Summary
Hier presenteren we een protocol om te visualiseren van immune cellen die zijn ingesloten in een matrix van de driedimensionale (3D) collageen met behulp van licht vel microscopie. Dit protocol wordt ook ingegaan hoe bijhouden van cel migratie in 3D. Dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten schorsing cellen in de 3D-matrix.
Abstract
In vivo, activering, proliferatie en functie van alle immuuncellen optreden in een driedimensionale (3D) omgeving, bijvoorbeeld in de lymfeklieren of weefsels. Up to date afhankelijk meeste in vitro systemen van tweedimensionale (2D) oppervlakken, bijvoorbeeld cel-cultuur platen of coverslips. Optimaal mimic fysiologische omstandigheden in vitrogebruiken we een eenvoudige 3D collageen-matrix. Collageen is een van de belangrijkste componenten van de extracellulaire matrix (ECM) en is wijd verbeid gebruikt voor het vormen van 3D-matrices. Voor 3D-beeldbewerking, wordt de technologie van de onlangs ontwikkelde licht vel microscopie (ook enkel vliegtuig verlichting microscopie genoemd) gekenmerkt met de overname van de hoge snelheid, grote indringingsdiepte, lage bleken en fototoxiciteit. Licht vel microscopie is bovendien bijzonder voordelige voor lange termijn meting. Hier beschrijven we een geoptimaliseerde protocol hoe te zetten en behandelen van menselijke immune cellen, bijvoorbeeld primaire menselijke cytotoxische T-lymfocyten (CTL) en natural killer (NK) cellen in de matrix van de 3D collageen voor gebruik met de licht-blad microscopie voor levende cellen beeldvorming en vaste monsters. De procedure voor Beeldacquisitie en analyse van cel migratie worden gepresenteerd. Een bijzondere aandacht is besteed aan het wijzen op kritische stappen en factoren voor de bereiding van de monsters en data-analyse. Dit protocol kan worden gebruikt voor andere soorten schorsing cellen in een matrix van 3D collageen en is niet beperkt tot immune cellen.
Introduction
Meeste kennis over het migreren van cellen afkomstig van 2D experimenten1,2,3, die normaal gesproken worden uitgevoerd in een glas of plastic oppervlak voor een cultuur/imaging schotel. Een fysiologische scenario vereist echter, in de meeste gevallen een 3D communicatie, die de extracellulaire matrix (ECM) een beslissende rol speelt. ECM biedt niet alleen de 3D structuur essentieel belang zijn voor het handhaven van de juiste cel morfologie maar biedt ook overleving signalen of directionele signalen voor een optimale werking van veel cellen4,5 . Daarom moet een 3D-omgeving beter identificeren cellulaire functies en het gedrag in een omgeving die beter als gevolg van de fysiologische context.
In het menselijk lichaam oefenen de meeste cellen vooral immune cellen, hun functies in een 3D-scenario. Bijvoorbeeld, geactiveerde T-cellen patrouille op zoek naar doelcellen weefsels, naïef T cellen migreren door lymfklieren in zoektocht naar hun cognaat antigeen-presenteren cellen waarin de migratiemodus en machines aangepast aan de overeenkomstige extracellulaire zijn milieu3,6,7. De 3D collageen gel is wijd verbeid gebruikt als een gevestigde en goed gekarakteriseerd 3D cel cultuur systeem8,9,10. Onze vorige werk blijkt dat primaire menselijke lymfocyten uiterst mobiel zijn en op een gemiddelde snelheid van ongeveer 4,8 µm/min bij een 0,25% collageen gebaseerde matrix11migreren. Omlegging van cytoskelet speelt een sleutelrol in de cel migratie12. Het vergaren van bewijsmateriaal blijkt dat lymfocyten geldt niet slechts een enkele soort migratie nog kunnen schakelen tussen bepaalde migratie gedrag afhankelijk van de locatie, de communicatie, de cytokines, de Chemotactische hellingen, en extracellulaire welke melodie signalen de trekgedrag in verschillende manieren 3.
Om betrouwbaar te analyseren immuun cel functies en gedrag, bijvoorbeeld migratie, uitsteeksel vorming of vesiculaire vervoer, is het van groot voordeel te kunnen verwerven in relatief grote volumes van de 3D beelden op een snelle en betrouwbare manier. Voor 3D-beeldbewerking biedt de technologie van de onlangs ontwikkelde licht vel microscopie (ook enkel vliegtuig verlichting microscopie genoemd) een bevredigende oplossing13,14. Tijdens het imaging overname, is een dunne statisch licht blad gegenereerd om te verlichten van het monster. Op deze manier, op het vlak van de focus, kan een groot gebied gelijktijdig zonder de cellen uit het vliegtuig worden verlicht. Deze eigenschap laat een hoge acquisitie snelheid met een drastisch verminderde bleken en fototoxiciteit. In dit artikel beschrijven we hoe te visualiseren van primaire menselijke immune cellen met behulp van licht vel microscopie en hoe te analyseren van de migratie in een 3D-scenario.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Onderzoek uitgevoerd voor deze studie met de menselijk materiaal (leukocyte reductie systeem chambers van menselijk bloeddonoren) is geautoriseerd door de lokale ethische Commissie (verklaring van 16.4.2015 (84/15; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) en de desbetreffende richtsnoeren volgt.
1. bereiding van geneutraliseerde collageen-oplossing (500 µL)
- Breng 400 µL van gekoeld collageen stockoplossing (10.4 mg/mL) tot een steriele 1,5 mL koker onder de motorkap van cel cultuur. Voeg langzaam 50 µL van 10 x PBS (pH 7.0-7.3) tot 400 µL van gekoeld collageen stockoplossing gekoeld. Meng de oplossing door zachtjes het betegelen van de buis.
Opmerking: Alle stappen in deel 1 moeten gebeuren onder de motorkap van een cel cultuur. - Toevoegen 8 µL van 0,1 M NaOH aan 500 µL van de collageen-oplossing van 1.1. om de pH op 7,2-7,6. Gebruik van pH test strips (pH bereik: 6-10) om te bepalen van de pH-waarde van het mengsel.
Opmerking: Volumes kunnen variëren voor verschillende batches instellen van collageen. NaOH oplossing moet langzaam worden gemengd om luchtbellen te voorkomen. Het mengsel moet worden bewaard op het ijs om collageen gelering. - Voeg 2 µL van steriele ddH2O aan te brengen in het eindvolume 500 µL. goed mengen en bewaren deze collageen oplossing (8.32 mg/mL) op ijs of bij 4 ° C tot verder gebruik.
Opmerking: Onder deze voorwaarde, geneutraliseerde collageen kan worden gebruikt voor 24 h. Aliquots worden niet aanbevolen om te voorkomen dat luchtbellen.
2. monstervoorbereiding voor licht vel fluorescentie microscopie met behulp van haarvaten
- Fluorescently label de levende cellen van belang met de gewenste primaire fluorescente kleurstoffen15 of fluorescerende eiwitten11 zoals eerder is beschreven.
- Pipetteer 1 × 10-6 van cellen in een steriele 1,5 mL-buis onder de motorkap van een cel cultuur. Centrifugeer de buis bij 200 x g gedurende 8 min. negeren het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 µL cultuurmedium.
Opmerking: De celdichtheid van 5 × 106 cellen/mL wordt aanbevolen voor visualisatie van menselijk immuun cel migratie, met name voor de cytotoxische T-lymfocyten (CTL) en natural killer (NK) cellen. - Voeg 85,9 µL van geneutraliseerde collageen oplossing van 1.3. in de celsuspensie van 2.2. en meng goed tot een concentratie van collageen van 2,5 mg/mL. Laat de cel/collageen mix op ijs in de kap.
Opmerking: Stel de gewenste concentratie van collageen is N mg/mL, de hoeveelheid geneutraliseerd collageen oplossing (voor 200 µL celsuspensie) = 200 × N /(8.32-N) - Vervolgens zet de bijpassende zuiger in het capillair (binnendiameter ~ 1 mm) totdat de plunjer 1 mm uit het capillair is. Natte de plunjer door dompelen in kweekmedium (figuur 1A).
Opmerking: Deze stap kan helpen om luchtbellen te voorkomen dat wanneer het capillair wordt ondergedompeld in de cel/collageen mix. Het capillair en de plunjer hoeft niet te worden steriel. - Dompel het capillair in de cel/collageen mix van 2.3. Langzaam Trek de zuiger terug voor 10-20 mm (figuur 1B). Veeg de buitenmuur van het capillair met een papieren handdoek bevochtigd met 70% ethanol spray te verwijderen van de resterende collageen-oplossing.
- Monteren van het capillair met modelleren van klei op de binnenwand van een tube van 5 mL en duwen de cel/collageen mix aan de rand van het capillair (Figuur 1 c).
- Houd het capillair bij 37 ° C met 5% CO2 voor 1 h voor collageen polymerisatie.
- Het kweekmedium (ongeveer 1-2 mL) toevoegen aan een tube van 5 mL. Zorgvuldig de gepolymeriseerde collageen staaf uit in het medium voor ongeveer 3/4 van de collageen opknoping in het medium (Figuur 1 d) drukken.
- Houd het capillair, als dit, bij 37 ° C met 5% CO2 voor een andere 30 min aan de staaf van de collageen met het medium equilibreer.
Opmerking: Nadien de collageen staaf kan worden trok zich terug in de capillaire en gekweekte verdere voor verder gebruik.
3. image Acquisition met behulp van licht vel microscopie
- Vergadering de monsterkamer volgens de instructie van de fabrikant.
- Zet de incubatie en de Microscoop om te Verwarm de monsterkamer tot 37 ° C (voor levende cellen beeldvormende alleen).
- Plaats het capillair in de monsterkamer en zoek het monster om te zoeken naar het terrein van belang voor Beeldacquisitie.
- Activeer de overeenkomstige laser. De volgende instellingen: laser macht, belichtingstijd, stap-grootte van z-stack, begin- en positie van de z-stack, en het tijdsinterval voor de levende cel imaging.
Opmerking: bijvoorbeeld, was het monster in Figuur 2 beeld elke 40 s voor 6 uur bij 37 ° C met een stap grootte van 1 µm (total dikte: 538 µm). De laser-macht was 1% met een belichtingstijd van 30 ms. de pixelgrootte op x-y-richting is 0,23 µm. - Start de Beeldacquisitie.
4. geautomatiseerde analyse bijhouden
- Open de file converter, klikt u op Bestanden toevoegen om te kiezen van de grafische bestanden worden geconverteerd naar de bestandsindeling van de software (*.ims). Klik op Bladeren en selecteer een map waar de geconverteerde bestanden opgeslagen. Klik op Start alle.
- Open de analysesoftware. Klik op overtreffen. Ga naar bestand en klik op openen, kies dan het imaging bestand dat moet worden geanalyseerd.
Opmerking: Als de bestandsgrootte groot is deze stap kan duren. Bestanden groter dan 1 Terabyte (TB) worden niet aanbevolen voor een enkele experiment als het proces dergelijke grote bestanden zijn zeer computationele capaciteit eisen. - Klik op toevoegen nieuwe Spots. Vink het selectievakje Proces hele afbeelding ten slotte. Klik op volgende.
- Geef de coördinaten van x en y (in pixel) definiëren de regio van belang. Voer het aantal frames (tijd en z-positie) om te analyseren. Klik op volgende.
- Selecteer het doelkanaal, waarin de objecten worden bijgehouden, in de Dropdown lijst met Bronkanaal. Invullen geschat xy Diameter (µm). Klik op volgende.
Opmerking: De diameter van de geschatte xy is de gemiddelde diameter in de x-en y-dimensie van objecten worden bijgehouden. - Klik op de kwaliteit. Stel een drempel, waarin de meeste van de cellen (objecten) opgenomen worden moeten. Klik op volgende.
- Kies de gewenste algoritme (Autoregressieve beweging wordt aanbevolen). Voer de max afstand (20 µm wordt aanbevolen) en de max grootte (3 of 2 wordt aanbevolen). Klik op proces hele afbeelding ten slotte.
Opmerking: Max afstand en Max grootte zijn twee drempels te breken tracks. Meer in het bijzonder, in twee continue frames wordt wanneer de afstand tussen hetzelfde object groter is dan de Max afstand, dit object in het latere frame beschouwd als een nieuw object. Soms tijdens overname, kan hetzelfde object verdwijnen voor een paar frames en tonen weer. In dit geval, alleen wanneer dit object verschijnt opnieuw binnen de grootte van de gap Max, zal het worden beschouwd als hetzelfde object. - Klik op Filter Type en kies de optie om uit te sluiten van ongewenste sporen.
Opmerking: Deze stap is optioneel. - Klik op volgende en klik vervolgens op Voltooien.
Opmerking: Deze stap kan duren uren tot dagen afhankelijk van computerprestaties. - Klik op Nummers bewerken en kies Juiste Drift. Selecteer het juiste algoritme (Translationeel Drift wordt aanbevolen). Selecteer de gewenste Resultaat Dataset grootte (Nieuwe grootte gelijk aan huidige grootte wordt aanbevolen). Klik op OK.
Opmerking: Deze stap is alleen nodig wanneer de collageen dreef tijdens Beeldacquisitie. - Klik op Statistieken en kies Configureren van zichtbare statistieken lijstwaarden. Controleer de opties van belang om te worden uitgevoerd (bijvoorbeeld coördinaten, snelheid, enzovoort). Klik op OK.
- Klik op Alle statistieken exporteren naar bestand en geef de bestandsnaam.
5. fixatie en immunofluorescentie kleuring van cellen in collageen Matrices
- Pipetteer 1.000 µL van 4% paraformaldehyde (PFA, in PBS) in een tube van 5 mL onder een chemische motorkap.
Opmerking: PFA moet worden afgewogen op kamertemperatuur. - Dompel het capillair met gepolymeriseerde collageen van 2.9. in PFA oplossing (voor ~ 5 mm) en bevestig het capillair op de binnenwand van de tube van 5 mL met modelleren van klei (zoals weergegeven in Figuur 1 c).
- Druk zachtjes op de plunjer totdat de helft van de collageen-staaf is opknoping in de PFA-oplossing (Figuur 1 d). Houd de buis bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Het terugtrekken van de plunjer om de staaf van de collageen binnen het capillair. Neem het capillair en PFA negeren.
- Mount het capillair in een verse buis en voeg 1 mL PBS. Zorg ervoor dat het capillair is ondergedompeld in de PBS.
- Druk zachtjes op de plunjer totdat de helft van de collageen-staaf is opknoping in de oplossing. Monteer het capillair op de binnenmuur met modelleren van klei.
- Houd de buis bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Herhaal 5.4. -5.7 voor een ander 2 keer.
- Het terugtrekken van de plunjer om de staaf van de collageen binnen het capillair. Gooi PBS. Pipetteer blokkeren/permeabilization buffer (1-% BSA, PBS + 0,1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof) 1-2 mL in de tube en herhaal 5.6.
Opmerking: De BSA (1%) kan worden vervangen door 5% serum van het dier dat de secundaire Ab groeide op in. - Houd de buis bij kamertemperatuur gedurende 30-60 minuten.
- Het terugtrekken van de plunjer om de staaf van de collageen binnen het capillair. Gooi de buffer permeabilization. Breng 200-500 µL van het primaire antilichaam in blokkeren/permeabilization buffer en verdrijft de staaf in de oplossing.
- Houd de buis bij kamertemperatuur gedurende 1 uur.
- Wassen van de staaf van de collageen 3 keer met PBST (PBS + 0,1 - procent niet-ionogene oppervlakteactieve stof) zoals beschreven in 5.4. -5,8.
- Incubeer de staaf in secundair antilichaam in blokkeren/permeabilization buffer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Houden van licht.
- De staaf van de collageen 3 keer met PBS wassen zoals beschreven in 5.4. -5,8.
- Het terugtrekken van de plunjer om de staaf van de collageen binnen het capillair. Houd de monsters in PBS tot imaging.
- Scan de monsters zoals beschreven in 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Uitsteeksel formatie tijdens T-cel migratie is een uiterst dynamisch proces, dat actine afhankelijk is. Om te visualiseren uitsteeksel vorming van primaire menselijke CTL, transfected we Transient een mEGFP gesmolten eiwit om het cytoskelet actine in CTL zoals beschreven voor11van een label. Een dag na de transfectie, werden de cellen ingesloten in de collageen-matrix. Afbeeldingsstapels werden verworven elke 40 s met een stap grootte van 1 µm bij 37 ° C met behulp van licht vel microscopie. Zoals aangegeven in figuur 2A en aanvullende film 1, tijdens de migratie menselijke CTL vorm citroen-vormige grote uitsteeksels, omzoomd door fijne spindel-achtige structuren. In het experiment dat hier wordt weergegeven, niet slechts één enkele cel was beeld, maar een groot volume (450 x 450 x 538 µm3) (figuur 2B). Aldus, de optische kwaliteit en de resolutie die hier getoond werden verkregen met een lage vergroting doelstelling (20 X / 1.0 DIC-VIS-IR). Daarom kan de resolutie verder worden verbeterd met hogere nb doelstellingen.
In het experiment blijkt uit Figuur 2 en film 1, werden CTL's automatisch bijgehouden zoals beschreven in het protocol deel 4. De trajecten van CTL zijn afgebeeld in figuur 2B. Twee parameters van migratie werden geanalyseerd: snelheid en persistentie. Persistentie wordt gedefinieerd als de verplaatsing gedeeld door de totale Tracklengte. Uit de analyse blijkt dat de mobiliteit van CTL erg divers in 3D is: de snelheden variëren van 0.01-0.19 µm/s met een bijna 20-fold verschil, en de persistentie varieert van 0 - 0,7 (figuur 2C). Bij muizen werd gemeld dat in vivo interstitiële migratie gemiddelde snelheid van T-cellen 4 µm/min16was. Onlangs, hebben wij de gemiddelde snelheid van CTL 4-5 µm/min11 met behulp van de methoden die worden beschreven in dit document worden vastgesteld. Deze resultaten tonen aan dat licht vel microscopie is een krachtig hulpmiddel voor het visualiseren van cel gedrag, bijvoorbeeld cel migratie en cel-cel interactie. In vivo, vele factoren en een niet-homogeen ECM van de complexe samenstelling met inbegrip van oplosbare factoren die invloed kunnen hebben op migratie zal T cel gedrag wijzigen.
Toepassing van een matrix van collageen is niet beperkt tot levende cellen. Fixatie en immunokleuring kunnen ook worden uitgevoerd in de matrix. Figuur 3 toont een voorbeeld van vaste monsters in 3D collageen gel, in welke endogene perforin1 (PFN1) en actine werden gekleurd. Het monster werd verlicht hetzij uit één zijde (Single kant verlichting) of van beide kanten (Dual side verlichting). Wij constateren dat cellen op verschillende z-posities zijn gelijkmatig gekleurd, die aangeeft dat in ons protocol beschreven procedures bevredigend penetratie van antilichamen in collageen gels bereiken. Wat nog belangrijker is, na fixatie CTL tentoongesteld de dezelfde morfologie als in leven cel imaging (Vergelijk Figuur 3 en figuur 2B), die aangeeft dat ook de morfologie goed door dit protocol onderhouden is. Verlichting van één zijde of aan beide zijden maakt daarnaast niet een significant verschil in de kwaliteit van afbeeldingen op het brandvlak. Gezien het feit dat er minder ruimte is blootgesteld aan de laser met de mode van één zijde verlichting in vergelijking met dual side verlichting, is één zijde verlichting meer aanbevolen.
Figuur 1: illustratie voor de behandeling van haarvaten tijdens monstervoorbereiding. (A) zet de zuiger in het capillair en hoe nat de plunjer met het kweekmedium. (B) Trek de cel/collageen mix in het capillair. (C) Mount haarvaten met behulp van modellering klei. De zuiger en de stang collageen zijn afgebeeld in grijze en rode vakken, respectievelijk. (D) omgaan met collageen staaf voor evenwichtsinstelling met het kweekmedium of voor immunokleuring. De zuiger en de stang collageen zijn afgebeeld in grijze en rode vakken, respectievelijk. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: het bijhouden van primaire menselijke CTL in 3D collageen en visualiseren van actine dynamics. (A) maximale intensiteit projectie van actine in primaire menselijke CTL. Actin was gelabeld in CTL als eerder beschreven11. Dag één post transfectie cellen werden ingesloten in 0,5% collageen matrix. Één vertegenwoordiger cel wordt weergegeven. Schaal bars zijn 5 µm. fijne actine structuren aan de rand van het uitsteeksel worden gemarkeerd door de pijlpunt. (B) trajecten van CTL voor 6 uur. De trajecten worden automatedly bijgehouden door de software (kleur code: blauw = start, rood = einde van de track, 450 × 450 × 538 µm3 volume). De bar van de schaal is 50 µm. (C) kwantificering van snelheid en persistentie. Één punt vertegenwoordigt één cel. Resultaten worden weergegeven als bedoel ± SEM uit 4 donoren. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Immunokleuring van endogene profilin1 (PFN1) en actine in CD8+ T cellen ingebed in de matrix 3D collageen. Primaire menselijke CD8+ T cellen werden ingesloten in 0,25% collageen. Na PFA fixatie werd het monster met behulp van anti-PFN1 (oranje) en phalloidin (paars) en gevisualiseerd door licht vel microscopie in een stap-grootte van 1 µm voor een totaal volume van 440 x 440 x 1000 µm3gekleurd. Het monster werd verlicht hetzij uit één zijde (Single kant verlichting) of van beide kanten (Dual side verlichting). Maximale intensiteit projecties (MIP) van 3D reconstructie worden weergegeven. De schaal bars zijn 50 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Film 1: genereren van uitsteeksels tijdens T-cel migratie. De cel wordt weergegeven in de film werd genomen uit het volume wordt weergegeven in figuur 2A. Cellen werden ingesloten in een matrix van collageen (0,5%). Beelden werden verkregen elke 40 s voor 6 uur bij 37 ° C met behulp van licht vel microscopie. Gelieve Klik hier om deze video te bekijken. (Klik met de rechtermuisknop om te downloaden.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Meeste in vitro tests worden uitgevoerd op een 2D oppervlak, bijvoorbeeld in celkweek platen, petrischalen of op coverslips, terwijl in vivo cellen, met name de immuuncellen, meestal een 3D communicatie ervaren. Opkomende bewijs toont aan dat migratiepatronen van immune cellen tussen 2D en 3D scenario's17 verschillen. Bovendien zijn de expressieprofielen van tumorcellen ook verschillend in 2D - en 3D-gekweekte weefsels18,19,20. Daarom, om de beste simuleren de fysiologische omstandigheden in vitro, is het van een groot voordeel voor het uitvoeren van experimenten in een 3D-context, bijvoorbeeld in 3D collageen matrices. De nieuw ontwikkelde benaderingen, in het bijzonder, de licht-blad fluorescentie microscopie, maakt betrouwbare en reproduceerbare experimenten in 3D matrix systemen onder gecontroleerde milieu omstandigheden.
In tegenstelling tot een conventionele laser-scanning confocal microscopie die de hele sonde, met licht vel microscopie verlicht, wordt alleen een dunne plaat van laserlicht gegenereerd om te verlichten van de monsters. De camera detectie is loodrecht op het vlak van verhelderend. Als gevolg van deze techniek, wordt alleen het gedeelte op het brandvlak blootgesteld aan de laser. Daarom, foto-bleken en fototoxiciteit kunnen worden geminimaliseerd. Bovendien, ten opzichte van punt-scanning microscopie, de verwerving tarief is drastisch verbeterd met licht vel microscopie (100 - 1,000-fold sneller) en de signaal-/ ruisverhouding is ook verbeterd. Gecombineerd met de kamer van de incubatie van licht vel microscopie setup gebruikt in dit document deze Microscoop is een krachtige optie voor image aquisition van grote 3D volumes met het geminimaliseerde bleken en foto-schade over uitgebreide perioden (enkele dagen) onder Incubator voorwaarden.
Voor de bereiding van de monsters met de 3D collageen matrix is het meest kritieke punt om te voorkomen dat luchtbellen. Gezien de hoge viscositeit, wanneer de luchtbellen zijn ingevoerd om de collageen-oplossing is het erg moeilijk te verwijderen uit de oplossing. De aanwezigheid van de luchtbellen kan induceren heterogeniteit van de polymerisatie van collageen matrix; het kan bovendien het pad van het licht, dat afbreuk aan de kwaliteit van afbeeldingen doen zou blokkeren. Daarom, wanneer overdracht of meng de collageen-oplossing een heel voorzichtig moet Pipetteer en doen niet verdrijven de laatste druppel in het uiteinde van de pipet. Bovendien, collageen begint te langzaam polymeriseren bij kamertemperatuur. Dus Voorkom polymerisatie voordat de oplossing goed mengen en moeten de collageen-bevattende buizen worden altijd gehouden op ijs.
Één grote uitdaging die we tegenkomen in het toepassen van licht vel microscopie is gegevensverwerking. De gegevens die zijn gegenereerd door licht vel microscopie kunt gemakkelijk bereiken de grootte van 500 gigabytes of zelfs meerdere terabytes, in het bijzonder voor lange termijn experimenten. Duurt enkele dagen, soms tot een week door een werk-station met hoge berekening capaciteit om deze gegevens te analyseren. Omdat de grootte van de geanalyseerde afbeeldingen niet kleiner is dan de oorspronkelijke gegevens kan een beperkende factor voor de toepassing van licht vel microscopie snel uitgegroeid tot de capaciteit van de opslag. Daarom voor tracking experimenten of als complexe beeldanalyse nodig is is het sterk aanbevolen om het beperken van de bestandsgrootte per experiment met waarden die door de beschikbare verwerkingseenheden in een redelijk tijdsbestek kunnen worden verwerkt.
Licht vel fluorescentie microscopie in hier geïntroduceerd heeft een aantal functies, die de resultaten beïnvloeden kunnen als niet zorgvuldig behandeld. Het gebruik van de haarvaten is bijzonder voordelige voor een obstakelvrije verlichting van de monsters. Aangezien de collageen staaf is opknoping in het medium, kan het gebeuren dat de staaf collageen tijdens Beeldacquisitie, vooral voor lange termijn metingen drijft. Deze drift moet worden gecorrigeerd om te voorkomen dat de verkeerde interpretatie van de resultaten. Natuurlijk, zijn er andere opstellingen licht vel microscopie verkrijgbare op de markt, die geen haarvaten vereisen te monteren van de monsters. Bovendien, met de licht-blad microscopie, naast het feit dat in vergelijking met de conventionele spoorlijn scannen confocale microscopie fototoxiciteit sterk is gereduceerd, fototoxiciteit nog blijft een probleem voor lange termijn imaging21.
Naast licht vel microscopie zijn er andere benaderingen voor de beeldvorming van 3D fluorescentie, waaronder de meestal toegepast multiphoton microscopie, confocal microscopie en breed-gebied fluorescentie microscopie zijn vastgesteld. In termen van de indringingsdiepte, confocal en breed-gebied fluorescentie microscopie liggen in het vergelijkbaar bereik, doorgaans beperkt tot 100 nm22. Vanwege de langere golflengte licht gebruikt voor meerdere foton microscopie, kan de indringingsdiepte worden verbeterd om het bereik van 0.5 - 1 mm23. Ter vergelijking: de grootte van een multi-dimensionale afbeeldingen gegenereerd door optische afdelen van licht vel microscopie kan oplopen tot enkele millimeters24. In termen van laterale resolutie toont een elegant uitgevoerd experiment aan dat licht vel microscopie biedt een beter driedimensionale ruimtelijke resolutie ten opzichte van confocal fluorescentie microscopie in de grote monsters25. Onlangs, heeft licht vel microscopie is gecombineerd met twee-foton techniek, die verder verbetert de indringingsdiepte in vergelijking met normale één foton licht vel microscopie en is tien keer sneller dan de punt-scanning microscopie van het twee-foton26.
Rekening houdend met 3D matrix waarmee de micro-architectuur voor cellen, naast boviene collageen ik in dit document gebruikte, zijn er vele andere opties, zoals de extra-cellulaire matrix (ECM) afgeleid van muis Sarcoom cellen, agarose, synthetische hydrogels of andere biocompatibel polymere materialen. Muis Sarcoom ECM is een mengsel van eiwit waaronder collageen IV, laminin evenals talrijke groeifactoren. Te vergelijken met de synthetische materialen, biologische ECMs (collageen en muis Sarcoom, ECM), aan de ene kant presenteren een meer fysiologisch relevante context; maar aan de andere kant, de kwaliteit en de samenstelling biologische ECMs kunnen variëren tussen partijen en bedrijven. Daarentegen is de reproduceerbaarheid van synthetische materialen meer gegarandeerd. Opmerkelijk, "fine-tuning"-van biochemische en mechanische eigenschappen, evenals de gewenste wijzigingen, is toegestaan voor synthetische materialen, maar niet voor biologische ECMs10,27.
Kortom, in dit document beschreven we een protocol voor de bouw van 3D collageen matrix voor cel biologie-experimenten met behulp van licht vel fluorescentie microscopie, en hoe te verankeren van primaire menselijke CTL in de 3D collageen matrix visualiseren en analyseren van CTL migratie. Wij gewezen op de belangrijkste punten in de bereiding van de monsters, Beeldacquisitie en de analyse. Onze resultaten tonen aan dat de vorming van hoogdynamische uitsteeksels en fijne actine structuren kan worden gevisualiseerd door licht vel microscopie met een goede Spatio resolutie. Bovendien, het protocol van de analyse beschreven hier stelt ons in staat voor het op betrouwbare wijze bijhouden van cellen op een objectieve en geautomatiseerde wijze. Deze methode zal vooral gunstig voor menselijke immunologisch onderzoek als muizen en mensen verschillen aanzienlijk in vele immunologische functies en reactiviteit therapieën28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren geen financiële of commerciële belangenconflict.
Acknowledgments
Wij danken het Instituut voor klinische Hemostaseology en transfusiegeneeskunde voor het verstrekken van bloed van de donor; Carmen Hässig en Cora Hoxha voor uitstekende technische hulp. Wij danken Jens Rettig (Universiteit van Saarland) voor de gewijzigde pMAX vector, Roland Wedlich-Söldner (Universiteit van Münster) voor de originele constructie van de LifeAct-Ruby en Christian Junker (Universiteit van Saarland) voor het genereren van de LifeAct-mEGFP-constructie. Dit project werd gefinancierd door Sonderforschungsbereich 1027 (project A2 BQ) en 894 (project A1 M.H.). De licht-blad Microscoop werd gefinancierd door DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
- Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
- Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
- Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
