Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Lys arks mikroskopi for tredimensjonale visualisering av menneskelig immunceller

Published: June 13, 2018 doi: 10.3791/57651
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Biophysics, Center for Integrative Physiology and Molecular Medicine (CIPMM), School of Medicine, Saarland University

Summary

Her presenterer vi en protokoll for å visualisere immunceller i en tredimensjonal (3D) kollagen matrise med lys arks mikroskopi. Denne protokollen også utdyper hvordan spore celle migrasjon i 3D. Denne protokollen kan benyttes for andre typer suspensjon celler i 3D matrix.

Abstract

I vivo, aktivisering, spredning og funksjon av immunceller alle oppstå i et tredimensjonalt (3D)-miljø, for eksempel i lymfeknuter eller vev. Oppdatert avhengige de fleste i vitro systemer av todimensjonal (2D) overflater, for eksempel cellekultur plater eller coverslips. Optimalt etterligne fysiologiske forhold i vitrobruker vi en enkel 3D kollagen matrise. Kollagen er en av hovedkomponentene i ekstracellulær matrix (ECM) og har vært mye brukt å utgjøre 3D matriser. For 3D-bildebehandling, er nylig utviklet lys arks mikroskopi teknologien (også referert til som enkelt flyet belysning mikroskopi) kjennetegnet med høy oppkjøpet hastighet, store gjennomtrenging dyp, lav bleking og photocytotoxicity. Videre er lys-arks mikroskopi særlig fordelaktig for langsiktige mål. Her beskriver vi en optimalisert protokoll hvor sette og håndtere menneskelige immunceller, f.eks primære menneskelige cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) og naturlig killer (NK) celler i 3D kollagen matrisen for bruk med lys arks mikroskopi for levende celle bildebehandling og fast prøver. Fremgangsmåten for bildeopptak og analyse av celle migrasjon presenteres. Et særlig fokus er gitt til markere avgjørende skritt og for eksempel forberedelse og dataanalyse. Denne kan benyttes for andre typer suspensjon celler i en 3D kollagen matrise og er ikke begrenset til immunceller.

Introduction

De fleste kunnskap om overføring cellene kommer fra 2D eksperimenter1,2,3, som normalt gjennomføres i et glass eller plast overflaten av kultur tenkelig parabolen. Imidlertid krever fysiologiske scenario i de fleste tilfeller en 3D microenvironment, der den ekstracellulære matrisen (EFM) spiller en avgjørende rolle. ECM ikke bare gir den 3D struktur avgjørende for å opprettholde riktig celle morfologi, men tilbyr også overlevelse signaler eller retningsbestemt signaler for en optimal funksjon av mange celler4,5 . Et 3D-miljø er derfor nødvendig å forbedre cellulære funksjoner og atferd i et miljø som er reflektere bedre fysiologisk sammenheng.

I menneskekroppen utøve de fleste celler spesielt immunceller, sine funksjoner under et 3D scenario. For eksempel aktivert T celler patruljere vev etter målcellene, naiv T celler vandrer gjennom lymfeknuter i Søk etter sine beslektet antigen-presentasjon celler der overføring modus og maskiner er tilpasset de tilsvarende ekstracellulære miljø3,6,7. 3D kollagen gel har vært mye brukt som en veletablert og godt karakterisert 3D celle kultur-systemet8,9,10. Våre tidligere arbeid viser at primære menneskelige lymfocytter er svært mobile og overføre med en gjennomsnittlig hastighet på rundt 4,8 µm/min i en 0.25% kollagen-baserte matrix11. Omorganisering av cytoskjelett spiller en nøkkelrolle i celle migrasjon12. Samler bevis viser at lymfocytter gjelder ikke bare et enkelt modus av migrasjon ennå kan bytte mellom visse migrasjon virkemåter avhengig av beliggenhet, microenvironment, cytokiner, chemotactic graderinger og ekstracellulære signaler som tune det vandrende atferd i ulike måter 3.

Pålitelig analysere immun celle funksjoner og atferd, for eksempel overføring, protrusion formasjon eller vesicula transport, er det stor fordel å kunne hente bilder i relativt store 3D volumer på en rask og pålitelig måte. For 3D-bildebehandling tilbyr nylig utviklet lys arks mikroskopi teknologien (også referert til som enkelt flyet belysning mikroskopi) en tilfredsstillende løsning13,14. Under bildebehandling oppkjøpet, genereres et tynt statisk lys ark for å belyse prøven. På denne måten, på fokus flyet, kan et stort område være opplyst samtidig uten at det påvirker av flyet cellene. Denne funksjonen kan en høy oppkjøpet hastighet med en drastisk redusert bleking og photocytotoxicity. I dette papir beskriver vi hvordan å visualisere primære menneskelige immunceller bruker lys arks mikroskopi og analysere overføringen i 3D scenario.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Forskning gjennomført denne undersøkelsen med menneskelige materialet (leukocytter reduksjon system chambers fra menneskeblod givere) er autorisert av den lokale etikk (erklæring fra 16.4.2015 (84/15; Prof Dr. Rettig-Stürmer)) og følger retningslinjene som er tilsvarende.

1. forberedelse men kollagen løsning (500 µL)

  1. Overføre 400 µL av kjølt kollagen lagerløsning (10.4 mg/mL) til en bakteriefri 1.5 mL tube under celle kultur panseret. Sakte legge til 50 µL av kjølt 10 x PBS (pH 7.0-7.3) til 400 µL av kjølt kollagen lagerløsning. Bland løsningen ved forsiktig flislegging røret.
    Merk: Alle trinnene i del 1 bør gjøres under celle kultur hette.
  2. Legge til 8 µL av 0.1 M NaOH til 500 µL av kollagen løsningen fra 1.1. justere pH til 7,2 – 7,6. Bruke pH strimmelen (pH utvalg: 6-10) å bestemme pH verdien av blandingen.
    Merk: Volumer kan variere for forskjellige bunker av kollagen. NaOH løsningen har til å bli blandet sakte for å unngå luftbobler. Blandingen skal holdes på is å unngå kollagen gelation.
  3. Legge til 2 µL av sterile ddH2O gjøre det siste bindet 500 µL. Bland godt og lagre kollagen løsningen (8.32 mg/mL) på is eller på 4 ° C til fremme bruk.
    Merk: Under denne tilstanden, men kollagen kan brukes for 24 h. dele anbefales ikke å unngå luftbobler.

2. prøven forberedelse til lys arks fluorescens mikroskopi bruker kapillærene

  1. Fluorescently etiketten live cellene rundt med ønsket primære fluorescerende fargestoffer15 eller fluorescerende proteiner11 som beskrevet tidligere.
  2. Overføre 1 × 106 celler i en bakteriefri 1.5 mL tube under celle kultur hette. Sentrifuge røret på 200 x g for 8 min. Forkast nedbryting og resuspend pellet i 200 µL av kultur medium.
    Merk: Cellen tetthet 5 × 106 celler/mL anbefales for visualisering av human immun celle migrasjon, spesielt for cytotoksiske T-lymfocytter (CTL) og naturlig killer (NK) celler.
  3. Legg 85.9 µL men kollagen løsning fra 1.3. i celle suspensjon fra 2.2. og bland riktig for å nå en kollagen konsentrasjon av 2,5 mg/mL. La celle/kollagen blandingen på isen i panseret.
    Merk: Anta at ønsket konsentrasjonen av kollagen er N mg/mL, volumet av nøytralisert kollagen løsning (for 200 µL celle suspensjon) = 200 × N /(8.32-N)
  4. Neste, putte samsvarende stempelet inn av kapillær (indre diameter ~ 1 mm) til stempelet er 1 mm ut av kapillær. Våt stempelet av dipping i kultur medium (figur 1A).
    Merk: Dette trinnet kan bidra til å unngå luftbobler når av kapillær er dyppet i cellen/kollagen mix. Av kapillær og stempelet har ikke å bli steril.
  5. Dyppe av kapillær i cellen/kollagen mix fra 2.3. Langsomt dra stempelet tilbake for 10-20 mm (figur 1B). Tørk ytterveggen av av kapillær med et papirhåndkle fuktet med 70% etanol spray for å fjerne gjenværende kollagen løsningen.
  6. Montere av kapillær med modell-leire på indre veggen av en 5 mL tube og presse cellen/kollagen blandingen til kanten av kapillær (figur 1 c).
  7. Hold av kapillær på 37 ° C med 5% CO2 for 1 h for kollagen polymerisasjon.
  8. Legge til kultur medium (rundt 1-2 mL) i en 5 mL tube. Trykk polymerized kollagen stangen ut til medium til rundt 3/4 av kollagen hengende i medium (figur 1 d).
  9. Hold av kapillær, som dette, på 37 ° C med 5% CO2 for en annen 30 min til equilibrate kollagen stangen med mediet.
    Merk: Etterpå kollagen stangen kan trekkes tilbake i kapillære og kultivert ytterligere før videre bruk.

3. image vinningen bruker lys arks mikroskopi

  1. Montering prøve kammeret i henhold til produsentens instruksjoner.
  2. Slå på inkubering og mikroskopet varme eksempel kammeret 37 ° c (for levende celle tenkelig bare).
  3. Plasser av kapillær i prøve chamber og finne prøven for å finne området av interesse for bildeopptak.
  4. Aktivere den tilsvarende laser(s). Angi følgende innstillinger: laser makt, eksponeringstid, trinn-størrelsen på z-stack, start- og plasseringen av z-stack og tidsintervallet for levende celle bildebehandling.
    Merk: For eksempel eksemplet i figur 2 ble avbildet hver 40 s 6 h 37 ° C trinn-størrelse på 1 µm (total tykkelse: 538 µm). Laser makt var 1% med en eksponeringstid på 30 ms. pikselstørrelse ved XY retning er 0,23 µm.
  5. Start bilde oppkjøpet.

4. automatisk sporing analyse

  1. Åpne filkonverteringsprogrammet, klikk Legg til filer for å velge tenkelig filen(e) som skal konverteres til filformatet programvare (*.ims). Klikk Bla gjennom og velge en mappe å lagre den konverterte filen. Klikk Start alle.
  2. Åpne analyseprogramvare. Klikk overgå. Gå til fil og klikk Åpne, og velg filen bildebehandling som skal analyseres.
    Merk: Hvis filstørrelsen er stor dette trinnet kan ta tid. Filer større enn 1 Terabyte (TB) er ikke anbefalt for ett enkelt eksperiment som prosessen store filene er svært beregningsorientert kapasitet krevende.
  3. Klikk Legg til nye flekker. Merk av for Prosessen hele bildet endelig. Klikk neste.
  4. Angi koordinatene x og y (i piksler) til å definere en region av interesse. Angi antall rammer (tid og z-posisjonen) til å analysere. Klikk neste.
  5. Velg målet kanalen, som inneholder objektene skal spores, i rullegardinlisten for Kildekanal. Angi beregnet xy Diameter (i µm). Klikk neste.
    Merk: Anslått xy diameter er gjennomsnittlig diameter i xy dimensjonen av objekter skal spores.
  6. Klikk kvalitet. Angi en terskel, der de fleste av cellene (objekter) skal være inkludert. Klikk neste.
  7. Velg ønsket algoritmen (Autoregressive bevegelse anbefales). Angi avstanden på maks (20 µm anbefales) og max gapet størrelsen (3 eller 2 anbefales). Klikk prosessen hele bildet til slutt.
    Merk: Maks avstand og Maks gapet størrelse er to terskler bryte spor. Mer spesifikt, i to sammenhengende rammens vil når avstanden mellom samme objekt overskrider Maks avstand, dette objektet i senere rammen bli vurdert som et nytt objekt. Noen ganger under oppkjøpet, kan samme objekt forsvinne i noen få frames og dukke opp igjen. I dette tilfellet bare når objektet vises i Max gapet størrelsen, vil det bli vurdert som samme objekt.
  8. Klikk Filtertypen og velger å utelate uønskede spor.
    Merk: Dette trinnet er valgfritt.
  9. Klikk neste og deretter Fullfør.
    Merk: Dette trinnet kan ta timer til dager avhengig av databehandlingsopplevelse.
  10. Klikk Rediger spor og velg Riktig Drift. Velg den aktuelle algoritmen (Translasjonsforskning Drift anbefales). Velg ønsket Resultat Dataset størrelse (Ny størrelse lik gjeldende størrelse anbefales). Klikk på OK.
    Merk: Dette trinnet er kun nødvendig når kollagen drev under bildeopptak.
  11. Klikk statistikk og velg Konfigurer listen av synlig statistikk verdier. Kontroller alternativene av interesse å bli eksportert (f.eks koordinater, fart og så videre). Klikk på OK.
  12. Klikk Eksportere All statistikk til fil , og angi filnavnet.

5. fiksering og Immunofluorescence flekker av celler i kollagen matriser

  1. Overføre 1000 µL av 4% paraformaldehyde (PFA, i PBS) til en 5 mL tube under kjemiske hette.
    Merk: PFA skal være balansert til romtemperatur.
  2. Dypp av kapillær med polymerized kollagen fra 2,9. PFA løsning (for ~ 5 mm) og montere kapillær på den indre veggen av 5 mL tube med modell-leire (som vist i figur 1 c).
  3. Trykke stempelet forsiktig til halvparten av kollagen stangen henger i PFA løsningen (figur 1 d). Holde røret ved romtemperatur for 20 min.
  4. Skyv stempelet for å få kollagen stangen inne av kapillær. Ta ut av kapillær og kast PFA.
  5. Montere av kapillær i en fersk rør og tilsett 1 mL av PBS. Kontroller at av kapillær ligger i PBS.
  6. Trykke stempelet forsiktig til halvparten av kollagen stangen henger i løsningen. Montere av kapillær på indre veggen med modell-leire.
  7. Holde røret ved romtemperatur for 5 min.
  8. Gjenta 5.4. -5.7 for en annen 2 ganger.
  9. Skyv stempelet for å få kollagen stangen inne av kapillær. Kast PBS. Gjenta 5.6 overføre 1-2 mL blokkerer/permeabilization buffer (PBS + 1-% BSA + 0,1% ikke-ioniske surfactant) inn i røret.
    Merk: BSA (1%) kan bli erstattet med 5% serum av dyret sekundære Ab vokste opp i.
  10. Holde røret ved romtemperatur for 30-60 minutter.
  11. Skyv stempelet for å få kollagen stangen inne av kapillær. Kast permeabilization bufferen. Overføre 200-500 µL av primære antistoffer blokkere/permeabilization buffer og utvisning stangen i løsningen.
  12. Holde røret ved romtemperatur 1t.
  13. Vask kollagen stangen 3 ganger med PBST (PBS + 0,1-% ikke-ioniske surfactant) som beskrevet i 5.4. -5.8.
  14. Inkuber stangen på sekundære antistoffer blokkere/permeabilization buffer 1t ved romtemperatur. Holde det mot lyset.
  15. Vask kollagen stangen 3 ganger med PBS som beskrevet i 5.4. -5.8.
  16. Skyv stempelet for å få kollagen stangen inne av kapillær. Holde prøvene i PBS til bildebehandling.
  17. Skanne prøvene som beskrevet i 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protrusion formasjon under T celle migrasjon er en svært dynamisk prosess, som er begrepsordbok avhengige. For å visualisere protrusion dannelsen av primære menneskelige CTL, transfected vi transiently en mEGFP smeltet protein Hvis etiketten begrepsordbok cytoskeleton i CTLEN som beskrevet før11. En dag etter transfection, var cellene innebygd i kollagen matrisen. Bildestakker anskaffet hver 40 s trinn-størrelse på 1 µm ved 37 ° C med lys arks mikroskopi. Som vist i figur 2A og supplerende film 1, under migrering menneskelig CTL form sitron-formet store utstikkende deler, fringed av fine spindel-lignende strukturer. I eksperimentet vist her, ikke bare en enkelt celle ble avbildet, men et stort volum (450 x 450 x 538 µm3) (figur 2B). Dermed optisk kvalitet og oppløsning vises her ble oppnådd med et lavt forstørrelse mål (20 X / 1.0 DIC VIS IR). Derfor kan oppløsningen være ytterligere forbedret med høyere NA mål.

I eksperimentet vist i figur 2 og film 1ble CTLer automatisk sporet som beskrevet i del 4-protokollen. Baner av CTLEN er avbildet i figur 2B. To parametere av migrasjon ble analysert: hastighet og utholdenhet. Utholdenhet er definert som forskyvning delt på totalt antall Sporlengden. Analysen viser at mobiliteten til CTLEN er svært forskjellige i 3D: hastigheter varierer fra 0.01-0,19 µm/s med en nesten 20-fold forskjell og utholdenhet varierer fra 0 - 0,7 (figur 2C). Det ble rapportert i mus som i vivo interstitiell migrasjon gjennomsnittlig hastighet av T-celler var 4 µm/min16. Nylig har vi bestemt gjennomsnittlige hastigheten av CTL være 4-5 µm/min11 ved hjelp av metodene som er beskrevet i denne artikkelen. Disse resultatene viser at lys arks mikroskopi er et kraftig verktøy for å visualisere celle oppførsel, for eksempel celle migrasjon og celle-celle interaksjon. I vivo, mange faktorer og en ikke-homogene ECM av komplekse sammensetningen inkludert løselig faktorer som kan påvirke overføringen vil endre T celle atferd.

Anvendelsen av en kollagen matrise er ikke begrenset til live celler. Fiksering og immunostai-kan også utføres i matrisen. Figur 3 viser et eksempel på fast prøver i 3D kollagen gel, i som endogene perforin1 (PFN1) og utgangen var farget. Prøven ble opplyst fra én (enkelt side belysning) eller fra begge sider (dobbel side belysning). Vi observerer at celler forskjellige z-posisjoner er jevnt beiset, indikerer at prosedyrene som er beskrevet i våre protokollen oppnå tilfredsstillende gjennomtrengning av antistoffer i kollagen gels. Enda viktigere, etter fiksering CTL utstilt samme morfologi som i live celle imaging (sammenligne Figur 3 og figur 2B), som indikerer at også morfologi er godt vedlikeholdt av denne protokollen. I tillegg gjør belysning fra én side eller fra begge sider ikke en betydelig forskjell i kvaliteten på bilder på fokalplanet. Tatt i betraktning at mindre området er eksponert for laser med modus for enkelt side belysning sammenlignet med dobbel side belysning, er enkelt side belysning mer anbefalt.

Figure 1
Figur 1: illustrasjon håndtere capillaries under eksempel forberedelse. (A) inn stempelet av kapillær og hvordan våt stempelet med kultur medium. (B) trekk i cellen/kollagen blandingen inn av kapillær. (C) montere kapillærene bruker modellering leire. Stempelet og kollagen stangen er avbildet i grå og røde bokser, henholdsvis. (D) håndtere kollagen stang for balanse med kultur medium eller immunostai. Stempelet og kollagen stangen er avbildet i grå og røde bokser, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: sporing primære menneskelige CTL i 3D kollagen og visualisere begrepsordbok dynamics. (A) maksimum intensitet projeksjon av utgangen i primære menneskelige CTLEN. Utgangen ble merket i CTLEN som beskrevet tidligere11. Dag én post transfection celler var innebygd i 0,5% kollagen matrise. En representant celle vises. Skala barer er 5 µm. Fine begrepsordbok strukturer ved protrusion er markert ved pilspissen. (B) baner av Sertifikatklareringslisten for 6 h. Baner spores automatedly av programvaren (fargekode: blå = start, rød = slutten av sporet, 450 × 450 × 538 µm3 volum). Skala baren er 50 µm. (C) kvantifisering av hastighet og utholdenhet. Ett punkt representerer én celle. Resultatene vises som betyr ± SEM fra 4 givere. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Immunostaining av endogene profilin1 (PFN1) og utgangen i CD8+ T celler innebygd i 3D kollagen matrix. Primære menneskelige CD8+ T celler ble bygd inn i 0.25% kollagen. Etter PFA fiksering var prøven farget med anti-PFN1 (oransje) og phalloidin (lilla) og visualisert ved lys arks mikroskopi i trinn-størrelse på 1 µm for et totalt volum på 440 x 440 x 1000 µm3. Prøven ble opplyst fra én (enkelt side belysning) eller fra begge sider (dobbel side belysning). Maksimale intensitet anslag (MIP) fra 3D rekonstruksjon vises. Skala barer er 50 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Movie 1
Film 1: generasjon utstikkende deler under T celle migrasjon. Cellen i filmen ble tatt fra volumet vist i figur 2A. Cellene ble bygd inn i en kollagen matrise (0,5%). Bildene ble anskaffet hver 40 s 6 h 37 ° C med lys arks mikroskopi. Vennligst klikk her å se denne videoen. (Høyreklikk for å laste ned.)

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

De fleste i vitro analyser utføres på 2D underlag, for eksempel i cellekultur plater, Petri-retter eller på coverslips, mens i vivo celler, spesielt immunceller, oppleve mest en 3D microenvironment. Nye bevis viser at migrasjon av immunceller varierer mellom 2D og 3D scenarier17. Videre er uttrykket profiler av kreftceller også annerledes i 2D - og 3D-kulturperler vev18,19,20. Derfor å beste simulere fysiologiske forhold i vitro, er det en stor fordel å utføre eksperimenter i en 3D sammenheng, for eksempel i 3D kollagen matriser. De nyutviklede tilnærmingene, spesielt lys arks fluorescens mikroskopi, kan pålitelig og reproduserbar eksperimenter i 3D matrix systemer under kontrollerte forhold.

I motsetning til en vanlig laserskanning AC confocal mikroskopi som lyser opp hele sonden, med lys arks mikroskopi, genereres bare et tynt ark av laserlys for å lyse opp prøver. Ansiktsgjenkjenning kamera er vinkelrett på belyse flyet. På grunn av denne teknikken, er bare delen på fokalplanet utsatt for laser. Derfor kan Foto-bleking og Phototoksisitet minimeres. I tillegg sammenlignet med punkt-skanning mikroskopi, oppkjøp hastigheten er drastisk forbedret med lys arks mikroskopi (100 - 1000 ganger raskere) og signal-til-støy forholdet er også ameliorated. Kombinert med inkubering Mysteriekammeret lys arks mikroskopi installasjonen brukes i dette papiret denne mikroskopet er et kraftig alternativ for bildeopptak større 3D volumer med minimerte bleking og foto-skade over lengre perioder (flere dager) under inkubator forhold.

For eksempel forberedelser med 3D kollagen matrix er det mest kritiske punktet å unngå luftbobler. Gitt sin høy viskositet, når luftbobler introduseres kollagen løsningen er det svært vanskelig å fjerne det fra løsning. Tilstedeværelsen av luftbobler kan indusere heterogenitet av polymerisasjon av kollagen matrise; i tillegg kan det blokkere banen til lys, som ville redusere kvaliteten på bilder. Derfor når overføring eller blanding kollagen løsningen må Pipetter svært forsiktig og ikke utvise den siste dråpen i pipette spissen. Videre begynner kollagen å sakte danner ved romtemperatur. Dermed for å hindre polymerisasjon før blande løsningen godt, bør kollagen-holdig rør alltid holdes på is.

En stor utfordring som vi møter i ansette lys arks mikroskopi er håndtering. Dataene som genereres ved lys arks mikroskopi kan enkelt nå 500 GB eller aften flere terabyte, spesielt for langsiktig eksperimenter. Analysere disse dataene tar flere dager, noen ganger opptil en uke av en arbeidsstasjon med høy beregning kapasitet. Siden størrelsen på analysert bilder ikke er mindre enn de opprinnelige dataene kan kapasitet lagringsplass fort bli en begrensende faktor for anvendelse av lys-arks mikroskopi. Derfor for sporing eksperimenter eller hvis omfattende bildeanalyse kreves anbefales det å begrense filstørrelsen per forsøk til verdiene som kan håndteres i en rimelig tidsramme av tilgjengelige behandlingen enheter.

Lys arks fluorescens mikroskopi introdusert her har noen funksjoner, som kan påvirke resultatene dersom ikke håndteres forsiktig. Utnyttelsen av kapillærene er særlig fordelaktig for en uhindret belysning av prøvene. Siden kollagen stangen opp i medium, kan det hende at kollagen stangen driver under bildeopptak, spesielt for langsiktige mål. Denne drift må korrigeres for å unngå feiltolkning av resultatene. Selvfølgelig, er det andre lys arks mikroskopi oppsett kommersielt tilgjengelig på markedet, som ikke krever kapillærer å montere prøvene. Videre med lys arks mikroskopi, foruten det faktum at i forhold til konvensjonelle linjen skanning AC confocal mikroskopi Phototoksisitet er blitt betydelig redusert, fortsatt Phototoksisitet en bekymring for langsiktig tenkelig21.

Bortsett fra lyset arks mikroskopi finnes det andre tilnærminger etablert for 3D fluorescens avbilding, hvorav den mest brukte er AC confocal mikroskopi og wide-field fluorescens mikroskopi multiphoton mikroskopi. Når det gjelder gjennomtrenging dyp, AC confocal og wide-field fluorescens mikroskopi ligger i det samme området, vanligvis begrenset til 100 nm22. På grunn av lengre bølgelengde lyset benyttes for flere Foton mikroskopi, kan penetrasjon dybden styrkes utvalg av 0,5 - 1 mm23. Sammenligning kan størrelse på multi-dimensjonale bilder generert av optisk snitting av lys arks mikroskopi være opptil flere millimeter24. I laterale oppløsning viser et elegant utført eksperiment at lys arks mikroskopi gir en bedre tredimensjonale romlig oppløsning sammenlignet med AC confocal fluorescens mikroskopi i store prøver25. Nylig lys arks mikroskopi blitt kombinert med to-fotonet teknikk, som ytterligere forbedrer gjennomtrenging dyp sammenlignet med normal en Foton lys arks mikroskopi og ti ganger raskere enn punkt-skanning to-fotonet mikroskopi26.

Vurderer 3D matrix som mikro-arkitektur for celler, foruten bovin kollagen jeg brukte i dette papiret, er det mange andre alternativer, for eksempel ekstra-mobile matrix (EFM) avledet fra musen sarkomspesialitet celler, agarose, syntetisk hydrogels eller andre biokompatible polymere materialer. Musen sarkomspesialitet ECM er en protein blanding inkludert kollagen IV, laminin samt mange vekstfaktorer. I forhold til syntetiske materialer, biologiske ECMs (kollagen og mus sarkom ECM), på den ene siden, presentere en mer fysiologisk aktuelle konteksten. men på den annen side, kvaliteten og komposisjon biologiske ECMs kan variere mellom grupper og selskaper. Reproduserbarhet av syntetiske materialer er derimot mer garantert. Bemerkelsesverdig, finjustering av biokjemiske og mekaniske egenskaper, samt endringer, tillates for syntetiske materialer, men ikke for biologiske ECMs10,27.

I sammendraget, i denne artikkelen beskrev vi en protokoll for å lage 3D kollagen matrise for cellen biologi eksperimenter med lys arks fluorescens mikroskopi og hvordan du bygger inn primære menneskelige CTL i 3D kollagen matrix å visualisere og analysere CTL migrasjon. Understreket vi de viktigste punktene i utvalget forberedelse, bildeopptak og analyse. Våre resultater viser at dannelsen av svært dynamiske utstikkende deler og fine begrepsordbok strukturer kan visualiseres lys arks mikroskopi med en god spatiotemporal oppløsning. Videre kan analyse-protokoll beskrevet her vi spore pålitelig celler i en objektiv og automatisert måte. Denne metoden vil være spesielt fordelaktige for menneskelig immunologiske forskning som mus og mennesker varierer betydelig i mange immunologiske funksjoner og reaktivitet til terapi28.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklære noen økonomisk eller kommersielle interessekonflikt.

Acknowledgments

Vi takker Institutt for klinisk Hemostaseology og transfusjon medisin for å gi donor blod. Carmen Hässig og Cora Hoxha for utmerket teknisk hjelp. Vi takker Jens Rettig (Saarland University) for endret pMAX vektor, Roland Wedlich-Söldner (Universitetet i Muenster) for den opprinnelige LifeAct-Ruby konstruksjonen og Christian Junker (Saarland University) for å generere den LifeAct-mEGFP konstruksjonen. Dette prosjektet ble finansiert av Sonderforschungsbereich 1027 (prosjekt A2 til B.Q.) og 894 (prosjekt A1 til M.H.). Lys arks mikroskopet ble finansiert av DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibricol, bovine collagen solution Advanced Biomatrix  #5133-20ML Collagen matrix
0.5 M NaOH Solution Merck 1091381000 for neutralizing Fibricol solution
Ultra-Low melting agarose Affymetrix 32821-10GM Sample preparation in low c[Col]
Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit Thermo Fisher 11348D Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC
Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation Thermo Fisher 11132D Activation of CTL populations
Human recombinant interleukin-2 Thermo Fisher PHC0023 Stimulation of cultured CTL
P3 Primary solution kit Lonza V4XP-30XX Transfection
α-PFN1 antibody, rabbit, IgG Abcam ab124904 IF
Alexa Fluor 633 Phalloidin Thermo Fisher A22284 IF
CellMask Orange Plasma membrane Stain Thermo Fisher C10045 Fluorescent cell label
Tween 20 Sigma P1379-250mL IF
Triton X-100 Eurobio 018774 IF
DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline Thermo Fisher 14190250 IF
Bovine serum albumin Sigma A9418-100G IF
Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit Thermo Fisher A-11011 IF
Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) Zeiss N.A.
Cell culture hood Thermo Fisher HeraSafe KS
Cell culture incubator HERACell 150i  Thermo Fisher N.A.
Centrifuge 5418 and 5452 Eppendorf N.A.
Pippettes Eppendorf 3123000039, 3123000020, 3123000063
Pippette tips VWR 89079-444, 89079-436, 89079-452 
15 mL tubes Sarstedt  62.554.002
Capillaries 50 µL VWR (Brand) 613-3373 Zeiss LSFM sample preparation
Plunger for capillaries VWR (Brand) BRND701934 "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation
MColorPhast pH stips Merck 1095430001 to test pH of neutralized Fibricol
BD Plastipak 1mL syringes BD Z230723 ALDRICH Alternative sample preparation
Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) Play-Doh N.A.
Imaris file converter Bitplane available at http://www.bitplane.com  Convert imaging files to Imaris file format
Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) Bitplane available at http://www.bitplane.com  Analysis of 3D and 4D imaging data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
  2. Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
  3. Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
  4. Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
  5. Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
  6. Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
  7. Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
  8. Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
  9. Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
  10. Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
  11. Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
  12. Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
  13. Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
  14. Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
  15. Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
  16. Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
  17. Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
  18. Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
  19. Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
  20. Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
  21. Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
  22. Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
  23. Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
  24. Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
  25. Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
  26. Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
  27. Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
  28. Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).

Tags

Immunologi og infeksjon problemet 136 lys arks mikroskopi enkelt flyet belysning mikroskopi menneskelige immunceller naturlige drepe celler cytotoksiske T-lymfocytter celle sporing 3D-bildebehandling levende celle imaging celle fiksering i kollagen
Lys arks mikroskopi for tredimensjonale visualisering av menneskelig immunceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Schoppmeyer, R., Zhao, R., Hoth, M., … More

Schoppmeyer, R., Zhao, R., Hoth, M., Qu, B. Light-sheet Microscopy for Three-dimensional Visualization of Human Immune Cells. J. Vis. Exp. (136), e57651, doi:10.3791/57651 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter