Summary
Her, beskriver vi ruten intrakranielle subarachnoidal af infektion i mus at studere roller af biofilm i Streptococcus suis meningitis. Denne infektion model er også velegnet til at studere patogenesen af andre bakteriel meningitis og effekten af nye lægemidler mod bakteriel meningitis.
Abstract
Streptococcus suis er ikke kun en stor bakteriel patogen svin på verdensplan, men også en spirende zoonotisk agens. Hos mennesker og grise er meningitis en større manifestation af S. suis infektioner. En egnet infektion model er et vigtigt redskab til at forstå mekanismerne af sygdomme forårsaget af patogener. Flere ruter af infektion i mus er blevet udviklet for at studere patogenesen af S. suis infektion. Ruterne intraperitoneal, intranasal og intravenøs infektion er dog ikke velegnet til at studere roller S. suis overflade komponenter i meningitis direkte i hjernen, såsom den ekstracellulære matrix fra biofilm. Selvom intracisternal podning har været brugt til S. suis infektion, præcise injektionsstedet ikke er blevet beskrevet. Her, blev intrakraniel subarachnoidal rute af infektion beskrevet i en musemodel at undersøge roller af biofilm i S. suis meningitis. S. suis planktoniske celler eller biofilm stat celler blev direkte sprøjtet ind i subaraknoid rummet af mus gennem injektionsstedet beliggende 3,5 mm rostralt fra bregma. Histopatologisk analyse og øget mRNA udtryk af TLR2 og cytokiner af hjernevæv fra musene injiceret med biofilm stat celler tydeligt angivet, S. suis biofilm spiller endelige roller i S. suis meningitis. Denne rute af infektion har åbenlyse fordele i forhold til andre ruter af infektion, giver mulighed for undersøgelse af vært-bakterien interaktionen. Desuden, det tillader bakteriel komponenter indvirkning på værten immunrespons direkte i hjernen til at blive vurderet, og efterligner bakteriel indgangen i det centrale nervesystem. Denne rute af infektion kan udvides for at undersøge mekanismerne af meningitis forårsaget af andre bakterier. Det kan desuden også bruges til at teste effekten af lægemidler mod bakteriel meningitis.
Introduction
Streptococcus suis (S. suis) er en større bakteriel patogen svin på verdensplan, forårsager alvorlige sygdomme herunder meningitis, lungebetændelse, septikæmi, endocarditis, og gigt1. Det er også en spirende zoonotisk agens. Hidtil er blevet rapporteret, at ni serotyper kan forårsage infektion hos mennesker, herunder serotyper 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 og 312,3,4. Hos mennesker og grise er meningitis en af de store kliniske tegn på S. suis infektioner. I Vietnam og Thailand er S. suis den største årsag til meningitis hos voksne5. Mikrobielle biofilm er mikroorganismer, som holde sig til hinanden og er koncentreret på en grænseflade; de er uundværlige for bakteriel virulens, overlevelse i forskellige miljøer og antibiotikaresistens5. Biofilm er typisk omgivet af en ekstracellulære matrix, der generelt indeholder polysaccharider, proteiner og DNA6. Sidstnævnte er i stand til at fremkalde vært inflammatoriske respons og cytokin produktion7. Biofilmdannelse er blevet rapporteret at være involveret i streptokok meningitis i tidligere undersøgelser. Biofilm bidrager til Streptococcus agalactiae meningitis i en tilapia fisk model og Biofilmdannelse er blevet afsløret i hjernen væv og omkring meningeal overflader i vivo gennem intra-abdominal podning8. Under meningitis, Streptococcus pneumoniae er i en biofilm-lignende tilstand og bakterier i en biofilm situation var mere effektiv i inducerende meningitis i en mus infektion model9. Desuden, i vores tidligere undersøgelse, biofilm staten forbundet med S. suis i mus hjernen bidrager til bakteriel virulens af overlevelse analyse10. Dog kræver direkte beviser for biofilm inddragelse i S. suis meningitis yderligere undersøgelser.
S. suis infektion-dyremodeller er blevet udviklet i mus bruger intraperitoneal (i.p.)11, intranasal (i.n.)12, intravenøs (IV)13, og intracisternal (IC) ruterne af infektion14, 15 , 16. i.p., i.n. og i.v. ruterne af infektion er dog ikke velegnet til at studere roller S. suis overflade komponenter i meningitis direkte i hjernen. Disse omfatter ekstracellulære matrix fra biofilm. Selv om IC inokulation blev brugt til S. suis infektion, er præcise injektionsstedet ikke blevet beskrevet i disse papirer. Derimod stereotaxisk koordinaterne for injektionsstedet til intrakraniel subarachnoidal podning er klart blevet beskrevet i en tidligere undersøgelse17. Dette gav let anerkendelse af punktet, podning og mere forsimplede forsøgsplan. Derudover efterligner ruten intrakranielle subarachnoidal af infektion bakteriel indgangen til centralnervesystemet fra bihulerne eller mellemøret17og forholdet mellem mellemøret og meningitis forårsaget af S. suis er blevet påvist ved Madsen mfl18. Derudover anvender ruten intrakranielle subarachnoidal infektion hos mus, har vi vist, at S. suis små RNA rss04 bidrager til meningitis i vores tidligere undersøgelse10.
I nuværende undersøgelse, intrakraniel subarachnoidal rute af infektion blev brugt i mus til at undersøge roller af biofilm i S. suis meningitis. Mus blev smittet med planktoniske celler eller biofilm stat celler af S. suis ad denne vej af infektion. Histopatologisk analyse og øget mRNA udtryk af TLR2 og cytokiner fra hjernevæv af musene injiceret med biofilm stat celler tydeligt angivet, S. suis biofilm bidrager til meningitis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Musen infektion eksperimenter blev godkendt af det laboratorium dyr overvågning Udvalget af Jiangsu-provinsen, Kina og udført i Laboratory Animal Center af Nanjing Landbohøjskole (autorisationsnummer: SYXK (Su) 2017-0007).
1. forberedelse af bakterier
Bemærk: S. suis serotype 2 ondartet stamme P1/7 blev isoleret fra syge svin med meningitis19. Stamme P1/7 blev dyrket i Todd-Hewitt bouillon (THB, formel pr. liter af THB: hjertet Infusion, 3.1 g neopeptone, 20,0 g dextrose, 2,0 g, natriumchlorid, 2,0 g; dinatrium fosfat, 0,4 g; natriumkarbonat, 2,5 g) og forgyldt på Todd-Hewitt agar (THA, formel pr. liter THA: Hjertet Infusion, 3.1 g; neopeptone, 20,0 g; dextrose, 2,0 g; Natriumklorid, 2,0 g; dinatrium fosfat, 0,4 g; natriumkarbonat, 2,5 g; agar, 15,0 g) ved 37 ° C og 5% CO2.
- Samling af stamme P1/7 planktoniske celler
- Indsamle 5 mL af planktoniske celler fra midten log fase kultur (OD600= 0,6), centrifugeres i 3 min på 8000 × g, og derefter vask 3 gange med PBS.
- Resuspend celler med 5 mL 25% glycerol i THB, alikvot i 5 rør, og derefter opbevares ved-80 ° C.
- Samling af stamme P1/7 biofilm stat celler
- 20 ml af en overnight kultur og tilføje til 180 mL frisk THB; opdele den fortyndede kultur i 10 runde kultur plader ligeligt, og derefter sætte pladerne i en inkubator ved 37 ° C i 5% CO2 i 24 timer.
- Efter inkubationen ryste plade forsigtigt at resuspend bakterier, der ikke har levet op til pladen, og derefter supernatanten ved aspiration.
Bemærk: Ryst pladen forsigtigt og undgå resuspending sedimentet. - Der tilsættes 5 mL PBS til at høste biofilm stat celler, resuspend sedimentet helt, og derefter overføre prøven til et nyt rør.
- Der sonikeres biofilm stat celler fra det sidste skridt med følgende parametre: 60 W, 4 cyklusser, 5 s på og 10 s off.
- Der centrifugeres i 3 min på 8000 × g og gemme supernatanten ved-80 ° C.
Bemærk: Supernatanten kan indeholde biofilm komponenter og det kan bruges til resuspend biofilm bakterier før infektion som beskrevet i dyreforsøg (trin 3). - Resuspend sediment med 10 mL 25% glycerol i THB og derefter gemme biofilm stat celler ved-80 ° C.
2. scanning elektronmikroskopi (SEM) analyse
- Fix indsamlede biofilm stat celler og planktoniske celler ved hjælp af 4% PARAFORMALDEHYD i 12-24 timer ved 4 ° C.
- Skyl prøver hurtigt med destilleret vand og dehydrere prøver sekventielt med en stigende koncentration af ethanol (25%, 50%, 70%, 90% og 100%) i 30 min i hver løsning.
- Overholde de tørrede prøver at metal indehavere med dobbeltklæbende tape og endelig pels dem i en fordamper med guld og palladium.
- Observere prøverne ved en scanning elektron mikroskop ved hjælp af følgende parametre: EHT (ekstra høj spænding) = 10 kV; WD (arbejder afstand) = 7.0 eller 8.0 mm; Forstørrelse = 5000 ×; Signal A = SE1.
3. dyr eksperimenter
- Bruge SPF 6-uge-forhenværende BALB/c hunmus i denne undersøgelse. Inficere alle mus gennem ruten intrakranielle subarachnoidal af infektion hvis injektionsstedet er beliggende 3,5 mm rostralt fra bregma. Injektionsstedet stereotaxisk koordinater blev klart beskrevet af Chiavolini al.17.
- For histopatologiske analyse, inficere to grupper af mus (5 mus pr. gruppe) ved hjælp af planktoniske celler eller biofilm stat celler i en dosis på 3 × 107 kolonidannende enheder (CFU), og en anden 5 mus blev sprøjtet med PBS som en kontrol.
- Til påvisning af mRNA udtryk af TLR2 og cytokiner i hjernen, inficere to yderligere grupper af mus (6 mus pr. gruppe) celler ved hjælp af planktoniske celler eller biofilm stat i en dosis på 3 × 107 CFU.
- Bestemme antallet af levedygtige bakterier ved plettering serielle fortyndinger på THA.
- Aflive alle mus på 12 timer efter infektionen til yderligere forskning.
Bemærk: Glycerol stock mellemlang skal fjernes før infektionen. Både planktoniske celler og biofilm stat celler inddrives fra-80 ° C er vasket 3 gange med PBS. Derefter er planktoniske celler genopslemmes med PBS og fortyndet til den passende dosis for infektion; biofilm stat celler er genopslemmes med den lagrede supernatanten (fra trin 1.2.5) og fortyndes til den passende dosis for infektion. Lydstyrken for infektion bør ikke være mere end 50 µL.
- Påvisning af mRNA udtryk af TLR2 og cytokiner i hjernevæv
- Uddrag den samlede RNA fra hjernevæv bruger et RNA udvinding kit.
- For hver mus, skal du bruge hele hjernevæv til at udtrække RNA. Opdele hele hjernevæv i 5 rør. Tage op til 100 mg hjernevæv og tilsættes 1 mL lysis til hver tube indeholder matrixen lysing forudsat af sættet.
- Behandle røret i en homogeniseringsapparat for 40 s på en indstilling på 6,0, og derefter centrifugeres tube på 12000 × g og 4 ° C i 5 min.
- Efter centrifugering, skal du overføre den øverste fase til et nyt microcentrifuge-rør.
- Inkuber overførte prøven i 5 min ved stuetemperatur; Tilsæt 300 µL chloroform, vortex for 10 s, og derefter inkuberes i 5 min ved stuetemperatur.
- Centrifugeres tube på 12000 × g og 4 ° C i 5 min. Overfør den øverste fase til en ny tube.
- Tilføje 500 µL koldt absolut ethanol til rør, før invertere det for 5 gange, og derefter gemme prøven ved-20 ° C i mindst 1 time.
- Centrifugeres tube på 12000 × g og 4 ° C i 15 min og Fjern supernatanten. Vask pellet med 500 µL koldt 75% ethanol i RNase-fri H2O.
- Fjern ethanol, luft gold pellet i 5 min ved stuetemperatur og resuspend RNA i 100 µL af RNase-fri H2O.
- Inkuber RNA i 5 min ved stuetemperatur og RNA-koncentrationen bruger et RNA-bioanalyzer.
- Udføre cDNA syntese, herunder eliminering af genomisk DNA (gDNA), ved hjælp af en thermocycler med en reverse transkription (RT) reagens kit.
- Tilføje 1 µg af RNA til et rør indeholdende 2 µL af 5 x gDNA afskaffelse buffer, 1 µL af gDNA eliminering enzym og RNase-fri H2O indtil volumen når 10 µL. der inkuberes i 2 min på 42 ° C.
- Tilsæt 10 µL af master mix (1 µL af RT enzym blandes I, 1 µL af RT Primer Mix, 4 µL af 5 x Buffer 2 og 4 µL af RNase-fri H2O) til opløsningen reaktion fra sidst trin og derefter blandes forsigtigt. Fortsætte straks med RT reaktion: 37 ° C i 15 min og derefter 85 ° C i 5 s.
- Udføre den kvantitative real-time PCR (RT-qPCR) analyse ved hjælp af en Real-Time PCR maskine med en SYBR RT-qPCR kit. Tilsæt 10 µL af 2 x enzym, 0,8 µL af fremad primer, 0,8 µL af reverse primer, 0,4 µL af 50 x ROX Reference farvestof II, 2 µL cDNA skabelon og RNase-fri H2O indtil en samlet maengde paa 20 µL.
- Kør hver prøve i tre eksemplarer ved hjælp af de følgende parametre, der termisk: 30 s på 94 ° C, efterfulgt af 40 cyklusser af 5 s ved 95 ° C, og 34 s på 60 ° C, med en afsluttende fase af 15 s ved 95 ° C, 1 min. ved 60 ° C , og 15 s ved 95 ° C. Primere for RT-qPCR er angivet i tabel 1. Husholdning gener B2m og 18s rRNA blev brugt som intern kontrol.
- Beregne den relative fold ændring baseret på metoden 2-ΔΔCt .
- Uddrag den samlede RNA fra hjernevæv bruger et RNA udvinding kit.
-
Observation af histologiske sektioner
- Efter 24 h fiksering med 10% formalin, rekonstruere den faste hjernevæv i passende størrelser af væv stykker på 2-3 mm.
- Sat væv stykker i en indlejring kassette og Fordyb dig i en ny Fikseringsvæske løsning for dehydrering med en automatisk vakuum dehydrator.
- Tag den faste væv og dehydrere den sekventielt i stigende koncentrationer ethanol (70%, 80%, 95%, 95% og 100%) i 30 min i hver løsning.
- Transparentize prøve med xylen i 15 min., dyppe den i flydende paraffin på 60 ° C til 90 min, og derefter integrere ved hjælp af en indlejring maskine.
- Skær paraffin blok indlejret væv i 3 µm skiver, flise skive på vand ved 45 ° C, og derefter tørres i luften.
- Inkuber afsnittet i 3 timer ved 60 ° C, bejdse det med haematoxylin og eosin (han) metode, og forsegle det med den neutrale tyggegummi.
- Overholde de histopatologiske forandringer i hjernen med et optisk mikroskop. En fire-punkts grading system blev brugt til at evaluere histologiske forandringer. Bruge en uparret t -test for statistisk analyse.
Congestion/blødning: fraværende, score 0; lille område af fokale overbelastning/hjerneblødning, score 1; stort område af fokale overbelastning/blødning, eller flere steder i lille område af fokale overbelastning/hjerneblødning, score 2; op til tre store fokale overbelastning/hjerneblødning websteder, score 3; diffuse overbelastning/hjerneblødning, score 4.
Nekrose: fraværende, score 0; fokal nekrose, score 1; diffuse forekomst af 1-10 nekrotiske celler, score 2; Foci af sammenflydende nekrose, score 3; omfattende sammenflydende nekrose, score 4.
Inflammatoriske celle infiltration: fraværende, score 0; par og fokale infiltrationer, score 1; multifokal infiltration eller infiltrationer med dannelsen af aggregater, score 2; op til tre aggregater, score 3; og mere end fire aggregater, score 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SEM analyse blev udført for at undersøge Biofilmdannelse under forsøgsbetingelserne. Som vist i figur 1, er der en betydelig forskel i Biofilmdannelse mellem planktoniske celler (fig. 1A) og biofilm stat celler (figur 1B). SEM analyse viste, at biofilm bakterier var i klumper og flere lag, og de var indkapslet i den ekstracellulære matrix, mens planktoniske bakterier var meget mindre tætte og især spredte individuelt.
Komponenterne i den ekstracellulære matrix af biofilm, såsom DNA, er i stand til at fremkalde vært inflammatoriske respons og cytokin produktion. Siden TLR2 og cytokiner CCL2, er IL-6 og TNF-α involveret i cerebral inflammatoriske respons relateret til meningitis ifølge tidligere undersøgelser10,11,20, mRNA udtryk for disse gener blev sammenlignet in vivo for mus inficeret med planktoniske celler og smittede med biofilm stat celler. Dette blev gjort for at undersøge effekten af biofilm på inflammatoriske respons i murine hjernevæv. Som vist i figur 2, på 12 timer efter infektionen, udtryk for TLR2, CCL2, IL-6 og TNF-α fra hjerner af inficerede mus var signifikant højere for biofilm stat celler sammenlignet med planktoniske celler.
Mus inficeret med biofilm bakterier viste langt mere alvorlige tegn på meningitis (stiv holdning, ataksi eller kramper) end de smittede med planktoniske bakterier. Histologisk undersøgelse af hjernevæv fra mus inficeret med S. suis stamme P1/7 viste overbelastning/hjerneblødning, nekrose og inflammatoriske celle infiltration i meninges, hjernebarken, hjertekamrene eller diencephalon (figur 3) . Sammenlignet med mus inficeret med planktoniske bakterier (figur 3E-H), på 12 h efter infektionen, langt mere alvorlige patologiske ændringer blev observeret i hjernevæv fra mus inficeret med biofilm bakterier (fig. 3A-D), herunder store områder af overbelastning/hjerneblødning, nekrose eller intens inflammatoriske celle infiltration. De grove patologiske ændringer i hjernen fra mus inficeret med planktoniske og biofilm bakterier blev indspillet i tabel 2. Hverken patologiske ændringer eller neurologiske symptomer blev observeret fra musene injiceret med PBS. Taget sammen, viser disse data klart, at S. suis biofilm bidrager til induktion af meningitis.
Figur 1: SEM billeder af stammen P1/7 planktoniske celler og biofilm stat celler. Bakterier var kulturperler i THB medium. SEM analyse viste, at planktoniske celler (A) var langt mindre tætte og især spredte individuelt, mens biofilm bakterier (B) var grupperet i klumper og flere lag, og de var indkapslet i den ekstracellulære matrix. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: biofilm aktivere mRNA udtryk for CCL2, IL-6, TNF-α og TLR2 i mus hjernevæv i vivo. Seks BALB/c mus pr. gruppe var hver injiceres gennem ruten intrakranielle subarachnoidal af infektion med 3 × 107 CFU af planktoniske celler eller biofilm stat celler. Mus blev aflivet på 12 timer efter infektionen. Resultaterne er præsenteret som klappen ændring af mRNA udtryk i biofilm stat celle-inficerede mus sammenlignet med planktoniske celle-inficerede mus. A gen B2m blev brugt som reference-gen; (B) gen 18s rRNA blev brugt som reference-genet. En uparret t-test blev anvendt til statistiske analyser. ** p ≤0.01, og * p ≤0.05. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: histologiske analyse af hjernevæv af mus inficeret med stamme P1/7 planktoniske bakterier og biofilm stat bakterier. A-D, hjernen prøver fra mus inficeret med biofilm stat bakterier; E-H, hjernen prøver fra inficeret med planktoniske bakterier-mus. A, B, E og F: meninges og hjernebarken; C og G: ventrikler; D og H: diencephalon. Δ, overbelastning/blødning; □, nekrose; ○: inflammatoriske celle infiltration. Forstørrelse = 200 X; skalalinjen = 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Primer navn | Rækkefølge (5' - 3') | Gen symbol |
| IL-6 fremad | CTTCCATCCAGTTGCCTTCT | Il6 |
| IL-6 reverse | CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG | Il6 |
| TLR2 frem | CACTATCCGGAGGTTGCATATC | Tlr2 |
| TLR2 omvendt | GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC | Tlr2 |
| CCL2 frem | CTCACCTGCTGCTACTCATTC | Ccl2 |
| CCL2 omvendt | ACTACAGCTTCTTTGGGACAC | Ccl2 |
| TNF-α frem | TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT | TNF |
| TNF-α reverse | GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG | TNF |
| Β2m frem | GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT | B2m |
| Β2m omvendt | TATGTTCGGCTTCCCATTCTC | B2m |
| 18s frem | GTAACCCGTTGAACCCCATT | 18s rRNA |
| 18s omvendt | CCATCCAATCGGTAGTAGCG | 18s rRNA |
Tabel 1: Primere for RT-qPCR.
Tabel 2: de brutto histopatologiske forandringer i hjernen fra mus inficeret med S. suis stamme P1/7. En fire-punkts grading system blev brugt til at evaluere histologiske forandringer, som beskrevet i protokollen afsnit 3.3.7. Den samlede score blev beregnet som summen af noder fra forskellige histopatologiske forandringer. Gennemsnittet er beregnet som den samlede score/antallet af mus. En uparret t-test blev anvendt til statistiske analyser. ** p ≤0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ruten intrakranielle subarachnoidal af infektion beskrevet her har åbenlyse fordele i forhold til andre ruter af infektion. Det giver mulighed for efterforskerne at studere vært-bakterien interaktion og påvirkning af bakteriel komponenter vært immunrespons direkte i hjernen, som efterligner bakteriel indgangen i det centrale nervesystem. Således, denne rute af infektion kan udvides for at undersøge mekanismerne af meningitis forårsaget af andre bakterier. Det kan desuden også bruges til at teste effekten af lægemidler mod bakteriel meningitis.
For at opnå gode resultater ved hjælp af denne model, er følgende kritiske trin eksplicit. Biofilmdannelse skal undersøges under forsøgsbetingelser. I den nuværende undersøgelse, blev det undersøgt, ved hjælp af scanning elektron mikroskop analyse. Andre metoder kan også bruges til at undersøge Biofilmdannelse, såsom vævskultur plade metode og rør metode21. Én dag før infektionen, delprøver af både planktoniske celler og biofilm stat celler har brug for at blive optøet fra-80 ° C til at bestemme CFU. Den næste dag, skal bakterier fortyndes til den passende dosis efter CFU for infektion. Mock-inficerede kontrolgruppen injiceres med PBS skal medtages og mus fra kontrolgruppen mock-inficerede bør udviser ingen manifestationer i løbet af infektion eksperiment. Forskellige stammer kan have forskellige smitsomme doser, så en indledende eksperiment er stærkt anbefales at bestemme den passende infektiøse dosis. I den nuværende undersøgelse, blev en dosis af 3 × 107 CFU for infektion brugt, baseret på vores foreløbige eksperiment. Denne dosis af biofilm bakterier var i stand til at fremkalde alvorlige tegn på meningitis og efterfølgende død i alle 5 mus 48 h efter infektion i den foreløbige eksperiment.
Afbrydelse af blod-hjerne eller blod-cerebrospinal fluid barrierer af S. suis er et vigtigt skridt i at forårsage meningitis22,23,24. Ruten intrakranielle subarachnoidal af infektion er ikke egnet til evaluering S. suis evne til at bryde igennem disse barrierer. Andre ruter af infektion, såsom i.p., i.v. eller i.n., kan bruges til at nå dette mål.
Her, vise vi først, at S. suis biofilm bidrager til induktion af meningitis ved hjælp af ruten intrakranielle subarachnoidal af infektion. Denne infektion model ikke kun hjælper til yderligere for at forstå mekanismerne af S. suis meningitis, men også er velegnet til at studere patogenesen af meningitis forårsaget af andre bakterier og effekten af nye lægemidler mod bakteriel meningitis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af tilskud fra den nationale nøgle forskning og udvikling Program i Kina [2017YFD0500102]; National Natural Science Foundation i Kina [31572544]; den statslige centrale laboratorium af veterinære ætiologisk biologi [SKLVEB2016KFKT005]; Shanghai landbrug anvendt teknologi udvikling Program, Kina [G2016060201].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
- Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen? Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
- Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45 (2014).
- Kerdsin, A., et al. Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).
- Hatrongjit, R., et al. First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand. BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).
- Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis. Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).
- Isiaku, A. I., et al. Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish. Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).
- Oggioni, M. R., et al. Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).
- Xiao, G., et al. Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model. Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).
- Seitz, M., et al. A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2. Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).
- Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).
- Williams, A. E., Blakemore, W. F. Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).
- Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection. Pathogens. 5 (3), (2016).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiology. 4, 36 (2004).
- Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs. Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).
- Holden, M. T., et al. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis. PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).
- Dominguez-Punaro Mde, L., et al. In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis. Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).
- Hassan, A., et al. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).
- Vanier, G., et al. New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).
- Takeuchi, D., et al. The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis. Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).
