Summary
Burada, enfeksiyon biyofilmler streptokok suis menenjit içinde rolleri çalışma farelerde intrakranial subarachnoidal rotanın tarif. Bu enfeksiyon model diğer bakteriyel menenjit patogenezi ve bakteriyel menenjit karşı yeni ilaçların etkinliğini çalışmak için uygundur.
Abstract
Streptokok suis sadece domuz dünya çapında büyük bir bakteriyel patojen aynı zamanda gelişmekte olan Hayvansal ajanı var. İnsanlar ve domuzlar, menenjit S. suis enfeksiyonların büyük bir tezahürüdür. Uygun enfeksiyon manken patojenlerin yol açtığı hastalıklar mekanizmaları anlamak için önemli bir araçtır. Enfeksiyon farelerde birçok yolların S. suis enfeksiyon patogenezi okumaya geliştirilmiştir. Ancak, enfeksiyon mayi, etkilerinin ve intravenöz yolları menenjit gibi hücre dışı matriks biyofilmler üzerinden doğrudan beyindeki S. suis yüzey bileşenlerinde rolleri eğitim için uygun değildir. Her ne kadar intracisternal aşılama S. suis enfeksiyonu için kullanılan, hassas enjeksiyon yeri tarif değil. Burada, intrakranial subarachnoidal yolu enfeksiyonu S. suis menenjit biyofilmler rollerini araştırmak için bir fare modeli tanımlanmıştır. S. suis planktonik hücreleri veya biyofilm devlet hücreleri doğrudan 3, 5 mm bregma rostral bulunan enjeksiyon sitesi aracılığıyla farelerin Subaraknoid boşluk içine enjekte edildi. Histopatolojik Analizi ve TLR2 artan mRNA ifade ve sitokinler biyofilm devlet hücreleri enjekte fareler gelen beyin dokusunun S. suis biyofilm S. suis menenjit kesin rol oynar açıkça belirtti. Bu yolu enfeksiyonu diğer yolları enfeksiyonu, ana bilgisayar-bakteri etkileşim çalışma izin üzerinde belirgin avantajları vardır. Ayrıca, bakteriyel bileşenleri etkisi ana bilgisayar bağışıklık yanıtı doğrudan beyindeki değerlendirilmesi için izin verir ve merkezi sinir sistemi bakteriyel giriş taklit eder. Bu yolu enfeksiyonu diğer bakterilerin neden olduğu menenjit mekanizmalarının araştırılması için genişletilebilir. Üstelik, o da bakteriyel menenjit karşı ilaçların etkinliğini test etmek için kullanılabilir.
Introduction
Streptokok suis (S. suis) büyük bir bakteriyel patojen domuz dünya çapında, menenjit, pnömoni, septisemi, endokardit ve artrit1de dahil olmak üzere ağır hastalığa neden oluyor. Ortaya çıkan olabilmekte ajanı da sağlar. Şimdiye kadar bu dokuz serotipleri enfeksiyon serotipleri 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 ve 312,3,4de dahil olmak üzere insanlarda neden olabilir bildirilmiştir. İnsanlar ve domuzlar, menenjit S. suis enfeksiyonlar önemli klinik belirtileri biridir. Vietnam ve Tayland, S. suis menenjit yetişkin5önemli nedenidir. Mikrobiyal biyofilmler birbirine bağlı ve bir arabirim konsantre olan mikroorganizmalar vardır; Onlar bakteriyel virülans, çeşitli ortamlarda ve antibiyotik direnci5hayatta kalmak için gereklidir. Biyofilmler genellikle genellikle polisakkaritler, proteinler ve DNA6içeren bir hücre dışı matriks tarafından çevrili. İkinci ana bilgisayar inflamatuar yanıt ve sitokin üretim7temin edebilmektedir. Biyofilm oluşumu önceki çalışmalarda streptokok menenjit dahil olmak için rapor edildi. Streptococcus agalactiae menenjit tilapia balık modelindeki biyofilmler katkıda ve biyofilm oluşumu ortaya beyin doku içinde ve çevresinde meninjeal vivo içinde ile intra abdominal aşılama8yüzeyler. Menenjit sırasında bir biyofilm benzeri durumda Streptococcus pneumoniae ve böyle bir biyofilm devlet bakterilerde bir fare enfeksiyon modeli9menenjit inducing daha etkili. Buna ek olarak, bizim önceki çalışma, S. suis fare beyin ile ilişkili biyofilm durumu bakteriyel virülans için hayatta kalma analiz10tarafından katkıda bulunur. Ancak, doğrudan kanıt S. suis menenjit biyofilm katılımı için daha fazla araştırma gerektirir.
Mayi (IP)11, burunici (i.n.)12, şarapla (IV)13ve enfeksiyon14, intracisternal (araç ten) yollarını kullanarak farelerde hayvan modelleri S. suis enfeksiyon geliştirilmiştir 15 , 16. ancak, enfeksiyon ı.p., i.n. ve damar içi enjeksiyona yolları menenjit doğrudan beyindeki S. suis yüzey bileşenlerinde rolleri eğitim için uygun değildir. Bu hücre dışı matriks biyofilmler üzerinden içerir. Her ne kadar araç ten aşılama S. suis enfeksiyonu için kullanılan, hassas enjeksiyon yeri bu gazetelerde tanımlanmıştır değil. Buna ek olarak, intrakranial subarachnoidal aşı enjeksiyon izi stereotaksik koordinatlarını açıkça tarif edilmiş bir önceki çalışma17'. Bu aşı noktası ve daha fazla basit Deneysel protokol kolay tanınmasını sağladı. Buna ek olarak, intrakranial subarachnoidal yolu enfeksiyonu taklit eden bakteri giriş merkezi sinir sistemi sinüsler veya orta kulak17ve orta kulak ve S. suis tarafından neden menenjit ilişkisi içine Madsen ve ark18tarafından kanıtlanmıştır. Ayrıca, intrakranial subarachnoidal yolu enfeksiyonu farelerde uygulayarak, biz S. suis küçük RNA rss04 menenjit bizim önceki çalışma10katkıda göstermiştir.
Mevcut çalışma, intrakranial subarachnoidal yolu enfeksiyonu farelerde S. suis menenjit biyofilmler rollerini araştırmak için kullanıldı. Fareler planktonik hücreleri veya S. suis biyofilm devlet hücreleri ile enfeksiyon bu yoldan bulaşmış. Histopatolojik Analizi ve TLR2 ve sitokinler biyofilm devlet hücreleri enjekte farelerin beyin dokusundan artan mRNA ifadesi açıkça S. suis biyofilm menenjit için katkıda belirtti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Fare enfeksiyon deneyler laboratuvar hayvan İzleme Komitesi Jiangsu Province, Çin tarafından onaylanmış ve laboratuvar hayvan Merkezi, Nanjing Tarım Üniversitesi'nde gerçekleştirilen (izin numarası: SYXK (Su) 2017-0007).
1. bakteri hazırlanması
Not: S. suis serotip 2 öldürücü soy P1 7/menenjit19hastalıklı bir domuzla yalıtılmış. Zorlanma P1/7 Todd-Hewitt suyu yetiştirilen (THB, formül en düşük THB litre başına: kalp infüzyon, 3.1 g neopeptone, 20.0 g dekstroz, 2.0 g; sodyum klorür, 2.0 g; disodyum fosfat, 0.4 g; sodyum karbonat, 2.5 g) ve Todd-Hewitt agar (THA, litre başına formül üzerinde kaplama THA: Kalp infüzyon, 3.1 g; neopeptone, 20.0 g; dekstroz, 2.0 g; Sodyum klorür, 2.0 g; disodyum fosfat, 0.4 g; sodyum karbonat, 2.5 g; ağar, 15,0 g) 37 ° C ve % 5 CO2.
- Topluluğu P1/7 planktonik hücreleri zorlanma
- Planktonik hücre 5 mL orta log fazı kültüründen toplamak (OD600= 0,6), santrifüj kapasitesi 8000 × g de 3 dakika ve sonra 3 kez PBS ile yıkayın.
- 5 mL % 25 gliserol içinde en düşük THB, 5 tüpler içine aliquot de bulunduğu hücreleri resuspend ve-80 ° C'de depolayın
- Topluluğu P1/7 biyofilm devlet hücreleri zorlanma
- Bir gecede kültür 20 mL al ve taze en düşük THB için 180 mL ekleyin; seyreltilmiş kültür 10 yuvarlak kültür kalıplara eşit, bölmek ve sonra % 5 CO2 37 ° C'de bir kuluçka 24 h için plakaları koymak.
- Kuluçka sonra yavaşça plakasına kalmadığımızı bakteri resuspend için plaka sallamak ve o zaman süpernatant aspirasyon tarafından atın.
Not: plaka yavaşça sallayın ve tortu resuspending kaçının. - Biyofilm devlet hücre hasat, tortu tamamen resuspend ve o zaman örnek için yeni bir tüp transferi için PBS 5 mL ekleyin.
- Aşağıdaki parametreler ile son adım biyofilm devlet hücrelerden solüsyon içeren temizleyicide: 60 W, 4 döngüleri, 5 s off üzerinde ve 10 sn.
- 8000 × g de 3 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant-80 ° C'de depolayın
Not: Süpernatant biyofilm bileşenleri içerebilir ve biyofilm bakteri daha önce hayvan deneyleri (adım 3) açıklandığı gibi enfeksiyon resuspend için kullanılabilir. - En düşük THB içinde tortu 10 mL % 25 gliserol ile resuspend ve biyofilm devlet hücreleri-80 ° C'de depolayın
2. Tarama elektron mikroskobu (SEM) analiz
- Toplanan biyofilm devlet hücreleri ve 12-24 h 4 ° C'de % 4 paraformaldehyde kullanarak planktonik hücreleri tamir
- Örnekleri hızlı distile su ile durulama ve etanol (% 25, % 50, % 70, % 90 ve % 100) 30 dk içinde her çözümü için artan bir konsantrasyon sırayla örnekleriyle kurutmak.
- Kurutulmuş örneklerini sahipleri çift taraflı bant ile metal ve sonunda onları bir buharlaştırıcı altın ve Paladyum içinde kat için uygun.
- Taramalı elektron mikroskobu aşağıdaki parametreleri kullanarak tarafından örnekleri gözlemlemek: EHT (ekstra yüksek gerilim) = 10 kV; WD (mesafe çalışma) = 7.0 veya 8.0 mm; Büyütme = 5000 ×; Sinyal A SE1 =.
3. hayvan deneyleri
- SPF 6-hafta-yaşlı kullanın Bu çalışmada kadın BALB/c fareler. Kafa içi subarachnoidal yolu enfeksiyonu olan enjeksiyon izi bulunduğu 3, 5 mm bregma rostral olduğunu tüm fareler bulaştırmak. Enjeksiyon yeri stereotaksik koordinatlarını açıkça Chiavolini ve ark17tarafından tarif edildi.
- Histopatolojik analiz için iki grup (grup başına 5 fareler) farelerin bulaştırmak planktonik hücreleri veya biyofilm kullanarak devlet bir doz 3 × 107 birim (CFU) koloni oluşturan hücreleri ve başka bir 5 fare denetimi olarak PBS ile enjekte edildi.
- TLR2 ve sitokinler beyin, mRNA ifade tespiti bulaştırmak için farelerin (grup başına 6 fareler) iki ek grupları planktonik hücreleri veya biyofilm kullanarak devlet 3 × 107 CFU bir doz hücreleri.
- Üstünde-e doğru bu seri dilutions kaplama tarafından canlı bakteri sayısını belirleyin.
- 12 h sonrası enfeksiyon daha fazla araştırma için tüm fareler ötenazi.
Not: Stok orta gliserol enfeksiyonu önce kaldırılması gerekir. Planktonik hücreleri ve biyofilm devlet hücreleri-80 ° C'den kurtarılan 3 kez PBS ile yıkanır. Sonra planktonik hücreleri PBS ile resuspended ve enfeksiyon için uygun doza seyreltilmiş; biyofilm devlet hücreleri saklı süpernatant (Kimden adım 1.2.5) ile resuspended ve enfeksiyon için uygun doza seyreltilmiş. Enfeksiyon için birim fazla 50 µL olmamalıdır.
- TLR2 ve sitokinler mRNA ifadesi beyin dokusunda algılama
- Toplam RNA, RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak beyin dokusundan ayıklayın.
- Her fare için tüm beyin dokusu RNA ayıklamak için kullanın. Bütün beyin dokusu 5 tüpler içine bölün. 100 mg beyin dokusu ile alıp kit tarafından sağlanan lysing matris içeren her tüp için 1 mL lizis çözeltisi ekleyin.
- Bir homogenizer 40 tüpte işlemek bir ayar 6.0 ve daha sonra santrifüj tüpü 12000 × g ve 4 ° C 5 min için s.
- Santrifüjü sonra üst aşaması için yeni bir microcentrifuge tüp aktarın.
- Oda sıcaklığında 5 min için transfer edilen örnek kuluçkaya; kloroform, 10 için girdap 300 µL eklemek s ve oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
- Tüp 12000 ×, santrifüj kapasitesi g ve 4 ° C'de 5 dakika süreyle aktarmak üst aşaması için yeni bir tüp.
- 5 kez ters çevirme önce Tüp, soğuk mutlak etanol 500 µL ekleyin ve örnek için en az 1 h-20 ° C'de depolayın.
- Tüp 12000 ×, santrifüj kapasitesi g ve 4 ° C'de 15 dakika ve süpernatant kaldır. Yıkama 500 µL RNase free H2o soğuk % 75 etanol ile Pelet
- Kaldır etanol, hava kuru oda sıcaklığında ve resuspend RNA içinde 100 µL RNase free H2o 5 min için Pelet
- Oda sıcaklığında 5 min için RNA kuluçkaya ve RNA bioanalyzer kullanarak RNA konsantrasyonu belirlemek.
- CDNA sentezi, genomik DNA (gDNA), bir thermocycler bir ters Transkripsiyon (RT) reaktif kiti ile kullanarak kaldırılması da dahil olmak üzere gerçekleştirin.
- Birim ulaşır 10 µL. kuluçkaya kadar 42 ° C'de 2 min için bir tüp içeren 2 µL 5 x gDNA eleme arabelleği, gDNA eleme enzim ve RNase free H2O 1 µL RNA'ın 1 µg ekleyin
- 10 µL ana karışımı ekleyin (RT enzim 1 µL Mix I, RT astar Mix 1 µL, 4 µL 5 tampon 2 x ve 4 µL RNase free H2O) tepki çözüm son adım ve sonra hafifçe karıştırın. Hemen RT tepki ile devam: 37 ° C 15 dk ve sonra 85 ° C 5 s.
- SYBR RT-qPCR kiti ile gerçek zamanlı PCR makinasıyla nicel gerçek zamanlı PCR (RT-qPCR) çözümlemesi gerçekleştirin. 2 enzim x 10 µL, ileri astar, 0.8 µL ters astar, 0.4 µL 50 x ROX başvuru boya II, cDNA şablonu ve RNase free H2O 2 µL 0.8 µL toplam hacmi 20 µL kadar ekleyin.
- Her örnek nüsha aşağıdaki termal parametrelerini kullanarak çalıştırın: 30 s 94 ° C'de 5 40 döngüsü tarafından takip s 95 ° c ve 34 s son aşaması 15 ile 60 ° C'de s 95 ° c, 1 dk. 60 ° c ve 15 s 95 ° C'de Astar RT-qPCR için Tablo 1' de listelenmiştir. Temizlik genler B2m ve 18s rRNA iç kontrol kullanılmıştır.
- 2-ΔΔCt yöntemine göre göreli kat değişir hesaplayın.
- Toplam RNA, RNA ekstraksiyon kiti kullanılarak beyin dokusundan ayıklayın.
-
Histolojik kesitler gözlenmesi
- % 10 formalin ile 24 h fiksasyon sonra sabit beyin dokusu içine 2-3 mm doku parçaları uygun ölçüde yeniden.
- Gömme bir kasete doku adet koyun ve dehidratasyon ile otomatik bir vakum kurutucu için yeni bir sabitleştirici çözüm bırakın.
- Sabit doku almak ve etanol (% 70, %80, % 95, % 95 ve % 100) 30 dk içinde her çözüm için konsantrasyonları artan sırayla kurutmak.
- Ksilen 15 dakika ile örnek transparentize, o Sıvı parafin 90 dk 60 ° C'de eğim ve gömme bir makine kullanarak embed.
- Parafin blok gömülü doku 3 µm dilimler halinde kesip, dilim su 45 ° c üzerinde döşeme ve sonra hava kuru.
- 60 ° C'de 3 h için bir bölüm kuluçkaya, haematoxylin ve eozin (o) kullanarak yöntemi leke ve tarafsız sakız ile kapatın.
- Histopatolojik değişiklikleri beynin optik mikroskopla gözlemlemek. Bir dört maddelik derecelendirme sistemi histolojik değişiklikler değerlendirmek için kullanıldı. Bir unpaired t testi istatistiksel analizi için kullanın.
Tıkanıklık/kanaması: yok, o 0; odak tıkanıklık/kanaması, küçük alanda 1 puan edinildi; geniş alan fokal tıkanıklık/kanaması veya fokal tıkanıklık/kanaması, küçük alanının birden çok site 2 puan edinildi; üç büyük odak tıkanıklık/kanaması siteleri kadar 3 puan edinildi; tıkanıklık/kanaması diffüz, 4 puan.
Nekroz: yok, o 0; odak nekroz, 1; puan edinildi 1-10 nekrotik hücre oluşumunu diffüz, o 2 puan; konfluent nekroz, Foci puan edinildi 3; geniş konfluent nekroz, 4 puan edinildi.
İltihabi hücre infiltrasyonu: yok, o 0; kaç ve odak infiltrasyonlar, 1 puan edinildi; çok görüşlü infiltrasyon veya toplamları, oluşumu infiltrations 2 puan edinildi; Üç toplamları kadar 3 puan edinildi; ve dörtten fazla toplamları, puan 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SEM analiz biyofilm oluşumu deneysel koşullar altında incelemek için gerçekleştirildi. Şekil 1' de gösterildiği gibi biyofilm oluşumu planktonik hücreleri (Şekil 1A) ve biyofilm devlet hücreleri (Şekil 1B) arasında önemli bir fark vardır. SEM analiz biyofilm bakteri kümeleri ve planktonik bakteriler tek tek daha az yoğun ve esas olarak dağınık iken birden çok katman ve hücre dışı matriks içinde kaplı idi olduğunu gösterdi.
Biyofilmler gibi DNA, hücre dışı matriks bileşenlerinin ana bilgisayar inflamatuar yanıt ve sitokin üretim temin edebiliyoruz. TLR2 ve sitokinler CCL2 beri Il-6 ve TNF-α menenjit önceki çalışmalar10,11,20, bu genlerin ifade karşılaştırıldığında mRNA göre ilgili beyin inflamatuar yanıt içinde dahil olan içinde vivo için fare ile planktonik hücreleri enfekte ve bu biyofilm devlet hücreleri ile enfekte. Bu inflamatuar yanıt olarak fare beyin dokusu üzerinde biyofilmler etkisini keşfetmeye yapıldı. Şekil 2' de, 12 h sonrası enfeksiyon Il-6, TLR2, CCL2, ifadesinin gösterildiği gibi ve TNF-α gelen virüslü farelerin beyinlerinin biyofilm devlet hücrelerin planktonik hücreleri ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde daha yüksek.
Biyofilm bakteri ile enfekte fareler menenjit (sert duruş, ataksi veya kasılmalar) çok daha şiddetli belirtileri bu planktonik bakteri ile enfekte daha gösterdi. P1/7 tıkanıklık/kanaması, nekroz ve inflamatuar hücre infiltrasyonu meninkslerde, serebral korteks, ventrikül veya diencephalon (Şekil 3) gösterdi S. suis zorlanma ile enfekte fareler gelen beyin dokusunun histolojik inceleme . 12 sonrası enfeksiyon, çok daha şiddetli patolojik değişiklikler (Şekil 3A-D), biyofilm bakteri ile enfekte fareler gelen beyin dokusunda gözlendi s (resim 3E-H), planktonik bakteri ile enfekte fareler ile karşılaştırıldığında tıkanıklık/kanaması, nekroz veya yoğun iltihabi hücre infiltrasyonu geniş alanlar dahil olmak üzere. Fare beyninden brüt patolojik değişiklikleri planktonik ile enfekte ve biyofilm bakteri Tablo 2' de kaydedildi. Ne patolojik değişiklikler ne de nörolojik belirtiler PBS ile enjekte fareler üzerinden tespit edildi. Birlikte ele alındığında, bu veriler açıkça S. suis biyofilmler menenjit indüksiyon katkı gösteriyor.
Resim 1: SEM görüntüleri süzün P1/7 planktonik hücreleri ve biyofilm devlet hücreleri. En düşük THB ortamda kültürlü bakteri. SEM analiz planktonik hücreleri(a)ayrı ayrı, süre biyofilm bakteri (B) kümeleri kümelenmiş ve birden çok katman ve hücre dışı matriks kaplı idi çok daha az yoğun ve esas olarak dağınık olduğunu gösterdi. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2: biyofilmler etkinleştirmek CCL2, mRNA ifade TLR2 fare beyin dokusu içinde IL-6 ve TNF-α in vivo. Grup başına altı BALB/c fareler her 3 × 107 CFU ile enfeksiyon planktonik hücreleri veya biyofilm devlet hücreler intrakranial subarachnoidal yönlendirme yolu enjekte edildi. Fareler 12 h sonrası enfeksiyon euthanized. Kat mRNA ifade hücre enfekte fareler planktonik hücre enfekte fareler ile karşılaştırıldığında biyofilm devlet değiştikçe sonuçları sunulmuştur. (A) gen b2a referans gen kullanılan; (B) gen 18s rRNA referans gen kullanıldı. Bir unpaired t-testi istatistiksel analiz için kullanıldı. ** p ≤0.01, ve * p ≤0.05. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: gerilme P1/7 ile enfekte farelerin beyin dokusunun histolojik analiz planktonik bakteri ve biyofilm devlet bakteri. A-D, fareler biyofilm devlet bakteri ile enfekte beyin örnekleri; E-H, beyin örnekleri planktonik bakteri ile enfekte fareler. A, B, E ve f meninkslerde ve serebral korteks; C ve G: ventrikül; D ve H: diencephalon. Δ, tıkanıklık/kanaması; □, nekroz; ○: inflamatuar hücre infiltrasyonu. Büyütme = 200 X; ölçek çubuğu 100 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
| Astar adı | Sıra (5' - 3') | Gene sembolü |
| Il-6 ileri | CTTCCATCCAGTTGCCTTCT | Il6 |
| Il-6 ters | CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG | Il6 |
| TLR2 ileri | CACTATCCGGAGGTTGCATATC | Tlr2 |
| TLR2 ters | GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC | Tlr2 |
| CCL2 ileri | CTCACCTGCTGCTACTCATTC | Ccl2 |
| CCL2 ters | ACTACAGCTTCTTTGGGACAC | Ccl2 |
| TNF-α ileri | TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT | TNF |
| TNF-α ters | GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG | TNF |
| Β2m ileri | GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT | B2a |
| Β2m ters | TATGTTCGGCTTCCCATTCTC | B2a |
| ileri 18s | GTAACCCGTTGAACCCCATT | 18s rRNA |
| 18s ters | CCATCCAATCGGTAGTAGCG | 18s rRNA |
Tablo 1: Astar için RT-qPCR.
Tablo 2: fare ile enfekte beyinden brüt histopatolojik değişiklikleri S. suis P1/7 süzün. Bölüm 3.3.7 iletişim kuralında tanımlandığı gibi bir dört maddelik derecelendirme sistemi histolojik değişiklikler, değerlendirmek için kullanıldı. Toplam skor farklı histopatolojik değişikliklerden puanları toplamı olarak hesaplanır. Ortalama puanı/sayısı fareler hesaplanır. Bir unpaired t-testi istatistiksel analiz için kullanıldı. ** p ≤0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan enfeksiyon intrakranial subarachnoidal rotanın diğer yolları enfeksiyonu üzerinde belirgin avantajları vardır. Ana bilgisayar-bakteri etkileşim ve bakteriyel bileşenleri etkisi ana bilgisayar bağışıklık yanıtı doğrudan beyindeki hangi bakteri giriş merkezi sinir sistemi taklit çalışmaya müfettişler sağlar. Böylece, bu yolu enfeksiyonu diğer bakterilerin neden olduğu menenjit mekanizmalarının araştırılması için genişletilebilir. Üstelik, o da bakteriyel menenjit karşı ilaçların etkinliğini test etmek için kullanılabilir.
Bu modeli kullanan iyi sonuçlar elde etmek için aşağıdaki önemli adımlar açık. Biyofilm oluşumu deneysel koşullar altında incelenmesi gereken. Bu da çalışmanın, taramalı elektron mikroskobu analizi ile incelenmiştir. Doku kültürü plaka yöntemi ve tüp yöntemi21gibi diğer yöntemler de biyofilm oluşumu, incelemek için kullanılabilir. Bir gün önce enfeksiyon, aliquots planktonik hücreleri ve biyofilm devlet hücre CFU belirlemek için-80 ° C'den çözdürülen gerek. Ertesi gün, uygun doza göre enfeksiyon için CFU bakteri seyreltilmiş. Eklenmek üzere PBS ihtiyaçları ve sahte enfekte kontrol grubundan fareler ile enjekte sahte enfekte kontrol grubu yok bulgular enfeksiyon deneme süresi sırasında göstermelidir. Bir ön deneme uygun bulaşıcı doz belirlemek için önerilir böylece farklı suşları farklı bulaşıcı dozda, olabilir. Bu da çalışmanın, bizim ön deney üzerinde dayalı bir doz 3 × 107 CFU enfeksiyon için kullanıldı. Biyofilm bakteri bu doz menenjit ve tüm 5 farelerde 48 saat sonraki ölümünden sonra ön denemede enfeksiyon şiddetli belirtileri ikna etmeyi başardı.
Kan-beyin ya da kan cerebrospinal sıvı engellerin S. suis tarafından kesintiye uğraması menenjit22,23,24neden önemli bir adım vardır. Kafa içi subarachnoidal yolu enfeksiyonu S. suis bu engelleri kırmak yoluyla yeteneği değerlendirmek için uygun değildir. Diğer yolları enfeksiyonu, IP, damardan veya i.n., bu hedefe ulaşmak için kullanılabilir.
Burada, biz ilk S. suis biyofilm intrakranial subarachnoidal yolu enfeksiyonu kullanmanın menenjit indüksiyon katkı göstermektedir. Bu enfeksiyon model sadece S. suis menenjit mekanizmaları daha fazla anlamaya yardımcı olur ancak aynı zamanda diğer bakteri ve bakteriyel menenjit karşı yeni ilaçların etkinliğini neden menenjit patogenezinde çalışmak için uygundur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa gerek yok.
Acknowledgments
Bu eser ulusal anahtar araştırma ve geliştirme programı Çin [2017YFD0500102]; gelen hibe tarafından desteklenmiştir Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı Çin [31572544]; Devlet anahtar laboratuvar veteriner etiyolojik biyoloji [SKLVEB2016KFKT005]; Shanghai tarım teknoloji geliştirme programı, Çin [G2016060201] uygulanan.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
- Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen? Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
- Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45 (2014).
- Kerdsin, A., et al. Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).
- Hatrongjit, R., et al. First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand. BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).
- Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis. Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).
- Isiaku, A. I., et al. Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish. Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).
- Oggioni, M. R., et al. Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).
- Xiao, G., et al. Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model. Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).
- Seitz, M., et al. A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2. Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).
- Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).
- Williams, A. E., Blakemore, W. F. Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).
- Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection. Pathogens. 5 (3), (2016).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiology. 4, 36 (2004).
- Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs. Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).
- Holden, M. T., et al. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis. PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).
- Dominguez-Punaro Mde, L., et al. In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis. Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).
- Hassan, A., et al. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).
- Vanier, G., et al. New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).
- Takeuchi, D., et al. The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis. Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).
