yoğunluğu görselleştirme sitotoksik T lenfositler (CTL) ve doğal öldürücü (NK) hücreler için özellikle insan bağışıklık hücre göç için önerilir. - Etkisiz kollajen çözüm 85,9 µL 1,3 ekleyin. 2.2 üzerinden hücre süspansiyon. ve 2.5 mg/mL bir kollajen konsantrasyon ulaşmak için düzgün karıştırın. Hücre/kollajen karışımı buz başlıklı açık bırak.
Not: kollajen istenen konsantrasyonu N mg/mL olduğunu varsayalım, ses düzeyini nötralize kollajen çözüm (için 200 µL hücre süspansiyon) = 200 × N /(8.32-N) - Daha sonra eşleşen pistonu kılcal damar koymak (iç çap ~ 1 mm) pistonu kılcal dışında 1 mm kadar. Pistonu kültür orta (Şekil 1A) daldırma tarafından ıslak.
Not: Bu adım kapiller hücre/kollajen karışımı içine daldırma hava kabarcıklarını önlemek için yardımcı. Kılcal damar ve pistonu steril olması gerekmez. - Kılcal 2.3 hücre/kollajen karışımından içine daldırma. Yavaşça çek pistonu geri için 10-20 mm (Şekil 1B). Kılcal dış duvarına kalan kollajen çözümü kaldırmak için % 70 etanol sprey ile nemlendirilmiş bir kağıt havlu ile silin.
- Kil 5 mL tüp iç duvarında modelleme ile kılcal dağ ve hücre/kollajen mix kılcal (Şekil 1 c) kenarına doğru itin.
- Kılcal 37 ° C % 5 CO2 kollajen polimerizasyon için 1 h için tutun.
- Kültür orta (yaklaşık 1-2 mL) 5 mL tüp ekleyin. Dikkatlice dışarı polimerli kollajen çubuk yaklaşık 3/4 Orta (Şekil 1 d) asılı kollajen ortamına basın.
- Kılcal böyle, % 5 CO2 orta kollajen demiriyle equilibrate başka bir 30 dk 37 ° C'de tutun.
Not: Daha sonra kollajen çubuk geri kapiller ve kültürlü daha fazla kullanılmadan önce daha da çekilebilir.
3. resim alma ışık sayfalık mikroskobu kullanarak
- Derleme üreticinin yönerge göre örnek odası.
- Kuluçka ve 37 ° C (canlı hücre yalnızca görüntüleme için) örnek odasına ısıtmak için mikroskop açın.
- Kılcal örnek odasında yerleştirin ve ilgi alanı resim alma için bulmak için örnek bulun.
- Karşılık gelen lazer aktif hale getirin. Aşağıdaki ayarları ayarla: lazer güç, pozlama süresi, adım-z-yığın, başlangıç ve bitiş konumları z-yığın ve canlı hücre görüntüleme için zaman aralığı boyutunu.
Not: Örneğin, Şekil 2 ' deki örnek yansıma her 40 adım büyüklüğü 1 µm ile 37 ° c 6 h s (toplam kalınlığı: 538 µm). Lazer güç 30 Bayan x-y yönünde piksel boyutunda bir çekim hızı ile %1 0,23 µm olduğunu. - Resim alma başlatın.
4. otomatik izleme çözümlemesi
- Dosya dönüştürücüsünü açıkken, (*.ims) yazılım dosya biçimine dönüştürmek için görüntü dosyaları seçmek için Dosya Ekle'yi tıklatın. Gözat ' ı tıklatın ve dönüştürülmüş dosyaları kaydetmek için bir klasör seçin. Tüm Başlat' ı tıklatın.
- Analiz yazılımı açın. Aşmak' ı tıklatın. Dosya gidin ve Aç' ı tıklatın, ardından çözümlenmesi için görüntü dosyasını seçin.
Not: dosya boyutu büyük ise bu adım zaman alabilir. 1 terabayt (TB) büyük dosyaları tavsiye edilmez tek bir deneme için işlem olarak böyle büyük dosyalardır son derece Hesaplamalı kapasite talep. - Yeni noktalar Ekleseçeneğini tıklatın. İşlemi tüm görüntü sonundakutuyu işaretleyin. İleri' yi tıklatın.
- X için koordinatları girin ve y (için piksel) bölgenin ilgi tanımlamak için. (Zaman ve z-pozisyon) çözümlemek için kare sayısını girin. İleri' yi tıklatın.
- İzlenmesi gereken nesneleri içerir, hedef kanal Kaynak kanalıaşağı açılan listesinde seçin. Tahmini xy çapı (µm) girin. İleri' yi tıklatın.
Not: Tahmini xy çapı ortalama çap x-y boyut izlenmesi gereken nesneler olduğunu. - Kalitesi' ni tıklatın. (Nesneler) hücrelerin çoğu dahil edilecek bir eşik ayarlamak. İleri' yi tıklatın.
- İstenen algoritma (Autoregressive hareketli önerilir) seçin. Maksimum uzaklığı girin (20 µm önerilir) ve maksimum boşluk boyutu (3 veya 2 önerilir). İşlemi tüm görüntü son olarak'ıtıklatın.
Not: Max mesafe ve en büyük boşluk boyutu parça kırmak için iki eşikleri vardır. Aynı nesne arasındaki uzaklığı Max mesafe aştığında daha ayrıntılı olarak, iki sürekli çerçevelerde bu nesne daha sonra çerçeve içinde yeni bir nesne olarak kabul edilecektir. Bazen satın alma sırasında aynı nesne için birkaç kare kaybolur ve tekrar ortaya. Bu durumda, yalnızca bu nesne içinde en büyük boşluk boyutu yeniden görüntülenir zaman, aynı nesne olarak değerlendirilir. - Filtre türü tıklatın ve istenmeyen parçaları dışlamak için seçeneği seçin.
Not: Bu isteğe bağlı bir adımdır. - İleri ' yi tıklatın ve sonra son' u tıklatın.
Not: Bu adımı saat bilgisayar performansına bağlı olarak gün kadar sürebilir. - Parça Düzenle'yi tıklatın ve Doğru Driftseçin. (Translasyonel Drift önerilir) uygun algoritma seçin. İstediğiniz Sonuç veri kümesi boyutu seçin (Yeni boyutu geçerli boyutuna eşit tavsiye edilir). Tamam' ı tıklatın.
Not: Bu sadece bir adımdır gerekli resim alma sırasında kolajen sürüklendi. - İstatistikler ' i tıklatın ve Yapılandırdığınız liste, görünür istatistik değerleriseçin. Kontrol seçenekleri ilgi olmak (koordinatları, hız ve benzeri gibi) ihraç. Tamam' ı tıklatın.
- Tüm istatistiklerini dosyasına dışa aktar'ı tıklatın ve dosya adı girin.
5. fiksasyon ve ayirt kollajen matrisler hücrelerinin boyama
- %4 paraformaldehyde (PFA, PBS) 1.000 µL kimyasal bir başlık altında 5 mL tüp içine aktarın.
Not: PFA oda sıcaklığına dengeli olmalıdır. - Kılcal 2,9 dan polimerli kollajen ile daldırma. İngiltere'de yılın çözüm içine (için ~ 5 mm) ve kılcal ( Şekil 1 ciçinde gösterildiği gibi) kil modelleme ile 5 mL tüp iç duvara monte edin.
- Kollajen çubuk yarısı asılı 's kadar İngiltere'de yılın çözüm (Şekil 1 d) pistonu hafifçe bastırın. Tüp, oda sıcaklığında 20 dakika tutun.
- Kılcal damar içinde kollajen oltayı getir pistonu geri çek. Kılcal almak ve İngiltere'de yılın atın.
- Kılcal damar taze bir tüp dağ ve PBS 1 mL ekleyin. Kılcal PBS içinde dalmış emin olun.
- Kollajen çubuk yarısı asılı 's kadar çözümde pistonu hafifçe bastırın. Kılcal kil modelleme ile iç duvar bağlama.
- Tüp 5 min için oda sıcaklığında tutmak.
- 5.4 yineleyin. -5.7 için başka bir 2 kere.
- Kılcal damar içinde kollajen oltayı getir pistonu geri çek. PBS atmak. Engelleme/permeabilization arabellek (PBS + % 1 BSA + %0,1 non-iyonik yüzey aktif) 1-2 mL tüp içine aktarmak ve 5.6 tekrarlayın.
Not: BSA (% 1) %5 serum ikincil Ab içinde büyüdü hayvan tarafından değiştirilebilir. - Tüp 30-60 dakika oda sıcaklığında tutmak.
- Kılcal damar içinde kollajen oltayı getir pistonu geri çek. Permeabilization arabellek atmak. 200-500 µL engelleme/permeabilization tampon birincil antikor, transfer ve çözüm içine çubuk ihraç etti.
- Tüp 1 h için oda sıcaklığında tutmak.
- Kollajen çubuk 3 kez ile PBST (PBS + % 0,1 - iyonik olmayan yüzey aktif) 5.4 içinde açıklandığı gibi yıkayın. -5,8.
- Oda sıcaklığında 1 h için engelleme/permeabilization arabellekte ikincil antikor çubuk kuluçkaya. Işıktan tutun.
- Kollajen çubuk 3 kez PBS ile 5.4 içinde açıklandığı gibi yıkayın. -5,8.
- Kılcal damar içinde kollajen oltayı getir pistonu geri çek. Örnekleri PBS içinde görüntüleme kadar tutun.
- Örnekleri 3'te açıklandığı gibi inceden inceye gözden geçirmek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Çıkıntı oluşumu T hücre göç sırasında aktin bağımlı olan son derece dinamik bir süreçtir. Birincil insan CTL oluşumu çıkıntı görselleştirmek için geçici11' den önce açıklandığı gibi CTL aktin sitoiskeleti etiketlemek için erimiş mEGFP protein transfected. Bir gün transfection sonra hücreleri kollajen matris içinde gömülü. Görüntü yığınları alınan her 40 s ışık sayfalık mikroskobu kullanılarak 37 ° C'de 1 µm boyutunda adım. Şekil 2A ve takıma giren film 1, geçiş sırasında insan CTL formunda büyük çıkıntılar, limon şeklindeki gösterildiği ince iğ benzeri yapılar tarafından saçaklı. Burada sadece bir tek hücre görüntüsü gösterildiği deneme ama büyük hacimli (450 x 450 x 538 µm3) (Şekil 2B). Böylece, optik kalite ve burada gösterilen çözünürlük düşük büyütme amacı ile elde edilmiştir (20 X / 1.0 DIC VIS IR). Bu nedenle, çözünürlüğü daha yüksek NA hedefleri ile daha da geliştirilebilir.
Şekil 2 ve Film 1' de gösterilen denemede CTL'ler otomatik olarak Protokolü Bölüm 4 açıklandığı gibi takip. CTL yörüngeleri Şekil 2Btasvir edilir. İki parametre göç analiz: hız ve sebat. Sebat toplam hat uzunluğu tarafından bölünmüş deplasman olarak tanımlanır. Analiz CTL hareketliliğini 3D çok farklı olduğunu gösterir: hızları aralığı 0,01-0,19 neredeyse 20-fold bir fark ve sebat aralıkları 0 - µm/s 0,7 (Şekil 2C). Bu fareler T hücrelerinin içinde vivo interstisyel geçiş ortalama hız 4 µm/min16olduğunu bildirildi. Son zamanlarda, bu makalede açıklanan yöntemleri kullanarak 4-5 µm/dk11 için CTL ortalama hız belirledik. O ışık sayfalık mikroskobu hücre davranış, örneğin, hücre göç ve hücre-hücre etkileşim görselleştirmek için güçlü bir araçtır bu sonuçlar gösterilmektedir. Vivo, pek çok faktör ve homojen olmayan bir ECM geçiş etkileyebilir çözünür faktörler de dahil olmak üzere karmaşık kompozisyon T hücre davranışı değiştirir.
Uygulama bir kollajen matris hücreleri yaşamak için sınırlı değildir. Fiksasyon ve immunostaining da matris içinde gerçekleştirilir. Şekil 3 3D kollajen jel, hangi endojen perforin1 sabit örnekleri örneği gösterir (PFN1) ve aktin lekeli. Örnek aydınlattı ya tek taraflı (tek tarafı aydınlatma) veya her iki taraftan (çift taraflı aydınlatma). Hücreleri farklı z-pozisyonlarda eşit lekeli ki, bizim iletişim kuralı'nda açıklanan yordamları kollajen jelleri içine antikorların tatmin edici nüfuz elde gösteren gözlemlemek. Fiksasyon CTL olduğu gibi aynı morfoloji sergilenen sonra daha da önemlisi, canlı hücre görüntüleme ( Şekil 3 ve Şekil 2B, ayrıca morfolojisi de bu iletişim kuralı tarafından korunur gösteren karşılaştırın). Buna ek olarak, aydınlatma tek taraflı veya iki taraflı odak düzlemi görüntülerin kalitesi önemli bir fark yapmaz. Daha az alan çift yan aydınlatma için karşılaştırıldığında tek taraflı aydınlatma modu ile lazer maruz göz önüne alındığında, tek taraflı aydınlatma daha önerilir.
Şekil 1: kılcal numune hazırlama sırasında işleme örnek. (A) pistonu kılcal ve pistonu kültür orta ile ıslak nasıl içine koymak. (B) hücre/kollajen karışımı kılcal damar içine çek. (C) kılcal modelleme clay kullanarak Mount. Dalgıç ve kollajen çubuk gri ve kırmızı kutularına sırasıyla tasvir edilmektedir. (D) kolajen çubuk kültür orta ile denge ya da immunostaining başa. Dalgıç ve kollajen çubuk gri ve kırmızı kutularına sırasıyla tasvir edilmektedir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 2: 3D kollajen birincil insan CTL izleme ve aktin dynamics görselleştirme. (A) maksimum yoğunluk projeksiyon aktin birincil insan CTL içinde. Aktin CTL içinde yukarıda açıklanan11etiketli oldu. Bir gün sonrası hücreleri % 0.5 kollajen matris içinde gömülü transfection. Bir temsilci hücre gösterilir. Ölçek çubukları 5 µm. ince aktin yapıları çıkıntı kenarına ok ucu tarafından vurgulanır vardır. (B) yörüngeleri CTL 6 h için. Yörüngeleri automatedly yazılım tarafından izlenir (renk kodu: mavi = başlangıç, kırmızı son parça, 450 x 450 × 538 µm3 birim =). Ölçek çubuğu 50 µm. (C) bu miktar hız ve kalıcılık. Bir nokta bir hücreyi temsil eder. Sonuçları ± SEM 4 bağışçılardan demek gibi görüntülenir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Endojen profilin1 Immunostaining (PFN1) ve CD8 aktin+ T hücreleri gömülü 3D kollajen matrisinde. Birincil insan CD8+ T hücreleri % 0.25 kolajen gömülü. Sonra İngiltere'de yılın fiksasyon örnek anti-PFN1 (turuncu) ve phalloidin (mor) kullanarak ve ışık sayfalık mikroskobu 1 µm 440 x 440 x 1000 µm3toplam hacmi için bir adım boyutta tarafından görüntülenmiştir lekeli. Örnek aydınlattı ya tek taraflı (tek tarafı aydınlatma) veya her iki taraftan (çift taraflı aydınlatma). Maksimum yoğunluk projeksiyonlar 3D yeniden yapılanma (MIP) gösterilir. Ölçek çubukları 50 µm. çoğu Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Film 1: çıkıntılar oluşturma sırasında T hücre geçiş. Filmde gösterilen hücre Şekil 2Agösterildiği birimden çekildi. Hücreleri kollajen matris (%0,5) gömülü. Görüntüleri elde her 40 s ışık sayfalık mikroskobu kullanılarak 37 ° C'de 6 h için. Bu videoyu izlemek için lütfen buraya tıklayın. (İndirmek için sağ tıklatın.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Vivo hücreleri, özellikle bağışıklık hücreleri, çoğunlukla bir 3D microenvironment deneyim, ancak çoğu vitro deneyleri bir 2D yüzeyi, hücre kültürü kaplamalar, Petri yemekler veya coverslips, örneğin devam etmektedir. Kanıt ortaya çıkan geçiş desen bağışıklık hücrelerinin 2D ve 3D senaryoları17arasında farklılık gösterir. Ayrıca, tümör hücrelerinin ifade profilleri de 2D ve 3D kültürlü doku18,19,20dakikaya farklıdır. Bu nedenle, en iyi fizyolojik şartlarda vitrobenzetimini yapmak için bir 3D içeriğinde, örneğin 3D kollajen matrisler deneyler gerçekleştirmek için büyük bir avantaj taşımaktadır. Yeni geliştirilen yaklaşımlar özellikle, ışık sayfalık floresans mikroskobu 3D matris sistemlerinde çevre kontrollü şartlar altında güvenilir ve tekrarlanabilir deneyler sağlar.
Hangi ışık sayfalık mikroskobu ile tüm sonda aydınlatan bir konvansiyonel lazer tarama confocal mikroskobu aksine sadece ince bir levha ile lazer ışığı örnekleri aydınlatmak için oluşturulur. Algılama kamera aydınlatıcı uçağın dikey. Bu teknik sayesinde, sadece odak düzlemi kısmında lazer için yararlanılır. Bu nedenle, fotoğraf ağartma ve fototoksisite en aza indirilebilir. Buna ek olarak, nokta-tarama için karşılaştırıldığında mikroskobu, satın alma oranı büyük ölçüde ışık sayfalık mikroskobu (100 - 1000 kat daha fazla daha hızlı) ile geliştirilir ve sinyal-gürültü oranı da iyileştirmiştir. Bu yazıda bu mikroskop resim alma simge durumuna küçültülmüş beyazlatma ile 3D büyük miktarlar için güçlü bir seçenektir ve altında bir süre (birkaç gün) fotoğraf-hasar üzerinde genişletilmiş kullanılan ışık sayfalık mikroskobu Kur kuluçka odası ile kombine Kuluçka koşulları.
3D kollajen matris ile örnek hazırlık için en kritik nokta hava kabarcıkları kaçınmaktır. Hava kabarcıkları kollajen çözüm tanıtıldı zaman yüksek viskozite göz önüne alındığında, çözümden kaldırmak çok zordur. Hava kabarcıkları varlığı heterojen polimerizasyon kollajen matris neden olabilir; Buna ek olarak, görüntü kalitesini azaltmak istiyorsunuz ışık yolunu bloke edebilirsiniz. Bu nedenle, ne zaman transfer veya bir çok yavaşça pipette gerekir ve Pipet Ucu son düşüş kovmak değil kollajen çözüm karıştırın. Ayrıca, kolajen yavaşça oda sıcaklığında polimerize başlar. Böylece, çözüm iyi karıştırma önce polimerizasyon önlemek için kolajen içeren tüpler her zaman buz üzerinde tutulmalıdır.
Karşılaştığımız ışık sayfalık mikroskobu istihdam bir büyük veri işleme mücadeledir. Işık sayfalık mikroskobu tarafından oluşturulan verilerin kolayca boyutu 500 gigabayt veya bile birkaç terabayt, özellikle uzun süreli deneyler için ulaşabilirsiniz. Bu verileri çözümlemek için bir iş istasyonu yüksek hesaplama kapasiteli bir haftaya kadar bazen birkaç gün alır. Analiz görüntülerin boyutunu daha küçük daha özgün veri olmadığından depolama kapasitesini hızla ışık sayfalık mikroskobu uygulanması için kısıtlayıcı bir faktör olabilir. Bu nedenle, izleme deneyleri veya karmaşık görüntü analizi gerekli olup olmadığını için makul bir zaman dilimi içinde kullanılabilir işleme birimleri tarafından işlenebilir değerler deneye başına dosya boyutunu sınırlamak için önerilir.
Burada tanıtılan ışık sayfalık floresans mikroskobu sonuçları dikkatle ele değil eğer etkileyebilecek bazı özelliklere sahiptir. Kılcal kullanımı özellikle örnekleri Bariyersiz aydınlatma için avantajlıdır. Kollajen çubuk ortamda asılı beri bu özellikle uzun vadeli ölçümler için resim alma sırasında kolajen çubuk sürüklenir çıkabilir. Bu yarışı sonuçları yanlış yorumlanmasına önlemek için düzeltilmesi gerekiyor. Tabii ki, bulunmuyor diğer ışık sayfalık mikroskobu kurulumları ticari olarak piyasada bulunan kılcal örnekleri bağlamaya gerektirmeyen. Ayrıca, tarama confocal mikroskobu fototoksisite önemli ölçüde azalttı, geleneksel çizgisine göre gerçeği dışında ışık sayfalık mikroskobu ile fototoksisite hala uzun vadeli görüntüleme21için bir endişe kalır.
Işık sayfalık mikroskobu dışında çoğunlukla uygulamalı confocal mikroskobu, geniş alanlı floresans mikroskobu ve multiphoton mikroskobu olan arasında 3D floresans görüntüleme için kurulan diğer yaklaşım vardır. Penetrasyon derinliği açısından confocal ve geniş alanlı floresans mikroskobu normalde 100 nm22' ye sınırlı benzer aralığında, yalan. Çoklu foton Mikroskopi için kullanılan daha uzun dalga boyu bu ışık, penetrasyon derinliği 0,5 - 1 mm23Aralık için gelişmiş olabilir. Buna karşılık, optik ışık sayfalık mikroskobu kesit tarafından oluşturulan çok boyutlu görüntülerin boyutunu birkaç milimetre24e kadar olabilir. Yanal çözünürlük açısından zarif gerçekleştirilen deney o ışık sayfalık mikroskopi confocal floresan mikroskopi büyük karşılaştırıldığında bir daha iyi üç boyutlu Uzaysal Çözünürlük25örnekleri sağlar gösterir. Son zamanlarda, ışık sayfalık mikroskobu daha normal bir foton ışık sayfalık Mikroskopi için karşılaştırıldığında penetrasyon artırılır ve noktası tarama iki fotonlu mikroskobu on kat daha hızlı iki fotonlu tekniği ile birlikte26.
Mikro mimarisi hücreler, yanı sıra bu yazıda kullanılan sığır kollajen için sağlar 3D matris göz önüne alındığında orada ekstra hücresel matris (ECM) fare sarkomu hücreleri, özel, sentetik hydrogels türetilmiş veya diğer gibi birçok diğer seçenekleri biyouyumlu polimer malzemeler. Fare sarkomu ECM kollajen IV, laminin gibi çok sayıda büyüme faktörleri de dahil olmak üzere bir protein karışımdır. Karşılaştırmak-e doğru sentetik malzemeler, biyolojik ECMs (kollajen ve fare sarkomu ECM), bir yandan, bir daha fizyolojik ilgili içeriği mevcut; Ama öte yandan, kalite ve kompozisyon biyolojik ECMs toplu işlemleri ve şirketler arasında değişebilir. Buna ek olarak, tekrarlanabilirlik sentetik malzeme daha garantilidir. Dikkat çekici, biyokimyasal ve mekanik özelliklerini ince ayar, istenilen değişiklikleri yanı sıra sentetik malzemeler için kullanılır, ancak biyolojik ECMs10,27için izin verilir.
Özet olarak, bu yazıda biz ışık sayfalık floresans mikroskobu ve nasıl birincil insan CTL görselleştirmek ve CTL geçiş çözümlemek için 3D kollajen matris katıştırmak için kullanarak hücre biyoloji deneyleri için 3D kollajen matris oluşturmak için bir protokol nitelendirdi. Numune hazırlama, resim alma ve analiz önemli noktaları vurgulanır. Bizim sonuçlar son derece dinamik çıkıntılar ve ince aktin yapıların oluşumu ışık sayfalık mikroskobu ile iyi bir kronolojik zamanmekansal kararlılık tarafından görüntülenmeyecektir gösterir. Ayrıca, burada açıklanan Çözümleme Protokolü bize güvenilir bir şekilde objektif ve otomatik şekilde hücreleri izlemek sağlar. Bu yöntem-ecek var olmak özellikle insan immünolojik araştırmalar için avantajlı fareler ve insanlar birçok immünolojik işlevleri ve reaktivite terapiler28önemli ölçüde farklı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar hiçbir mali veya ticari çıkar çatışması beyan ederim.
Acknowledgments
Biz klinik Hemostaseology Enstitüsü ve kan nakli tıp donör kan sağlamak için teşekkür ederiz; Carmen Hässig ve Cora hoca mükemmel teknik yardım için. Biz için değiştirilmiş değerleri vektör Jens Rettig (Saarland Üniversitesi), Roland Wedlich-Söldner (Münster Üniversitesi) orijinal LifeAct-yakut inşa etmek için ve Christian Junker (Saarland Üniversitesi) LifeAct-mEGFP yapı oluşturmak için teşekkür ederiz. Bu proje Sonderforschungsbereich 1027 (proje A2 BQ) ve 894 (projeye A1 M.H.) tarafından finanse edildi. Işık sayfalık mikroskop DFG tarafından finanse edildi (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
- Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
- Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
- Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
