Summary
여기, 우리 구 이렇게 뵙 수 막 염에 biofilms의 역할을 공부 하는 쥐에 감염 intracranial subarachnoidal 경로 설명 합니다. 이 감염 모델은 또한 다른 세균성 수 막 염의 병 인 세균성 수 막 염에 대 한 새로운 약물의 효능을 연구 하 고 적합 합니다.
Abstract
구 이렇게 뵙 는 전세계 돼지의 주요 세균성 병원 체 뿐만 아니라 신흥 동물 매개 대리인입니다. 인간과 돼지, 뇌 막 염에서는 S. 이렇게 뵙 감염의 주요 징후입니다. 적당 한 감염 모델 병원 균으로 인 한 질병의 메커니즘을 이해 하는 필수적인 도구입니다. 마우스 감염의 여러 노선 S. 이렇게 뵙 감염의 병 인 연구 개발 되었습니다. 그러나, 감염의 복, intranasal, 그리고 정 맥 노선 공부 biofilms에서 기질 등 뇌에 직접 뇌 막 염에 S. 이렇게 뵙 표면 구성 요소의 역할에 대 한 적합 하지 않습니다. Intracisternal 접종 S. 이렇게 뵙 감염에 대 한 사용 되었습니다, 하지만 정밀 사출 사이트 설명 하지 하고있다. 여기, 감염 intracranial subarachnoidal 경로 S. 이렇게 뵙 수 막 염에 biofilms의 역할을 조사 하기 위해 마우스 모델에서 설명 했다. S. 이렇게 뵙 planktonic 셀 또는 biofilm 상태 셀 직접 3.5 m m는 bregma에서 rostral 위치한 사출 사이트를 통해 쥐의 거미 막 밑 공간에 주입 했다. Histopathological 분석 및 증가 mRNA TLR2의 표현과 biofilm 상태 셀을 주사 하는 생쥐에서 뇌 조직의 cytokines 명확 하 게 표시 S. 이렇게 뵙 biofilm S. 이렇게 뵙 수 막 염에 확실 한 역할을 합니다. 이 감염 경로 감염, 호스트-박테리아 상호 작용의 연구를 수의 다른 경로 통한 확실 한 장점이 있습니다. 그것은 평가, 뇌에 직접 호스트 면역 반응에 세균성 구성의 효과 허용 하는 또한, 그리고 중앙 신경 조직에 세균 입구를 모방. 감염의이 경로 다른 박테리아에 의해 발생 하는 뇌 막 염의 메커니즘을 조사에 대 한 확장할 수 있습니다. 또한, 그것은 또한 세균성 수 막 염에 대 한 약물의 효능을 테스트를 사용할 수 있습니다.
Introduction
이렇게 뵙 구 (S. 이렇게 뵙)은 수 막 염, 폐 렴, septicaemia, 심장 내 막 염, 관절염1등 심각한 질병을 일으키는 돼지, 전세계의 주요 세균성 병원 체 이다. 그것은 또한 새로운 동물 매개 대리인입니다. 지금까지, 그것은 9 serotypes 인간, 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24, 그리고 31 serotypes2,,34를 포함 하 여 감염을 일으킬 수 보고 되었습니다. 인간과 돼지, 뇌 막 염에서는 S. 이렇게 뵙 감염의 주요 임상 증상 중 하나입니다. 베트남, 태국, S. 이렇게 뵙 는 어른5에 수 막 염의 주요 원인입니다. 미생물 biofilms는 미생물을 서로 게 고착 하 고 집중 인터페이스; 그들은 세균 독성, 다양 한 환경에 항생제 저항5생존에 필수적입니다. Biofilms는 일반적으로 일반적으로 포함 하는 다 당 류, 단백질과 DNA6세포 외 매트릭스 둘러싸여 있습니다. 후자는 호스트 염증 성 반응과 cytokine 생산7유도 수 있습니다. Biofilm 형성은 이전 연구에서 연쇄 구 균 수 막 염에서 포함 되기 위하여 알려졌다. Biofilms는 연쇄 상 구 균 agalactiae 염 tilapia 물고기 모델에 기여할 biofilm 형성 뇌 조직 내에서 공개 되었습니다 하 고 meningeal 주위 vivo에서 내부 복 부 접종8표면. 수 막 염, 중 연쇄 상 구 균 균 biofilm 같은 상태 이며 이러한 biofilm 상태에 박테리아 했다 마우스 감염 모델9에 수 막 염 유도에 더 효과적. 또한 우리의 이전 연구, 생존 분석10여 세균 독성에 기여 하는 S. 이렇게 뵙 마우스 뇌에서와 관련 된 biofilm 상태. 그러나, S. 이렇게 뵙 수 막 염에서 biofilm 참여에 대 한 직접 증거 조사 더 필요합니다.
S. 이렇게 뵙 감염의 동물 모델에서 마우스 복 (i.p.)11, intranasal (i.n.)12, 정 맥 (i.v.)13및 감염14, intracisternal (i.c.) 경로 사용 하 여 개발 되어 15 , 그러나 16., 감염의 i.p., i.n., 및 i.v. 노선 표면 구성 요소 S. 이렇게 뵙 는 뇌에 직접 뇌 막 염의 역할을 공부 하 고 적합 하지 않습니다. Biofilms에서 세포 외 기질 포함 됩니다. I.c. 접종 S. 이렇게 뵙 감염을 위해 사용 되었다, 비록 정확한 주사 부 하지 그 논문에서 설명 하고있다. 반면, stereotaxic 좌표 intracranial subarachnoidal 접종에 대 한 사출 사이트의 명확 하 게 이전 연구17에서 설명 하고있다. 이 접종 점과 더 단순한 실험 프로토콜의 쉽게 인식 허용. 또한, 감염 intracranial subarachnoidal 경로 sinuses 또는 중간 귀17, 그리고 중간 귀 및 S. 이렇게 뵙 로 인 한 수 막 염의 관계에서 중앙 신경 조직에 세균 입구를 모방 매드 슨 외18에 의해 증명 되었습니다. 또한, 마우스에서 감염 intracranial subarachnoidal 경로 적용 하 여 우리 시연 S. 이렇게 뵙 작은 RNA rss04 우리의 이전 연구10에 수 막 염에 기여 한다.
현재에서 연구, 감염 intracranial subarachnoidal 경로 S. 이렇게 뵙 수 막 염에 biofilms의 역할을 조사 하기 위해 쥐에 사용 되었다. 마우스 감염의이 경로 의해 planktonic 셀 또는 biofilm 상태 셀 S. 이렇게 뵙 의 감염 되었다. Histopathological 분석 및 TLR2 biofilm 상태 세포를 주입 하는 쥐의 뇌 조직에서 cytokines의 증가 mRNA 표현 명확 하 게 표시 S. 이렇게 뵙 biofilm 수 막 염에 기여.
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Protocol
마우스 감염 실험 했다는 실험실 동물 모니터링 위원회의 장쑤 성, 중국에 의해 승인 및 실험 동물 센터의 난징 농업 대학교에서 수행 (허가 번호: SYXK (Su) 2017-0007).
1입니다. 박테리아의 준비
참고: S. 이렇게 뵙 serotype 2 악성 긴장 P1/7 수 막 염19병에 걸린 돼지 로부터 격리 했다. 스트레인 P1/7 토 드-휴이 트 국물에서 성장 했다 (THB, THB의 리터 당 수식: 심장 주입, 3.1 g, neopeptone, 20.0 g, 포도 당, 2.0 g, 염화 나트륨, 2.0 g; disodium 인산 염, 0.4 g, 나트륨 탄산염, 2.5 g)와 한 천 토 드-휴이 트 (THA, 리터 당 수식에 도금 그쪽으로: 심장 주입, 3.1 g; neopeptone, 20.0 g; 포도 당, 2.0 g; 염화 나트륨 2.0 g; disodium 인산 염, 0.4 g; 탄산 나트륨 2.5 g; 한 천, 15.0 g) 37 ° C, 5% CO2.
- 컬렉션의 스트레인 P1/7 planktonic 셀
- 중간 로그 단계 문화에서 planktonic 셀의 5 mL을 수집 (OD600= 0.6), 8000 × g에서 3 분 동안 원심 및 다음 PBS로 3 회 세척.
- 셀 5 튜브, aliquot THB에서 25% 글리세롤의 5 mL을 resuspend 하 고-80 ° c.에 저장
- 컬렉션의 스트레인 P1/7 biofilm 상태 셀
- 20 mL의 숙박 문화를가지고 고 신선한 THB;의 180 mL에 추가 10 라운드 배양 배지로 희석된 문화를 동등 하 게, 분한 다음 24 h에 대 한 5% CO2 에서 37 ° C에서 인큐베이터에 접시를 넣어.
- 부 화, 후 접시 resuspend은 접시를 준수 하지 박테리아를 부드럽게 흔들어 고 다음는 상쾌한 포부에 의해 무시.
참고: 접시를 부드럽게 흔들어 하 고 resuspending는 앙금을 피하십시오. - Biofilm 상태 셀을 수확, 퇴적 물을 완전히, resuspend 다음 새로운 튜브에 샘플을 전송 하는 PBS의 5 mL를 추가 합니다.
- 다음 매개 변수는 마지막 단계에서 biofilm 상태 셀 sonicate: 60 W, 4 사이클 5 s 오프 및 10 s.
- 8000 × g에서 3 분 centrifuge 고-80 ° c.에 상쾌한 저장
참고:는 상쾌한 biofilm 구성 요소를 포함할 수 있습니다 그리고 동물 실험 (3 단계)에 설명 된 대로 감염 전에 biofilm 박테리아 resuspend를 사용할 수 있습니다. - THB에 10 mL 25% 글리세롤과 앙금을 resuspend 하 고-80 ° c.에 biofilm 상태 셀을 저장
2. 스캐닝 전자 현미경 (SEM) 분석
- 수집 된 biofilm 상태 셀과 planktonic 셀 4 ° c.에 12-24 h에 대 한 4 %paraformaldehyde 사용 하 여 수정
- 증류수와 신속 하 게 샘플을 헹 구 고 탈수 순차적으로 30 분 각 솔루션에 대 한 에탄올 (25%, 50%, 70%, 90%, 및 100%)의 증가 농도와 샘플.
- 더블 양면 테이프와 홀더를 금속 금과 팔라듐으로 증발 기에서 마지막으로 코트 그들 말린된 샘플을 준수 합니다.
- 다음 매개 변수를 사용 하 여 스캐닝 전자 현미경에 의해 샘플을 관찰: EHT (여분 고전압) = 10 kV; WD (작동 거리) = 7.0 또는 8.0 m m; 확대 = 5000 ×; A 신호 SE1 =.
3. 동물 실험
- SPF 6 주 오래 된을 사용 하 여이 연구에서 여성 BALB/c 마우스. 그 주사 부는 있는 3.5 m m는 bregma에서 rostral 감염의 intracranial subarachnoidal 경로 통해 모든 쥐를 감염. 사출 사이트의 stereotaxic 좌표 Chiavolini 외17에 의해 명확 하 게 설명 했다.
- Histopathological 분석, 대 한 감염 쥐 (그룹 당 5 쥐)의 2 개 그룹 planktonic 셀 또는 biofilm를 사용 하 여 상태 세포 3 × 107 콜로 니 형성 단위 (CFU)의 복용량에 그리고 또 다른 5 마우스 컨트롤 PBS를 주입 했다.
- TLR2 및 두뇌에서 cytokines의 mRNA 표현의 검색 감염 쥐 (그룹 당 6 쥐)의 두 개의 추가 그룹에 대 한 3 × 107 CFU의 복용량에 상태 세포 planktonic 셀 또는 biofilm를 사용 하 여.
- 그쪽으로에 직렬 희석을 도금 하 여 실행 가능한 박테리아의 수를 결정 합니다.
- 추가 연구에 대 한 감염 된 후 12 h에서 모든 마우스 안락사
참고: 재고 매체에 글리세롤 감염 하기 전에 제거 되어야 합니다. Planktonic 전지와 biofilm 상태 셀-80 ° C에서 복구 PBS로 3 회를 씻어 있습니다. Planktonic 세포는 PBS를 가진 resuspended 그리고 감염;에 대 한 적절 한 복용량을 희석 biofilm 상태 셀 (1.2.5 단계)에서 저장 된 상쾌한와 함께 resuspended 고 감염에 대 한 적절 한 복용량을 희석. 감염에 대 한 볼륨 50 µ L 해서는 안됩니다.
- 뇌 조직에서 TLR2 및 cytokines의 mRNA 표현 검색
- 뇌 조직의 RNA 추출 키트를 사용 하 여에서 총 RNA를 추출 합니다.
- 각 마우스에 대 한 전체 뇌 조직의 RNA를 추출 하기 위한 사용 합니다. 전체 뇌 조직을 5 튜브 나눕니다. 100mg 뇌 조직에 차지 하 고 키트에 의해 제공 lysing 매트릭스를 포함 하는 각 관에 세포 솔루션의 1 mL를 추가 합니다.
- 40 대 한 균질 화기에 튜브를 처리 6.0, 그리고 원심 분리기 튜브 12000 × g와 4 ° C에서 5 분에 대 한 설정에서 s.
- 원심, 후 위 단계는 새로운 microcentrifuge 튜브 전송.
- 실내 온도;에 5 분에 대 한 전송된 샘플을 품 어 클로 프롬, 10에 대 한 소용돌이의 300 µ L 추가 s, 다음 실 온에서 5 분 동안 품 어 고.
- 12000 ×에서 튜브 원심 g 및 4 ° C 5 분에 대 한 새로운 튜브에 위 단계를 전송.
- 5 시간 동안 그것을 반전 하기 전에 튜브를 감기 절대 에탄올의 500 µ L을 추가 하 고 적어도 1 시간 동안-20 ° C에서 샘플을 저장.
- 12000 ×에서 튜브 원심 g와 15 분 및 제거는 상쾌한 4 ° C. RNase 무료 H2o. 찬 75% 에탄올 500 µ L와 펠 릿을 세척
- 제거는 에탄올, 공기 건조 실 온, RNase 무료 H2o.의 100 µ L에서 resuspend RNA에서 5 분 동안 펠 릿
- 실 온에서 5 분 동안 RNA를 품 어 고 RNA bioanalyzer를 사용 하 여 RNA 농도 결정 합니다.
- CDNA 합성을 한 thermocycler 반전 녹음 방송 (RT) 시 약 키트와 함께 사용 하 여 게놈 DNA (gDNA)의 제거를 포함 하 여 수행 합니다.
- RNA의 1 µ g는 튜브 포함 2 µ L 5 x gDNA 제거 버퍼의, 1 µ L gDNA 제거 효소, RNase 무료 H2O의 때까지 추가 볼륨 도달 10 µ L. Incubate 42 ° c.에서 2 분
- 믹스 마스터의 10 µ L을 추가 (RT 효소의 1 µ L 믹스 나, RT 뇌관 믹스의 1 µ L, 버퍼 2, x 5의 4 µ L 및 RNase 무료 H2O 4 µ L) 마지막에서 반응 솔루션 단계 및 다음 부드럽게 섞는다. RT 반응으로 즉시 진행: 37 ° C 15 분 그리고 85 ° C 5에 대 한 s.
- SYBR 실시간 정량 Pcr 키트와 함께 실시간 PCR 기계를 사용 하 여 실시간 정량 PCR (RT-정량) 분석을 수행. 20 µ L의 총 볼륨까지 효소 x 2의 10 µ L, 앞으로 뇌관, 역방향 뇌관의 0.8 µ L, 0.4 µ L를 이용한 참조 염료 II x 50의,의 cDNA 템플릿과 RNase 무료 H2O 2 µ L의 0.8 µ L를 추가 합니다.
- 다음 열 매개 변수를 사용 하 여 3 중에서 각 샘플을 실행: 30 94 ° c s 5의 40 주기 다음 95 ° c, s 및 34 s 15의 마지막 단계와 60 ° C에서 95 ° C, 60 ° C에서 1 분에 그리고 15 s 95 ° c.에 실시간 정량 Pcr를 위한 뇌관은 표 1에 나열 됩니다. 하우스키핑 유전자 B2m 및 18s rRNA 내부 제어로 사용 되었다.
- 2-ΔΔCt 방법에 따라 상대 겹 변경을 계산 합니다.
- 뇌 조직의 RNA 추출 키트를 사용 하 여에서 총 RNA를 추출 합니다.
-
조직학 단면도의 관찰
- 24 시간 10% 포 르 말린으로 고정, 후 조직 조각 2-3 m m에서의 적절 한 크기로 고정된 뇌 조직을 재구성 합니다.
- 조직 조각을 포함 카세트에 넣고 자동 진공 탈수로 탈수에 대 한 새로운 통 솔루션에 몰두.
- 고정된 조직에 밖으로가 고 각 솔루션에서 30 분 (70%, 80%, 95%, 95%, 및 100%) 에탄올의 농도 증가에 순차적으로 탈수.
- 15 분 동안 크 실 렌과 샘플을 transparentize 하 고 90 분 동안 60 ° C에 액체 파라핀에 찍어 후 포함 기계를 사용 하 여 포함.
- 파라핀 블록 포함 조직 3 µ m 조각으로 잘라, 45 ° C에서 물에 조각 타일 그리고 공기에서 건조.
- 60 ° C에서 3 h에 대 한 섹션을 품 어, haematoxylin 및 오신 (그)를 사용 하 여 메서드, 얼룩 그리고 중립 껌 함께 인감.
- 광학 현미경으로는 뇌의 histopathological 변화를 관찰 합니다. 4-포인트 그레이 딩 시스템 조직학 변화를 평가 하기 위해 사용 되었다. 짝이 없는 t 테스트를 사용 하 여 통계 분석을 위해.
혼잡/출혈: 결 석, 점수 0; 초점 혼잡/출혈의 작은 영역 점수 1; 초점 혼잡/출혈의 넓은 지역 또는 초점 혼잡/출혈의 작은 지역의 여러 사이트 점수 2; 3 개 큰 초점 혼잡/출혈 사이트까지 점수 3; 혼잡/출혈 확산, 4 점수.
괴 사: 결 석, 점수 0; 초점 괴 사 점수 1; 1-10 회 저 성 세포의 발생을 확산, 점수 2; confluent 괴 사의 foci 점수 3; 광범위 한 confluent 괴 사, 4 점수.
선 동적인 세포 침투: 결 석, 점수 0; 몇 고 초점 침입, 점수 1; 다 초점 침투 또는 집계의 형성으로 침입 점수 2; 3 집계까지 점수 3; 그리고 더 이상의 집계 점수 4.
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Representative Results
SEM 분석 실험 조건에서 biofilm 형성 검사를 수행 했습니다. 그림 1에서 보듯이 planktonic 세포 (그림 1A)와 biofilm 주 세포 (그림 1B) 사이의 biofilm 형성에 상당한 차이가 있다. SEM 분석 biofilm 박테리아 덩어리에 있던 여러 레이어와 그들은 쌌 다 했다 기질, 동안 planktonic 박테리아 훨씬 조밀 하 고 주로 분산 개별적으로 보여주었습니다.
Biofilms, DNA 등의 세포 외 매트릭스의 구성 요소 호스트 염증 성 반응과 사이토카인 생산을 유도 할 수 있습니다. TLR2 cytokines CCL2 이후, 일리노이-6와 TNF-α 대뇌 염증 응답 이전 연구10,,1120,이 유전자의 표현 비교 되었다 mRNA에 따라 뇌 막 염에 관련 된 에에서 관련 된 vivo에서 planktonic 세포로 감염 된 쥐과 그 감염 된 biofilm 상태 셀에 대 한. 이 murine 뇌 조직에서 염증 반응에 biofilms의 효과 탐험 하 고 이루어졌다. 같이 그림 2, 감염 된 후 12 h에 TLR2, CCL2, 표현 일리노이-6와 TNF-α 감염 된 쥐의 두뇌에서 biofilm 상태 셀 planktonic 셀에 비해 크게 높았다.
Biofilm 박테리아로 감염 된 쥐 보다 planktonic 박테리아 감염 수 막 염 (경직 된 자세, 운동 실 조, 또는 경련)의 훨씬 더 심각한 징후를 보였다. P1/7 meninges, 대뇌 피 질, 뇌 실, 또는 diencephalon (그림 3)에 혼잡/출혈, 괴 사, 그리고 선 동적인 세포 침투 했다 S. 이렇게 뵙 긴장으로 감염 된 쥐에서 뇌 조직의 조직학 검사 . 12 h biofilm 박테리아 (그림 3A D), 감염 된 쥐에서 뇌 조직에 감염 된 후, 훨씬 더 심각한 병 적인 변화가 관찰 되었다 planktonic 박테리아 (그림 3E-H), 감염 된 쥐와 비교 혼잡/출혈, 괴 사, 또는 강렬한 선 동적인 세포 침투의 넓은 영역을 포함 하 여. 쥐에서 뇌에 심한 병 적인 변화 planktonic 감염 그리고 biofilm 박테리아는 표 2에 기록 되었다. 학적 변화 없고 신경학 상 증 후는 PBS를 주입 하는 쥐에서 관찰 되었다. 함께 찍은, 이러한 데이터 명확 하 게 보여준다 S. 이렇게 뵙 biofilms의 수 막 염 유도에 기여
그림 1: 의 SEM 이미지 변형 P1/7 planktonic 셀과 biofilm 상태 셀. 박테리아는 THB 매체에 교양 있었다. SEM 분석을 보여주었다는 planktonic 셀 (A) 매우 보다 적게 조밀 하 고 주로 분산 개별적으로, biofilm 박테리아 (B) 덩어리에 클러스터 된 하는 동안 여러 레이어와 그들은 세포 외 매트릭스에 쌌 다 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: Biofilms 활성화 mRNA 표현의 CCL2, 일리노이-6, TNF-α와 TLR2 마우스 뇌 조직에서 vivo에서. 그룹 당 6 BALB/c 마우스 각 planktonic 셀 또는 biofilm 상태 셀의 3 × 107 CFU 감염의 intracranial subarachnoidal 경로 통해 주입 했다. 마우스 감염 된 후 12 h에서 안락사 되었다. 결과 배 세포에 감염 쥐 planktonic 세포에 감염 된 쥐와 비교 하는 biofilm 주에서 mRNA 표현의 변경 되 게 됩니다. (A) 유전자 B2m 참조 유전자;로 사용 (B) 유전자 18s rRNA 참조 유전자로 사용 되었다. 짝이 없는 t-테스트 통계 분석을 위해 사용 되었다. * * p ≤0.01와 * p 0.05. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 스트레인 P1/7 감염 쥐의 뇌 조직의 조직학 분석 planktonic 박테리아와 biofilm 상태 박테리아. A-D, biofilm 상태 박테리아; 감염 쥐에서 뇌 샘플 E-H, planktonic 박테리아로 감염 된 쥐에서 뇌 샘플. A, B, E 및 f: meninges과 대뇌 피 질; C와 g: 심; D와 h: diencephalon입니다. Δ, 혼잡/출혈; □, 괴 사; ○: 선 동적인 세포 침투. 확대 = 200 X; 눈금 막대 = 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 뇌관 이름 | 시퀀스 (5'-3') | 유전자 기호 |
| 일리노이-6 앞으로 | CTTCCATCCAGTTGCCTTCT | Il6 |
| 일리노이-6 역 | CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG | Il6 |
| TLR2 앞으로 | CACTATCCGGAGGTTGCATATC | Tlr2 |
| TLR2 역 | GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC | Tlr2 |
| 앞으로 CCL2 | CTCACCTGCTGCTACTCATTC | Ccl2 |
| CCL2 역 | ACTACAGCTTCTTTGGGACAC | Ccl2 |
| 앞으로 TNF-α | TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT | Tnf |
| TNF-α 역 | GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG | Tnf |
| Β2m 앞으로 | GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT | B2m |
| Β2m 역 | TATGTTCGGCTTCCCATTCTC | B2m |
| 18 앞으로 | GTAACCCGTTGAACCCCATT | 18s rRNA |
| 18 역 | CCATCCAATCGGTAGTAGCG | 18s rRNA |
표 1: 실시간 정량 Pcr를 위한 뇌관.
표 2: 감염 된 쥐에서 뇌에 총 histopathological 변경 S. 이렇게 뵙 변형 P1/7. 4-포인트 그레이 딩 시스템 프로토콜 3.3.7 섹션에에서 설명 된 대로 조직학 변화를 평가 하기 위해 사용 되었다. 총 점수는 histopathological 변화에서 점수의 합으로 계산 되었다. 평균은 마우스의 총 점수/수로 계산 됩니다. 짝이 없는 t-테스트 통계 분석을 위해 사용 되었다. * * p ≤0.01입니다.
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Discussion
여기서 설명 하는 감염 intracranial subarachnoidal 경로 감염의 다른 경로 통한 확실 한 장점이 있습니다. 호스트-박테리아 상호 작용 및 중앙 신경 조직에 세균 입구를 모방 하는 뇌에 직접 호스트 면역 응답에 세균성 구성의 효과 연구 조사 수 있습니다. 따라서,이 감염 경로 조사 다른 박테리아에 의해 발생 하는 뇌 막 염의 메커니즘에 대 한 확장할 수 있습니다. 또한, 그것은 또한 세균성 수 막 염에 대 한 약물의 효능을 테스트를 사용할 수 있습니다.
이 모델을 사용 하 여 좋은 결과 얻으려면 다음 중요 한 단계는 명시적. Biofilm 형성 실험 조건 하에서 시험 될 필요가 있다. 현재의 연구에서는 그것은 스캐닝 전자 현미경 분석을 사용 하 여 시험 되었다. 조직 문화 접시 방법 및 튜브 방법21와 같은 다른 방법 또한 biofilm 형성 검사를 사용할 수 있습니다. 감염, 전에 1 일 planktonic 셀과 biofilm 상태 셀의 aliquots CFU 결정-80 ° C에서 해 동 될 필요가 있다. 다음 날, 박테리아 감염에 대 한 CFU에 따라 적절 한 복용량에 희석 한다. 포함 되도록 PBS 요구와 모의 감염 제어 그룹에서 마우스 주입 모의 감염 제어 그룹 감염 실험 기간 동안 아무 발현을 전시 한다. 적절 한 감염 복용량을 결정 하는 예비 실험이 좋습니다 그래서 다른 긴장 다른 전염 성 접종 할 수 있습니다. 현재 연구에서 3 × 107 CFU 감염에 대 한 복용량은 우리의 예비 실험에 따라 사용 되었다. 이 복용량 biofilm 박테리아의 수 막 염 및 예비 실험에서 감염 후 모든 5 쥐 48 h에에서 후속 죽음의 심각한 표시를 유도 수 있었습니다.
혈액 또는 혈액 cerebrospinal 유체 장벽을 S. 이렇게 뵙 여의 장애는 원인 수 막 염22,,2324에 중요 한 단계입니다. 감염 intracranial subarachnoidal 경로 이러한 장벽을 돌파 S. 이렇게 뵙 수 평가 적합 합니다. 이 목표를 달성 하기 위해 감염, i.p., i.v., i.n., 등의 다른 경로 사용할 수 있습니다.
여기, 우리가 먼저 S. 이렇게 뵙 biofilm 수 막 염 감염 intracranial subarachnoidal 경로 사용 하 여 유도에 기여를 보여줍니다. 이 감염 모델 추가 S. 이렇게 뵙 수 막 염의 메커니즘을 이해 하는 데 도움이 뿐만 아니라 또한 다른 박테리아와 세균성 수 막 염에 대 한 새로운 약물의 효능에 의해 발생 하는 뇌 막 염의 병 인을 공부를 위해 적당 하다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품은 국가 주요 연구 및 개발 프로그램의 중국 [2017YFD0500102];에서 교부 금에 의해 지원 되었다 [31572544]; 중국의 국가 자연과학 기초 수의 Etiological 생물학 [SKLVEB2016KFKT005]; 주 키 연구실 상하이 농업 기술 개발 프로그램, 중국 [G2016060201] 적용.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
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