Summary
هنا، يمكننا وصف مسار العدوى في الفئران لدراسة أدوار للأغشية الحيوية في التهاب السحايا العقدية الخنزيرية سوباراتشنويدال داخل الجمجمة. هذا النموذج الإصابة أيضا مناسبة لدراسة الآلية المرضية لالتهاب السحايا الجرثومي الأخرى ونجاعة أدوية جديدة لمكافحة التهاب السحايا الجرثومي.
Abstract
هو العقدية الخنزيرية الممرضات بكتيرية رئيسية الخنازير في جميع أنحاء العالم ليس فقط، بل أيضا وكيلاً الحيوانية ناشئة. في البشر والخنازير، التهاب السحايا مظهراً رئيسيا للالتهابات الخنزيرية . نموذج عدوى مناسبة أداة أساسية فهم آليات الأمراض الناجمة عن العوامل الممرضة. وقد وضعت عدة طرق للعدوى في الفئران لدراسة الآلية المرضية للعدوى الخنزيرية . ومع ذلك، طرق العدوى داخل وداخل الآنف، وعن طريق الحقن الوريدي ليست مناسبة لدراسة دور كل من مكونات السطح الخنزيرية في التهاب السحايا مباشرة في الدماغ، مثل المصفوفة خارج الخلية من الأغشية الحيوية. على الرغم من أن التطعيم إينتراسيستيرنال قد استخدمت للإصابة الخنزيرية ، لا قد وصف موقع الحقن دقيقة. هنا، وصفت الطريق سوباراتشنويدال داخل الجمجمة للإصابة في طراز ماوس للتحقيق في دور كل من الأغشية الحيوية في التهاب السحايا الخنزيرية . مباشرة تم حقن الخنزيرية العوالق الخلايا أو الخلايا الدولة بيوفيلم في الفضاء تحت العنكبوتية من الفئران عن طريق الحقن يقع روسترال من بريجما 3.5 ملم. تحليل نسيجية وزيادة التعبير مرناً من TLR2 والسيتوكينات من أنسجة المخ من الفئران حقن الخلايا بيوفيلم الدولة بينت بوضوح أن بيوفيلم الخنزيرية يلعب أدوار نهائية في التهاب السحايا الخنزيرية . هذا الطريق للعدوى ومزايا واضحة عبر طرق أخرى للعدوى، مما يتيح دراسة تفاعل البكتيريا المضيفة. وعلاوة على ذلك، فهو يسمح تأثير عناصر جرثومية على الاستجابات المناعية المضيف مباشرة في الدماغ لتقييم، ويحاكي مدخل البكتيرية في الجهاز العصبي المركزي. ويمكن تمديد هذا الطريق للعدوى للتحقيق وآليات لالتهاب السحايا الناجم عن بكتيريا أخرى. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدامه لاختبار فعالية العقاقير المضادة لالتهاب السحايا الجرثومي.
Introduction
العقدية الخنزيرية (الخنزيرية) هو الممرضات بكتيرية رئيسية الخنازير في جميع أنحاء العالم، مما تسبب في الأمراض الحادة بما في ذلك التهاب السحايا والالتهاب الرئوي وتسمم الدم، والتهاب الشغاف والتهاب المفاصل1. وأيضا عامل الحيوانية ناشئة. وحتى الآن، أفيد أن تسعة من اللقاح يمكن أن يسبب عدوى في البشر، بما في ذلك اللقاح 2 و 4، 5، 9، 14، 16، 21، 24 و 312،،من34. في البشر والخنازير، التهاب السحايا واحد من علامات سريرية رئيسية التهابات الخنزيرية . الخنزيرية في فيتنام وتايلاند، السبب الرئيسي لالتهاب السحايا في البالغين5. الأغشية الحيوية الميكروبية هي الكائنات المجهرية التي تنضم إلى بعضها البعض والتي تتركز في واجهة؛ أنها ضرورية لضراوة البكتيرية، والبقاء على قيد الحياة في بيئات متنوعة، ومقاومة المضادات الحيوية5. الأغشية الحيوية عادة محاطة مصفوفة خارج الخلية تحتوي عموما على السكريات والبروتينات والحمض النووي6. هذه الأخيرة غير قادرة على الحصول على استجابات المضيف التحريضية و إنتاج سيتوكين7. تشكيل بيوفيلم أبلغ أن تشارك في التهاب السحايا العقدية في الدراسات السابقة. الأغشية الحيوية المساهمة في التهاب السحايا العقدية اجالاكتيا في نموذج أسماك البلطي وتشكيل بيوفيلم تم كشف داخل أنسجة المخ وحولها سحائي السطوح في فيفو عن طريق التلقيح داخل البطن8. أثناء التهاب السحايا، العقدية الرئوية في دولة مثل بيوفيلم والبكتيريا في هذه دولة بيوفيلم كانت أكثر فعالية في حمل التهاب السحايا في نموذج9إصابة بماوس. وبالإضافة إلى ذلك، في أعمالنا السابقة دراسة، تسهم الدولة بيوفيلم المرتبطة الخنزيرية في الدماغ الماوس ضراوة البكتيريا ب تحليل البقاء على قيد الحياة10. ومع ذلك، أدلة مباشرة لمشاركة بيوفيلم في التهاب السحايا الخنزيرية تتطلب مزيدا من التحقيق.
وقد وضعت نماذج حيوانية للإصابة الخنزيرية في الفئران باستخدام داخل (القائمة)11،12من داخل الآنف (i.n.) وفي الوريد (رابعا)13وطرق العدوى14، إينتراسيستيرنال (جيم) 15 , 16-ومع ذلك، الطرق القائمة، و i.n.، ورابعاً للعدوى ليست مناسبة لدراسة دور كل من مكونات السطح الخنزيرية في التهاب السحايا في الدماغ مباشرة. وتشمل هذه المصفوفة خارج الخلية من الأغشية الحيوية. على الرغم من أن تم استخدام التطعيم جيم للإصابة الخنزيرية ، قد وصف موقع الحقن دقيقة لا في هذه الورقات. وفي المقابل، وصفت إحداثيات الموقع حقن التطعيم داخل الجمجمة سوباراتشنويدال ستيريوتاكسيك وضوح في دراسة سابقة17. هذا يسمح بالتعرف السهل نقطة التطعيم والبروتوكول التجريبي التبسيط أكثر. وباﻹضافة إلى ذلك، يحاكي الطريق سوباراتشنويدال داخل الجمجمة للعدوى البكتيرية مدخل في الجهاز العصبي المركزي من الجيوب الأنفية أو الإذن الوسطى17، والعلاقة بين الإذن الوسطى والتهاب السحايا الناجم عن الخنزيرية وقد تجلت مادسن وآخرون18. وعلاوة على ذلك، بتطبيق التوجيه سوباراتشنويدال داخل الجمجمة للعدوى في الفئران، لقد أظهرنا أن الخنزيرية الصغيرة رنا rss04 يسهم في التهاب السحايا في أعمالنا السابقة دراسة10.
في هذه الدراسة، استخدمت الطريق سوباراتشنويدال داخل الجمجمة للعدوى في الفئران للتحقيق في دور كل من الأغشية الحيوية في التهاب السحايا الخنزيرية . كانوا مصابين الفئران العوالق الخلايا أو الخلايا الدولة بيوفيلم من الخنزيرية في هذا الطريق للعدوى. تحليل نسيجية وزيادة التعبير مرناً TLR2 والسيتوكينات من أنسجة المخ الفئران حقن الخلايا بيوفيلم الدولة بينت بوضوح أن بيوفيلم الخنزيرية يسهمان في التهاب السحايا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ووافقت في مختبر الحيوان رصد اللجنة لمقاطعة جيانغسو "، الصين" تجارب العدوى بالماوس ثم أداؤها في الجامعة "مختبر الحيوان مركز نانجينغ الزراعية" (رقم تصريح: سيكسك (سو) 2017-0007).
1-إعداد البكتيريا
ملاحظة: السويسية 2 النمط المصلي المسيطر ظهرت سلالة P1/7 كان معزولاً عن خنزير مريضة بالتهاب السحايا19. سلالة P1/7 كان يزرع في مرق تود هيويت (THB، صيغة للتر الواحد من THB: "ضخ القلب"، ز 3.1؛ نيوبيبتوني، ز 20.0 سكر العنب، ز 2.0؛ وكلوريد الصوديوم، ز 2.0؛ وثنائي فوسفات، ز 0.4؛ كربونات الصوديوم، 2.5 g) ومطلي على هيويت تود أجار (ثا، صيغة للتر الواحد من ثا: ضخ القلب، ز 3.1؛ نيوبيبتوني، ز 20.0؛ سكر العنب، ز 2.0؛ كلوريد الصوديوم، ز 2.0؛ ثنائي فوسفات، ز 0.4؛ كربونات الصوديوم، 2.5 g؛ أجار، ز 15.0) في شركة 37 درجة مئوية و 5%2.
- مجموعة من سلالة الخلايا العوالق P1/7
- جمع 5 مل خلايا العوالق من الثقافة سجل منتصف المرحلة (OD600= 0.6) والطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 8000 × ز، ويغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني.
- ريسوسبيند الخلايا مع 5 مل والغليسيرول 25% في THB، الكوة في أنابيب 5، ومن ثم تخزين في-80 درجة مئوية.
- مجموعة من سلالة الخلايا الدولة بيوفيلم P1/7
- أخذ 20 مل ثقافة بين عشية وضحاها، وإضافة إلى 180 مل THB جديدة؛ تقسيم ثقافة المخفف 10 جولة الثقافة لوحات على قدم المساواة، ومن ثم وضع اللوحات في حاضنة في 37 درجة مئوية في 5% CO2 ح 24.
- وبعد الحضانة، يهز لوحة بلطف ريسوسبيند البكتيريا التي لم تنضم إلى اللوحة ومن ثم تجاهل المادة طافية بتطلع.
ملاحظة: اهتزاز اللوحة بلطف وتجنب ريسوسبيندينج الرواسب. - إضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني حصاد بيوفيلم الدولة الخلايا وريسوسبيند الرواسب تماما ثم نقل العينة إلى أنبوب جديد.
- Sonicate الخلايا بيوفيلم الدولة من الخطوة الأخيرة مع المعلمات التالية: 60 ث، دورات 4، 5 s s 10 وعلى الخروج.
- الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 8000 × ز وتخزين المادة طافية في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: قد تحتوي المادة طافية على مكونات بيوفيلم ويمكن استخدامه على ريسوسبيند البكتيريا بيوفيلم قبل الإصابة كما هو موضح في التجارب الحيوانية (الخطوة 3). - ريسوسبيند الرواسب مع 10 مل والغليسيرول 25% في THB ومن ثم تخزين الخلايا بيوفيلم الدولة في-80 درجة مئوية.
2-المسح تحليل المجهر الإلكتروني (SEM)
- إصلاح الخلايا الدولة بيوفيلم التي تم جمعها والعوالق الخلايا باستخدام بارافورمالدهيد 4% ح 12-24 في 4 درجات مئوية.
- شطف العينات بسرعة مع الماء المقطر ويذوي في نماذج التتابع مع تركيز متزايد من الإيثانول (25% و 50%، 70%، 90% و 100%) لمدة 30 دقيقة في كل حل.
- الالتزام العينات المجففة للمعادن أصحاب مع الشريط على الوجهين وأخيراً معطف لهم في مبخر مع الذهب والحراسة.
- مراقبة العينات مجهر الإلكتروني المسح الضوئي استخدام المعلمات التالية: ات (التوتر العالي إضافي) = 10 كيلو فولت؛ (العمل عن بعد) WD = 7.0 أو 8.0 ملم؛ التكبير = 5000 ×؛ إشارة A = SE1.
3-الحيوانات والتجارب
- استخدام منتدى جنوب المحيط الهادئ في الأسبوع من 6-العمر الإناث بالب/ج الفئران في هذه الدراسة. تصيب كل الفئران من خلال مسار الإصابة الحقن التي يقع 3.5 مم روسترال من بريجما سوباراتشنويدال داخل الجمجمة. ووصفت ستيريوتاكسيك إحداثيات موقع الحقن وضوح et alتشيافوليني17.
- لتحليل نسيجية، تصيب مجموعتين من الفئران (5 الفئران في كل مجموعة) باستخدام خلايا العوالق أو بيوفيلم الدولة الخلايا في جرعة مقدارها 3 × 107 مستعمرة تشكيل وحدات (زيمبابوي)، وتم حقن الفئران 5 آخر مع برنامج تلفزيوني كعنصر تحكم.
- باستخدام خلايا العوالق أو بيوفيلم الخلايا الدولة عند جرعة مقدارها 3 × 107 زيمبابوي للكشف عن التعبير مرناً TLR2 والسيتوكينات في الدماغ، وتصيب اثنين مجموعات إضافية من الفئران (6 الفئران في كل مجموعة).
- تحديد العدد من البكتيريا قادرة على البقاء بطلاء تخفيف المسلسل إلى ثا.
- Euthanize جميع الفئران في ح 12 الإصابة بعد إجراء مزيد من البحوث.
ملاحظة: يجب إزالة الجلسرين في وسيط الأوراق المالية قبل الإصابة. تغسل العوالق الخلايا والخلايا الدولة بيوفيلم شُفي-80 درجة مئوية 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. ثم حراكه مع برنامج تلفزيوني خلايا العوالق والمخفف للجرعة المناسبة للعدوى؛ بيوفيلم الدولة الخلايا حراكه مع المادة طافية المخزنة (من الخطوة 1.2.5) والمخفف للجرعة المناسبة للإصابة. لا ينبغي أن يكون حجم الإصابة بأكثر من 50 ميليلتر.
- الكشف عن التعبير مرناً TLR2 والسيتوكينات في أنسجة المخ
- استخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي من أنسجة المخ باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي الريبي.
- لكل الماوس، استخدام أنسجة المخ كله لاستخراج الحمض النووي الريبي. تقسيم أنسجة المخ كله إلى أنابيب 5. يستغرق فترة تصل إلى 100 مغ أنسجة المخ وإضافة 1 مل من محلول تحلل لكل أنبوبة تحتوي على مصفوفة ليسينج التي قدمتها عدة.
- عملية الأنبوب في الخالطون ل 40 ثانية عند إعداد 6.0، ومن ثم الطرد المركزي الأنبوب في 12000 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- بعد الطرد المركزي، نقل في المرحلة العليا لأنبوب ميكروسينتريفوجي جديدة.
- احتضان العينة المحولة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة؛ إضافة 300 ميليلتر من كلوروفورم، دوامة ل 10 ق، واحتضان ثم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- الطرد المركزي الأنبوب في 12000 × ز و 4 درجة مئوية للحد الأدنى 5 نقل في المرحلة العليا لأنبوب جديد.
- إضافة 500 ميليلتر من الإيثانول المطلقة الباردة إلى الأنبوب، قبل عكس ذلك 5 مرات ومن ثم تخزين العينة في-20 درجة مئوية على الأقل 1 ح.
- الطرد المركزي الأنبوب في 12000 × ز و 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وإزالة المادة طافية. أغسل بيليه مع 500 ميليلتر الباردة الإيثانول 75% في خالية رناسي ح2o.
- إزالة الإيثانول، الهواء الجاف بيليه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وريسوسبيند الجيش الملكي النيبالي في 100 ميليلتر خالية رناسي ح2o.
- احتضان الجيش الملكي النيبالي لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة وتحديد تركيز الجيش الملكي النيبالي باستخدام بيواناليزير من الجيش الملكي النيبالي.
- إجراء توليف كدنا، بما في ذلك القضاء على الحمض النووي (جدنا)، باستخدام ثيرموسيكلير مع مجموعة كاشف نسخ عكسي (RT).
- إضافة 1 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي ميليلتر أنبوب 2 تحتوي على x gDNA 5 القضاء على المخزن المؤقت، 1 ميليلتر من إنزيم القضاء على جدنا وخالية من رناسي ح2س حتى حجم يصل إلى 10 ميليلتر. احتضانها لمدة 2 دقيقة في 42 درجة مئوية.
- إضافة 10 ميليلتر من مزيج الرئيسي (1 ميليلتر من إنزيم RT المزيج الأول، 1 ميليلتر من "الرايت التمهيدي مزيج"، ميليلتر 4 من 5 × 2 المخزن المؤقت، وميليلتر 4 خالية رناسي ح2س) في حل رد فعل آخر خطوة وثم تخلط بلطف. الشروع فورا برد فعل RT: 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ومن ثم 85 درجة مئوية 5 s.
- القيام التحليل الكمي لبكر (RT-qPCR) في الوقت الحقيقي باستخدام جهاز PCR الوقت الحقيقي مع مجموعة سيبر RT-قبكر. إضافة 10 ميليلتر من 2 × الإنزيم، 0.8 ميليلتر من التمهيدي إلى الأمام، ميليلتر 0.8 لعكس التمهيدي، ميليلتر 0.4 50 x "الثاني صبغ إشارة روكس"، 2 ميليلتر من قالب كدنا، وخالية من رناسي ح2س حتى إجمالي حجم 20 ميليلتر.
- تشغيل كل عينة في ثلاث نسخ باستخدام المعلمات الحرارية التالية: 30 s في 94 درجة مئوية، تليها دورات 40 من 5 s عند 95 درجة مئوية، و 34 ثانية في 60 درجة مئوية، مع مرحلة نهائية من 15 s عند 95 درجة مئوية، 1 دقيقة في 60 درجة مئوية ، و 15 ثانية عند 95 درجة مئوية. كبسولة تفجير ل RT qPCR مدرجة في الجدول 1. التدبير المنزلي الجينات ب2م و 18s الرنا الريباسي واستخدمت الضوابط الداخلية.
- حساب التغيير إضعاف النسبي على أساس الأسلوب 2-ΔΔCt .
- استخراج مجموع الجيش الملكي النيبالي من أنسجة المخ باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي الريبي.
-
مراقبة الأقسام النسيجي
- بعد التثبيت 24 ساعة مع الفورمالين 10%، إعادة بناء أنسجة المخ الثابتة إلى أحجام مناسبة لقطع الأنسجة في 2-3 مم.
- وضع قطع الأنسجة في كاسيت تضمين وتزج في حل مثبت جديد للجفاف مع dehydrator فراغ تلقائي.
- إخراج الأنسجة الثابتة ويذوي من التتابع في زيادة تركيزات إيثانول (70% و 80%، 95%، 95% و 100%) لمدة 30 دقيقة في كل حل.
- ترانسبارينتيزي العينة مع زيلين نفط لمدة 15 دقيقة، تراجع من البارافين السائل عند 60 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة، ومن ثم تضمين باستخدام جهاز تضمين.
- قطع الأنسجة كتلة المضمنة البارافين إلى شرائح 3 ميكرومتر وتجانب الشريحة على المياه في 45 درجة مئوية ثم الجافة في الهواء.
- احتضان باب 3 ح عند 60 درجة مئوية ووصمة عار haematoxylin وويوزين (أنه) باستخدام أسلوب، وختم ذلك بالصمغ محايدة.
- مراقبة تغييرات نسيجية في الدماغ مع مجهر ضوئي. واستخدم نظام درجات أربع نقاط لتقييم التغييرات النسيجي. استخدام إجراء اختبار مزاوج تي للتحليل الإحصائي.
الازدحام/النزف: غائبا، ونقاط 0؛ مساحة صغيرة من الازدحام المحورية/النزيف، نقاط 1؛ مساحة كبيرة من الازدحام/النزف المحورية، أو مواقع متعددة لمساحة صغيرة من الازدحام المحورية/النزيف، نقاط 2؛ ما يصل إلى ثلاثة مواقع للازدحام تنسيق كبير/النزيف، نقاط 3؛ نزع فتيل احتقان/النزيف، 4 نقاط.
نخر: غائبا، ونقاط 0؛ نخر المحورية، نقاط 1؛ منتشر الحدوث من 1-10 نخرية الخلايا، ونقاط 2؛ نقاط بؤر نخر المتلاقية، 3؛ نخر المتلاقية واسعة النطاق، 4 نقاط.
تسلل خلية التحريضية: غائبا، ونقاط 0؛ نقاط قليلة وتنسيق عمليات التسلل، 1؛ نقاط تسلل البؤر أو تسلل مع تشكيل المجاميع، 2؛ ما يصل إلى ثلاثة مجاميع، نقاط 3؛ وأكثر من أربعة مجاميع، نقاط 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم إجراء تحليل وزارة شؤون المرأة لدراسة تشكيل بيوفيلم تحت ظروف تجريبية. كما هو مبين في الشكل 1، وهناك اختلاف كبير في تشكيل بيوفيلم بين الخلايا العوالق (الشكل 1أ) والدولة بيوفيلم الخلايا (الشكل 1ب). وأظهر تحليل وزارة شؤون المرأة أن البكتيريا بيوفيلم في كتل وطبقات متعددة، وأنهم كانوا المغطى في المصفوفة خارج الخلية، بينما البكتيريا العوالق كانت أقل بكثير من الكثافة ومشتتة أساسا على حدة.
عناصر المصفوفة خارج الخلية للأغشية الحيوية، مثل الحمض النووي، وقادرة على الحصول على استجابات المضيف التحريضية وإنتاج سيتوكين. منذ TLR2 السيتوكينات CCL2، وايل-6، وتنف-α متورطون في الردود التهاب دماغي المتصلة بالتهاب السحايا وفقا للسابقة الدراسات10،،من1120، مرناً تمت مقارنة هذه الجينات المجراة في للفئران المصابة بالخلايا العوالق وأولئك المصابين بخلايا الدولة بيوفيلم. وقد تم ذلك لاستكشاف أثر الأغشية الحيوية على استجابة التهابات في أنسجة المخ مورين. كما هو مبين في الشكل 2، في ح 12 مرحلة ما بعد الإصابة، التعبير عن TLR2، CCL2، إيل-6، وكان أعلى بكثير لخلايا الدولة بيوفيلم مقارنة مع الخلايا العوالق تنف-α من أدمغة الفئران المصابة.
الفئران المصابة بالبكتيريا بيوفيلم علامات أشد قسوة من التهاب السحايا (الموقف الجامد، ترنح أو التشنجات) من المصابين بالبكتيريا العوالق. دراسة نسيجية لانسجة المخ من الفئران المصابة بسلالة الخنزيرية P1/7 أظهرت الازدحام/النزف ونخر، وتسلل خلية التهاب في السحايا، وقشرة الدماغ، والبطينين أو الجملة (الشكل 3) . مقارنة مع الفئران المصابة بالبكتيريا العوالق (الشكل 3ح ه)، في 12 ح ما بعد الإصابة، وأشد وطأة بكثير من التغيرات المرضية وقد لوحظت في أنسجة المخ من الفئران المصابة بالبكتيريا بيوفيلم (الشكل 3ألف-دال)، بما في ذلك مناطق كبيرة من الازدحام/النزف أو نخر أو تسلل خلية التحريضية مكثفة. إجمالي التغييرات المرضية في الدماغ من الفئران المصابة مع العوالق والبكتيريا بيوفيلم تم تسجيلها في الجدول 2. كما لوحظت التغيرات الباثولوجية ولا أعراض عصبية من الفئران حقن مع برنامج تلفزيوني. أخذت معا، هذه البيانات تظهر بوضوح أن الخنزيرية الأغشية الحيوية المساهمة في تنظيم دورات تعريفية لالتهاب السحايا.
الشكل 1: الصور ووزارة شؤون المرأة لسلالة الخلايا العوالق P1/7 وخلايا الدولة بيوفيلم- وكانت البكتيريا المستزرعة في المتوسط THB. وأظهر تحليل وزارة شؤون المرأة أن الخلايا العوالق (A) كانت أقل بكثير من الكثافة ومشتتة أساسا على حدة، بينما بيوفيلم البكتيريا (ب) كانت تتجمع في كتل وطبقات متعددة، وأنهم كانوا المغطى في المصفوفة خارج الخلية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2: الأغشية الحيوية تنشيط التعبير مرناً من CCL2، إيل-6، وتنف-α، و TLR2 في أنسجة المخ الماوس في فيفو. كانت حقن كل ستة بالب/ج الفئران كل مجموعة من خلال الطريق سوباراتشنويدال داخل الجمجمة للعدوى مع 3 × 107 زيمبابوي من العوالق الخلايا أو الخلايا الدولة بيوفيلم. وقد euthanized الفئران في ح 12 مرحلة ما بعد الإصابة. وترد النتائج الحظيرة تغيير التعبير مرناً في الدولة بيوفيلم الفئران المصابة بالخلية مقارنة مع العوالق الفئران المصابة بالخلية. (أ) الجين B2m استخدمت كمرجع الجينات؛ (ب) الجينات 18s الرنا الريباسي كانت تستخدم كالجين مرجع. مزاوج تي-تم استخدام اختبار للتحليل الإحصائي. * * ف ≤0.01، و * ≤0.05 ف. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: التحليل النسيجي لانسجة المخ في الفئران المصابة بسلالة P1/7 العوالق البكتيريا والبكتيريا الدولة بيوفيلم- أ-د، عينات الدماغ من الفئران المصابة بالبكتيريا بيوفيلم الدولة؛ ه-ح، الدماغ العينات المأخوذة من الفئران المصابة بالبكتيريا العوالق. أ ب، وهاء وواو: السحايا وقشرة الدماغ؛ البطينين جيم وزاي:؛ الجملة دال وحاء. Δ، والازدحام/النزيف؛ □، نخر؛ ○: تسلل خلية التحريضية. التكبير = 200 X؛ شريط المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| اسم الدليل | تسلسل (5 '-3') | رمز الجينات |
| إيل-6 إلى الأمام | كتككاتككاجتجككتكت | Il6 |
| عكس إيل-6 | كتككجاكتجتجاجتجتاتاج | Il6 |
| TLR2 إلى الأمام | كاكتاتككجاجتجكاتاتك | Tlr2 |
| TLR2 عكس | جاجاككتجكتجتكتكتاك | Tlr2 |
| CCL2 إلى الأمام | كتكاككتجكتجكتاكتكاتك | Ccl2 |
| CCL2 عكس | أكتاكاجكتكتتججاكاك | Ccl2 |
| تنف-α إلى الأمام | تجتكتاكتكككاجتكتكت | تنف |
| عكس تنف-α | جاجتجاكتتكتككتجتاتج | تنف |
| Β2m إلى الأمام | جتكتتكتجتجكتجتكت | B2m |
| Β2m عكس | تاتجتكجكتكككاتكتك | B2m |
| 18s إلى الأمام | جتاكككجتجاككككات | 18s الرنا الريباسي |
| عكس 18s | ككاتككاتكجتاجتاجكج | 18s الرنا الريباسي |
الجدول 1: كبسولة تفجير ل RT-قبكر-
الجدول 2: إجمالي التغييرات نسيجية في الدماغ من الفئران المصابة مع السويسية سلالة P1/7- واستخدم نظام درجات أربع نقاط لتقييم التغييرات النسيجي، كما هو موضح في البروتوكول مقطع 3.3.7. وتم حساب النتيجة المجموع كمجموع لعشرات من تغييرات نسيجية مختلفة. تم حساب المتوسط كالنقاط/العدد الكلي للفئران. مزاوج تي-تم استخدام اختبار للتحليل الإحصائي. * * ف ≤0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
مسار سوباراتشنويدال داخل الجمجمة الإصابة الموصوفة هنا مزايا واضحة عبر طرق أخرى للعدوى. أنها تسمح للمحققين بدراسة تفاعل البكتيريا المضيفة وتأثير عناصر جرثومية على الاستجابات المناعية المضيف مباشرة في الدماغ، والتي تحاكي مدخل البكتيرية في الجهاز العصبي المركزي. وهكذا، يمكن توسيع هذا الطريق للعدوى للتحقيق وآليات لالتهاب السحايا الناجم عن بكتيريا أخرى. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أيضا استخدامه لاختبار فعالية العقاقير المضادة لالتهاب السحايا الجرثومي.
وللحصول على نتائج جيدة باستخدام هذا النموذج، تكون الخطوات الحاسمة التالية صراحة. تشكيل بيوفيلم يحتاج إلى دراسة ظروف تجريبية. في هذه الدراسة، فإنه تم بحث استخدام تحليل المسح الإلكتروني المجهري. يمكن أيضا استخدام أساليب أخرى لبحث تشكيل بيوفيلم، مثل زراعة الأنسجة لوحة الأسلوب أسلوب وأنبوب21. يوم واحد قبل الإصابة، مختبرين العوالق الخلايا والخلايا بيوفيلم الدولة تحتاج إلى يكون مذاب من-80 درجة مئوية لتحديد في زيمبابوي. في اليوم التالي، ينبغي أن تضعف البكتيريا إلى الجرعة المناسبة وفقا لزيمبابوى للعدوى. ينبغي أن يحمل مجموعة مراقبة العدوى وهمية حقن مع احتياجات برنامج تلفزيوني لإدراجها والفئران من مجموعة مراقبة العدوى وهمية لا مظاهرة خلال مدة التجربة العدوى. سلالات مختلفة قد الجرعات المعدية المختلفة، لذا ينصح بشدة بتجربة أولية لتحديد الجرعة المعدية المناسبة. واستخدمت جرعة مقدارها 3 × 107 زيمبابوي للإصابة في هذه الدراسة، استناداً إلى تجربتنا الأولى. هذه الجرعة من البكتيريا بيوفيلم كان قادراً على حمل علامات شديدة من الالتهاب السحائي والموت لاحقة في الفئران 5 كل 48 ساعة بعد الإصابة في التجربة الأولى.
انقطاع الدم في الدماغ أو الدم أو الحواجز السوائل الخنزيرية خطوة هامة في التسبب في التهاب السحايا22،،من2324. مسار سوباراتشنويدال داخل الجمجمة العدوى ليست مناسبة لتقييم قدرة الخنزيرية على اختراق هذه الحواجز. يمكن استخدام طرق أخرى للإصابة، مثل القائمة، ورابعاً، أو i.n.، لتحقيق هذا الهدف.
هنا، نحن يثبت أولاً أن بيوفيلم الخنزيرية يسهم في تنظيم دورات تعريفية لاستخدام توجيه سوباراتشنويدال داخل الجمجمة للإصابة بالتهاب السحايا. هذا النموذج الإصابة ليس فقط يساعد على زيادة فهم آليات الالتهاب السحائي الخنزيرية بل هو أيضا مناسبة لدراسة الآلية المرضية لالتهاب السحايا الناجم عن بكتيريا أخرى ونجاعة أدوية جديدة لمكافحة التهاب السحايا الجرثومي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
أيد هذا العمل منح من البحوث الرئيسية الوطنية وبرنامج التنمية في الصين [2017YFD0500102]؛ المؤسسة الوطنية للعلوم الطبيعية من الصين [31572544]؛ الدولة الرئيسية مختبر بيولوجيا مسببا البيطرية [SKLVEB2016KFKT005]؛ الزراعة شانغهاي تطبق تكنولوجيا تطوير البرنامج، الصين [G2016060201].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
- Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen? Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
- Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45 (2014).
- Kerdsin, A., et al. Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).
- Hatrongjit, R., et al. First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand. BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).
- Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis. Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).
- Isiaku, A. I., et al. Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish. Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).
- Oggioni, M. R., et al. Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).
- Xiao, G., et al. Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model. Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).
- Seitz, M., et al. A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2. Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).
- Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).
- Williams, A. E., Blakemore, W. F. Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).
- Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection. Pathogens. 5 (3), (2016).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiology. 4, 36 (2004).
- Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs. Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).
- Holden, M. T., et al. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis. PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).
- Dominguez-Punaro Mde, L., et al. In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis. Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).
- Hassan, A., et al. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).
- Vanier, G., et al. New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).
- Takeuchi, D., et al. The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis. Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).
