Summary
Здесь мы представляем протокол визуализировать клетки иммунной системы, внедренные в матрицу трехмерного (3D) коллагена, с помощью микроскопии свет лист. Этот протокол также рассматриваются как отслеживать миграции клеток в 3D. Этот протокол может использоваться для других типов клеток подвеска в матрице 3D.
Abstract
В естественных условиях, активации, распространением и функции всех иммунокомпетентные клетки происходят в трехмерных (3D) среде, например в лимфатических узлах или тканей. До даты большинство систем в vitro полагаются на двухмерный (2D) поверхности, такие как культура клетки пластин или coverslips. Чтобы оптимально мимических физиологических условиях в пробиркемы используем простой 3D коллагеновой матрицы. Коллаген является одним из основных компонентов внеклеточного матрикса (ECM) и широко используется в качестве 3D матрицы. Для 3D визуализации, недавно разработанных свет лист микроскопии технологии (также называется один самолет освещения микроскопии) отличен с высокой скоростью, большие глубины, низкий отбеливания и photocytotoxicity. Кроме того свет лист микроскопии является особенно выгодным для долгосрочных измерений. Здесь мы описываем оптимизированный протокол как создать и обработать человека иммунные клетки, например первичного человека цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и природные убийца (НК) клетки в 3D коллагеновой матрицы для использования с свет лист микроскопии для живых клеток и фиксированных выборок. Процедура приобретения изображений и анализа миграции клеток представлены. Особое внимание уделяется выделить важные шаги и факторы для пробоподготовки и анализа данных. Этот протокол может использоваться для других типов клеток подвеска в 3D коллагеновой матрицы и не ограничивается иммунных клеток.
Introduction
Большинство знаний о миграции клеток происходит от 2D экспериментов1,2,3, которая обычно проводится в стеклянные или пластмассовые поверхности культуры/изображений блюдо. Однако, в большинстве случаев, физиологические сценарий требует 3D микроокружения, в котором внеклеточного матрикса (ECM) играет решающую роль. ECM не только обеспечивает эфирное 3D структуры для поддержания надлежащего клеток морфологии, но также предлагает выживания сигналов или направленного подсказки для оптимального функционирования многих клеток4,5 . Таким образом 3D окружающей среды требуется для лучшего определения клеточных функций и поведения в среде, лучше отражающие физиологических контекст.
В человеческом теле большинство клеток особенно иммунных клеток, оказывают свои функции согласно сценарию 3D. К примеру активированные Т-клетки сторожевые тканей, поиск для клеток-мишеней, наивно T-клетки мигрируют через лимфатические узлы в поисках их родственных антиген представляющих клеток, во время которых режим миграции и машины адаптированы к соответствующим внеклеточного окружающей среды3,6,7. Геля 3D коллаген широко использовался как устоявшихся и хорошо изученных 3D клеточной культуры системы8,9,10. Наши предыдущие работы показывает, что основной лимфоцитах человека мобильны и мигрируют со средней скоростью около 4,8 мкм/мин в 0,25% коллагена основе матрицы11. Перестановка цитоскелета играет ключевую роль в миграции клеток12. Накопление доказательств показывает, что лимфоциты не применяется только один режим миграции еще можно переключаться между определенное поведение миграции в зависимости от местоположения, микроокружение, цитокины, эозинофилов градиенты, и внеклеточных сигналов какой мотив мигрирующие поведение в 3различными способами.
Для надежного анализа иммунных клеток функции и поведение, например, миграция, формирования протрузии или везикулярный транспорт, это большое преимущество, чтобы иметь возможность получить изображения в относительно больших объемах 3D быстрым и надежным способом. Для 3D визуализации, недавно разработанных свет лист микроскопии технологии (также называется один самолет освещения микроскопии) предлагает удовлетворительного решения13,14. Во время визуализации приобретения, тонколистовой статический свет генерируется для освещения образца. Таким образом, на плоскости фокуса большой площади может быть освещен одновременно не затрагивая-плоскости клетки. Эта функция позволяет высокой скоростью с резко сниженным отбеливания и photocytotoxicity. В этой статье мы описываем, как визуализировать первичного человека иммунные клетки, с помощью микроскопии свет листа и как для анализа миграции в сценарии 3D.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Исследования, проведенные для этого исследования с человеческого материала (лейкоцитов сокращения системы камер от человеческой крови доноров) уполномоченным местным этике (декларация от 16.4.2015 (84/15; Профессор д -р Rettig-Stürmer)) и соответствующие руководящие принципы.
1. Подготовка нейтрализованы коллагена раствор (500 мкл)
- Передача 400 мкл охлажденные коллагена раствор (10,4 мг/мл) в стерильных 1,5 мл трубку под капотом культуры клеток. Медленно добавьте 50 мкл охлажденные 10 x PBS (рН 7,0-7.3) до 400 мкл охлажденные коллагена раствор. Mix решение, нежно черепица трубки.
Примечание: Все шаги в части 1 должно быть сделано под капотом культуры клеток. - Мкл 8 0,1 М NaOH в 500 мкл раствора коллагена от 1.1. для регулировки рН 7,2-7,6. Используйте рН тест-полоски (pH диапазон: 6-10) для определения рН смеси.
Примечание: Объемы могут отличаться для различных пакетов коллагена. Раствор NaOH должен смешиваться медленно, чтобы избежать воздушных пузырей. Смесь должны храниться на льду, чтобы избежать гелеобразования коллагена. - Добавить 2 мкл стерильных ddH2O сделать окончательный объем 500 мкл. хорошо перемешать и хранить это решение коллаген (8.32 мг/мл) на льду или на 4 ° C до дальнейшего использования.
Примечание: Согласно этому условию, нейтрализованные коллаген может использоваться для 24 h. аликвоты не рекомендуется чтобы избежать воздушных пузырей.
2. Пробоподготовка для микроскопии флуоресцирования свет листа с помощью капилляров
- Дневно обозначить живой клетки интерес с желаемой первичной флуоресцентных красителей15 или флуоресцентные белки11 как описано ранее.
- Передача 1 × 106 клеток в стерильных 1,5 мл трубку под капотом культуры клеток. Центрифуга трубки на 200 x g 8 мин удалить супернатант и Ресуспензируйте гранулы в 200 мкл питательной среды.
Примечание: Плотность клеток 5 × 106 клеток/мл рекомендуется для визуализации иммунных клеток человека миграции, особенно для цитотоксических Т-лимфоцитов (CTL) и естественных киллеров (НК). - Мкл 85.9 нейтрализованы коллагена решения от 1.3. в суспензию клеток от 2.2. и правильно смешивать достичь коллаген концентрации 2,5 мг/мл. Оставьте смесь мобильный/коллагеновые на льду в капюшоне.
Примечание: Предположим, желаемой концентрации коллагена N мг/мл, объем нейтрализованы коллагена раствор (для 200 мкл суспензии клеток) = 200 × N /(8.32-N) - Далее, поместите соответствующий поршень в капилляр (внутренний диаметр ~ 1 мм) до тех пор, пока поршень составляет 1 мм из капилляра. Влажные поршень путем погружения в питательной среды (рис. 1A).
Примечание: Этот шаг может помочь предотвратить воздушные пузыри, когда капилляра погружается в мобильный/коллагеновые микс. Капилляр и поршень не должны быть стерильными. - Окунитесь в мобильный/коллагеновые микс от 2.3 капилляра. Медленно потяните поршень обратно на 10-20 мм (рис. 1B). Протрите наружной стенки капилляра с бумажным полотенцем, смоченным 70% этанол спрей для удаления оставшихся решения коллагена.
- Маунт капилляра с глина моделирования на внутренней стенке трубки 5 мл и нажмите мобильный/коллагеновые смеси к краю капиллярные (рис. 1 c).
- Держите капилляр при 37 ° C с 5% CO2 на 1 ч для полимеризации коллагена.
- Добавьте 5 мл питательной среды (около 1-2 мл). Аккуратно нажмите полимеризованной коллаген стержень, в средне-и около 3/4 коллагена, висит в среде (рис. 1 d).
- Держите капилляра, как это, при 37 ° C с 5% CO2 для еще 30 минут, чтобы сбалансировать коллагена стержень с носителя.
Примечание: Впоследствии, коллаген стержень может быть вытащил обратно в капиллярной и культивировали до дальнейшего использования.
3. изображение приобретение с помощью микроскопии свет лист
- Ассамблея палаты образца согласно инструкции производителя.
- Включите инкубации и микроскоп для нагрева образца камеры до 37 ° C (для живых клеток изображений только).
- Капилляр в палате образец и найдите пример найти область интереса для захвата изображений.
- Активируйте соответствующий laser(s). Задайте следующие параметры: Лазерные власти, выдержка, шаг размер z стек, начальное и конечное положение z стека, и интервал времени для живых клеток.
Примечание: например, образец в рисунке 2 был воспроизведен образ каждые 40 s для 6 ч при 37 ° C с шагом размером 1 микрон (Общая толщина: 538 мкм). Мощность лазера был 1% с Выдержка 30 г-жа размер пикселя в направлении x-y 0.23 мкм. - Начало захвата изображений.
4. Автоматическое отслеживание анализ
- Откройте конвертер файлов, нажмите кнопку Добавить файлы для выбора изображений файлов преобразовываться в формат файлов программного обеспечения (*.ims). Нажмите кнопку Обзор и выберите папку для сохранения преобразованных файлов. Нажмите кнопку выполнить все.
- Откройте программное обеспечение для анализа. Нажмите кнопку, превзойти. Перейдите к файлу и нажмите кнопку Открыть, затем выберите изображения файл для анализа.
Примечание: Если большой размер файла этот шаг может занять время. Файлы размером более 1 терабайт (ТБ) не рекомендуются для одного эксперимента как процесс такие большие файлы являются весьма вычислительные мощности требованием. - Нажмите кнопку Добавить новые места. Установите флажок Процесса весь образ окончательно. Нажмите кнопку Далее.
- Введите координаты x и y (в пикселях) для определения области интереса. Введите число кадров (время и позиции z) для анализа. Нажмите кнопку Далее.
- Выберите целевой канал, который содержит объекты, которые необходимо отслеживать, в раскрывающемся списке Источник. Введите xy Ориентировочная диаметр (в мкм). Нажмите кнопку Далее.
Примечание: Диаметр оценкам xy – средний диаметр в измерении x-y объектов, которые необходимо отслеживать. - Выберите качество. Установите порог, в котором большинство клеток (объекты) должны быть включены. Нажмите кнопку Далее.
- Выберите нужный алгоритм (Авторегрессии движения рекомендуется). Введите расстояние Макс (рекомендуется20 мкм ) и Макс разрыв размера (рекомендуется 3 или 2). Нажмите кнопку весь процесс окончательно изображение.
Примечание: Максимальное расстояние и Макс размер интервала являются два пороговых значения сломать треков. Говоря более конкретно в двух кадров непрерывной когда расстояние между того же объекта превышает максимальное расстояние, этот объект в кадре позднее будет рассматриваться как новый объект. Иногда во время приобретения тот же объект может исчезнуть в течение нескольких фреймов и показать снова. В этом случае только тогда, когда этот объект появляется в пределах Макс разрыв размера, он будет рассматриваться как тот же объект. - Выберите Тип фильтра и выберите параметр, чтобы исключить нежелательные треков.
Примечание: Этот шаг является необязательным. - Нажмите кнопку Далее и затем нажмите кнопку Готово.
Примечание: Этот шаг может занять часов до суток в зависимости от вычислительной мощности. - Нажмите кнопку Редактировать треки и выбрать Правильный дрейфа. Выберите соответствующий алгоритм (Поступательные смещения рекомендуется). Выберите желаемый Размер результирующего набора данных (Новый размер, равным текущему размеру рекомендуется). Нажмите кнопку ОК.
Примечание: Этот шаг является лишь требуется, когда коллаген дрейфовал во время захвата изображений. - Нажмите Статистика и выберите Настроить список видимых значений статистики. Проверить параметры интерес быть экспортированы (например, координаты, скорость и т. д). Нажмите кнопку ОК.
- Нажмите кнопку Экспорт всех статистических данных в файл и введите имя файла.
5. Фиксация и иммунофлюоресценции окрашивания клеток в Коллагеновые матрицы
- Передачи 1000 мкл параформальдегида 4% (ПФА, в PBS) в 5 мл трубку под химические вытяжки.
Примечание: PFA должны быть сбалансированы до комнатной температуры. - Окуните капилляра с полимеризованной коллагена от 2,9. в раствор PFA (за ~ 5 мм) и монтировать капилляр на внутренней стенке трубки 5 мл с пластилин (как показано на рисунке 1 c).
- Аккуратно нажмите поршень, до тех пор, пока половина коллагена стержня висит в решении PFA (рис. 1 d). Держите трубку при комнатной температуре в течение 20 мин.
- Вытяните назад поршень, чтобы получить коллаген стержня внутри капилляра. Взять из капилляра и отбросить PFA.
- Маунт капилляра в свежий трубку и добавьте 1 mL PBS. Убедитесь, что капилляр погружается в PBS.
- Аккуратно нажмите поршень, до тех пор, пока половина коллагена стержня висит в решении. Смонтируйте капилляр на внутренней стенке с глина моделирования.
- Держите трубку при комнатной температуре в течение 5 мин.
- Повторите 5.4. -5.7 для еще 2 раза.
- Вытяните назад поршень, чтобы получить коллаген стержня внутри капилляра. Выбросите PBS. Передача 1-2 мл буфера блокирование/permeabilization (PBS + 1% BSA + 0.1% неионные ПАВ) в трубку и повторите 5.6.
Примечание: BSA (1%) могут быть заменены 5% сывороточного животного, вторичные Ab был поднят в. - Держите трубку при комнатной температуре за 30-60 мин.
- Вытяните назад поршень, чтобы получить коллаген стержня внутри капилляра. Удалить в буфер permeabilization. Перевести 200-500 мкл основное антитело в буфере блокирование/permeabilization и изгоняет стержня в раствор.
- Держите трубку при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Вымойте коллагена стержня 3 раза с PBST (PBS + 0.1-% неионные ПАВ), как описано в 5.4. -5.8.
- Инкубируйте жезл в вторичное антитело в буфере блокирование/permeabilization за 1 ч при комнатной температуре. Держите его от света.
- Вымойте коллагена стержня 3 раза с PBS, как описано в 5.4. -5.8.
- Вытяните назад поршень, чтобы получить коллаген стержня внутри капилляра. Сохранить образцы в PBS до изображений.
- Сканировать образцы, как описано в разделе 3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Формирования протрузии во время миграции клеток T является весьма динамичный процесс, который является актина зависимых. Чтобы визуализировать выступ формирование первичных человеческих CTL, мы временно transfected mEGFP плавленый белка на этикетке Цитоскелет актина в CTL как описано до11. Один день после трансфекции, клетки были внедрены в коллагеновой матрицы. Стеки изображений были приобретены каждые 40 s с размером шаг 1 мкм при 37 ° C, с помощью микроскопии свет лист. Как показано в рисунке 2A и Дополнительные фильм 1, во время миграции, человеческой форме CTL лимон образный основных выступающих частей, окаймленные тонкой шпинделя подобных структур. В эксперимент, показанный здесь, не только один образ одну ячейку, но большой объем (450 x 450 x 538 мкм3) (рис. 2B). Таким образом, оптическое качество и разрешение, показанный здесь были получены с целью малое увеличение (20 X / 1.0 DIC VIS IR). Таким образом резолюции можно добиться дальнейшего улучшения с выше NA целей.
В эксперименте, показано на рисунке 2 и 1 киноЦТЛ автоматически отслеживаются как описано в протоколе часть 4. Траекторий CTL изображены на рисунке 2B. Были проанализированы два параметры миграции: скорость и настойчивость. Сохранением определяется как перемещение, разделенных длины всего трека. Анализ показывает, что мобильность CTL является весьма разнообразной в 3D: скоростей в диапазоне от 0.01-0,19 мкм/сек с почти кратной разницы и сохранением в диапазоне от 0 - 0,7 (рис. 2 c). Мышей было сообщено, что в естественных условиях интерстициальных миграции средняя скорость Т-клеток было 4 мкм/мин16. Недавно мы определили средняя скорость CTL будет 4-5 мкм/мин11 с помощью методов, описанных в данном документе. Эти результаты показывают, что свет лист микроскопии является мощным инструментом для визуализации ячейки поведение, например, миграции клеток и клеток взаимодействия. В естественных условиях, многие факторы и неоднородных ECM сложного состава, включая растворимых факторов, которые могут повлиять на миграцию изменить поведение Т-клеток.
Применение матрицы коллаген не ограничивается живой клетки. Фиксации и иммуноокрашивания также могут быть выполнены в матрице. На рисунке 3 показан пример фиксированных выборок в 3D коллагена геля, в котором эндогенного perforin1 (PFN1) и окрашивали актина. Подсветкой образца либо с одной стороны (одна сторона освещения) или с обеих сторон (двойной боковой подсветки). Мы отмечаем, что клетки в разных z позиции равномерно окрашенных, указав, что процедуры, описанные в нашей протокол добиться удовлетворительного проникновения антител в коллагеновые гели. Что еще более важно, после фиксации CTL выставлены же морфологии как в прямом клеток (Сравните рис. 3 и рис. 2B), указав, что также морфология хорошо поддерживается этот протокол. Кроме того освещение, с одной стороны или с обеих сторон не делает существенную разницу в качество изображений в фокальной плоскости. Учитывая, что меньше площадь подвергается лазер с режимом освещения одной стороны, по сравнению с двойной боковой освещения, освещения одной стороны более рекомендуется.
Рисунок 1: Иллюстрация обработке капилляров пробоподготовка. (A) вставьте поршень капилляра и как для мокрой поршень с питательной среды. (B) потяните мобильный/коллагеновые смесь в капилляр. (C) смонтировать капилляров с помощью моделирования глины. Поршень и коллаген стержень изображены в серых и красных коробках, соответственно. (D) обработка коллагена стержень для уравновешивания с питательной среды или иммуноокрашивания. Поршень и коллаген стержень изображены в серых и красных коробках, соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: отслеживание основных человеческих CTL в 3D коллагена и визуализации актина динамика. (A) максимальная интенсивность проекция актина в первичных человеческих CTL. Актин был обозначен в CTL как описано11. Один день пост transfection клетки были встроенные в 0,5% коллагеновой матрицы. Один представитель ячейки отображается. Масштаб гистограммы являются 5 мкм. штраф актина структур на краю выступа выделяются стрелки. (B) траектории CTL на 6 ч. Траекторий отслеживаются automatedly программного обеспечения (код цвета: синий = начало, красный = конца дорожки, 450 × 450 × 538 мкм3 тома). Шкалы бар-50 мкм. (C) количественная оценка скорости и настойчивость. Одна точка представляет одну ячейку. Результаты отображаются как означает ± SEM от 4 доноров. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: Иммуноокрашивания эндогенного profilin1 (PFN1) и актина в CD8+ T клетки, встроенные в 3D коллагеновой матрицы. Основная CD8 человека+ T клетки были внедрены в 0,25% коллагена. После фиксации PFA образец был окрашенных с помощью анти PFN1 (оранжевый) и Фаллоидин (фиолетовый) и визуализированное микроскопии свет лист на шаг размер 1 мкм для общего объема 440 x 440 x 1000 мкм3. Подсветкой образца либо с одной стороны (одна сторона освещения) или с обеих сторон (двойной боковой подсветки). Максимальная интенсивность (МИП) с 3D-реконструкции показана. Масштаб гистограммы являются 50 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Фильм 1: поколение выступы во время миграции клеток T. Клетки, показано в фильме, была взята из тома, показано на рисунке 2А. Клетки были внедрены в коллагеновой матрицы (0,5%). Изображения были приобретены каждые 40 s для 6 ч при 37 ° C, с помощью микроскопии свет лист. Пожалуйста нажмите здесь, чтобы посмотреть это видео. (Правой кнопкой мыши для загрузки.)
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Большинство анализов в vitro осуществляется на 2D поверхности, например в культуре клеток тарелки, чашки Петри или на coverslips, тогда как в естественных условиях клетки, особенно иммунные клетки, опыт работы главным образом 3D микроокружения. Новые свидетельства показывает, что миграции иммунных клеток отличаются между 2D и 3D сценарии17. Кроме того выражение профили опухолевых клеток также являются различными в 2D - и 3D-культурной ткани18,19,20. Таким образом чтобы лучше имитировать физиологических условиях в пробирке, это большое преимущество для выполнения экспериментов в 3D контексте, например в 3D Коллагеновые матрицы. Недавно разработанные подходы, в частности, свет лист флуоресцентной микроскопии, позволяет надежных и воспроизводимых экспериментах в системах 3D матрицы в контролируемых условиях окружающей среды.
В отличие от обычных лазерное сканирование confocal микроскопии, которое освещает весь зонд, с помощью микроскопии свет лист освещать примеры генерируется только тонкий лист лазерного света. Обнаружения камеры перпендикулярно плоскости освещающей. Благодаря этой технике только раздел в фокальной плоскости подвергается лазера. Таким образом фото отбеливания и Фототоксичность могут быть минимизированы. Кроме того, по сравнению с точки сканирование микроскопии, приобретение курс резко усиливается с свет лист микроскопии (100 - Гарибова быстрее) и отношение сигнал шум также улучшится. В сочетании с инкубации палаты микроскопии света лист установки используется в настоящем документе этот Микроскоп является мощным средством для захвата изображений больших 3D томов с свернутого отбеливания и фото повреждения в течение продолжительных периодов времени (несколько дней) под Инкубатор условий.
Для подготовки проб с 3D коллагеновой матрицы наиболее критической точки, чтобы избежать воздушных пузырей. С учетом ее высокой вязкости когда пузырьки воздуха вводятся в коллагена решение это очень трудно удалить из решения. Наличие воздушных пузырей может вызвать неоднородность полимеризации коллагеновой матрицы; Кроме того он может блокировать путь света, который уменьшит качество изображений. Поэтому, когда передавать или mix решение коллаген один должен Пипетка очень аккуратно и не высылать последней каплей в наконечник пипетки. Кроме того коллаген начинает медленно полимеризации при комнатной температуре. Таким образом для предотвращения полимеризации до смешивания решение хорошо, содержащие коллаген труб должны всегда храниться на льду.
Одна большая проблема, мы сталкиваемся с использованием микроскопии свет лист является обработка данных. Данные, полученные в свет лист микроскопии можно легко добраться до размера 500 гигабайт или даже несколько терабайт, в частности для долгосрочных экспериментов. Для анализа этих данных занимает несколько дней, иногда до недели работы станции с высоким расчет емкости. Поскольку размер анализируемого изображений не меньше, чем исходные данные емкости хранения может быстро стать ограничивающим фактором для применения света лист микроскопии. Таким образом для отслеживания экспериментов или если необходим анализ сложных изображений рекомендуется ограничить размер файла за эксперимент для значений, которые могут быть обработаны в разумные сроки доступных процессоров.
Свет лист флуоресцентной микроскопии представил здесь имеет некоторые особенности, которые могут повлиять на результаты, если не обработан внимательно. Использование капилляров является особенно выгодным для безбарьерного иллюминации образцов. Поскольку род коллагена висит в среде, может случиться, что коллаген стержень дрейфует во время захвата изображений, особенно для долгосрочных измерений. Этот дрейф должно быть исправлено, чтобы избежать неправильного толкования результатов. Конечно есть другие настройки света лист микроскопии коммерчески доступных на рынке, которые не требуют капилляров для монтирования образцы. Кроме того с помощью микроскопии свет лист, помимо того, что по сравнению с обычными линии сканирования Фототоксичность confocal микроскопии значительно сократилось, фототоксичности по-прежнему остается проблемой для долгосрочное изображений21.
Помимо света лист микроскопии существуют другие подходы, установленные для визуализации 3D флуоресценции, среди которых преимущественно прикладной являются конфокальная микроскопия, широкий поле флуоресцентной микроскопии и multiphoton микроскопии. С точки зрения глубины проникновения конфокальных и широкий поле флуоресцентной микроскопии лежат в аналогичных диапазоне, обычно ограничивается 100 Нм22. Благодаря больше длины волны света, использованы для микроскопии мульти Фотон ее глубина проникновения может быть повышена в диапазоне 0,5 - 1 мм23. В сравнении до нескольких миллиметров24может быть размер многомерного изображений, генерируемых оптического секционирование света лист микроскопии. С точки зрения латеральное разрешение элегантно осуществляется эксперимент показывает микроскопии что свет лист обеспечивает лучше трехмерного пространственного разрешения по сравнению с конфокальный флуоресцентной микроскопии в больших образцов25. Недавно, свет лист микроскопия была объединена с двух Фотон технику, которая далее улучшает глубину проникновения, по сравнению с нормальной один фотон света лист микроскопии и десять раз быстрее, чем точка сканирующей микроскопии двух Фотон26.
Учитывая 3D матрицы, что обеспечивает микро архитектуры для ячеек, кроме бычьего коллагена, использованные в настоящем документе существует много других вариантов, таких как внеклеточных матрица (ECM) производные от саркомы клетки мыши, агарозы, синтетические гидрогели или других биосовместимых полимерных материалов. Мышь саркома ECM является смесью белков, включая коллаген IV, Ламинин, а также многочисленные факторы роста. В сравнении с синтетическим материалом, биологические ECMs (коллаген и мыши саркома ECM), с одной стороны, представить более физиологически соответствующий контекст; но с другой стороны, качество и состав биологических ECMs может варьироваться между партиями и компаний. В отличие от более гарантировано воспроизводимость синтетических материалов. Удивительно совершенствование биохимических и механических свойств, а также желаемые изменения, допускается для синтетических материалов, но не для биологических ECMs10,27.
В резюме в этой статье мы описали протокол для создания 3D коллагеновой матрицы для экспериментов биологии клетки, с помощью микроскопии флуоресцирования свет лист и как внедрять первичного человека CTL в 3D коллагеновой матрицы для визуализации и анализа миграции CTL. Мы выделили ключевые моменты в пробоподготовки, загрузки изображений и анализа. Наши результаты показывают, что формирование высокодинамичные выступов и тонкой актина структуры могут быть визуализированы на свет лист микроскопии с хорошим разрешением пространственно-временных. Кроме того протокол анализа, описанный здесь позволяет надежно отслеживать клетки в объективной и автоматическом режиме. Этот метод будет особенно выгодным для иммунологических исследований человеческого как мышей и людей существенно отличаются во многих иммунологической функции и реактивность к терапии28.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют финансовые или коммерческие конфликта интересов.
Acknowledgments
Мы благодарим институт клинической Hemostaseology и трансфузионной медицины для предоставления донорской крови; Кармен Hässig и кора Ходжа за отличную техническую помощь. Мы благодарим Jens Реттиг (Университет Саарленд) для модифицированных pMAX вектора, Roland Ведлих-Söldner (Университет Мюнстер) для оригинальной конструкции рубиново-LifeAct и Кристиан Юнкер (Университет Саарленд) для генерации LifeAct-mEGFP конструкции. Этот проект финансировался 1027 Sonderforschungsbereich (проект A2 до B.Q.) и 894 (проект A1 м.г.). Микроскоп свет лист был финансируемых DFG (GZ: INST 256/4 19-1 FUGG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fibricol, bovine collagen solution | Advanced Biomatrix | #5133-20ML | Collagen matrix |
| 0.5 M NaOH Solution | Merck | 1091381000 | for neutralizing Fibricol solution |
| Ultra-Low melting agarose | Affymetrix | 32821-10GM | Sample preparation in low c[Col] |
| Dynabeads Untouched Human CD8 T Cells Kit | Thermo Fisher | 11348D | Isolation of primary human CD8+ T cells from PBMC |
| Dynabeads Human T-Activator CD3/CD28 for T Cell Expansion and Activation | Thermo Fisher | 11132D | Activation of CTL populations |
| Human recombinant interleukin-2 | Thermo Fisher | PHC0023 | Stimulation of cultured CTL |
| P3 Primary solution kit | Lonza | V4XP-30XX | Transfection |
| α-PFN1 antibody, rabbit, IgG | Abcam | ab124904 | IF |
| Alexa Fluor 633 Phalloidin | Thermo Fisher | A22284 | IF |
| CellMask Orange Plasma membrane Stain | Thermo Fisher | C10045 | Fluorescent cell label |
| Tween 20 | Sigma | P1379-250mL | IF |
| Triton X-100 | Eurobio | 018774 | IF |
| DPBS Dulbecco's phopsphate buffered saline | Thermo Fisher | 14190250 | IF |
| Bovine serum albumin | Sigma | A9418-100G | IF |
| Goat α Rabbit 568, IgG, rabbit | Thermo Fisher | A-11011 | IF |
| Lightsheet Z.1 (Light-sheet microscopy) | Zeiss | N.A. | |
| Cell culture hood | Thermo Fisher | HeraSafe KS | |
| Cell culture incubator HERACell 150i | Thermo Fisher | N.A. | |
| Centrifuge 5418 and 5452 | Eppendorf | N.A. | |
| Pippettes | Eppendorf | 3123000039, 3123000020, 3123000063 | |
| Pippette tips | VWR | 89079-444, 89079-436, 89079-452 | |
| 15 mL tubes | Sarstedt | 62.554.002 | |
| Capillaries 50 µL | VWR (Brand) | 613-3373 | Zeiss LSFM sample preparation |
| Plunger for capillaries | VWR (Brand) | BRND701934 | "Stamps with Teflon tip" LSFM sample preparation |
| MColorPhast pH stips | Merck | 1095430001 | to test pH of neutralized Fibricol |
| BD Plastipak 1mL syringes | BD | Z230723 ALDRICH | Alternative sample preparation |
| Modeling clay (Hasbro Play-Doh A5417EU7) | Play-Doh | N.A. | |
| Imaris file converter | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Convert imaging files to Imaris file format |
| Imaris 8.1.2 (MeasurementPro, Track, Vantage) | Bitplane | available at http://www.bitplane.com | Analysis of 3D and 4D imaging data |
References
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Med Res Rev. 27 (2), 149-176 (2007).
- Doyle, A. D., Petrie, R. J., Kutys, M. L., Yamada, K. M. Dimensions in cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 642-649 (2013).
- Krummel, M. F., Bartumeus, F., Gerard, A. T cell migration, search strategies and mechanisms. Nat Rev Immunol. 16 (3), 193-201 (2016).
- Entschladen, F., et al. Analysis methods of human cell migration. Exp Cell Res. 307 (2), 418-426 (2005).
- Meredith, J. E., Fazeli, B., Schwartz, M. A. The extracellular matrix as a cell survival factor. Mol Biol Cell. 4 (9), 953-961 (1993).
- Friedl, P., Wolf, K. Plasticity of cell migration: a multiscale tuning model. J Cell Biol. 188 (1), 11-19 (2010).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302 (5651), 1704-1709 (2003).
- Shamir, E. R., Ewald, A. J. Three-dimensional organotypic culture: experimental models of mammalian biology and disease. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (10), 647-664 (2014).
- Ravi, M., Paramesh, V., Kaviya, S. R., Anuradha, E., Solomon, F. D. 3D cell culture systems: advantages and applications. J Cell Physiol. 230 (1), 16-26 (2015).
- Fang, Y., Eglen, R. M. Three-Dimensional Cell Cultures in Drug Discovery and Development. SLAS Discov. 22 (5), 456-472 (2017).
- Schoppmeyer, R., et al. Human profilin 1 is a negative regulator of CTL mediated cell-killing and migration. Eur J Immunol. 47 (9), 1562-1572 (2017).
- Mogilner, A., Oster, G. Cell motility driven by actin polymerization. Biophys J. 71 (6), 3030-3045 (1996).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. J Histochem Cytochem. 59 (2), 129-138 (2011).
- Power, R. M., Huisken, J. A guide to light-sheet fluorescence microscopy for multiscale imaging. Nat Methods. 14 (4), 360-373 (2017).
- Zhou, X., et al. Bystander cells enhance NK cytotoxic efficiency by reducing search time. Sci Rep. 7, 44357 (2017).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453 (7191), 51-55 (2008).
- Petrie, R. J., Yamada, K. M. At the leading edge of three-dimensional cell migration. J Cell Sci. 125 (Pt 24), 5917-5926 (2012).
- Imamura, Y., et al. Comparison of 2D- and 3D-culture models as drug-testing platforms in breast cancer). Oncol Rep. 33 (4), 1837-1843 (2015).
- Lee, J. M., et al. A three-dimensional microenvironment alters protein expression and chemosensitivity of epithelial ovarian cancer cells in vitro. Lab Invest. 93 (5), 528-542 (2013).
- Luca, A. C., et al. Impact of the 3D microenvironment on phenotype, gene expression, and EGFR inhibition of colorectal cancer cell lines. PLoS One. 8 (3), e59689 (2013).
- Jemielita, M., Taormina, M. J., Delaurier, A., Kimmel, C. B., Parthasarathy, R. Comparing phototoxicity during the development of a zebrafish craniofacial bone using confocal and light sheet fluorescence microscopy techniques. J Biophotonics. 6 (11-12), 920-928 (2013).
- Graf, B. W., Boppart, S. A. Imaging and analysis of three-dimensional cell culture models. Methods Mol Biol. 591, 211-227 (2010).
- Helmchen, F., Denk, W. Deep tissue two-photon microscopy. Nat Methods. 2 (12), 932-940 (2005).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Verveer, P. J., et al. High-resolution three-dimensional imaging of large specimens with light sheet-based microscopy. Nat Methods. 4 (4), 311-313 (2007).
- Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy. Nat Methods. 8 (9), 757-760 (2011).
- Haycock, J. W. 3D cell culture: a review of current approaches and techniques. Methods Mol Biol. 695, 1-15 (2011).
- Mestas, J., Hughes, C. C. Of mice and not men: differences between mouse and human immunology. J Immunol. 172 (5), 2731-2738 (2004).
