Summary
Qui, descriviamo l'itinerario subarachnoidal intracranica dell'infezione nei topi per studiare i ruoli dei biofilm nella meningite Streptococcus suis . Questo modello di infezione è anche adatto per studiare la patogenesi di altre meningite batterica e l'efficacia di nuovi farmaci contro la meningite batterica.
Abstract
Streptococcus suis è non solo un importante agente patogeno batterico di suini in tutto il mondo, ma anche un agente zoonotico emergente. In esseri umani e maiali, la meningite è una manifestazione importante di infezioni da S. suis . Un modello di infezione adatto è uno strumento essenziale per comprendere i meccanismi delle malattie causate da agenti patogeni. Diversi itinerari dell'infezione nei topi sono stati sviluppati per studiare la patogenesi dell'infezione da S. suis . Tuttavia, i percorsi intraperitoneali, intranasali ed endovenosa dell'infezione non sono adatti per studiare i ruoli dei componenti di superficie di S. suis nella meningite direttamente nel cervello, come la matrice extracellulare da biofilm. Anche se l'inoculazione intracisternal è stato utilizzato per infezione da S. suis , il sito di iniezione precisa non è stata descritta. Qui, l'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione è stata descritta in un modello murino per studiare i ruoli di biofilm in S. suis meningite. S. suis cellule planctoniche o biofilm dello stato sono stati iniettati direttamente nello spazio subaracnoideo dei topi attraverso il sito di iniezione si trova 3,5 mm rostrale dal bregma. L'analisi istopatologica e aumentata espressione di mRNA di TLR2 e citochine del tessuto cerebrale da topi iniettati con le cellule di biofilm stato indicato chiaramente che S. suis biofilm svolge ruoli definitivi in S. suis meningite. Questo itinerario dell'infezione ha evidenti vantaggi rispetto ad altre vie di infezione, permettendo lo studio dell'interazione ospite-batterio. Inoltre, esso consente l'effetto di componenti batteriche sulla risposta immune dell'ospite direttamente nel cervello per essere valutati e imita ingresso batterica nel sistema nervoso centrale. Questo itinerario dell'infezione può essere esteso per indagare i meccanismi della meningite causate da altri batteri. Inoltre, può anche essere utilizzato per testare l'efficacia di farmaci contro la meningite batterica.
Introduction
Streptococcus suis (S. suis) è un importante agente patogeno batterico di suini in tutto il mondo, causando gravi malattie tra cui la meningite, polmonite, setticemia, endocardite e artrite1. È anche un agente zoonotico emergente. Finora, è stato segnalato che nove sierotipi possono causare infezione in esseri umani, compreso i sierotipi 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 e 312,3,4. In esseri umani e maiali, la meningite è uno dei principali segni clinici delle infezioni da S. suis . In Vietnam e Thailandia, S. suis è la principale causa della meningite in adulti5. Biofilm microbici sono microrganismi che aderiscono a vicenda e sono concentrati in un'interfaccia; Essi sono essenziali per la virulenza batterica, sopravvivenza in ambienti diversi e Antibiotico-resistenza5. I biofilm sono in genere circondati da una matrice extracellulare che generalmente contiene polisaccaridi, proteine e DNA6. Quest'ultimo è in grado di suscitare la risposta infiammatoria dell'ospite e di produzione di citochina7. Formazione di biofilm è stata segnalata per essere coinvolti nella meningite streptococcica in studi precedenti. Biofilm contribuiscono alla meningite da Streptococcus agalactiae in un modello di pesce tilapia e formazione di biofilm è stato rivelato all'interno dei tessuti del cervello e nei dintorni di meningea superfici in vivo attraverso Inoculazione intra-addominale8. Durante la meningite, lo streptococco pneumoniae è in uno stato di biofilm e batteri in un tale stato di biofilm erano più efficaci nell'induzione della meningite in un modello di infezione del mouse9. Inoltre, nel nostro precedente studio, lo stato di biofilm associato S. suis nel cervello del topo contribuisce alla virulenza batterica di sopravvivenza analisi10. Tuttavia, la prova diretta per il coinvolgimento di biofilm in S. suis meningite richiede ulteriori indagini.
Modelli animali di infezione da S. suis sono stati sviluppati nei topi utilizzando intraperitoneale (i.p.)11, intranasale (i.n.)12, endovenosa (i.v.)13e gli itinerari di intracisternal (i.c.) di infezione14, 15 , 16. Tuttavia, le vie di i.p., i.n. e i.v. di infezione non sono adatte per studiare i ruoli dei componenti di superficie di S. suis nella meningite direttamente nel cervello. Questi includono matrice extracellulare da biofilm. Anche se l'inoculazione di i.c. è stato usato per infezione da S. suis , il sito di iniezione precisa non è stata descritta in quei fascicoli. Al contrario, le coordinate stereotassiche del sito di iniezione per inoculazione subarachnoidal intracranica chiaramente è stato descritto in un precedente studio17. Questo ha permesso il facile riconoscimento del punto di inoculazione e più semplicistico protocollo sperimentale. Inoltre, l'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione imita ingresso batterica nel sistema nervoso centrale da seni o l' orecchio medio17e la relazione tra l'orecchio medio e la meningite causata da S. suis è stato dimostrato da Madsen et al.18. Inoltre, applicando l'itinerario subarachnoidal intracranica dell'infezione nei topi, abbiamo dimostrato che S. suis piccolo RNA rss04 contribuisce alla meningite nel nostro precedente studio10.
Nello studio presente, l'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione è stato utilizzato nei topi per indagare i ruoli di biofilm in S. suis meningite. Topi sono stati infettati con cellule planctoniche o cellule stato biofilm di S. suis da questo itinerario dell'infezione. L'analisi istopatologica e aumentata espressione di mRNA di TLR2 e citochine dal tessuto di cervello di topi iniettati con le cellule di biofilm stato chiaramente indicato che il biofilm di S. suis contribuisce alla meningite.
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Protocol
Gli esperimenti di infezione del mouse sono stati approvati dal laboratorio animale monitoraggio Comitato della provincia di Jiangsu, Cina ed eseguiti nel laboratorio animale Center of Nanjing Agricultural University (permesso numero: SYXK (Su): 2017-0007).
1. preparazione di batteri
Nota: Il ceppo virulento di S. suis sierotipo 2 P1/7 è stato isolato da un maiale malato con meningite19. Ceppo P1/7 è stato coltivato in brodo Todd-Hewitt (THB, formula per litro di THB: Heart Infusion, 3,1 g neopeptone, 20,0 g; destrosio, 2,0 g; cloruro di sodio, 2,0 g; fosfato disodico, 0,4 g; carbonato di sodio, 2,5 g) e placcato su Todd-Hewitt agar (THA, formula per litro di THA: Heart Infusion, 3,1 g; neopeptone, 20,0 g; destrosio, 2,0 g; cloruro di sodio, 2,0 g; disodio fosfato, 0,4 g; carbonato di sodio, 2,5 g; agar, 15,0 g) a 37 ° C e 5% CO2.
- Raccolta di ceppo cellule planctoniche P1/7
- Raccogliere 5 mL di cellule planctoniche da cultura Mid-registro fase (OD600= 0,6), centrifugare per 3 min a 8000 × g e poi lavare 3 volte con PBS.
- Risospendere le cellule con 5 mL di glicerolo al 25% in THB, aliquotare in 5 provette e quindi conservare a-80 ° C.
- Raccolta di ceppo cellule di stato biofilm P1/7
- Prendere 20 mL di una coltura durante la notte e aggiungere a 180 mL di THB fresco; dividere la cultura diluita in 10 piastre di coltura rotondo ugualmente e poi mettere le piastre in un incubatore a 37 ° C in 5% CO2 per 24 h.
- Dopo l'incubazione, agitare la piastra delicatamente per risospendere i batteri che non hanno aderito alla piastra e quindi eliminare il surnatante tramite aspirazione.
Nota: Agitare la piastra delicatamente ed evitare risospendere il sedimento. - Aggiungere 5 mL di PBS per raccogliere le cellule di stato del biofilm, risospendere il sedimento completamente e poi trasferire il campione ad un nuovo tubo.
- Sottoporre ad ultrasuoni le celle di stato di biofilm dall'ultimo passaggio con i seguenti parametri: 60 W, 4 cicli, 5 s s on e 10 off.
- Centrifugare per 3 min a 8000 × g e conservare il supernatante a-80 ° C.
Nota: Il supernatante può contenere componenti di biofilm e può essere utilizzato per risospendere i biofilm di batteri prima dell'infezione come descritto negli esperimenti sugli animali (passaggio 3). - Risospendere il sedimento con glicerolo 25% 10ml in THB e quindi memorizzare le celle di stato biofilm a-80 ° C.
2. scansione analisi di microscopia elettronica (SEM)
- Difficoltà il biofilm raccolti stato cellule e cellule planctoniche usando paraformaldeide al 4% per 12-24 h a 4 ° C.
- Sciacquare i campioni rapidamente con acqua distillata e disidratare i campioni in sequenza con una crescente concentrazione di etanolo (25%, 50%, 70%, 90% e 100%) per 30 min in ogni soluzione.
- Rispettare i campioni essiccati per titolari con nastro biadesivo in metallo e infine trattarle in un evaporatore con oro e Palladio.
- Osservare i campioni da un microscopio elettronico a scansione utilizzando i seguenti parametri: EHT (Extra alta tensione) = 10 kV; WD (distanza di lavoro) = 7.0 o 8.0 mm; Ingrandimento = 5000 ×; Segnale A = SE1.
3. animale esperimenti
- Utilizzare SPF 6-settimana-vecchi topi BALB/c femminili in questo studio. Infettare tutti i topi attraverso l'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione cui sito di iniezione è situato 3,5 mm rostrale dal bregma. Le coordinate stereotassiche del sito di iniezione sono stati chiaramente descritti da Chiavolini et al17.
- Per l'analisi istopatologica, infettare due gruppi di topi (5 topi per gruppo) utilizzando cellule planctoniche o biofilm stato cellule ad una dose di 3 × 107 unità formanti colonie (CFU), e un altro 5 topi sono stati iniettati con PBS come controllo.
- Per la rilevazione dell'espressione del mRNA di TLR2 e citochine nel cervello, infettare altre due gruppi di topi (6 topi per ogni gruppo) utilizzando cellule planctoniche o biofilm stato cellule ad una dose di 3 × 107 CFU.
- Determinare il numero di batteri vitali di diluizioni seriali a THA di placcatura.
- Eutanasia tutti i topi a di post-infezione 12 h per ulteriori ricerche.
Nota: Glicerolo a stock medio deve essere rimosso prima dell'infezione. Sia le cellule planctoniche e biofilm celle di state recuperate da-80 ° C vengono lavate 3 volte con PBS. Quindi, le cellule planctoniche sono risospese con PBS e diluite alla dose appropriata per l'infezione; biofilm stato cellule sono risospese con il surnatante stored (dal punto 1.2.5) e diluite alla dose appropriata per l'infezione. Il volume per l'infezione non dovrebbe essere più di 50 µ l.
- Rilevare l'espressione del mRNA di TLR2 e citochine nel tessuto cerebrale
- Estratto il RNA totale dal tessuto di cervello utilizzando un kit di estrazione di RNA.
- Per ogni mouse, è possibile utilizzare tessuto cerebrale tutta per l'estrazione di RNA. Dividere del tessuto di cervello intero in 5 provette. Prenda al tessuto cerebrale 100mg e aggiungere 1 mL di soluzione di lisi in ogni provetta contenente la matrice lisante fornita dal kit.
- Elaborare il tubo in un omogeneizzatore per 40 s con un'impostazione del 6.0 e poi Centrifugare la provetta a 12000 × g e 4 ° C per 5 min.
- Dopo la centrifugazione, trasferire la fase superiore ad un nuovo tubo del microcentrifuge.
- Incubare il campione trasferito per 5 min a temperatura ambiente; aggiungere 300 µ l di cloroformio, vortexare per 10 s e poi incubare per 5 min a temperatura ambiente.
- Centrifugare la provetta a 12000 × g e 4 ° C per 5 min. trasferire la fase superiore ad un nuovo tubo.
- Aggiungere 500 µ l di etanolo assoluto freddo al tubo, prima di esso invertente per 5 volte e quindi conservare il campione a-20 ° C per almeno 1 h.
- Centrifugare la provetta a 12000 × g e 4 ° C per 15 min e rimuovere il surnatante. Lavare la pallina con 500 µ l di etanolo 75% freddo privo di RNasi H2O.
- Rimuovi l'etanolo, aria secca il pellet per 5 min a temperatura ambiente e risospendere il RNA in 100 µ l di RNAsi-libera H2O.
- Incubare il RNA per 5 min a temperatura ambiente e determinare la concentrazione di RNA con un RNA bioanalyzer.
- Eseguire sintesi di cDNA, compreso eliminazione del DNA genomico (gDNA), utilizzando un termociclatore con un kit di reagenti di trascrizione inversa (RT).
- Aggiungere 1 µ g di RNA da un tubo contenente 2 µ l di buffer di eliminazione 5 x gDNA, 1 µ l di enzima eliminazione gDNA e privo di RNasi H2O fino a quando il volume raggiunge 10 µ l. Incubare per 2 min a 42 ° C.
- Aggiungere 10 µ l di master mix (1 µ l di enzima RT mescolare I, 1 µ l di miscela di Primer RT, 4 µ l di tampone 2: 5x e 4 µ l di RNAsi-libera H2O) per la soluzione di reazione dall'ultimo passo e poi mescolare delicatamente. Procedere immediatamente con la reazione di RT: 37 ° C per 15 min e poi 85 ° C per 5 s.
- Eseguire l'analisi quantitativa di PCR (RT-qPCR) in tempo reale, utilizzando una macchina PCR Real-Time con un kit SYBR RT-qPCR. Aggiungere 10 µ l di enzima: 2x, 0,8 µ l di primer forward, 0,8 µ l di primer reverse, 0,4 µ l di 50 x ROX riferimento Dye II, 2 µ l di modello di cDNA e privo di RNasi H2O fino a un volume totale di 20 µ l.
- Eseguire ogni esempio in triplice copia utilizzando i seguenti parametri termici: 30 s a 94 ° C, seguiti da 40 cicli di 5 s a 95 ° C e 34 s a 60 ° C, con una fase finale di 15 s a 95 ° C, 1 min a 60 ° C e 15 s a 95 ° C. Primer per RT-qPCR sono elencati nella tabella 1. Geni housekeeping B2m e 18s rRNA sono stati usati come controlli interni.
- Calcolare la variazione relativa piega sulla base del metodo 2-ΔΔCt .
- Estratto il RNA totale dal tessuto di cervello utilizzando un kit di estrazione di RNA.
-
Osservazione delle sezioni istologiche
- Dopo la fissazione di 24h con formalina al 10%, è possibile ricostruire il tessuto cerebrale fisso in dimensioni appropriate di pezzi di tessuto a 2-3 mm.
- Mettere i pezzi di tessuto in una cassetta di incorporamento e immergere in una nuova soluzione fissante per disidratazione con un essiccatore di vuoto automatico.
- Estrarre il tessuto fisso e si disidratano in sequenza in aumento delle concentrazioni di etanolo (70%, 80%, 95%, 95% e 100%) per 30 min in ogni soluzione.
- Transparentize il campione con xilene per 15 min, immergerlo nel liquido paraffina a 60 ° C per 90 min e quindi incorporare utilizzando una macchina per l'incorporamento.
- Tagliare il tessuto di blocco incorporato di paraffina a fette di 3 µm, affianca la fetta sull'acqua a 45 ° C e poi asciugare all'aria.
- Incubare la sezione per 3 h a 60 ° C, macchia utilizzando il haematoxylin ed eosina (lui) metodo e sigillare con la gomma neutra.
- Osservare i cambiamenti istopatologici del cervello con un microscopio ottico. Un sistema di classificazione del quattro-punto è stato utilizzato per valutare i cambiamenti istologici. Utilizzare un test spaiato t per l'analisi statistica.
Congestione/emorragia: assente, Punteggio 0; piccola area di congestione/emorragia focale, Punteggio 1; grande area di congestione/emorragia focale, o più siti di piccola zona di congestione/emorragia focale, Punteggio 2; fino a tre siti di grande congestione/emorragia focale, Punteggio 3; diffusa congestione/emorragia, Punteggio 4.
Necrosi: assente, Punteggio 0; necrosi focale, Punteggio 1; diffusa presenza di cellule necrotiche 1-10, Punteggio 2; i fuochi di necrosi confluente, Punteggio 3; vasta necrosi confluente, Punteggio 4.
L'infiltrazione delle cellule infiammatorie: assente, Punteggio 0; pochi e focale infiltrazioni, Punteggio 1; multifocale infiltrazione o infiltrazioni con formazione di aggregati, Punteggio 2; fino a tre aggregati, Punteggio 3; e più di quattro aggregati, Punteggio 4.
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Representative Results
Analisi SEM è stato effettuato per esaminare la formazione di biofilm nelle circostanze sperimentali. Come illustrato nella Figura 1, c'è una differenza significativa nella formazione del biofilm tra cellule planctoniche (Figura 1A) e stato biofilm (Figura 1B). Analisi SEM ha mostrato che il biofilm batteri erano in ciuffi e più livelli e sono stati racchiusi nella matrice extracellulare, mentre i batteri planctonici erano molto meno denso e principalmente dispersi singolarmente.
I componenti della matrice extracellulare del biofilm, come il DNA, sono in grado di suscitare la risposta infiammatoria dell'ospite e la produzione di citochine. Dal TLR2 e citochine CCL2, IL-6 e TNF-α sono coinvolte nelle risposte infiammatorie cerebrali legate alla meningite secondo precedente studi10,11,20, il mRNA di espressione di questi geni è stato confrontato in vivo per topi infettati con cellule planctoniche e quelli infettati con cellule di stato di biofilm. Questo è stato fatto per esplorare l'effetto di biofilm sulla risposta infiammatoria nel tessuto del cervello murino. Come illustrato nella Figura 2, a post-infezione 12h, l'espressione di TLR2, CCL2, IL-6, e TNF-α dai cervelli dei topi infettati era significativamente più alto per le celle di stato biofilm rispetto alle cellule planctoniche.
Topi infettati con batteri di biofilm ha mostrato molto più gravi segni di meningite (postura rigida, atassia o convulsioni) rispetto a quelli infettati con batteri planctonici. Esame istologico del tessuto cerebrale da topi infettati con ceppo di S. suis che P1/7 ha mostrato la congestione/emorragia, necrosi e infiltrazione delle cellule infiammatorie nelle meningi, corteccia cerebrale, i ventricoli o diencefalo (Figura 3) . Rispetto ai topi infettati con batteri planctonici (Figura 3E-H), alle 12 ore dopo l'infezione, molto più gravi alterazioni patologiche sono stati osservati nel tessuto cerebrale da topi infettati con batteri di biofilm (Figura 3A-D), comprese le grandi aree di congestione/emorragia, necrosi o infiltrazione infiammatoria intensa delle cellule. Le variazioni patologiche macroscopiche nel cervello da topi infettati con planctonici e biofilm batteri è stata registrata nella tabella 2. Alterazioni patologiche né i sintomi neurologici sono stati osservati da topi iniettati con PBS. Presi insieme, questi dati mostrano chiaramente che il biofilm di S. suis contribuire all'induzione della meningite.
Figura 1: Immagini di SEM di ceppo P1/7 cellule planctoniche e biofilm stato. I batteri sono stati coltivati nel mezzo di THB. Analisi SEM ha mostrato che le cellule planctoniche (A) erano molto meno denso e principalmente dispersi singolarmente, mentre biofilm batteri (B) sono stati raggruppati in ciuffi e più livelli e sono stati racchiusi nella matrice extracellulare. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: biofilm attivare l'espressione del mRNA di CCL2, IL-6, TNF-α e TLR2 nel tessuto di cervello di topo in vivo. Ciascuno sei topi BALB/c per ogni gruppo sono stati iniettati attraverso l'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione con 3 × 107 CFU di cellule planctoniche o biofilm dello stato. Topi sono stati eutanasizzati post-all'infezione 12h. I risultati sono presentati come la piega cambiamento di espressione di mRNA in stato di biofilm topi infettati cella rispetto ai topi infettati delle cellule planctonici. (A) il gene B2m è stato usato come il gene di riferimento; (B) il gene 18s rRNA è stato usato come il gene di riferimento. Un spaiati t-test è stato utilizzato per l'analisi statistica. * * p ≤ 0,01, e * p ≤ 0.05. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: analisi istologica del tessuto cerebrale di topi infettati con ceppo P1/7 batteri planctonici e biofilm stato batteri. A-D, campioni del cervello da topi infettati con batteri di stato del biofilm; Campioni di cervello E-H, da topi infettati con batteri planctonici. A, B, E e f: meninges e corteccia cerebrale; C e g: ventricoli; D e h: diencefalo. Δ, congestione/emorragia; □, necrosi; ○: infiltrazione delle cellule infiammatorie. Ingrandimento = 200 X; barra della scala = 100 µm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Nome di primer | Sequenza (5' - 3') | Sigla del gene |
| IL-6 in avanti | CTTCCATCCAGTTGCCTTCT | Il6 |
| Inverso del-6 | CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG | Il6 |
| TLR2 avanti | CACTATCCGGAGGTTGCATATC | Tlr2 |
| TLR2 inversa | GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC | Tlr2 |
| CCL2 avanti | CTCACCTGCTGCTACTCATTC | Ccl2 |
| CCL2 inversa | ACTACAGCTTCTTTGGGACAC | Ccl2 |
| TNF-α in avanti | TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT | TNF |
| TNF-α inverso | GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG | TNF |
| Β2m avanti | GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT | B2M |
| Β2m inversa | TATGTTCGGCTTCCCATTCTC | B2M |
| 18 anni in avanti | GTAACCCGTTGAACCCCATT | 18S rRNA |
| 18s inversa | CCATCCAATCGGTAGTAGCG | 18S rRNA |
Tabella 1: Primer per RT-qPCR.
Tabella 2: I cambiamenti istopatologici lordi nel cervello da topi infettati con S. suis ceppo P1/7. Un sistema di classificazione del quattro-punto è stato utilizzato per valutare i cambiamenti istologici, come descritto nel protocollo sezione 3.3.7. Il Punteggio totale è stato calcolato come la somma dei punteggi da diversi cambiamenti istopatologici. La media è stata calcolata come il punteggio totale/numero di topi. Un spaiati t-test è stato utilizzato per l'analisi statistica. * * p ≤ 0,01.
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Discussion
L'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione qui descritto ha ovvi vantaggi sopra altri itinerari dell'infezione. Esso consente ai ricercatori di studiare l'interazione ospite-batterio e l'effetto di componenti batteriche sulla risposta immune dell'ospite direttamente nel cervello, che mimano ingresso batterica nel sistema nervoso centrale. Così, questo itinerario dell'infezione può essere esteso per indagare i meccanismi della meningite causate da altri batteri. Inoltre, può anche essere utilizzato per testare l'efficacia di farmaci contro la meningite batterica.
Al fine di ottenere buoni risultati utilizzando questo modello, i seguenti passaggi critici sono espliciti. Formazione di biofilm deve essere esaminato in condizioni sperimentali. Nello studio presente, è stato esaminato usando l'analisi del microscopio elettronico a scansione. Altri metodi utilizzabile anche per esaminare la formazione di biofilm, come metodo e tubo metodo21piastra di coltura tissutale. Un giorno prima dell'infezione, le aliquote di cellule planctoniche e di cellule di biofilm stato necessario essere scongelati da-80 ° C per determinare il CFU. Il giorno successivo, batteri devono essere diluiti alla dose appropriata secondo il CFU per l'infezione. Il gruppo di controllo mock-infettati iniettato con PBS deve essere incluso e i topi dal gruppo di controllo mock-infettato non dovrebbe esibire manifestazioni durante tutta la durata dell'esperimento infezione. Diversi ceppi possono avere diverse dosi infettive, quindi un esperimento preliminare è fortemente raccomandato per determinare la dose infettiva appropriata. Nello studio presente, una dose di 3 × 107 CFU per l'infezione è stata utilizzata basato su nostro esperimento preliminare. Questa dose di biofilm batteri è stata in grado di indurre gravi segni di meningite e la successiva morte in tutti i 5 topi 48h dopo l'infezione nell'esperimento preliminare.
L'interruzione del sangue-cervello o del fluide cerebrospinale sangue barriere da S. suis rappresentano un passo importante nel causare meningite22,23,24. L'itinerario di subarachnoidal intracranica dell'infezione non è adatto per valutare la capacità di S. suis a superare queste barriere. Altre vie di infezione, come i.p., i.v. o i.n., possono essere utilizzati per raggiungere questo obiettivo.
Qui, dimostriamo prima che S. suis biofilm contribuisce all'induzione della meningite utilizzando l'itinerario subarachnoidal intracranica dell'infezione. Questo modello di infezione non solo aiuta a capire meglio i meccanismi della meningite di S. suis , ma è anche adatto per studiare la patogenesi della meningite causata da altri batteri e l'efficacia di nuovi farmaci contro la meningite batterica.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Quest'opera è stata sostenuta da sovvenzioni nazionali chiave di ricerca e sviluppo programma della Cina [2017YFD0500102]; la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina [31572544]; il laboratorio chiave dello stato di biologia eziologico veterinaria [SKLVEB2016KFKT005]; l'agricoltura di Shanghai applicato tecnologia sviluppo programma, Cina [G2016060201].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
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