Summary
Nous présentons ici un protocole afin de visualiser les cellules immunitaires noyées dans une matrice tridimensionnelle (3D) collagène microscope à lumière-feuille. Ce protocole précise également comment suivre la migration cellulaire en 3D. Ce protocole peut être utilisé pour d’autres types de cellules en suspension dans la matrice 3D.
Abstract
In vivo, l’activation, la prolifération et la fonction des cellules immunitaires tous se produisent dans un environnement de tridimensionnel (3D), par exemple dans les ganglions lymphatiques ou des tissus. Jusqu'à date, la plupart des systèmes in vitro reposent sur une surface bidimensionnelle (2D), tels que plaques de culture cellulaire ou de lamelles. De façon optimale de reproduire les conditions physiologiques in vitro, nous utilisons une matrice de collagène 3D simple. Collagène est l’une des principales composantes de la matrice extracellulaire (ECM) et a été largement utilisé pour constituer des matrices 3D. Pour l’imagerie 3D, la technologie de microscopie de lumière-feuille récemment développés (également dénommée microscopie illumination seul plan) est décrit avec acquisition haute vitesse, grande profondeur, faible de blanchiment et photocytotoxicité. En outre, microscopie à lumière-feuille est particulièrement avantageuse pour la mesure à long terme. Nous décrivons ici un protocole optimisé comment configurer et gérer les cellules immunitaires humaines, par exemple primaire humains lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules tueuses naturelles (NK) dans la matrice de collagène 3D pour une utilisation avec la microscopie en lumière-feuille pour l’imagerie de cellules vivantes et échantillons fixes. La procédure d’acquisition d’images et analyse de la migration cellulaire sont présentés. Une attention particulière est donnée pour mettre en évidence les étapes critiques et des facteurs pour la préparation des échantillons et l’analyse des données. Ce protocole peut être utilisé pour d’autres types de cellules en suspension dans une matrice de collagène 3D et n’est pas limité aux cellules immunitaires.
Introduction
La plupart des connaissances sur la migration cellules vient de 2D expériences1,2,3, qui sont normalement effectués dans un verre ou une surface en plastique d’une culture/imagerie plat. Toutefois, un scénario physiologique exige, dans la plupart des cas, un micro-environnement 3D, dans laquelle la matrice extracellulaire (ECM) joue un rôle décisif. ECM non seulement fournit l’essentiel de la structure 3D afin de maintenir la morphologie cellulaire appropriée, mais offre également des signaux de survie ou des indications directionnelles pour un fonctionnement optimal de nombreuses cellules4,5 . Par conséquent, il faut un environnement 3D pour mieux identifier les fonctions cellulaires et le comportement dans un environnement reflétant mieux le contexte physiologique.
Dans le corps humain, la plupart des cellules en particulier les cellules immunitaires, exercent leurs fonctions selon un scénario 3D. Par exemple, les lymphocytes T activés patrouillent tissus recherchant des cellules cibles, cellules naïves T migrent dans les ganglions lymphatiques dans la recherche de leurs cellules présentatrices d’antigène apparentés au cours de laquelle le mode de migration et les machines sont adaptées aux correspondants extracellulaire environnement,3,6,7. Le gel de collagène 3D a été largement utilisé comme une cellule 3D bien établies et bien caractérisé la culture système8,9,10. Nos travaux antérieurs montre que les lymphocytes humains primaires sont très mobiles et migrent à une vitesse moyenne d’environ 4,8 µm/min dans une matrice à base de collagène de 0,25 %11. Réarrangement du cytosquelette joue un rôle clé dans la migration de cellules12. Accumulation de preuves montre que les lymphocytes ne s’appliquent pas seulement à un seul mode de migration mais peuvent passer d’un certain comportement de migration selon l’emplacement, cytokines, microenvironnement, gradient chimiotactique et des signaux extracellulaires qui tune le comportement migratoire dans différentes manières 3.
Pour analyser efficacement les fonctions des cellules immunitaires et comportement, par exemple, migration, formation de protrusion ou le transport vésiculaire, c’est un avantage pour être en mesure d’acquérir des images dans des quantités relativement importantes de 3D de manière rapide et fiable. Pour l’imagerie 3D, la technologie de microscopie de lumière-feuille récemment développés (également dénommée microscopie illumination seul plan) offre une solution satisfaisante13,14. Au cours de l’acquisition de l’imagerie, une mince feuille de lumière statique est générée pour éclairer l’échantillon. De cette façon, sur le plan focal, une grande surface peut être illuminée simultanément sans affecter les cellules hors plan. Cette fonctionnalité permet une vitesse d’acquisition élevée avec un blanchiment drastiquement réduite et la photocytotoxicité. Dans cet article, nous décrivons comment visualiser des cellules immunitaires humaines primaires microscope à lumière-feuille et comment analyser la migration dans un scénario de 3D.
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Protocol
Les recherches menées pour la présente étude avec le matériel humain (chambres de système réduction leucocytaire de donneurs de sang humain) sont autorisé par le Comité d’éthique local (déclaration de 16.4.2015 (84/15 ; Prof. Dr. Rettig-Stürmer)) et suit les directives correspondantes.
1. préparation de la Solution de collagène neutralisée (500 µL)
- Transférer 400 µL de la solution mère de collagène réfrigérés (10,4 mg/mL) dans un tube stérile de 1,5 mL sous le capot de la culture cellulaire. Lentement, ajouter 50 µL de réfrigérée 10 x PBS (pH de 7,0 à 7,3) à 400 µL de solution mère de collagène réfrigérés. Mélanger la solution de carrelage doucement le tube.
Remarque : Toutes les étapes dans la partie 1 doivent se faire sous une hotte de culture cellulaire. - Ajouter 8 µL de NaOH 0,1 M en 500 µL de la solution de collagène de 1,1. pour ajuster le pH à 7,2 et 7,6. Utilisez les bandelettes de test pH (gamme de pH : 6-10) pour déterminer la valeur pH du mélange.
Remarque : Les Volumes peuvent varier pour les différents lots de collagène. Solution de NaOH doit être mélangé lentement pour éviter les bulles d’air. Le mélange doit être maintenu sur la glace pour éviter la formation de collagène. - Ajouter 2 µL de ddH stérile2O pour transformer le volume final à 500 µL. bien mélanger et conserver cette solution de collagène (8,32 mg/mL) sur la glace ou à 4 ° C jusqu'à l’utilisation ultérieure.
Remarque : Dans ces conditions, neutralisé collagène peut être utilisé pendant 24 h. parties aliquotes ne sont pas recommandés pour éviter les bulles d’air.
2. préparation pour la microscopie de Fluorescence lumière-feuille à l’aide de capillaires
- Fluorescent étiqueter les cellules vivantes d’intérêt avec les colorants fluorescents primaire désiré15 ou protéines fluorescentes11 comme décrit plus haut.
- Transférer 1 × 106 cellules dans un tube stérile de 1,5 mL sous une hotte de culture cellulaire. Centrifuger le tube à 200 x g pendant 8 min. jeter le surnageant et Resuspendre le culot dans 200 µL de milieu de culture.
Remarque : La densité cellulaire de 5 × 106 cellules/mL est recommandée pour la visualisation de la migration des cellules immunitaires humaines, surtout pour les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) et les cellules tueuses naturelles (NK). - Ajouter 85,9 µL de solution neutralisée collagène de 1,3. dans la suspension cellulaire de 2,2. et mélanger correctement pour atteindre une concentration de collagène de 2,5 mg/mL. Laisser le mélange cellulaire/collagène sur glace dans la hotte.
Remarque : Supposons que la concentration désirée du collagène est N mg/mL, a neutralisé le volume de solution de collagène (pour 200 µL de la suspension cellulaire) = 200 × N /(8.32-N) - Ensuite, mettre le piston correspondant dans le capillaire (diamètre intérieur ~ 1 mm) jusqu'à ce que le piston soit 1 mm sur le tube capillaire. Mouiller le piston en plongeant dans le milieu de culture (Figure 1 a).
Remarque : Cette étape permettrait d’éviter les bulles d’air lorsque le capillaire est plongé dans le mélange de cellule/collagène. Le capillaire et le piston n’ont pas à être stérile. - Plonger le tube capillaire dans le mélange de cellule/collagène de 2,3. Tirez lentement sur le piston arrière pour 10-20 mm (Figure 1 b). Essuyer la paroi extérieure du capillaire avec un essuie-tout humidifié avec un spray d’éthanol 70 % pour supprimer la solution restante de collagène.
- Monter le tube capillaire avec le modelage d’argile sur la paroi d’un tube de 5 mL et placer le mélange de cellule/collagène sur le bord du capillaire (Figure 1).
- Gardez le tube capillaire à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 1 h pour la polymérisation de collagène.
- Ajouter le milieu de culture (environ 1 à 2 mL) dans un tube de 5 mL. Soigneusement, appuyer sur le piston de collagène polymérisé out dans le milieu à environ 3/4 du collagène suspendus dans le milieu (Figure 1).
- Gardez le capillaire, comme ça, à 37 ° C, avec 5 % de CO2 pendant 30 min à équilibrer la tige de collagène avec le milieu.
Remarque : Par la suite, la tige de collagène peut être tiré vers l’arrière dans le capillaire et d’élevage supplémentaire avant d’utiliser.
3. image Acquisition microscope à lumière-feuille
- Assemblée de la chambre de mesure selon les instructions du fabricant.
- Allumez l’incubation et le microscope pour chauffer la chambre de mesure à 37 ° C (pour l’imagerie de cellules vivantes seulement).
- Placer le tube capillaire dans le compartiment de mesure et de localiser l’échantillon pour trouver la zone d’intérêt pour l’acquisition d’images.
- Activer la laser(s) correspondante. Définissez les paramètres suivants : laser puissance, durée d’exposition, étape-taille de position z-pile, de début et de fin de z-pile et l’intervalle de temps pour l’imagerie de cellules vivantes.
Remarque : par exemple, l’exemple à la Figure 2 a été photographié chaque 40 s pendant 6 h à 37 ° C, avec une taille de palier 1 µm (épaisseur totale : 538 µm). La puissance du laser était de 1 % avec un temps de pose de 30 m la taille en pixels à l’axe x-y est 0,23 µm. - Démarrer l’acquisition de l’image.
4. automatisée d’analyse de suivi
- Ouvrir le convertisseur de fichier, cliquez sur Ajouter des fichiers pour choisir l’ou les fichiers d’imagerie à convertir dans le format de fichier du logiciel (*.ims). Cliquez sur Parcourir et sélectionnez un dossier dans lequel enregistrer les fichiers convertis. Cliquez sur Démarrer Tous.
- Ouvrez le logiciel d’analyse. Cliquez sur le surpasser. Allez dans fichier et cliquez sur ouvrir, puis choisissez le fichier image à analyser.
Remarque : Si la taille du fichier est grande cette étape peut prendre de temps. Fichiers de plus de 1 téraoctet (to) ne sont pas recommandés pour une expérience unique dans le processus de ces gros fichiers sont hautement calcul capacité exigeant. - Cliquez sur ajouter de nouveaux Spots. Cochez la case Processus toute Image enfin. Cliquez sur suivant.
- Entrez les coordonnées x et y (en pixels) pour définir la zone d’intérêt. Entrez le nombre d’images (temps et z-position) à analyser. Cliquez sur suivant.
- Sélectionnez la chaîne cible, qui contient les objets à être l’objet d’un suivi, dans la liste déroulante du Canal Source. Renseignez estimée xy diamètre (µm). Cliquez sur suivant.
Remarque : Diamètre estimé xy est le diamètre moyen dans la dimension x-y d’objets à suivre. - Cliquez sur qualité. Définir un seuil, dans lequel la plupart des cellules (objets) devraient être incluse. Cliquez sur suivant.
- Choisir l’algorithme souhaité (Autoregressive Motion est recommandé). Entrez la distance max (il est recommandé de20 µm ) et la taille de l’écart maximum (3 ou 2 est recommandée). Cliquez sur le processus entier d’images enfin.
Remarque : Distance Max et Max écart taille sont deux seuils pour briser les titres. Plus précisément, dans les deux cadres continus lorsque la distance entre le même objet dépasse la distance Max, cet objet dans le cadre plus tard est considéré comme un nouvel objet. Parfois lors de l’acquisition, le même objet peut disparaître pour quelques images et apparaître à nouveau. Dans ce cas, seulement lors cet objet réapparaît au sein de la taille d’écart Max, elle est considérée comme l’objet même. - Cliquez sur le Type de filtre , choisissez l’option d’exclure des pistes non désirés.
Remarque : Cette étape est facultative. - Cliquez sur suivant et puis cliquez sur Terminer.
Remarque : Cette étape peut prendre des heures à jours en fonction des performances de calcul. - Cliquez sur Modifier les titres et choisissez Dérive Correct. Sélectionnez l’algorithme approprié (Drift translationnelle est recommandé). Sélectionnez le Résultat Dataset taille (Taille nouveau égal à la taille actuelle est recommandé). Cliquez sur OK.
Remarque : Cette étape n’est nécessaire quand le collagène dérivé lors de l’acquisition de l’image. - Cliquez sur statistiques et choisissez Configurer liste de statistiques valeurs visibles. Vérifiez les options d’intérêt à être exporté (p. ex., coordonnées, vitesse et ainsi de suite). Cliquez sur OK.
- Cliquez sur Exporter toutes les statistiques de fichier et entrez le nom du fichier.
5. fixation et Immunofluorescence souillant des cellules dans des Matrices de collagène
- Transférer 1 000 µL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA, dans du PBS) dans un tube de 5 mL sous une hotte chimique.
Remarque : IFP doit être équilibré à température ambiante. - Plonger le tube capillaire avec collagène polymérisée de 2,9. dans la solution de la PFA (pour ~ 5 mm) et monter le capillaire sur la paroi interne du tube 5 mL avec le modelage d’argile (comme illustré à la Figure 1).
- Appuyez doucement sur le piston jusqu'à ce que la moitié de la tige de collagène est suspendu dans la solution de la PFA (Figure 1). Maintenir le tube à température ambiante pendant 20 min.
- Tirer sur le piston pour obtenir la tige de collagène à l’intérieur du capillaire. Sortez le capillaire et jeter la PFA.
- Monter le capillaire dans un nouveau tube et ajouter 1 mL de PBS. Assurez-vous que le tube capillaire est plongé dans du PBS.
- Appuyez doucement sur le piston jusqu'à ce que la moitié de la tige de collagène est suspendu dans la solution. Monter le capillaire sur la paroi intérieure avec le modelage d’argile.
- Maintenir le tube à température ambiante pendant 5 min.
- 5.4 le répète. -5.7 pour un autre 2 fois.
- Tirer sur le piston pour obtenir la tige de collagène à l’intérieur du capillaire. Jeter les PBS. Transférer 1 à 2 mL de tampon de blocage/perméabilisation (1-% de BSA, PBS + surfactant non ionique de 0,1 %) dans le tube et répétez 5,6.
Remarque : La BSA (1 %) peut être remplacée par 5 % de sérum de l’animal dans que l’Ab secondaire a été soulevée. - Maintenir le tube à température ambiante pendant 30-60 min.
- Tirer sur le piston pour obtenir la tige de collagène à l’intérieur du capillaire. Jeter le tampon perméabilisation. 200-500 µL de l’anticorps primaire dans un tampon bloquant/perméabilisation de transfert et expulse la tige dans la solution.
- Maintenir le tube à température ambiante pendant 1 h.
- Lavez la tige de collagène 3 fois avec PBST (PBS + surfactant non ionique - 0,1 %), comme décrit au point 5.4. -5,8.
- Incuber la tige dans l’anticorps secondaire dans un tampon bloquant/perméabilisation pendant 1 h à température ambiante. Garder de la lumière.
- Lavez la tige de collagène 3 fois avec du PBS comme décrit au point 5.4. -5,8.
- Tirer sur le piston pour obtenir la tige de collagène à l’intérieur du capillaire. Conserver les échantillons dans du PBS jusqu’en imagerie.
- Analyser les échantillons comme décrit dans 3.
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Representative Results
Formation de saillie au cours de la migration des cellules T est un processus très dynamique, qui est dépendante de l’actine. Pour visualiser la formation de saillie de CTL humain primaire, nous transfectées transitoirement une protéine mEGFP fusionné pour étiqueter le cytosquelette d’actine en CTL comme décrit avant11. Un jour après la transfection, les cellules ont été incorporés dans la matrice de collagène. Piles d’images ont été acquises chaque 40 s avec une taille de palier de 1 µm à 37 ° C en utilisant la microscopie de lumière-feuille. Comme illustré à la Figure 2 a et 1 de film supplémentaire, pendant la migration, forme humaine de CTL en forme de citron grandes saillies, bordées de fines structures en broche. Dans l’expérience présentée ici, non seulement une cellule unique a été photographié, mais un grand volume (450 x 450 x 538 µm3) (Figure 2 b). Ainsi, la qualité optique et la résolution présenté ici ont été obtenus avec un objectif de faible grossissement (20 X / 1.0 DIC VIS IR). Par conséquent, la résolution pourrait être encore améliorée avec des objectifs plus élevés de NA.
Dans l’expérience illustré à la Figure 2 et film 1, CTL ont été suivies automatiquement comme décrit dans le protocole n ° 4 de la partie. Les trajectoires des CTL sont illustrés dans la Figure 2 b. Deux paramètres de migration ont été analysés : vitesse et persistance. Persistance se définit comme le déplacement divisé par la longueur de piste total. L’analyse montre que la mobilité des CTL est très diversifiée en 3D : les vitesses varient de 0,01-0,19 µm/s avec une différence de près de 20 fois et les plages de la persistance de 0 - 0,7 (Figure 2). Il a été signalé chez la souris que in vivo interstitielle moyenne vitesse de migration des cellules T était 4 µm/min16. Récemment, nous avons déterminé la vitesse moyenne de CTL pour 4-5 µm/min11 selon les méthodes décrites dans cet article. Ces résultats démontrent que la microscopie à lumière-feuille est un outil puissant pour visualiser le comportement des cellules, par exemple, la migration cellulaire et interactions cellule-cellule. In vivo, de nombreux facteurs et une ECM non homogène de la composition complexe, y compris des facteurs solubles qui peuvent affecter la migration vont modifier le comportement de cellules T.
Application d’une matrice de collagène n’est pas limitée aux cellules en direct. Fixation et immunomarquage peuvent également être effectuées dans la matrice. La figure 3 montre un exemple d’échantillons fixes en gel de collagène 3D, dans lequel perforin1 endogène (PFN1) et de l’actine se colorent. L’échantillon était allumé soit à partir d’un seul côté (un seul éclairage latéral) ou des deux côtés (éclairage latéral double). Nous observons que les cellules à différentes positions z sont uniformément colorées, indiquant que les procédures décrites dans notre protocole obtenir une pénétration satisfaisante des anticorps dans des gels de collagène. Plus important encore, après fixation CTL présentait la même morphologie comme dans vivre d’imagerie cellulaire (cf. Figure 3 et Figure 2 b), ce qui indique que la morphologie est maintenue aussi bien par le présent protocole. En outre, l’illumination du seul côté ou des deux côtés ne fait pas une différence significative dans la qualité des images dans le plan focal. Considérant que moins zone est exposée au laser avec le mode d’éclairage seul côté par rapport à un éclairement latéral double, éclairage latéral unique est plus recommandé.
Figure 1 : Illustration de manutention capillaires au cours de la préparation de l’échantillon. (A) mettre le piston dans le tube capillaire et comment mouiller le piston avec le milieu de culture. (B) retirer le mélange de cellule/collagène dans le capillaire. (C) montage capillaires à l’aide de glaise à modeler. Le piston et la tige de collagène sont représentés dans les boîtes grises et rouges respectivement. (D) poignée tige de collagène pour équilibration au milieu de culture ou pour immunostaining. Le piston et la tige de collagène sont représentés dans les boîtes grises et rouges respectivement. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : suivi primaire CTL humaine en collagène 3D et la visualisation dynamique de l’actine. (A) projection d’intensité Maximum de l’actine en primaire CTL humaine. Actine a été marquée en CTL comme décrit précédemment11. Premier jour après transfection de cellules ont été incorporés dans la matrice de collagène de 0,5 %. Une cellule représentative est montrée. Barreaux de l’échelle est de 5 µm. actine fines structures au bord protrusion sont mises en évidence par la pointe de flèche. (B) les trajectoires des CTL pendant 6 h. Les trajectoires sont automatedly suivies par le logiciel (code couleur : bleu = start, rouge = fin de la piste, 450 × 450 × 538 µm3 volume). La barre d’échelle est 50 µm. (C) Quantification de vélocité et de persistance. Un point représente une seule cellule. Résultats sont présentés en moyenne ± SEM 4 donneurs. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Immunostaining des profilin1 endogène (PFN1) et l’actine en CD8+ T cellules enfoui dans la matrice de collagène 3D. CD8 humains primaires+ T les cellules étaient enfouis dans le collagène de 0,25 %. Après fixation de la PFA, l’échantillon était Taché à l’aide d’anti-PFN1 (orange) et la phalloïdine (violet) et lumière-feuille microscope à une étape-taille 1 µm pour un volume total de 440 x 440 x 1 000 µm3. L’échantillon était allumé soit à partir d’un seul côté (un seul éclairage latéral) ou des deux côtés (éclairage latéral double). Intensité maximale de projections (MIP) de reconstruction 3D sont représentées. Les barres d’échelle sont 50 µm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Movie 1 : génération de protubérances au cours de la migration des cellules de T. La cellule représentée dans le film est extraite du volume illustré à la Figure 2 a. Les cellules ont été noyées dans une matrice de collagène (0,5 %). Les images ont été acquises chaque 40 s pendant 6 h à 37 ° C en utilisant la microscopie de lumière-feuille. S’il vous plaît cliquez ici pour voir cette vidéo. (Clic droit pour télécharger.)
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Discussion
La plupart des essais in vitro sont réalisées sur une surface 2D, par exemple dans les plaques de culture cellulaire, Pétri ou à lamelles, considérant que l’expérience in vivo des cellules, en particulier les cellules immunitaires, pour la plupart un micro-environnement 3D. Des preuves nouvelles montre que les patrons de migration des cellules immunitaires diffèrent entre 2D et 3D de scénarios17. En outre, les profils d’expression des cellules tumorales sont également différents en 2D-3D-cultivé et tissus18,19,20. Par conséquent, pour mieux simuler les conditions physiologiques in vitro, il est un grand avantage pour réaliser des expériences dans un contexte 3D, par exemple dans les matrices de collagène 3D. Les approches nouvellement mis au point, en particulier, la microscopie de fluorescence lumière-feuille, permet des expériences fiables et reproductibles dans des systèmes de matrice 3D dans des conditions environnementales contrôlées.
Contrairement à une conventionnelle microscopie confocale à balayage laser qui illumine la sonde ensemble, avec la microscopie à lumière-feuille, seulement une mince feuille de lumière laser est générée pour éclairer les échantillons. L’appareil de détection est perpendiculaire au plan de l’éclairage. Grâce à cette technique, que la section dans le plan focal est exposée au laser. Par conséquent, photo de blanchiment et de phototoxicité peuvent être minimisés. En outre, par rapport au point-balayage microscopie, le taux d’acquisition est considérablement renforcé avec lumière-feuille microscopie (100 - 1000 plus rapide) et le rapport signal-bruit est également amélioré. Combiné avec la chambre d’incubation de la microscopie de lumière-feuille d’installation utilisée dans cet article, ce microscope est une option puissante pour l’acquisition d’images de grands volumes 3D avec le blanchiment réduit et photo-dégâts sur de longues périodes de temps (plusieurs jours) en vertu de conditions de l’incubateur.
Pour la préparation de l’échantillon avec la matrice de collagène 3D, le point le plus critique est d’éviter les bulles d’air. Compte tenu de sa haute viscosité, lorsque des bulles d’air sont introduites à la solution de collagène, il est très difficile de l’enlever de la solution. La présence de bulles d’air peut induire l’hétérogénéité de la polymérisation de la matrice de collagène ; en outre, il peut bloquer le chemin de la lumière, ce qui diminuerait la qualité des images. Par conséquent, lorsque le transfert ou mélanger la solution de collagène un doit déposer très doucement et expulser pas la dernière goutte dans l’embout de la pipette. Par ailleurs, le collagène commence à lentement se polymérisent à température ambiante. Ainsi, pour empêcher la polymérisation avant de bien mélanger la solution, les tubes contenant du collagène doivent être toujours sur la glace.
Un grand défi que nous rencontrons en utilisant la microscopie de lumière-feuille est le traitement des données. Les données générées par microscopie à lumière-feuille peuvent facilement atteindre la taille de 500 gigaoctets ou même plusieurs téra-octets, en particulier pour les expériences à long terme. Pour analyser ces données prend plusieurs jours, parfois jusqu'à une semaine par un poste de travail avec une capacité de calcul élevé. Étant donné que la taille des images analysées n’est pas plus petite que les données originales la capacité de stockage peut rapidement devenir un facteur limitant pour l’application de la feuille de lumière microscopie. Donc, pour des expériences de suivi ou si l’analyse d’image complexe est nécessaire il est fortement recommandé pour limiter la taille de fichier par expérience à des valeurs qui peuvent être traitées dans un délai raisonnable par les unités de traitement disponibles.
Microscopie à fluorescence lumière-feuille a présenté ici a quelques caractéristiques, qui peuvent affecter les résultats si ne pas manipulés avec soin. L’utilisation des capillaires est particulièrement avantageuse pour un éclairage sans entraves des échantillons. Étant donné que la tige de collagène est suspendu dans le milieu, il peut arriver que la tige de collagène des dérives lors de l’acquisition de l’image, en particulier pour les mesures à long terme. Cette dérive doit être corrigée pour éviter une interprétation erronée des résultats. Bien sûr, il y a autres configurations de microscopie de lumière-feuille commercialement disponibles sur le marché, qui ne nécessitent pas de capillaires pour monter les échantillons. En outre, avec la microscopie de lumière-feuille, outre le fait que par rapport à la ligne conventionnelle phototoxicité de microscopie confocale balayage a été considérablement réduite, phototoxicité reste un sujet de préoccupation pour l' imagerie à long terme21.
En dehors de la microscopie à lumière-feuille, il y a autres approches établies pour l’imagerie de fluorescence 3D, parmi lesquels est la plupart du temps appliquée microscopie confocale, microscopie à fluorescence de grand champ et la microscopie multiphoton. En termes de profondeur de la pénétration, la microscopie en fluorescence confocale et grand champ se trouvent dans la même gamme, normalement limitée à 100 nm22. Grâce à la lumière de longueur d’onde plue utilisée pour la microscopie multiphotonique, sa profondeur de pénétration peut être améliorée à la gamme de 0,5 - 1 mm23. En comparaison, la taille des images multidimensionnelles générées en sectionnant optiques de microscopie de lumière-feuille peut être jusqu'à plusieurs millimètres24. En termes de résolution latérale, une expérience élégamment réalisée montre que microscopie de lumière-feuille offre une meilleure résolution spatiale tridimensionnelle par rapport à la microscopie confocal fluorescence dans les grands échantillons25. Récemment, microscopie de lumière-feuille a été combinée avec la technique de deux photons, qui améliore la profondeur de pénétration par rapport à la normale une microscopie lumière-feuille de photon et est dix fois plus rapide que point-microscopie biphotonique26.
Compte tenu de la matrice 3D qui fournit l’architecture micro pour les cellules, en plus de collagène bovin que j’ai utilisé dans cet article, il y a beaucoup d’autres options, telles que de la matrice extracellulaire (ECM) dérivée de cellules de sarcome de souris, agarose, hydrogels synthétiques ou autre matériaux polymères biocompatibles. Sarcome de souris ECM est un mélange de protéines, y compris le collagène IV, laminine ainsi que de nombreux facteurs de croissance. Comparez les matériaux synthétiques, ECMs biologiques (collagène et souris sarcome ECM), d’une part, présenter un contexte plus physiologiquement pertinent ; mais en revanche, la qualité et la composition biologique SEGDA peut-être varier entre les lots et les entreprises. En revanche, la reproductibilité des matériaux synthétiques est plus garantie. Remarquablement, fine-tuning des propriétés biochimiques et mécaniques, ainsi que les modifications souhaitées, est autorisé pour les matériaux synthétiques, mais pas pour les biologiques SEGDA10,27.
En résumé, nous avons décrit dans cet article un protocole pour construire la matrice de collagène 3D pour des expériences de biologie cellulaire à l’aide de la microscopie en fluorescence lumière-feuille et comment intégrer les CTL humain primaire dans la matrice de collagène 3D pour visualiser et analyser la migration CTL. Nous avons mis en évidence les points clés dans la préparation de l’échantillon, l’acquisition de l’image et l’analyse. Nos résultats montrent que la formation des saillies très dynamiques et les structures fines de l’actine peut être visualisée par microscopie à lumière-feuille avec une bonne résolution spatio-temporelle. En outre, le protocole d’analyse décrit ici permet de suivi fiable des cellules de façon automatisée et objectif. Cette méthode sera particulièrement avantageuse pour la recherche immunologique que les souris et les humains diffèrent considérablement dans de nombreuses fonctions immunologiques et réactivité face aux thérapies28.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts, financier ou commerciaux.
Acknowledgments
Nous remercions l’Institut Hemostaseology clinique et médecine de Transfusion pour la fourniture de sang du donneur ; Carmen Hässig et Cora Hoxha pour l’aide technique excellente. Nous remercions Jens Rettig (Université de la Sarre) pour le vecteur mis à jour le pMAX, Roland Wedlich-Söldner (Université de Münster) pour la construction de LifeAct-Ruby originale et Christian Junker (Université de la Sarre) pour générer la construction LifeAct-mEGFP. Ce projet a été financé par Sonderforschungsbereich 1027 (projet A2 à B.Q.) et 894 (projet A1 à M.H.). Le microscope de lumière-feuille a été financé par la DFG (GZ : FUGG 19-1 INST 256/4).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
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