Summary
כאן, אנו מציגים פרוטוקול להמחיש תאים חיסוניים בתוך מטריצה תלת מימדי (3D) קולגן באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות. פרוטוקול זה מרחיב כיצד לעקוב אחר נדידת תאים ב- 3D. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק עבור סוגים אחרים של תאים השעיה מטריקס תלת-ממד.
Abstract
In vivo, הפעלה, התפשטות, ותפקודו של תאים חיסוניים כל להתרחש בסביבה תלת מימדי (3D), למשל בבלוטות הלימפה או רקמות. עד כה, רוב במבחנה מערכות להסתמך על משטחים (2D) דו מימדי, כגון לוחות תרבית תאים או coverslips. מחקים בצורה אופטימלית בתנאים פיזיולוגיים במבחנה, אנו מנצלים על מטריצת קולגן 3D פשוטה. קולגן הוא אחד המרכיבים העיקריים של מטריצה חוץ-תאית (ECM) והוא כבר בשימוש נרחב להוות מטריצות תלת-ממד. עבור הדמיה תלת-ממדית, הטכנולוגיה פיתחה לאחרונה מיקרוסקופ אור גיליונות (המכונה גם מטוס יחיד תאורה מיקרוסקופ) בהשתתפות עם מהירות גבוהה רכישה, עומק החדירה גדול, הלבנת נמוך ו photocytotoxicity. יתר על כן, מיקרוסקופ אור גיליונות הוא יתרון מיוחד עבור מדידה ארוכת טווח. כאן נתאר פרוטוקול ממוטבת כיצד להגדיר ולטפל תאים חיסוניים אנושי, למשל ראשי האדם ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T (CTL) ואת הרוצח הטבעיים (NK) תאי מטריצת קולגן תלת-ממד לשימוש עם מיקרוסקופ אור גיליונות עבור הדמיה תא חי, דוגמאות קבועות. ההליך עבור ייבוא תמונות וניתוח של נדידת תאים מוצגים. דגש מיוחד ניתן להדגיש שלבים קריטיים וגורמים עבור הכנת הדוגמא וניתוח נתונים. פרוטוקול זה יכול להיות מועסק עבור סוגים אחרים של תאים ההשעיה במטריצה קולגן תלת-ממד ואינו מוגבל תאים חיסוניים.
Introduction
רוב הידע אודות מעבר תאים נובע 2D ניסויים1,2,3, אשר נערכים בדרך כלל בכוס, או משטח הפלסטיק של תרבות/הדמיה המנה. עם זאת, תרחיש פיזיולוגיים דורש, ברוב המקרים, microenvironment תלת-ממד, שבו מטריצות (ECM) ממלא תפקיד מכריע. ECM לא רק מספק הארומטיים במבנה התלת-ממדי כדי לשמור על מורפולוגיה התא הנכון אלא מציע גם אותות הישרדות או הכיוון הנכון לתפקוד אופטימלי של תאים רבים4,5 . לכן, נדרשת סביבה תלת-ממד לזיהוי טוב יותר של פונקציות תאית והתנהגות בסביבה כדאי המשקף את ההקשר פיזיולוגיים.
בגוף האדם, רוב התאים במיוחד תאים חיסוניים, להפעיל את הפונקציות שלהם תחת תרחיש תלת-ממד. לדוגמה, בתאי T מופעל סיור רקמות בחיפוש אחר התאים היעד, תמים T תאים נודדים דרך הלימפה בחיפוש אחר תאיהם אנטיגן cognate שבמהלכה מצב ההעברה, מכונות מותאמים המתאימה חוץ-תאית הסביבה3,6,7. הג'ל קולגן 3D כבר בשימוש נרחב כמו תא 3D ומבוססת, מאופיין היטב בתרבות מערכת8,9,10. העבודות הקודמות שלנו מראים כי ראשי לימפוציטים אנושיים הם ניידים מאוד להעביר במהירות ממוצעת של מיקרומטר סביב 4.8/min מבוססי קולגן מטריצה 0.25%11. סידורם מחדש של שלד התא ממלא תפקיד מפתח ההעברה תא12. לצבירת ראיות מראה כי לימפוציטים אינן חלות רק מצב אחד של הגירה עדיין יכול לעבור בין התנהגות מסוימת ההעברה בהתאם למיקום, microenvironment, ציטוקינים, מעברי צבע chemotactic, חוץ-תאית אותות איזה מנגינה התנהגות נודדים בדרכים שונות 3.
לנתח באופן אמין תא החיסון פונקציות והתנהגות, לדוגמה, הגירה, תיתכן היווצרות או תחבורה vesicular, זה יתרון גדול כדי שניתן יהיה לרכוש תמונות בכמויות גדולות יחסית 3D בצורה מהירה ואמינה. הדמיה תלת-ממדית, הטכנולוגיה פיתחה לאחרונה מיקרוסקופ אור גיליונות (המכונה גם מטוס יחיד תאורה מיקרוסקופ) מציע פתרון משביע רצון13,14. במהלך הדימות רכישה, סדין דק אור הסטטי נוצר כדי להאיר את הדגימה. בדרך זו, על מישור המוקד, שטח גדול יכול להיות מואר בו-זמנית מבלי להשפיע על התאים את המטוס. תכונה זו מאפשרת מהירות גבוהה רכישה מופחת באופן דרסטי הלבנה, photocytotoxicity. בנייר זה, אנו מתארים איך לדמיין ראשי תאים חיסוניים האנושי באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות ואיך לנתח את ההעברה בתרחיש של תלת-ממד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
מחקר המבוצע במחקר זה החומר האנושי (ליקוציט צמצום מערכת צ'יימברס מתורמים דם אנושי) מוסמך על ידי ועדת האתיקה המקומית (ההכרזה מ- 16.4.2015 (84/15; פרופסור ד ר רטיג-Stürmer)), עוקב אחר ההנחיות המתאימות.
1. הכנת קולגן ינוטרלו פתרון (500 µL)
- העברת µL 400 של קולגן צוננת מניות פתרון (10.4 mg/mL) צינור mL 1.5 סטרילי מתחת למכסה התרבות תאים. לאט לאט להוסיף 50 µL של צונן PBS x 10 (pH 7.0-7.3) כדי µL 400 של פתרון מלאי הקולגן צוננת. לערבב את הפתרון על ידי ריצוף בעדינות את הצינור.
הערה: כל השלבים בחלק 1 צריך להיעשות תחת ברדס התרבות תאים. - הוסף 8 µL של 0.1 M NaOH לתוך µL 500 של הפתרון קולגן 1.1. כדי להתאים את ה-pH ל 7.2-7.6. השתמש במבחן חומציות (pH בטווח: 6-10) כדי לקבוע את ערך ה-pH של התערובת.
הערה: אמצעי אחסון עשויים להשתנות עבור קבוצות שונות של קולגן. NaOH שהפתרון צריך להיות מעורב באיטיות כדי למנוע בועות אוויר. התערובת יש לשמור בקירור כדי להימנע gelation קולגן. - להוסיף 2 µL של ddH סטרילי2O כדי להפוך את עוצמת הקול הסופי µL 500. לערבב היטב ולאחסן פתרון זה קולגן (8.32 mg/mL) על קרח או ב 4 ° C עד שימוש נוסף.
הערה: תחת תנאי זה, קולגן ינוטרלו יכול לשמש עבור ה 24 Aliquots לא מומלץ להימנע בועות אוויר.
2. דגימה הכנה מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות באמצעות נימים
- Fluorescently תווית של תאים חיים מעניינים עם צבעי פלורסנט הראשית הרצוי15 או חלבונים פלורסנט11 כפי שתואר לעיל.
- העברת 1 × 106 תאים לתוך צינור mL 1.5 סטרילי תחת ברדס התרבות תאים. Centrifuge הצינור ב- g 200 x עבור 8 מינימלית להשליך את תגובת שיקוע, resuspend בגדר ב 200 µL של תרבות בינוני.
הערה: צפיפות תא 5 × 106 תאים למ"ל מומלצת ויזואליזציה של נדידת תאים חיסוניים אנושית, במיוחד עבור ציטוטוקסיות לימפוציטים מסוג T (CTL) ותאי הרוצח הטבעיים (NK). - הוסף µL 85.9 של קולגן ינוטרלו פתרון 1.3. לתוך התליה תא מ- 2.2. ומערבבים היטב כדי להגיע ריכוז קולגן של 2.5 מ"ג/מ"ל. להשאיר את התמהיל תא/קולגן קרח בשכונה.
הערה: נניח הריכוז הרצויה של קולגן היא N מ"ג/מ"ל, הנפח שהמשרד קולגן פתרון (עבור השעיה תא µL 200) = 200 × N /(8.32-N) - בשלב הבא, מכניסים הבוכנה תואמות נימי (הקוטר הפנימי ~ 1 מ מ) עד 1 מ מ. נימי הבוכנה. רטוב על הבוכנה בטבילת לתוך תרבות בינוני (איור 1 א').
הערה: שלב זה יכול לעזור למנוע בועות אוויר כאשר נימי מוכנס לתערובת תא/קולגן. את נימי, הבוכנה אין להיות סטרילי. - טובלים את נימי לתערובת תא/קולגן מ- 2.3. לאט לאט למשוך את הבוכנה בחזרה במשך 10-20 מ מ (איור 1B). למחוק את הקיר החיצוני של נים עם מגבת נייר לחלח עם 70% אתנול ספריי כדי להסיר את הפתרון הנותרים של קולגן.
- לטעון את נימי עם בפלסטלינה על הקיר הפנימי של שפופרת 5 מ ל ודחף את התמהיל תא/קולגן לקצה נים (איור 1C).
- שמור את נימי ב 37 ° C עם 5% CO2 עבור 1h לציון קולגן הפילמור.
- להוסיף המדיום תרבות (בסביבות 1-2 מ"ל) שפופרת 5 מ. בזהירות לחץ המטה קולגן polymerized החוצה לתוך המדיום בסביבות 3/4 של הקולגן שתלוים המדיום (איור 1D).
- שמור את נימי, ככה, ב 37 ° C עם 5% CO2 למשך עוד 30 דקות equilibrate את המוט קולגן עם המדיום.
הערה: לאחר מכן, מוט קולגן ניתן למשוך בחזרה לתוך נימי תרבותי נוסף לפני להמשך השימוש.
3. התמונה רכישה באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות
- מכלול תא דגימה על-פי הוראות היצרן.
- הפעל את הדגירה ולאחר המיקרוסקופ לחימום תא הדגימה עד 37 ° C (עבור תא חי הדמיה בלבד).
- מקם את נימי בבית הבליעה מדגם ואתר את הדגימה כדי למצוא את תחום העניין עבור ייבוא תמונות.
- הפעל את laser(s) המתאים. לקבוע את ההגדרות הבאות: לייזר כוח, זמן החשיפה, שלב-בגודל של מיקום z-מחסנית, התחלה וסיום של z-מחסנית, את מרווח הזמן עבור הדמיה תא חי.
הערה: לדוגמה, הדוגמה באיור 2 צולמה כל 40 s עבור 6-אייץ ' ב 37 ° C עם שלב-בגודל של 1 מיקרומטר (סה כ עובי: 538 מיקרומטר). עוצמת הלייזר היה % 1 עם מועד החשיפה של גב' 30 גודל פיקסל-כיוון x-y הוא 0.23 מיקרומטר. - התחל את רכישת התמונה.
4. מעקב אחר ניתוח אוטומטיות
- פתח את ממיר קובץ, לחץ על הוסף קבצים לבחור את הקבצים הדמיה להמיר תבנית הקובץ של התוכנה (*.ims). לחץ על עיון ובחר תיקיה בה ברצונך לשמור את הקבצים שעברו המרה. לחץ על התחל כל.
- פתח את תוכנת ניתוח. לחץ על מעבר. קובץ , לחץ על פתח, ולאחר מכן לבחור את קובץ הדמיה כדי להיות מנותח.
הערה: אם גודל קובץ גדול שלב זה עלול לקחת זמן. בקבצים גדולים מ- 1 טרה-בתים (TB) אינם מומלצים עבור ניסוי יחיד כתהליך קבצים גדולים כאלה הם יכולת חישובית מאוד תובעניים. - לחץ על הוסף מקומות חדשים. סמן את התיבה תהליך התמונה כולה לבסוף. לחץ על הבא.
- הזן את קואורדינטות x ו- y (ב פיקסלים) כדי להגדיר את האזור של ריבית. הזן מספר המסגרות (זמן, z-position) כדי לנתח. לחץ על הבא.
- בחרו בערוץ היעד, אשר מכיל את האובייקטים כדי להיות במעקב, ברשימה הנפתחת של ערוץ המקור. הזן משוער xy קוטר (מיקרומטר). לחץ על הבא.
הערה: קוטר xy המשוער הוא בקוטר ממוצע של הממד x-y של אובייקטים לבצע אחריהם מעקב. - לחץ על איכות. לקבוע סף, שבו רוב התאים (אובייקטים) צריך להיות כלול. לחץ על הבא.
- בחר את האלגוריתם הרצוי (מומלץ להשתמשAutoregressive תנועה ). הזן את המרחק המרבי (מומלץ להשתמש20 מיקרומטר ) ואת גודל הפער מקסימום (3 או 2 מומלצת). לחץ על התהליך כולו תמונה סוף סוף.
הערה: מרחק מקסימלי גודל הפער מירבי הם שני ספי לשבור רצועות. ליתר דיוק, שתי מסגרות רציף כאשר המרחק בין באותו האובייקט חורג המרחק מקס, אובייקט זה במסגרת מאוחר יותר ייחשב בתור אובייקט חדש. לפעמים במהלך הרכישה, אותו אובייקט יכול להיעלם. לעוד כמה מסגרות, להופיע שוב. במקרה זה, רק כאשר אובייקט זה שבה ומופיעה בתוך גודל הפער מקס, זה ייחשב כאי אותו אובייקט. - לחץ על סוג המסנן ובחר את האפשרות להוציא שירים בלתי רצויה.
הערה: שלב זה הוא אופציונלי. - לחץ על הבא ולאחר מכן לחץ על סיום.
הערה: שלב זה יכול לקחת שעות עד ימים בהתאם ביצועי מחשוב. - לחץ על עריכת מסלולים ובחרו הסחף נכון. בחר את האלגוריתם המתאים (סחיפה Translational מומלץ). בחר גודל הנתונים (dataset) התוצאה הרצויה (חדש בגודל שווה לגודל הנוכחי מומלץ). לחץ על אישור.
הערה: השלב זה רק הנדרש כאשר הקולגן נסחפה במהלך ייבוא תמונות. - לחץ על סטטיסטיקה ובחרו להגדיר רשימה של סטטיסטיקה הערכים הגלויים. בדוק האפשרויות של עניין להיות מיוצאים (למשל קואורדינטות, מהירות וכן הלאה). לחץ על אישור.
- לחץ על סטטיסטיקה כל לייצא לקובץ והזן את שם קובץ.
5. קיבוע ו Immunofluorescence מכתים של תאים בקולגן מטריצות
- העברת µL 1,000 של 4% paraformaldehyde (PFA, ב- PBS) לתוך צינור 5 מ"ל ברדס כימי.
הערה: PFA צריכה להיות מאוזנת לטמפרטורת החדר. - טובלים את נימי עם קולגן polymerized מ- 2.9. בתוך תמיסת מחברים (עבור ~ 5 מ מ) והר את נימי בקיר הפנימי של הצינור מ עם בפלסטלינה (כפי שמוצג באיור 1C).
- הקש על הבוכנה בעדינות עד מחצית קולגן מוט תלוי בפתרון מחברים (איור 1D). שמור את הצינור בטמפרטורת החדר במשך 20 דקות.
- למשוך בחזרה על הבוכנה כדי לקבל את המוט קולגן פנימה נימי. להוציא את נימי וזורקים מחברים.
- לטעון את נימי לתוך צינור טריים ומוסיפים 1 מ"ל ל- PBS. ודא כי נימי הוא שקוע, טוב, מגניב.
- הקש על הבוכנה בעדינות עד מחצית קולגן מוט תלוי בפתרון. לטעון את נימי על הקיר הפנימי עם בפלסטלינה.
- שמור את הצינור בטמפרטורת החדר במשך 5 דקות.
- חזור על 5.4. -5.7 עבור עוד 2 פעמים.
- למשוך בחזרה על הבוכנה כדי לקבל את המוט קולגן פנימה נימי. להתעלם PBS. העברה מ ל 1-2 של מאגר חוסם/permeabilization (PBS + 1-% BSA + 0.1% חומרים פעילי שטח ללא יונית) לתוך הצינור וחזור 5.6.
הערה: BSA (1%) יכול להיות מוחלף על ידי 5% סרום של החיה ש-ab משני גדל. - שמור את הצינור בטמפרטורת החדר למשך 30-60 דקות.
- למשוך בחזרה על הבוכנה כדי לקבל את המוט קולגן פנימה נימי. למחוק מאגר permeabilization. העברת µL 200-500 של נוגדן ראשוני במאגר חוסם/permeabilization וגרוש המוט לתוך הפתרון.
- שמור את הצינור בטמפרטורת החדר מאובטח.
- לשטוף את המוט קולגן 3 פעמים עם PBST (PBS + % 0.1 - ללא-יונית חומרים פעילי שטח) כמתואר ב- 5.4. -5.8.
- דגירה המוט ב נוגדנים משניים במאגר חוסם/permeabilization לשעה בטמפרטורת החדר. למנוע את האור.
- לשטוף את המוט קולגן 3 פעמים עם PBS כמתואר ב- 5.4. -5.8.
- למשוך בחזרה על הבוכנה כדי לקבל את המוט קולגן פנימה נימי. שומרים את הדגימות ב- PBS עד הדמיה.
- סרוק את הדגימות כמתואר ב- 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תיתכן היווצרות במהלך ההעברה תא T הוא תהליך דינמי מאוד, אשר תלויים אקטין. כדי להמחיש תיתכן היווצרות CTL אנושי ראשוני, אנחנו transiently transfected חלבון mEGFP התמזגו לתייג את שלד התא אקטין ב- CTL כמתואר לפני11. יום אחד לאחר תרביות תאים, התאים היו מוטבע קולגן המטריצה. אוספי תמונות נרכשו בכל 40 s עם שלב-בגודל של 1 מיקרומטר ב 37 ° C באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות. כפי שמוצג באיור 2A ו- 1 הסרט משלים, במהלך ההעברה, צורת CTL אדם בצורת לימון בליטות הגדולות, בדקלים בסדר מבנים דמויי כישור. הניסוי המוצג כאן, לא רק אחד לתא בודד היה עם תמונה, אבל נפח גדול (450 x 450 x מיקרומטר 5383) (איור 2B). לפיכך, איכות אופטית והרזולוציה המוצגת כאן התקבלו עם מטרה הגדלה נמוכה (20 X / 1.0 DIC VIS IR). לכן, הרזולוציה יכול שיפור נוסף עם יעדים נה גבוה יותר.
בניסוי שמוצג באיור 2 ו- 1 סרט, Ctl היו באופן אוטומטי מעקב אחר כמפורט בפרוטוקול חלק 4. מסלולים של CTL מתוארים ב איור 2B. שני פרמטרים של הגירה נותחו: מהירות והתמדה. התמדה מוגדר העקירה מחולק באורך הרצועה הכולל. ניתוח הנתונים מראה כי הניידות של CTL מגוונת מאוד 3D: בין המהירויות נעות בין 0.01-0.19 מיקרומטר/s עם הבדל כמעט 20-fold, את ההתמדה נע בין 0 - 0.7 (איור 2C). דווח בעכברים כי אין ויוו ההעברה interstitial מהירות ממוצעת של תאי T היה מיקרומטר/דקה 416. לאחרונה, אנחנו קבעו את מהירות ממוצעת של CTL להיות 4-5 מיקרומטר/דקה11 בשיטות המתוארות במאמר זה. תוצאות אלה מדגימים שאת מיקרוסקופ אור גיליונות הוא כלי רב עוצמה כדי להמחיש בהתנהגות התא, לדוגמה, נדידת תאים ואינטראקציה תא-תא. In vivo, גורמים רבים, של ECM אי-הומוגניות של ההרכב מורכב כולל גורמים מסיסים יכולים להשפיע על ההעברה יהיה לשנות את אופן הפעולה של תא T.
יישום של קולגן מטריצה אינה מוגבלת לחיות תאים. ניתן גם לבצע קיבוע ו immunostaining במטריקס. איור 3 מראה דוגמה של דגימות קבוע ב- 3D קולגן ג'ל, אילו perforin1 אנדוגני (PFN1) היו והמוכתמות אקטין. המדגם היה מואר או צד בודד (לצד תאורה יחיד) או משני הצדדים (הצדדיים הכפולים תאורה). אנו מבחינים כי תאים ב- z-עמדות שונות באופן שווה מוכתמים, המציין כי בהליכים המתוארים תחת פרוטוקול שלנו להשיג חדירה משביע רצון של נוגדנים לתוך ג'לים קולגן. וחשוב מכך, לאחר קיבוע CTL הציג המורפולוגיה אותו כמו חיה תא הדמיה (להשוות איור 3 ו- 2B איור), המציין כי גם המורפולוגיה מתוחזקות היטב על ידי פרוטוקול זה. בנוסף, תאורה מצד אחד או משני הצדדים לא עושה הבדל משמעותי באיכות של תמונות על המטוס מוקד. בהתחשב בכך כי האזור פחות חשוף הלייזר עם מצב ההארה צד בודד לעומת הצדדיים הכפולים תאורה, תאורה צד בודד מומלץ יותר.
איור 1: איור של טיפול בנימים במהלך הכנת הדוגמא. (א) מכניסים את הבוכנה את נימי וכיצד רטוב על הבוכנה עם המדיום תרבות. (B) למשוך את התמהיל תא/קולגן לתוך נימי. (ג) הר נימים באמצעות חימר דוגמנות. הבוכנה והשוט קולגן מתוארים בתיבות אפור ואדום, בהתאמה. (ד) להתמודד עם רוד קולגן equilibration עם המדיום תרבות או immunostaining. הבוכנה והשוט קולגן מתוארים בתיבות אפור ואדום, בהתאמה. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: מעקב אחר ראשי CTL האנושי ב- 3D קולגן והצגה של אקטין dynamics. (א) הטלה בעוצמה מקסימלית של אקטין ב- CTL אנושי ראשוני. אקטין סומן ב- CTL כפי שתואר לעיל11. יום אחד פוסט תרביות תאים תאים הוטבעו ב- 0.5% קולגן מטריקס. תא נציג אחד מוצג. גודל ברים הם 5 אקטין בסדר מבנים מיקרומטר. בקצה בליטה מודגש על ידי החץ. (B) מסלולים של CTL במשך 6 שעות. מסלולים מסומנים automatedly על-ידי התוכנה (לפי צבעים: כחול = התחלה, אדום = סוף המסלול, 450 × 450 × 538 מיקרומטר3 נפח). סרגל קנה מידה הוא 50 מיקרומטר. (ג) כימות של מהירות והתמדה. נקודה אחת מייצגת תא אחד. התוצאות מוצגות כפי מתכוון ± SEM מתורמים 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: Immunostaining של profilin1 אנדוגני (PFN1) ואני אקטין ב- CD8+ T תאים נעוץ 3D קולגן המטריצה. ראשי CD8 האנושי+ T תאים הוטבעו ב- 0.25% קולגן. לאחר PFA קיבוע הדגימה היתה מוכתמת באמצעות אנטי-PFN1 (כתום) ו- phalloidin (סגול), דמיינו ידי מיקרוסקופ אור גיליונות בגודל-שלב של 1 מיקרומטר עבור הנפח הכולל של 440 x 440 x מיקרומטר 1,0003. המדגם היה מואר או צד בודד (לצד תאורה יחיד) או משני הצדדים (הצדדיים הכפולים תאורה). העוצמה המקסימלית תחזיות (MIP) משחזור תלת-ממד מוצגים. פסי בקנה מידה הם 50 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
סרט 1: דור של בליטות במהלך ההעברה תא T. התא המוצג בסרט נלקח האחסון המוצגת באיור 2A. תאים הוטבעו במטריצה קולגן (0.5%). תמונות נרכשו בכל 40 s עבור 6-אייץ ' ב 37 ° C באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות. אנא לחץ כאן כדי לצפות בסרטון. (לחיצה ימנית כדי להוריד.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
רוב מבחני במבחנה מתבצעות על משטח דו-מימדית, לדוגמה-פטרי, לוחיות תרבית תאים או על coverslips, ואילו ויוו תאים, במיוחד תאים חיסוניים, לחוות בעיקר microenvironment תלת-ממד. מתעוררים ראיות מראה כי דפוסי ההגירה של תאים חיסוניים שונים בין תרחישים של 2D and 3D-17. יתר על כן, ביטוי פרופילים של תאים סרטניים שונים גם ב- 2D ו 3D-תרבותי רקמות18,19,20. לכן, כדי לדמות בצורה הטובה ביותר את התנאים הפיזיולוגיים במבחנה, זה של יתרון גדול לביצוע ניסויים בהקשר תלת-ממד, למשל אצל קולגן 3D מטריצות. הגישות פיתח, בפרט, מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות, מאפשר לשחזור ואמין ניסויים במערכות מטריקס תלת-ממד תחת תנאי סביבה מבוקרת.
בניגוד קונבנציונאלי סריקה בלייזר מיקרוסקופיה קונפוקלית אשר מאירה המכשיר כולו, עם מיקרוסקופ אור גיליונות, רק סדין דק של אור לייזר נוצרת כדי להאיר דוגמאות. למצלמה זיהוי הוא בניצב למישור זרחני. עקב טכניקה זו, ורק החלק על המטוס מוקד חשופים הלייזר. לכן, ניתן למזער הלבנת-צילום ו- phototoxicity. בנוסף, בהשוואה לסריקת נקודת מיקרוסקופ, קצב רכישת באופן דרסטי משופרת עם מיקרוסקופ אור גיליונות (100 - 1,000-fold מהר יותר), יחס אות לרעש היא גם יושבחו. בשילוב עם התא דגירה של מיקרוסקופ אור גיליונות לכיוונון המשמש בעיתון הזה מיקרוסקופ זה הוא אפשרות עוצמה עבור ייבוא תמונות תלת-ממד כמויות גדולות עם הלבנת ממוזער והרחבה צילום-נזק מעל פרקי זמן (מספר ימים) תחת תנאי חממה.
עבור הכנת הדוגמא עם 3D קולגן המטריצה, הנקודה הקריטית ביותר היא להימנע בועות אוויר. בהתחשב שלו צמיגות גבוהה, כאשר בועות אוויר הם הציגו את הפתרון קולגן קשה מאוד להסיר אותו מהפתרון. הנוכחות של בועות אוויר יכול לגרום הטרוגניות של פלמור של קולגן מטריקס; בנוסף, יכולה לחסום את הנתיב של אור, אשר לצמצם את איכות התמונות. לכן, בעת העברה או לערבב את הפתרון קולגן אחד חייב pipette בעדינות, לא לגרש את הטיפה האחרונה בקצה פיפטה. יתר על כן, קולגן מתחיל לאט פולימריזציה בטמפרטורת החדר. לכן, כדי למנוע הפילמור לפני ערבוב הפתרון טוב, הצינורות המכילים קולגן יש תמיד לשמור על הקרח.
אתגר גדול אחד, שאנו פוגשים את העסקת מיקרוסקופ אור גיליונות הוא טיפול נתונים. הנתונים הנוצר על ידי מיקרוסקופ אור גיליונות תוכלו להגיע בקלות בגודל 500 ג'יגה-בתים או אפילו מספר טרה-בתים, בפרט לניסויים לטווח ארוך. כדי לנתח את הנתונים האלה לוקח כמה ימים, לפעמים עד שבוע על-ידי תחנת עבודה עם קיבולת גבוהה חישוב. כיוון גודל התמונות שנותחה אינו קטן מהנתונים המקוריים מקיבולת האחסון יכול להפוך במהירות גורם מגביל עבור היישום של מיקרוסקופ אור גיליונות. לכן, עבור ניסויים מעקב או אם נדרש ניתוח תמונות מורכבות מומלץ להגביל את גודל הקובץ לכל ניסוי לערכים אשר יכולות להיות מטופלות במסגרת זמן סביר ע"י יחידות עיבוד זמין.
מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות הציג כאן יש תכונות מסוימות, אשר עשויים להשפיע על התוצאות אם לא יטפלו בזהירות. הניצול של נימים הוא יתרון מיוחד לתאורת ממכשולים של הדגימות. מאז קולגן מוט תלוי במדיום זה יכול לקרות. זה מוט קולגן עוקצים במהלך ייבוא תמונות, במיוחד עבור מדידות לטווח ארוך. הסחף הזה יש לתקן על מנת למנוע פירוש מוטעה של התוצאות. כמובן, ישנם אחרים setups מיקרוסקופ אור גיליונות הנמכרים בשוק, שאינן דורשות נימים כדי לטעון את הדגימות. יתר על כן, עם מיקרוסקופ אור גיליונות, מלבד העובדה כי בהשוואה לקו קונבנציונאלי סריקה phototoxicity קונפוקלית הופחת באופן משמעותי, phototoxicity נשאר עדיין חשש הדמיה לטווח ארוך21.
מלבד מיקרוסקופ אור גיליונות, יש גישות אחרות הוקמה עבור הדמיה תלת-ממד פלורסצנטיות, שימושית בעיקר ובהן מיקרוסקופיה קונפוקלית מיקרוסקופיית שדה רחב פלורסצנטיות, מיקרוסקופ multiphoton. מבחינת עומק החדירה, מיקרוסקופ קונפוקלי והשדה רחב זריחה לשקר בטווח דומה, בדרך כלל מוגבלת ל- 100 ננומטר22. בשל אור באורך גל ארוך יותר, מנוצל עבור פוטון מרובה מיקרוסקופ, עומק החדירה שלה יכול להיות משופרת על הטווח של 0.5 - 1 מ מ23. לשם השוואה, גודל התמונות רב-ממדי שנוצר על ידי חלוקתה אופטי של מיקרוסקופ אור גיליונות יכול להיות עד מילימטרים מספר24. מבחינת רזולוציה לרוחב, מראה ניסוי באלגנטיות שבוצעו שמיקרוסקופ אור-גיליון זה מספק כדאי תלת מימדי רזולוציה מרחבית בהשוואה מיקרוסקופ קונפוקלי זריחה בגדול דגימות25. לאחרונה, מיקרוסקופ אור גיליונות יש כבר בשילוב עם שני הפוטונים טכניקה, אשר עוד יותר משפר את עומק החדירה בהשוואה מיקרוסקופ אור גיליונות פוטון אחד נורמלי, הוא עשר פעמים מהר יותר מאשר נקודת לסריקת מיקרוסקופ שני הפוטונים26.
בהתחשב 3D matrix המעניק המיקרו-ארכיטקטורה של תאים, מלבד קולגן שהשתמשתי בנייר זה, ישנן הרבה אפשרויות אחרות, כגון הסלולר במיוחד מטריקס (ECM) נגזר מן העכבר סרקומה תאים, agarose, hydrogels סינתטי או אחרים חומרים פולימריים מסתיימים. העכבר סרקומה ECM הוא תערובת החלבון קולגן הרביעי, laminin וכן גורמי גדילה רבים. השווה ל חומרים סינתטיים, ביולוגית ECMs (קולגן ועכבר סרקומה ECM), מצד אחד, להציג את הקשר רלוונטי יותר מבחינה פיזיולוגית; אבל מצד שני, האיכות ואת הרכב ECMs הביולוגי עשוי להשתנות בין קבוצות וחברות. לעומת זאת, הפארמצבטית של חומרים סינתטיים מובטחת יותר. למרבה הפלא, כוונון של מאפייני הביוכימי ועל מכניים, כמו גם השינויים הרצויים, מותר חומרים סינתטיים, אך לא ביולוגי ECMs10,27.
לסיכום, במאמר זה אנו המתואר פרוטוקול לבנות מטריצת קולגן תלת-ממד עבור ניסויים בביולוגיה של התא באמצעות מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות, ואיך להטמיע CTL אנושי ראשוני ב- מטריצת קולגן תלת-ממד כדי להמחיש ולנתח CTL ההעברה. סימנו את נקודות המפתח הכנת הדוגמא, ייבוא תמונות ולאחר הניתוח. התוצאות שלנו מראים כי היווצרות בליטות דינמי מאוד ומבנים אקטין בסדר ניתן לאבחן על ידי מיקרוסקופ אור גיליונות עם רזולוציה ייתכן טוב. יתר על כן, הפרוטוקול ניתוח המתוארים כאן מאפשר לנו לעקוב בצורה אמינה תאים באופן אובייקטיבי ובלתי באופן אוטומטי. שיטה זו יהיה יתרון במיוחד למחקר אימונולוגי אנושי כמו עכברים, בני אדם נבדלים באופן משמעותי הרבה פונקציות אימונולוגי תגובתיות טיפולים28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים לא פיננסיים או מסחרי ניגוד אינטרסים.
Acknowledgments
אנו מודים המכון Hemostaseology קלינית ורפואה עירוי למתן דם התורם; כרמן Hässig, קורה Hoxha לעזרה טכנית מצוינת. אנו מודים רטיג ג'נס (אוניברסיטת חבל הסאר) עבור וקטור pMAX ששונה רולנד Wedlich-Söldner (אוניברסיטת מינסטר) עבור הבונה LifeAct-רובי המקורי, כריסטיאן יונקר (אוניברסיטת חבל הסאר) ליצירת הבונה LifeAct-mEGFP. הפרויקט מומן על ידי 1027 Sonderforschungsbereich (פרוייקט A2 כדי B.Q.) ו- 894 (פרוייקט A1 מ. ה). מיקרוסקופ אור גיליונות מומן על ידי DFG (GZ: מוסד 256/4 19-1 FUGG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
- Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
- Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
- Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
