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Immunology and Infection

मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं के तीन आयामी दृश्य के लिए हल्की चादर माइक्रोस्कोपी

Published: June 13, 2018 doi: 10.3791/57651
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biophysics, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), School of Medicine, Saarland University

Summary

यहां, हम एक तीन आयामी (3 डी) कोलेजन मैट्रिक्स प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर में एम्बेडेड प्रतिरक्षा कोशिकाओं कल्पना करने के लिए एक प्रोटोकॉल मौजूद । यह प्रोटोकॉल भी कैसे 3 डी में सेल माइग्रेशन ट्रैक करने के लिए सविस्तार । इस प्रोटोकॉल 3 डी मैट्रिक्स में निलंबन कोशिकाओं के अंय प्रकार के लिए नियोजित किया जा सकता है ।

Abstract

vivo में, सक्रियण, प्रसार, और प्रतिरक्षा कोशिकाओं के समारोह में सभी हो एक तीन आयामी (3 डी) वातावरण, उदाहरण के लिए लिम्फ नोड्स या ऊतकों में. अप टू डेट, इन विट्रो सिस्टम में अधिकांश दो आयामी (2d) सतहों, जैसे सेल-कल्चर प्लेट्स या coverslips पर निर्भर करते हैं । बेहतर इन विट्रो मेंशारीरिक शर्तों की नकल करने के लिए, हम एक साधारण 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स का उपयोग । कोलेजन extracellular मैट्रिक्स (ECM) के प्रमुख घटकों में से एक है और व्यापक रूप से 3 डी मैट्रिक्स का गठन किया गया है । 3 डी इमेजिंग के लिए, हाल ही में विकसित प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकी (भी एकल विमान दीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में संदर्भित) उच्च अधिग्रहण की गति, बड़ी पैठ गहराई, कम ब्लीचिंग, और photocytotoxicity के साथ चित्रित किया है । इसके अलावा, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी दीर्घकालिक माप के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है । यहां हम एक अनुकूलित प्रोटोकॉल का वर्णन कैसे स्थापित करने के लिए और मानव प्रतिरक्षा कोशिकाओं को संभालने के लिए, उदाहरण के लिए प्राथमिक मानव साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTL) और 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में प्राकृतिक हत्यारा (NK) प्रकाश के साथ उपयोग के लिए कक्ष-शीट माइक्रोस्कोपी लाइव सेल के लिए इमेजिंग और निर्धारित नमूनों । छवि प्राप्ति और सेल माइग्रेशन के विश्लेषण के लिए प्रक्रिया प्रस्तुत कर रहे हैं । नमूना तैयारी और डेटा विश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण चरणों और कारकों को हाइलाइट करने के लिए एक विशेष ध्यान दिया जाता है । इस प्रोटोकॉल एक 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में निलंबन कोशिकाओं के अंय प्रकार के लिए नियोजित किया जा सकता है और प्रतिरक्षा कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं है ।

Introduction

कोशिकाओं के प्रवास के बारे में सबसे अधिक जानकारी 2d प्रयोग1,2,3से आता है, जो आम तौर पर एक गिलास या एक संस्कृति के प्लास्टिक की सतह/ हालांकि, एक शारीरिक परिदृश्य की आवश्यकता है, ज्यादातर मामलों में, एक 3d microenvironment, जिसमें extracellular मैट्रिक्स (ECM) एक निर्णायक भूमिका निभाता है । ECM न केवल उचित सेल आकृति विज्ञान बनाए रखने के लिए आवश्यक 3d संरचना प्रदान करता है लेकिन यह भी कई कोशिकाओं के एक इष्टतम कार्य के लिए अस्तित्व के संकेत या दिशात्मक cues प्रदान करता है4,5 . इसलिए, एक 3 डी वातावरण बेहतर एक बेहतर शारीरिक संदर्भ को प्रतिबिंबित वातावरण में सेलुलर कार्यों और व्यवहार की पहचान करने के लिए आवश्यक है ।

मानव शरीर में, ज्यादातर कोशिकाओं विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं, एक 3 डी परिदृश्य के तहत अपने कार्यों डालती है । उदाहरण के लिए, सक्रिय टी कोशिकाओं गश्ती ऊतकों लक्ष्य कोशिकाओं के लिए खोज, भोली टी कोशिकाओं उनके cognate प्रतिजन के लिए खोज में लिम्फ नोड्स के माध्यम से माइग्रेट-कोशिकाओं के दौरान जो माइग्रेशन मोड और मशीनरी संगत extracellular के लिए अनुकूलित कर रहे हैं पेश पर्यावरण3,6,7। 3 डी कोलेजन जेल व्यापक रूप से एक अच्छी तरह से स्थापित और अच्छी तरह से 3 डी सेल संस्कृति प्रणाली8,9,10विशेषता के रूप में इस्तेमाल किया गया है । हमारे पिछले काम से पता चलता है कि प्राथमिक मानव लिम्फोसाइटों उच्च मोबाइल और लगभग ४.८ µm/मिनट की एक औसत गति से एक ०.२५% कोलेजन में विस्थापित-11मैट्रिक्स आधारित है । cytoskeleton की पुनर्व्यवस्था कक्ष माइग्रेशन12में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है । सबूत जमा करने से पता चलता है कि लिम्फोसाइटों केवल माइग्रेशन का केवल एक ही मोड लागू न करें अभी तक स्थान, microenvironment, साइटोकिंस, chemotactic ग्रेडिएंट्स, और extracellular संकेतों के आधार पर कुछ माइग्रेशन व्यवहार के बीच स्विच कर सकता है जो ट्यून करता है विभिंन तरीकों से प्रवासी व्यवहार 3।

मज़बूती से प्रतिरक्षा कोशिका कार्यों और व्यवहार का विश्लेषण करने के लिए, उदाहरण के लिए, प्रवास, घुसपैठ गठन या vesicular परिवहन, यह काफी लाभ की है एक तेज और विश्वसनीय तरीके से अपेक्षाकृत बड़े 3 डी मात्रा में छवियों को प्राप्त करने में सक्षम हो । 3 डी इमेजिंग के लिए, हाल ही में विकसित प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी प्रौद्योगिकी (भी एकल विमान दीप्ति माइक्रोस्कोपी के रूप में संदर्भित) एक संतोषजनक समाधान13,14प्रदान करता है । इमेजिंग अधिग्रहण के दौरान, एक पतली स्थिर प्रकाश चादर नमूना रोशन करने के लिए उत्पंन होता है । इस तरह, फोकस विमान पर, एक बड़े क्षेत्र से एक साथ प्रबुद्ध किया जा सकता है बंद विमान कोशिकाओं को प्रभावित किए बिना । यह सुविधा अत्यधिक कम ब्लीचिंग और photocytotoxicity के साथ उच्च प्राप्ति गति को सक्षम बनाती है । इस पत्र में, हम वर्णन कैसे प्राथमिक मानव प्रतिरक्षा प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर कोशिकाओं को कल्पना और कैसे एक 3 डी परिदृश्य में प्रवास का विश्लेषण करने के लिए ।

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Protocol

मानव सामग्री (मानव रक्त दाताओं से ल्युकोसैट कमी प्रणाली कक्षों) के साथ इस अध्ययन के लिए किए गए अनुसंधान स्थानीय नैतिकता समिति द्वारा अधिकृत है (16.4.2015 से घोषणा (84/15; प्रो Dr. Rettig-Stürmer)) और संबंधित दिशानिर्देशों का पालन करता है ।

1. बेअसर कोलेजन समाधान की तैयारी (५०० µ l)

  1. स्थानांतरण ४०० µ ठंडा कोलेजन स्टॉक समाधान के एल (१०.४ मिलीग्राम/एमएल) सेल संस्कृति हूड के तहत एक बाँझ १.५ मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए । धीरे ठंडा 10x पंजाबियों के ५० µ एल जोड़ें (पीएच ७.०-७.३) के लिए ४०० ठंड कोलेजन स्टॉक समाधान के µ एल । घोल को धीरे से ट्यूब टाइलिंग कर मिक्स कर लें ।
    नोट: 1 भाग में सभी कदम एक सेल संस्कृति हूड के तहत किया जाना चाहिए ।
  2. १.१ से कोलेजन समाधान के ५०० µ एल में ०.१ एम NaOH के 8 µ एल जोड़ें । पीएच को 7.2-7.6 समायोजित करने के लिए । उपयोग पीएच परीक्षण स्ट्रिप्स (पीएच रेंज: 6-10) मिश्रण का पीएच मान निर्धारित करने के लिए ।
    नोट: मात्रा कोलेजन के विभिंन बैचों के लिए भिंन हो सकते हैं । NaOH समाधान के लिए हवा के बुलबुले से बचने के लिए धीरे से मिलाया जाना है । मिश्रण बर्फ पर रखा जाना चाहिए कोलेजन जमाना से बचने के लिए ।
  3. जोड़ें 2 µ l के बाँझ ddH2हे बनाने के लिए अंतिम मात्रा करने के लिए ५०० µ l अच्छी तरह से मिश्रण और इस कोलेजन समाधान की दुकान (८.३२ mg/एमएल) बर्फ पर या 4 ° c पर आगे उपयोग तक.
    नोट: इस हालत के तहत, बेअसर कोलेजन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता 24 Aliquots हवा बुलबुले से बचने के लिए अनुशंसित नहीं कर रहे हैं.

2. प्रकाश-पत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी केशिकाओं का उपयोग करने के लिए नमूना तैयारी

  1. फ्लोरोसेंट वांछित प्राथमिक फ्लोरोसेंट रंजक15 या फ्लोरोसेंट प्रोटीन11 के रूप में पहले वर्णित के साथ ब्याज की जीवित कोशिकाओं लेबल ।
  2. एक कोशिका संस्कृति हूड के तहत एक बाँझ १.५ मिलीलीटर ट्यूब में कोशिकाओं के 1 × 106 स्थानांतरण. 8 मिनट के लिए २०० x g पर ट्यूब केंद्रापसारक । supernatant त्यागें और २०० µ में गोली reसस्पेंड संस्कृति माध्यम के एल ।
    नोट: सेल घनत्व के 5 × 106 कोशिकाओं/एमएल मानव प्रतिरक्षा सेल प्रवास के दृश्य के लिए सिफारिश की है, विशेष रूप से साइटोटोक्सिक टी लिम्फोसाइटों (CTL) और प्राकृतिक खूनी (NK) कोशिकाओं के लिए ।
  3. १.३ से बेअसर कोलेजन समाधान के ८५.९ µ एल जोड़ें । २.२ से सेल निलंबन में । और मिश्रण ठीक से २.५ मिलीग्राम/एमएल के एक कोलेजन एकाग्रता तक पहुंचने के लिए । हुड में बर्फ पर सेल/कोलेजन मिश्रण छोड़ दें ।
    नोट: कोलेजन का वांछित एकाग्रता मान लीजिए N मिलीग्राम/एमएल, बेअसर कोलेजन समाधान की मात्रा (२०० µ l सेल निलंबन के लिए) = २०० × n/(8.32-n)
  4. अगले, केशिका (भीतरी व्यास ~ 1 मिमी) में मिलान गोताख़ोर डाल जब तक गोताख़ोर केशिका से 1 मिमी है । गोताख़ोर को कल्चरल मीडियम (फिगर 1a) में डूबा कर गीला कर दीजिये.
    नोट: यह कदम हवा बुलबुले को रोकने में मदद जब केशिका कोशिका में डूबा हुआ है/ केशिका और गोताख़ोर करने के लिए बाँझ नहीं है ।
  5. २.३ से कोशिका/कोलेजन मिश्रण में केशिका डुबकी । धीरे गोताख़ोर वापस खींच 10-20 mm (आंकड़ा 1b) के लिए । एक कागज तौलिया के साथ केशिका की बाहरी दीवार पोंछ ७०% इथेनॉल स्प्रे के साथ गीला शेष कोलेजन समाधान को दूर ।
  6. एक 5 मिलीलीटर ट्यूब के भीतर की दीवार पर क्ले मॉडलिंग के साथ केशिका माउंट और केशिका (चित्रा 1C) के किनारे करने के लिए सेल/
  7. ३७ ° c पर केशिका बहुलकीकरण के लिए 1 एच के लिए 5% CO2 के साथ रखें ।
  8. संस्कृति माध्यम जोड़ें (लगभग 1-2 मिलीलीटर) एक 5 मिलीलीटर ट्यूब करने के लिए । ध्यान से एक मध्यम में (चित्रा 1 डी) में लटक कोलेजन के आसपास 3/4 के लिए मध्यम में बाहर बहुलक कोलेजन रॉड दबाएं ।
  9. इस तरह केशिका रखो, ३७ ° c के साथ 5% CO2 के लिए एक और 30 मिनट के लिए मध्यम के साथ कोलेजन रॉड equilibrate ।
    नोट: बाद में, कोलेजन रॉड केशिका में वापस खींच लिया जा सकता है और आगे का उपयोग करने से पहले और अधिक प्रसंस्कृत ।

3. छवि अधिग्रहण प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग

  1. असेंबली नमूना चैंबर निर्माता के निर्देश के अनुसार ।
  2. ३७ डिग्री सेल्सियस (लाइव सेल इमेजिंग के लिए केवल) के लिए नमूना चैंबर गर्मी के लिए मशीन और माइक्रोस्कोप पर बारी.
  3. नमूना कक्ष में केशिका प्लेस और नमूना का पता लगाने के लिए छवि अधिग्रहण के लिए ब्याज के क्षेत्र को खोजने के लिए ।
  4. संगत लेज़र (s) को सक्रिय करें । निंन सेटिंग्स सेट करें: लेज़र पावर, एक्सपोज़र समय, चरण-z-स्टैक के आकार, प्रारंभ और z-स्टैक के अंत की स्थिति, और लाइव सेल इमेजिंग के लिए समय अंतराल ।
    नोट: उदाहरण के लिए, चित्र 2 में नमूना 1 µm (कुल मोटाई: ५३८ µm) के एक कदम के आकार के साथ ३७ ° c पर 6 घंटे के लिए हर ४० s imaged था । लेजर पावर 30 ms. x-y दिशा में पिक्सेल आकार ०.२३ µm है की एक जोखिम समय के साथ 1% था ।
  5. छवि प्राप्ति प्रारंभ करें ।

4. स्वचालित ट्रैकिंग विश्लेषण

  1. फ़ाइल कनवर्टर खोलें, सॉफ़्टवेयर फ़ाइल स्वरूप (*. आईएमएस) में कनवर्ट करने के लिए इमेजिंग फ़ाइल (ओं) को चुनने के लिए फ़ाइलें जोड़ें क्लिक करें । ब्राउज़ करेंक्लिक करें और कनवर्ट की गई फ़ाइल (फ़ाइलों) को सहेजने के लिए किसी फ़ोल्डर का चयन करें । सभी प्रारंभकरेंक्लिक करें ।
  2. विश्लेषण सॉफ़्टवेयर खोलें । बढ़चढ़करक्लिक करें । फ़ाइल पर जाएँ और खोलेंपर क्लिक करें, फिर विश्लेषण की जाने वाली इमेजिंग फ़ाइल चुनें.
    नोट: यदि फ़ाइल का आकार बड़ा है, तो यह चरण समय लग सकता है । 1 टेराबाइट (टीबी) से बड़ी फ़ाइलें एक ही प्रयोग के लिए अनुशंसित नहीं है क्योंकि इस प्रक्रिया में ऐसी बड़ी फ़ाइलें अत्यधिक गणना क्षमता की मांग कर रहे हैं ।
  3. नए स्पॉट जोड़ेंपर क्लिक करें. बॉक्स प्रक्रिया पूरी छवि अंतमें जांच करें । अगलाक्लिक करें ।
  4. रुचि के क्षेत्र को परिभाषित करने के लिए निर्देशांक x और y के लिए (पिक्सेल में) दर्ज करें । का विश्लेषण करने के लिए फ्रेम (समय और जेड स्थिति) की संख्या दर्ज करें । अगलाक्लिक करें ।
  5. लक्ष्य चैनल का चयन करें, जिसमें ट्रैक किए जाने वाले ऑब्जेक्ट, स्रोत चैनलकी ड्रॉपडाउन सूची में शामिल हैं. अनुमानित xy व्यास (µm में) दर्ज करें । अगलाक्लिक करें ।
    नोट: अनुमानित xy व्यास वस्तुओं के एक्स-वाई आयाम में औसत व्यास ट्रैक किया जा करने के लिए है ।
  6. गुणवत्तापर क्लिक करें. एक थ्रेशोल्ड सेट करें, जिसमें अधिकांश कक्ष (ऑब्जेक्ट्स) शामिल होने चाहिए. अगलाक्लिक करें ।
  7. वांछित एल्गोरिथ्म चुनें (Autoregressive गति की सिफारिश की है) । अधिकतम दूरी दर्ज करें (20 µm की सिफारिश की है) और अधिकतम अंतराल आकार (3 या 2 की सिफारिश की है). संपूर्ण छवि अंतत: संसाधितकरेंक्लिक करें ।
    नोट: अधिकतम दूरी और अधिकतम अंतर आकार पटरियों को तोड़ने के लिए दो थ्रेसहोल्ड हैं. अधिक विशेष रूप से, दो निरंतर फ़्रेम में जब एक ही ऑब्जेक्ट के बीच की दूरी अधिकतम दूरी से अधिक है, बाद के फ़्रेम में इस ऑब्जेक्ट को एक नए ऑब्जेक्ट के रूप में माना जाएगा । कई बार अधिग्रहण के दौरान, एक ही वस्तु कुछ फ्रेम के लिए गायब हो सकता है और फिर से दिखा । इस स्थिति में, केवल जब इस ऑब्जेक्ट को अधिकतम अंतराल आकार के भीतर फिर से प्रकट होता है, यह एक ही ऑब्जेक्ट के रूप में माना जाएगा ।
  8. फ़िल्टर प्रकार पर क्लिक करें और अवांछित ट्रैक को बहिष्कृत करने का विकल्प चुनें.
    नोट: यह चरण वैकल्पिक है ।
  9. अगलाक्लिक करें, और उसके बाद समाप्तकरेंक्लिक करें ।
    नोट: इस चरण में कंप्यूटिंग प्रदर्शन के आधार पर दिनों दिन तक का समय लग सकता है ।
  10. ट्रैक संपादित करेंक्लिक करें और सही बहावचुनें । उपयुक्त एल्गोरिथ्म का चयन करें (अनुवाद बहाव की सिफारिश की है) । इच्छित परिणाम Dataset आकार (वर्तमान आकार के बराबर नए आकार अनुशंसित है) का चयन करें । ठीकक्लिक करें ।
    नोट: यह कदम केवल जब कोलेजन छवि अधिग्रहण के दौरान बहती की आवश्यकता है ।
  11. आँकड़े पर क्लिक करें और दृश्यमान आँकड़े मानों की सूची कॉन्फ़िगरकरें चुनें. निर्यात करने के लिए ब्याज के विकल्प की जाँच करें (जैसे निर्देशांक, गति और इतने पर). ठीकक्लिक करें ।
  12. फ़ाइल के लिए सभी आँकड़े निर्यात करें पर क्लिक करके फ़ाइल का नाम डालें.

5. निर्धारण और इम्यूनोफ्लोरेसेंस कोलेजन मैट्रिक्स में कोशिकाओं के दाग

  1. 4% paraformaldehyde (पीएफए, पंजाबियों में) के १,००० µ एल स्थानांतरण एक रासायनिक हुड के तहत एक 5 मिलीलीटर ट्यूब में ।
    नोट: पीएफए कमरे के तापमान को संतुलित किया जाना चाहिए ।
  2. २.९ से बहुलक कोलेजन के साथ केशिका डुबकी । पीएफए समाधान में (के लिए ~ 5 मिमी) और मॉडलिंग क्ले के साथ 5 एमएल ट्यूब के भीतरी दीवार पर केशिका माउंट (के रूप में चित्र 1Cमें दिखाया गया है) ।
  3. प्रेस गोताख़ोर धीरे जब तक कोलेजन रॉड का आधा पीएफए समाधान (1 डी आंकड़ा) में लटक रहा है । 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब रखें ।
  4. वापस खींच गोताख़ोर केशिका के अंदर कोलेजन रॉड मिलता है । बाहर केशिका ले लो और पीएफए त्यागें ।
  5. एक ताजा ट्यूब में केशिका माउंट और पंजाब के 1 मिलीलीटर जोड़ें । यह सुनिश्चित कर लें कि पंजाबियों में केशिकाएं डूब गई हैं ।
  6. प्रेस गोताख़ोर धीरे जब तक कोलेजन रॉड का आधा समाधान में लटक रहा है । क्ले मॉडलिंग के साथ भीतरी दीवार पर केशिका माउंट ।
  7. 5 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब रखें ।
  8. दोहराएं ५.४ । -५.७ एक और 2 बार के लिए ।
  9. वापस खींच गोताख़ोर केशिका के अंदर कोलेजन रॉड मिलता है । पंजाबियों को छोड़ें । अवरुद्ध/permeabilization बफर के 1-2 मिलीलीटर (पंजाबियों + 1-% BSA + ०.१% गैर ईओण surfactant) ट्यूब और दोहराने ५.६ में स्थानांतरण ।
    नोट: BSA (1%) पशु की 5% सीरम द्वारा प्रतिस्थापित किया जा सकता माध्यमिक एबी में उठाया गया था ।
  10. 30-60 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब रखें ।
  11. वापस खींच गोताख़ोर केशिका के अंदर कोलेजन रॉड मिलता है । permeabilization बफ़र छोड़ें । हस्तांतरण २००-५०० µ एल में प्राथमिक एंटीबॉडी के अवरुद्ध/permeabilization बफर और समाधान में रॉड निष्कासित कर ।
  12. 1 ज के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब रखें ।
  13. PBST (पंजाब + ०.१-% गैर ईओण surfactant) के रूप में ५.४ में वर्णित के साथ कोलेजन रॉड 3 बार धो लो । -५.८.
  14. कमरे के तापमान पर 1 घंटे के लिए अवरुद्ध/permeabilization बफर में माध्यमिक एंटीबॉडी में रॉड मशीन । इसे हल् के से रखें ।
  15. ५.४ में वर्णित के रूप में पंजाबियों के साथ कोलेजन रॉड 3 बार धो लो । -५.८.
  16. वापस खींच गोताख़ोर केशिका के अंदर कोलेजन रॉड मिलता है । पंजाब में नमूनों को इमेजिंग तक रखें ।
  17. 3 में वर्णित के रूप में नमूनों को स्कैन करें ।

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Representative Results

टी सेल प्रवास के दौरान घुसपैठ गठन एक अत्यधिक गतिशील प्रक्रिया है, जो actin निर्भर है । प्राथमिक मानव CTL के गठन की दखलंदाजी कल्पना करने के लिए, हम क्षणिक transfected एक mEGFP जुड़े प्रोटीन के लिए cytoskeleton में actin CTL लेबल के रूप में11से पहले वर्णित है । एक दिन अभिकर्मक के बाद, कोशिकाओं कोलेजन मैट्रिक्स में एंबेडेड थे । छवि ढेर हर ४० एस ३७ डिग्री सेल्सियस पर 1 µm के एक कदम आकार के साथ प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर अधिग्रहीत किया गया । के रूप में चित्रा 2a और अनुपूरक फिल्म 1में दिखाया गया है, प्रवास के दौरान, मानव CTL फार्म नींबू के आकार का प्रमुख दखलंदाजी, ठीक धुरी की तरह संरचनाओं द्वारा किनारे । प्रयोग में यहां दिखाया गया है, न केवल एक ही सेल imaged था, लेकिन एक बड़ी मात्रा (४५० x ४५० x ५३८ µm3) (चित्रा 2 बी) । इस प्रकार, ऑप्टिकल गुणवत्ता और संकल्प यहां दिखाया एक कम आवर्धन उद्देश्य के साथ प्राप्त किया गया (20X/१.० इसलिए, संकल्प आगे उच्च ना उद्देश्यों के साथ सुधार किया जा सकता है ।

आरेख 2 और चलचित्र 1में दिखाए गए प्रयोग में, CTLs प्रोटोकॉल भाग 4 में बताए गए अनुसार स्वचालित रूप से ट्रैक किए गए थे । CTL के पथ चित्रा बीमें चित्रित कर रहे हैं । प्रवासन के दो मापदंडों का विश्लेषण किया गया: वेग और हठ. हठ कुल ट्रैक की लंबाई से विभाजित विस्थापन के रूप में परिभाषित किया गया है । विश्लेषण से पता चलता है कि CTL की गतिशीलता 3 डी में बहुत ही विविध है: 0.01-0.19 µm से वेग रेंज लगभग 20 गुना अंतर के साथ, और हठ पर्वतमाला से 0-०.७ (चित्रा 2c) । यह चूहों में बताया गया था कि vivo मध्य माइग्रेशन औसत वेग में टी कोशिकाओं 4 µm/ हाल ही में, हम CTL के औसत वेग निर्धारित किया है 4-5 µm/ंयूनतम11 इस पत्र में वर्णित विधियों का उपयोग कर । इन परिणामों का प्रदर्शन है कि प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी एक शक्तिशाली करने के लिए सेल व्यवहार कल्पना उपकरण है, उदाहरण के लिए, सेल माइग्रेशन और सेल सेल संपर्क । vivo में, कई कारकों और एक गैर सजातीय ECM में घुलनशील कारकों है कि माइग्रेशन को प्रभावित कर सकते हैं सहित जटिल संरचना टी सेल व्यवहार को संशोधित करेगा ।

एक कोलेजन मैट्रिक्स के आवेदन जीवित कोशिकाओं तक ही सीमित नहीं है । निर्धारण और immunostaining भी मैट्रिक्स में किया जा सकता है । चित्रा 3 3 डी कोलेजन जेल, जिसमें अंतर्जात perforin1 (PFN1) और actin दाग थे में तय नमूनों का एक उदाहरण से पता चलता है । नमूना या तो एक ही पक्ष (एक तरफ रोशनी) से या दोनों पक्षों (दोहरी ओर रोशनी) से रोशन किया गया था । हम अलग z पदों पर है कि कोशिकाओं का पालन समान रूप से दाग रहे हैं, का संकेत है कि हमारे प्रोटोकॉल में वर्णित प्रक्रियाओं कोलेजन जैल में एंटीबॉडी के संतोषजनक प्रवेश को प्राप्त करने । इससे भी महत्वपूर्ण बात, निर्धारण के बाद CTL लाइव सेल इमेजिंग के रूप में एक ही आकृति विज्ञान प्रदर्शित ( चित्रा 3 और चित्रा 2 बीकी तुलना), यह दर्शाता है कि आकृति विज्ञान अच्छी तरह से इस प्रोटोकॉल द्वारा बनाए रखा है । इसके अलावा, एक पक्ष से या दोनों पक्षों से रोशनी फोकल विमान में छवियों की गुणवत्ता में एक महत्वपूर्ण अंतर नहीं है । कि कम क्षेत्र को ध्यान में रखते हुए एक तरफ रोशनी की विधा के साथ लेजर को उजागर दोहरी पक्ष रोशनी की तुलना में है, एक तरफ रोशनी अधिक की सिफारिश की है ।

Figure 1
चित्रा 1: नमूना तैयारी के दौरान केशिकाओं से निपटने का चित्रण. (क) गोताख़ोर को केशिकाओं में डाल दें और गोताख़ोर को कल्चरल मीडियम से गीला कैसे करें. (ख) केशिका में कोशिका/कोलेजन मिश्रण खींचो । (C) माउंट केशिकाओं मॉडलिंग क्ले का उपयोग । गोताख़ोर और कोलेजन रॉड भूरे और लाल बक्से में चित्रित कर रहे हैं, क्रमशः । (घ) संस्कृति माध्यम के साथ या immunostaining के लिए equilibration के लिए कोलेजन रॉड संभाल । गोताख़ोर और कोलेजन रॉड भूरे और लाल बक्से में चित्रित कर रहे हैं, क्रमशः । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2:3 डी कोलेजन और visualizing actin गतिशीलता में प्राथमिक मानव CTL ट्रैकिंग । (क) प्राथमिक मानव CTL में actin की अधिकतम तीव्रता का प्रक्षेपण. Actin पहले11वर्णित के रूप में CTL में लेबल किया गया था । दिन एक पोस्ट अभिकर्मक कोशिकाओं ०.५% कोलेजन मैट्रिक्स में एंबेडेड थे । एक प्रतिनिधि कक्ष दिखाया गया है । स्केल पट्टियां 5 µm हैं । ठीक actin संरचनाओं की दखलंदाजी एज पर arrowhead द्वारा प्रकाश डाला जाता है । (ख) 6 ज के लिए CTL का पथ । पथ स्वचालित रूप से सॉफ्टवेयर द्वारा ट्रैक कर रहे है (रंग कोड: नीला = प्रारंभ, लाल ट्रैक के अंत =, ४५० × ४५० × ५३८ µm3 मात्रा) । स्केल बार ५० µm है । (ग) वेग और हठ की ठहराव. एक डॉट एक कक्ष का प्रतिनिधित्व करता है । परिणाम 4 दाताओं से मतलब ± SEM के रूप में दिखाया जाता है । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: अंतर्जात profilin1 की Immunostaining (PFN1) और actin+ टी 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में एंबेडेड कोशिकाओं के लिए । प्राथमिक मानव सीडी 8+ टी कोशिकाओं ०.२५% कोलेजन में एंबेडेड थे । पीएफए निर्धारण के बाद नमूना विरोधी PFN1 (नारंगी) और phalloidin (बैंगनी) का उपयोग दाग था और एक कदम पर प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized 1 µm की कुल मात्रा के लिए ४४० x ४४० x १,००० µm3। नमूना या तो एक ही पक्ष (एक तरफ रोशनी) से या दोनों पक्षों (दोहरी ओर रोशनी) से रोशन किया गया था । 3 डी पुनर्निर्माण से अधिकतम तीव्रता अनुमानों (MIP) दिखाया जाता है । पैमाने सलाखों के ५० µm हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Movie 1
फिल्म 1: टी सेल प्रवास के दौरान दखलंदाजी की पीढ़ी । चलचित्र में दिखाया गया कक्ष चित्र 2aमें दिखाए गए वॉल्यूम से लिया गया था । कोशिकाओं को एक कोलेजन मैट्रिक्स में एंबेडेड (०.५%) थे । छवियों को अधिग्रहीत किया गया था हर ४० एस के लिए 6 ज पर ३७ ° c लाइट शीट माइक्रोस्कोपी का उपयोग. कृपया इस वीडियो को देखने के लिए यहां क्लिक करें । (डाउनलोड करने के लिए राइट-क्लिक करें.)

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Discussion

इन विट्रो में अधिकांश परख एक 2d सतह पर किए जाते हैं, उदाहरण के लिए सेल में संस्कृति प्लेटें, पेट्री-व्यंजन या coverslips पर, जबकि vivo कोशिकाओं में , विशेष रूप से प्रतिरक्षा कोशिकाओं, अनुभव ज्यादातर एक 3d microenvironment. उभरते सबूत से पता चलता है कि प्रतिरक्षा कोशिकाओं के प्रवास पैटर्न 2d और 3 डी परिदृश्यों17के बीच अलग है । इसके अलावा, ट्यूमर कोशिकाओं की अभिव्यक्ति प्रोफाइल 2d में भी अलग हैं-और 3 डी-संस्कृति वाले ऊतकों18,19,20. इसलिए, सबसे अच्छा इन विट्रो मेंशारीरिक शर्तों अनुकरण करने के लिए, यह एक 3 डी संदर्भ में प्रयोगों प्रदर्शन करने के लिए एक महान लाभ की है, उदाहरण के लिए 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में. नव विकसित दृष्टिकोण, विशेष रूप से, प्रकाश चादर प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, नियंत्रित पर्यावरण की स्थिति के तहत 3 डी मैट्रिक्स प्रणालियों में विश्वसनीय और reproducible प्रयोगों में सक्षम बनाता है ।

एक पारंपरिक लेजर के विपरीत, फोकल माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग जो पूरी जांच को रोशन, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के साथ, केवल लेजर प्रकाश की एक पतली चादर नमूनों को रोशन करने के लिए उत्पंन होता है । पता लगाने कैमरा रोशन विमान के लिए सीधा है । इस तकनीक के कारण, केवल फोकल विमान में अनुभाग लेजर के संपर्क में है । इसलिए फोटो-ब्लीचिंग और phototoxicity को छोटा किया जा सकता है । इसके अलावा, बिंदु की तुलना में माइक्रोस्कोपी स्कैनिंग, अधिग्रहण दर काफी प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के साथ बढ़ाया है (१००-१,०००-तेजी से गुना) और संकेत करने वाली शोर अनुपात भी उन्नति है. प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी सेटअप के इस पत्र में प्रयुक्त की मशीन चैंबर के साथ संयुक्त इस माइक्रोस्कोप के तहत समय की विस्तारित अवधि (कई दिनों) के साथ बड़ी 3 डी मात्रा के साथ बड़े 3d संस्करणों के छवि अधिग्रहण के लिए एक शक्तिशाली विकल्प है मशीन की स्थिति ।

3d कोलेजन मैट्रिक्स के साथ नमूना तैयारी के लिए, सबसे महत्वपूर्ण बिंदु हवा के बुलबुले से बचने के लिए है । इसकी उच्च चिपचिपापन को देखते हुए जब हवा बुलबुले कोलेजन समाधान यह बहुत समाधान से इसे दूर करने के लिए मुश्किल है करने के लिए शुरू कर रहे हैं । हवा बुलबुले की उपस्थिति कोलेजन मैट्रिक्स के बहुलकीकरण के विविधता प्रेरित कर सकते हैं; इसके अलावा, यह प्रकाश का रास्ता है, जो छवियों की गुणवत्ता कम होगा ब्लॉक कर सकते हैं । इसलिए, जब हस्तांतरण या मिश्रण कोलेजन समाधान एक बहुत धीरे पिपेट और पिपेट टिप में पिछले ड्रॉप निष्कासित नहीं करना चाहिए । इसके अलावा, कोलेजन को धीरे से कमरे के तापमान पर polymerize शुरू होता है । इस प्रकार, हल अच्छी तरह से मिश्रण से पहले बहुलकीकरण को रोकने के लिए, कोलेजन युक्त ट्यूबों हमेशा बर्फ पर रखा जाना चाहिए ।

एक बड़ी चुनौती हम प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी रोजगार में मुठभेड़ डेटा हैंडलिंग है । लाइट शीट माइक्रोस्कोपी द्वारा उत्पन्न डेटा आसानी से ५०० गीगाबाइट या भी कई टेराबाइट्स के आकार तक पहुँच सकते हैं, विशेष रूप से दीर्घकालिक प्रयोगों के लिए. इन आंकड़ों का विश्लेषण करने के लिए कई दिन लगते हैं, तो कभी एक सप्ताह तक एक काम से उच्च गणना क्षमता के साथ स्टेशन । विश्लेषण छवियों के आकार के बाद से मूल डेटा भंडारण की क्षमता से छोटा नहीं है जल्दी से प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के आवेदन के लिए एक सीमित कारक बन सकते हैं । इसलिए, प्रयोग पर नज़र रखने के लिए या यदि जटिल छवि विश्लेषण की जरूरत है यह अत्यधिक प्रयोग प्रति फ़ाइल आकार को सीमित करने के लिए अनुशंसित है मूल्यों है कि एक उचित समय सीमा में उपलब्ध प्रसंस्करण इकाइयों द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है ।

प्रकाश शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी यहां शुरू में कुछ विशेषताएं हैं, जो परिणाम को प्रभावित अगर ध्यान से नहीं संभाला हो सकता है । केशिकाओं का उपयोग नमूनों की बाधा मुक्त रोशनी के लिए विशेष रूप से लाभप्रद है । चूंकि कोलेजन रॉड माध्यम में लटक रहा है, यह हो सकता है कि कोलेजन रॉड छवि अधिग्रहण के दौरान बहती है, विशेष रूप से दीर्घकालिक माप के लिए । इस बहाव के लिए परिणाम की अशुद्ध व्याख्या से बचने के लिए ठीक हो गया है । बेशक, वहां अंय प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी बाजार पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, जो केशिकाओं नमूनों माउंट करने की आवश्यकता नहीं है सेटअप कर रहे हैं । इसके अलावा, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के साथ, तथ्य यह है कि परंपरागत फोकल माइक्रोस्कोपी phototoxicity स्कैनिंग लाइन की तुलना में काफी कम कर दिया गया है, phototoxicity अभी भी लंबी अवधि के लिए एक चिंता का विषय है21इमेजिंग ।

प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी के अलावा, वहां अंय 3 डी प्रतिदीप्ति इमेजिंग, जो बीच में ज्यादातर लागू फोकल माइक्रोस्कोपी, व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी हैं, और multiphoton माइक्रोस्कोपी के लिए स्थापित दृष्टिकोण हैं । प्रवेश गहराई के संदर्भ में, फोकल और व्यापक क्षेत्र प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी इसी तरह की श्रेणी में झूठ, सामान्य रूप से १०० एनएम22तक सीमित है । बहु फोटॉन माइक्रोस्कोपी के लिए उपयोग अब तरंग दैर्ध्य प्रकाश के कारण, अपनी पैठ गहराई ०.५-1 मिमी23की सीमा को बढ़ाया जा सकता है । इसकी तुलना में, बहु आयामी छवियों के आकार प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी के ऑप्टिकल अनुभाग द्वारा उत्पंन कई मिलीमीटर24तक हो सकता है । पार्श्व संकल्प के संदर्भ में, एक सुंदर ढंग से प्रदर्शन किया प्रयोग से पता चलता है कि प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी एक बेहतर तीन आयामी बड़े नमूनों में फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी की तुलना में स्थानिक संकल्प प्रदान करता है25. हाल ही में, प्रकाश शीट माइक्रोस्कोपी दो-फोटॉन तकनीक है, जो आगे प्रवेश गहराई सामांय एक फोटॉन प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी की तुलना में सुधार के साथ संयुक्त किया गया है और दस गुना तेजी से बिंदु स्कैनिंग दो फोटॉन माइक्रोस्कोपी26।

3 डी मैट्रिक्स है कि सूक्ष्म कोशिकाओं के लिए वास्तुकला प्रदान करता है पर विचार, गोजातीय कोलेजन के अलावा मैं इस अखबार में इस्तेमाल किया, वहां कई अंय विकल्प हैं, जैसे अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स (ECM) माउस सार्कोमा कोशिकाओं से व्युत्पंन, agarose, सिंथेटिक hydrogels या अंय संगत बहुलक सामग्री । माउस सार्कोमा ECM कोलेजन चतुर्थ, laminin के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कई विकास कारकों सहित एक प्रोटीन मिश्रण है । सिंथेटिक सामग्री की तुलना करें, जैविक ECMs (कोलेजन और माउस सार्कोमा ECM), एक हाथ पर, एक अधिक शारीरिक प्रासंगिक संदर्भ मौजूद; लेकिन दूसरी ओर, गुणवत्ता और संरचना जैविक ECMs बैचों और कंपनियों के बीच भिंन हो सकते हैं । इसके विपरीत सिंथेटिक सामग्रियों की reproducibility की अधिक गारंटी होती है । उल्लेखनीय, जैव रासायनिक और यांत्रिक गुणों की ठीक ट्यूनिंग, साथ ही वांछित संशोधनों, सिंथेटिक सामग्री के लिए अनुमति दी है, लेकिन जैविक ECMs के लिए नहीं10,27.

सारांश में, इस पत्र में हम एक प्रोटोकॉल वर्णित सेल जीव विज्ञान के लिए 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स का निर्माण प्रकाश का उपयोग कर शीट प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, और कैसे 3 डी कोलेजन मैट्रिक्स में एंबेड प्राथमिक मानव CTL को कल्पना और CTL प्रवास का विश्लेषण । हम नमूना तैयारी, छवि अधिग्रहण, और विश्लेषण में प्रमुख बिंदुओं पर प्रकाश डाला । हमारे परिणाम बताते है कि अत्यधिक गतिशील घुसपैठ और ठीक actin संरचनाओं के गठन एक अच्छा spatiotemporal संकल्प के साथ प्रकाश चादर माइक्रोस्कोपी द्वारा visualized किया जा सकता है । इसके अलावा, विश्लेषण प्रोटोकॉल यहां वर्णित हमें मज़बूती से एक उद्देश्य और स्वचालित तरीके से ट्रैक कोशिकाओं को सक्षम बनाता है । यह विधि चूहों और मनुष्यों के रूप में मानव प्रतिरक्षा अनुसंधान के लिए विशेष रूप से लाभप्रद होगा कई प्रतिरक्षा कार्यों में काफी अलग है और28चिकित्सा के लिए जेट ।

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Disclosures

लेखक कोई वित्तीय या वाणिज्यिक हितों के संघर्ष की घोषणा ।

Acknowledgments

हम क्लिनिकल Hemostaseology और दाता रक्त प्रदान करने के लिए चढ़ाए दवा के लिए संस्थान को धन्यवाद; कारमेन Hässig और उत्कृष्ट तकनीकी मदद के लिए को्् Hoxha । हम Rettig (Saarland विश्वविद्यालय) के संशोधित pMAX वेक्टर, रोलाण्ड Wedlich-Söldner (Muenster विश्वविद्यालय) के लिए मूल LifeAct-रूबी के निर्माण के लिए धंयवाद, और क्रिश्चियन कबाड़र (Saarland विश्वविद्यालय) LifeAct-mEGFP निर्माण पैदा करने के लिए । इस परियोजना को Sonderforschungsbereich १०२७ (परियोजना A2 से B.Q.) और ८९४ (परियोजना A1 से M.H.) द्वारा वित्तपोषित किया गया था. प्रकाश चादर माइक्रोस्कोप DFG द्वारा वित्त पोषित किया गया था (GZ: 256/4 19-1 FUGG) ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibricol, bovine collagen solution Advanced Biomatrix  #5133-20ML Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution Merck 1091381000 for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose Affymetrix 32821-10GM Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit Thermo Fisher 11348D Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation Thermo Fisher 11132D Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2 Thermo Fisher PHC0023 Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit Lonza V4XP-30XX Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG Abcam ab124904 IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin Thermo Fisher A22284 IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain Thermo Fisher C10045 Fluorescent cell label
Tween 20 Sigma P1379-250mL IF
Triton X-100 Eurobio 018774 IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline Thermo Fisher 14190250 IF
Bovine serum albumin Sigma A9418-100G IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit Thermo Fisher A-11011 IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) Zeiss N.A.
Cell culture hood Thermo Fisher HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i  Thermo Fisher N.A.
Centrifuge 5418 and 5452 Eppendorf N.A.
Pippettes Eppendorf 3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips VWR 89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tubes Sarstedt  62.554.002
Capillaries 50 µL VWR (Brand) 613-3373 Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries VWR (Brand) BRND701934 "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips Merck 1095430001 to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes BD Z230723 ALDRICH Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) Play-Doh N.A.
Imaris file converter Bitplane available at http://www.bitplane.com  Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) Bitplane available at http://www.bitplane.com  Analysis of 3D and 4D imaging data

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References

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Schoppmeyer, R., Zhao, R., Hoth, M., … More

Schoppmeyer, R., Zhao, R., Hoth, M., Qu, B. Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells. J. Vis. Exp. (136), e57651, doi:10.3791/57651 (2018).

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