Summary
Hier beschreiben wir die intrakranielle Subarachnoidal-Route der Infektion bei Mäusen, Rollen von Biofilmen in Streptococcus Suis Meningitis zu studieren. Diese Infektionsmodell eignet sich auch für die Untersuchung der Pathogenese der anderen bakteriellen Meningitis und die Wirksamkeit neuer Medikamente gegen bakterielle Meningitis.
Abstract
Streptococcus Suis ist nicht nur eine große bakterielle Erreger von Schweinen weltweit, sondern auch ein emerging zoonotische Agent. Bei Menschen und Schweinen ist Meningitis eine wichtige Manifestation des S. Suis Infektionen. Eine geeignete Infektionsmodell ist ein wichtiges Instrument zum Verständnis der Mechanismen von Krankheiten durch Krankheitserreger verursacht. Mehrere Wege der Infektion bei Mäusen wurden entwickelt, um die Pathogenese der Infektion S. Suis zu studieren. Die intraperitoneal, intranasale und intravenösem Wege der Infektion sind jedoch nicht geeignet für die Rollen von S. Suis Bauteilen in Meningitis direkt im Gehirn, wie z. B. die extrazelluläre Matrix von Biofilmen zu studieren. Obwohl Intracisternal Impfung für S. Suis Infektion verwendet worden ist, ist die genaue Einstichstelle nicht beschrieben worden. Hier wurde die intrakranielle Subarachnoidal-Route der Infektion in einem Mausmodell zu untersuchen, die Rollen von Biofilmen in S. Suis Meningitis beschrieben. S. Suis planktonischen Zellen oder Biofilm Staat wurden direkt in den Subarachnoidalraum von Mäusen durch die Einstichstelle befindet sich 3,5 mm von der Bregma rostral injiziert. Histopathologische Analyse und erhöhte mRNA Expression von TLR2 und Zytokine des Hirngewebes von Mäusen injiziert mit Biofilm Zustand Zellen deutlich gezeigt, dass S. Suis Biofilm in S. Suis Meningitis definitive Rollen spielt. Diese Route der Infektion hat offensichtliche Vorteile gegenüber anderen Wege der Infektion, so dass die Studie der Interaktion Host-Bakterium. Darüber hinaus erlaubt es die Wirkung von bakteriellen Komponenten auf Host Immune Antworten direkt in das Gehirn zu beurteilenden und imitiert bakterielle Eingang in das zentrale Nervensystem. Diese Route der Infektion kann erweitert werden, für die Untersuchung der Mechanismen der Meningitis verursacht durch andere Bakterien. Darüber hinaus können auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von Medikamenten gegen bakterielle Meningitis zu testen.
Introduction
Streptococcus suis (S. Suis) ist eine große bakterielle Erreger von Schweinen weltweit, verursacht schwere Krankheiten wie Meningitis, Lungenentzündung, Blutvergiftung, Endokarditis und Arthritis1. Es ist auch ein emerging zoonotische Agent. Bisher wurde berichtet, dass neun Serotypen Infektion beim Menschen, darunter Serotypen 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 und 312,3,4auslösen können. Bei Menschen und Schweinen ist Meningitis eine der wichtigsten klinischen Zeichen von S. Suis Infektionen. S. Suis ist in Vietnam und Thailand die wichtigste Ursache der Meningitis bei Erwachsenen5. Mikrobielle Biofilme sind Mikroorganismen, die zueinander halten und an einer Schnittstelle konzentriert sind; Sie sind unerlässlich für bakterielle Virulenz, Überleben in verschiedenen Umgebungen und Antibiotika-Resistenz-5. Biofilme sind in der Regel eine extrazelluläre Matrix umgeben, die in der Regel Polysaccharide, Proteine und DNA-6 enthält. Letzteres ist in der Lage, Host Entzündungsreaktionen und Cytokine Produktion7zu entlocken. Biofilmbildung wurde berichtet, an Streptokokken Meningitis in früheren Studien zu beteiligen. Biofilme tragen Streptococcus Agalactiae Meningitis in einem Tilapia-Fisch-Modell und Biofilmbildung im Hirngewebe aufgedeckt worden und um meningealen Oberflächen in Vivo durch intra-abdominalen Impfung8. Bei Meningitis Streptococcus Pneumoniae ist in einem Biofilm-ähnlichen Zustand und Bakterien in einem solchen Biofilm Zustand waren effektiver bei der Induktion von Meningitis in einem Maus-Infektion Modell9. Darüber hinaus in unserem früheren untersuchen, der Biofilm Zustand zugeordnet S. Suis im Gehirn der Maus trägt zur bakteriellen Virulenz von überleben Analyse10. Direkte Beweise für Biofilm Beteiligung an S. Suis Meningitis Bedarf jedoch weiterer Untersuchungen.
Tiermodelle der S. Suis Infektionen wurden bei Mäusen mit der intraperitonealen (i.p.)11, intranasale (i.n.)12, intravenös (i.v.)13und die Intracisternal (i.c) Wege der Infektion14, entwickelt 15 , 16. jedoch die i.p., i.n. und i.v. Infektionswege sind nicht geeignet für die Rollen von S. Suis Bauteilen in Meningitis direkt im Gehirn zu studieren. Dazu gehören die extrazellulären Matrix von Biofilmen. Obwohl die i.c-Impfung für S. Suis Infektion verwendet wurde, wurde die genaue Einstichstelle nicht in diesen Papieren beschrieben. Im Gegensatz dazu der stereotaktischen Koordinaten der Injektionsstelle intrakranielle Subarachnoidal Impfung ist eindeutig in einer früheren Studie17beschrieben worden. Dies erlaubt leichte Erkennbarkeit von der Impfung und weitere vereinfachende experimentelles Protokoll. Darüber hinaus imitiert die intrakranielle Subarachnoidal-Route der Infektion bakterielle Eingang in das zentrale Nervensystem aus die Nasennebenhöhlen oder das Mittelohr17und die Beziehung zwischen dem Mittelohr und Meningitis verursacht durch S. suis Madsen Et al.18nachgewiesen wurde. Darüber hinaus haben wir durch die Anwendung der intrakraniellen Subarachnoidal-Route der Infektion bei Mäusen, gezeigt, dass kleine RNA-rss04 S. Suis Meningitis in unserem vorherigen Studie10trägt.
In der vorliegenden Studie, die intrakranielle Subarachnoidal-Route der Infektion wurde bei Mäusen verwendet, um die Rollen von Biofilmen in S. Suis Meningitis zu untersuchen. Mäuse wurden mit planktonischen Zellen oder Biofilm Zustand von S. Suis auf diesem Weg der Infektion angesteckt. Histopathologische Analyse und erhöhte mRNA Expression von TLR2 und Zytokine aus Hirngewebe von Mäusen injiziert mit Biofilm Zustand Zellen deutlich erklärt, dass S. Suis Biofilm zur Meningitis beiträgt.
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Protocol
Die Maus-Infektions-Experimente wurde genehmigt durch das Labor Tier Monitoring Committee der Provinz Jiangsu, China und in Laboratory Animal Center of Nanjing Agricultural University durchgeführt (Anzahl zu ermöglichen: SYXK (Su) 2017-0007).
1. Vorbereitung von Bakterien
Hinweis: S. Suis Serotyp 2 virulenten Stamm P1/7 wurde von einem Kranken Schwein mit Meningitis19isoliert. Sorte P1/7 wuchs in Todd Hewitt Brühe (THB, Formel pro Liter THB: Herz Infusion, 3,1 g Neopeptone, 20,0 g Traubenzucker, 2,0 g, Natriumchlorid, 2,0 g; binatrium Phosphat, 0,4 g; Natriumcarbonat, 2,5 g) und vergoldeten auf Todd Hewitt Agar (THA, Formel pro Liter THA: Herz-Infusion, 3,1 g; Neopeptone, 20,0 g; Traubenzucker, 2,0 g; Natrium-Chlorid, 2,0 g; binatrium Phosphat, 0,4 g; Natriumcarbonat, 2,5 g; Agar, 15,0 g) bei 37 ° C und 5 % CO2.
- Sammlung von Stamm P1/7 planktonischen Zellen
- Sammle 5 mL von planktonischen Zellen von Mid Log-Phase Kultur (OD600= 0,6) für 3 min bei 8000 × g zentrifugiert und dann 3 Mal mit PBS waschen.
- Aufschwemmen der Zellen mit 5 mL 25 % Glycerin in THB, aliquoten in 5 Röhren, und dann speichern bei-80 ° C.
- Sammlung von Stamm P1/7 Biofilm Zustand Zellen
- Nehmen Sie 20 mL einer Übernacht-Kultur und 180 mL frisch THB hinzufügen; Teilen Sie die verdünnte Kultur in 10 Runden Kultur Platten gleichermaßen, und setzen Sie dann die Platten in einem Inkubator bei 37 ° C in 5 % CO2 für 24 h.
- Nach der Inkubation schütteln die Platte vorsichtig, um die Bakterien aufzuwirbeln, die die Platte nicht eingehalten haben, und verwerfen Sie den Überstand durch Absaugen.
Hinweis: Schütteln Sie die Platte leicht und vermeiden Sie resuspending Sediment. - Hinzugeben Sie 5 mL PBS Biofilm Zustand Zellen zu ernten, völlig das Sediment aufzuwirbeln und übertragen Sie dann die Probe auf eine neue Tube.
- Beschallen die Biofilm Zustand Zellen aus dem letzten Schritt mit den folgenden Parametern: 60 W, 4 Zyklen, 5 s auf und 10 s aus.
- Für 3 min bei 8000 × g zentrifugiert und den Überstand bei-80 ° c Lagern
Hinweis: Der Überstand enthält möglicherweise Komponenten von Biofilm und es kann verwendet werden, um den Biofilm-Bakterien vor der Infektion wie beschrieben im Tierversuch (Schritt 3) Aufschwemmen. - Aufschwemmen Sie das Sediment mit 10 mL 25 % Glycerin in THB und dann speichern Sie die Biofilm Zustand Zellen bei-80 ° C.
2. Scannen Rasterelektronenmikroskopie (SEM) Analyse
- Befestigen Sie den gesammelten Biofilm Zustand Zellen und planktischen Zellen mit 4 % Paraformaldehyd für 12-24 h bei 4 ° C.
- Die Proben schnell mit destilliertem Wasser spülen und die Proben nacheinander mit einer zunehmenden Konzentration von Ethanol (25 %, 50 %, 70 %, 90 % und 100 %) für 30 min in jeder Lösung zu entwässern.
- Halten Sie die getrockneten Proben um Metall-Halter mit doppelseitigem Klebeband und schließlich in einem Verdampfer mit Gold und Palladium zu beschichten.
- Beobachten Sie die Proben durch ein Rasterelektronenmikroskop mit den folgenden Parametern: EHT (Extra High Tension) = 10 kV; WD (Arbeitsabstand) = 7.0 oder 8.0 mm; Vergrößerung = 5000 ×; Signal A = SE1.
(3) Tierversuche
- Verwenden Sie SPF 6 Wochen alten weiblichen BALB/c Mäusen in dieser Studie. Alle Mäuse durch die intrakranielle Subarachnoidal-Route der Infektion deren Einstichstelle befindet sich 3,5 mm von der Bregma rostral ist zu infizieren. Die stereotaktischen Koordinaten der Injektionsstelle wurden eindeutig von Chiavolini Et Al17beschrieben.
- Zur histopathologischen Analyse infizieren zwei Gruppen von Mäusen (5 Mäusen pro Gruppe) mit planktonischen Zellen oder Biofilm Zustand Zellen in einer Dosierung von 3 × 107 koloniebildenden Einheiten (KBE), und ein weiteres 5 Mäusen wurden mit PBS als Steuerelement injiziert.
- Für die Erkennung von mRNA Expression von TLR2 und Zytokine im Gehirn, infizieren zwei weitere Gruppen von Mäusen (6 Mäuse pro Gruppe) Zellen mit planktonischen Zellen oder Biofilm Zustand in einer Dosierung von 3 × 107 KBE.
- Bestimmen Sie die Anzahl der lebensfähigen Bakterien durch Ausplattieren Verdünnungsreihen an THA.
- Alle Mäuse bei 12 h nach der Infektion für die weitere Forschung einschläfern.
Hinweis: Glycerin in das Lager Medium muss vor der Infektion entfernt werden. Sowohl planktonischen Zellen und Biofilm Zustand erholte sich von-80 ° C werden 3 Mal mit PBS gewaschen. Planktonischen Zellen sind dann Nukleinsäuretablette mit PBS und verdünnt, um die geeignete Dosis für Infektion; Biofilm Zustand Zellen sind Nukleinsäuretablette mit der gespeicherten überstand (aus Schritt 1.2.5) und verdünnt, um die entsprechende Dosis für eine Infektion. Das Laufwerk für Infektion sollte nicht mehr als 50 µL.
- Erkennung von mRNA Expression von TLR2 und Zytokine im Gehirngewebe
- Extrahieren Sie die gesamte-RNS von Hirngewebe mit einem RNA-Extraktion-Kit.
- Verwenden Sie für jede Maus ganze Hirngewebe für RNA extrahieren. Teilen Sie ganze Hirngewebe in 5 Rohre. Bis zu 100 mg Hirngewebe und jedes Rohr, die lysiereinrichtung Matrix zur Verfügung gestellt vom Kit enthält fügen Sie 1 mL Lyse-Lösung hinzu.
- Verarbeiten Sie das Rohr in einem Homogenisator für 40 s bei einer Einstellung von 6.0 und dann Zentrifuge das Rohr bei 12000 × g und 4 ° C für 5 Minuten.
- Übertragen Sie nach Zentrifugation die obere Phase auf einen neuen Microcentrifuge Schlauch.
- Inkubieren Sie die übertragenen Probe für 5 min bei Raumtemperatur; Fügen Sie 300 µL Chloroform, Wirbel für 10 s, und dann 5 min bei Raumtemperatur inkubieren.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 12000 × g und 4 ° C für 5 min. die obere Phase auf einen neuen Schlauch übertragen.
- Das Rohr vor für 5mal invertierenden 500 µL kalten absoluten Ethanol hinzu, und speichern Sie dann die Probe bei-20 ° C für mindestens 1 h.
- Zentrifugieren Sie das Rohr auf 12000 × g und 4 ° C für 15 min und Entfernen der Überstand. Waschen Sie die Tablette mit 500 µL kalter 75 % Ethanol in RNase-freie H2O.
- Entfernen Sie das Ethanol, Lufttrocknen das Pellet für 5 min bei Raumtemperatur und Aufschwemmen der RNA in 100 µL RNase-freie H2O.
- Inkubieren Sie die RNA für 5 min bei Raumtemperatur und bestimmen Sie die RNA-Konzentration mit Hilfe einer RNA Bioanalyzer.
- Führen Sie die cDNA-Synthese, einschließlich der Beseitigung von genomischer DNA (gDNA), mit einem Thermocycler mit einem reversen Transkription (RT)-Reagenz-Kit.
- Fügen Sie 1 µg RNA zu einem Rohr mit 2 µL 5 X gDNA Beseitigung Puffer, 1 µL gDNA Beseitigung Enzym und RNase-freie H2O hinzu, bis das Volumen erreicht 10 µL. 2 min bei 42 ° c inkubieren
- Fügen Sie 10 µL des master-Mix (1 µL RT-Enzym-Mix I, 1 µL RT-Primer-Mix, 4 µL 5 x Puffer 2 und 4 µL RNase-freie H2O), der Reaktionslösung aus dem letzten Schritt und dann vorsichtig mischen. Gehen Sie sofort mit der RT-Reaktion: 37 ° C für 15 min und dann 85 ° C für 5 s.
- Führen Sie die quantitative Echtzeit-PCR (RT-qPCR) Analyse mit einer Real-Time PCR-Maschine mit einem SYBR RT-qPCR-Kit. Fügen Sie 10 µL 2 x Enzym, 0,8 µL forward Primer, 0,8 µL des rückwärts-Primer, 0.4 µL 50 x ROX Referenz Farbstoff II, 2 µL cDNA-Vorlage und RNase-freie H2O bis zu einem Gesamtvolumen von 20 µL.
- Führen Sie jede Probe in dreifacher Ausfertigung mit Hilfe der folgenden thermischen Parameter: 30 s bei 94 ° C, gefolgt von 40 Zyklen von 5 s bei 95 ° C und 34 s bei 60 ° C mit einer Endstufe von 15 s bei 95 ° C, 1 min bei 60 ° C , und 15 s bei 95 ° C. Primer für RT-qPCR sind in Tabelle 1aufgeführt. Housekeeping-Gene B2m und 18 s rRNA dienten als die internen Kontrollen.
- Berechnen Sie die relative Falte ändern sich je nach der 2-ΔΔCt -Methode.
- Extrahieren Sie die gesamte-RNS von Hirngewebe mit einem RNA-Extraktion-Kit.
-
Beobachtung der histologischen Abschnitte
- Rekonstruieren Sie nach 24 h Fixierung mit 10 % Formalin die festen Hirngewebe in entsprechender Größe Stück Gewebe bei ca. 2-3 mm.
- Die Gewebe in einer Kassette, einbetten und tauchen ein in eine neue Fixativ Lösung für Austrocknung mit einer automatischen Vakuum Dörrgerät.
- Das fixierte Gewebe herausnehmen und nacheinander in steigenden Konzentrationen von Ethanol (70 %, 80 %, 95 %, 95 % und 100 %) für 30 min in jeder Lösung zu entwässern.
- Transparentize der Probe mit Xylol für 15 min, Tauchen sie in flüssigem Paraffin bei 60 ° C 90 min und dann einbetten ein Einbettungs-Automaten.
- Schneiden Sie das Paraffin eingebettet Block Gewebe in 3 µm Scheiben, Fliesen Sie-Scheibe auf dem Wasser bei 45 ° C und dann an der Luft trocknen.
- Abschnitt 3 h bei 60 ° C inkubieren, Färben mit Hämatoxylin und Eosin (HE) Methode, und versiegeln Sie es mit der neutralen Kaugummi.
- Beobachten Sie die histopathologischen Veränderungen des Gehirns mit einem optischen Mikroskop. Eine Vierpunkt-grading-System wurde zur histologische Veränderungen zu bewerten. Verwenden Sie einen ungepaarten t -Test für statistische Analysen.
Staus/Blutung: fehlt, score 0; kleiner Bereich der fokalen Staus/Blutungen, Tor 1; großen Bereich der fokalen Staus/Blutungen oder mehrere Standorte der kleine Bereich der fokalen Staus/Blutungen, Tor 2; bis zu drei große fokale Staus/Blutung Standorte Tor 3; diffuse Staus/Blutungen, Note 4.
Nekrose: fehlt, score 0; Fokale Nekrose, Tor 1; Auftreten von 1-10 nekrotische Zellen diffundieren, 2 Punkte; Brennpunkte der konfluierende Nekrose score 3; umfangreiche konfluierende Nekrose, Note 4.
Entzündliche Zelle eindringen: fehlt, score 0; Paar und fokale Infiltrationen, Tor 1; multifokale Infiltration oder Infiltrationen mit Bildung von Aggregaten, score 2; bis zu drei Aggregate Tor 3; und mehr als vier Aggregate, Note 4.
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Representative Results
SEM-Analyse wurde durchgeführt, um Biofilmbildung unter den experimentellen Bedingungen zu untersuchen. Wie in Abbildung 1dargestellt, gibt es ein signifikanten Unterschied in der Biofilmbildung zwischen planktonischen Zellen (Abb. 1A) und Biofilm Zustand (Abbildung 1B). SEM-Analyse zeigte, dass Biofilm Bakterien in Klumpen und mehrere Ebenen, und sie in die extrazelluläre Matrix eingehüllt waren planktonischen Bakterien waren viel weniger dicht und vor allem dispersen individuell.
Die Komponenten der extrazellulären Matrix von Biofilmen, wie DNA, können Host Entzündungsreaktionen und Produktion von Zytokinen zu entlocken. Seit TLR2 und Zytokine CCL2 engagieren sich die IL-6 und TNF-α in zerebralen Entzündungsreaktionen im Zusammenhang mit Meningitis nach früheren Studien10,11,20, die mRNA Expression dieser Gene verglichen wurde in-vivo für Mäuse mit planktonischen Zellen infiziert und die mit Biofilm Zustand Zellen infiziert. Dies wurde getan, um die Wirkung von Biofilmen auf entzündliche Reaktion in murinen Hirngewebe zu erkunden. Wie in Abbildung 2, bei 12 h nach der Infektion, die Expression von TLR2, CCL2, IL-6 und TNF-α von Gehirnen von infizierten Mäusen war signifikant höher bei Biofilm Zustand Zellen im Vergleich zu planktonischen Zellen.
Mäuse mit Biofilm-Bakterien infiziert zeigten viel strengere Anzeichen einer Hirnhautentzündung (starre Haltung, Ataxie oder Krämpfe) als jene mit planktonischen Bakterien infiziert. Histologische Untersuchung des Hirngewebes von Mäusen mit S. Suis Belastung zeigte P1/7 Staus/Blutungen, Nekrose und entzündlichen Zelle eindringen in die Hirnhaut, Großhirnrinde, Ventrikel oder Zwischenhirn (Abbildung 3) infiziert . Im Vergleich zu Mäusen infizierte planktonischen Bakterien (Abb. 3E-H), um 12 Uhr nach der Infektion, weit schwerwiegende pathologische Veränderungen im Gehirngewebe von Mäusen mit Biofilm Bakterien (Abbildung 3A-D), infiziert beobachtet wurden auch große Teile der Verkehrsstaus/Blutungen, Nekrose oder intensive entzündliche Zelle eindringen. Die groben pathologischen Veränderungen im Gehirn von Mäusen mit planktonischen infiziert und Biofilm-Bakterien wurde aufgenommen in Tabelle 2. Pathologischen Veränderungen weder neurologische Symptome wurden von Mäusen injiziert mit PBS beobachtet. Zusammengenommen zeigen diese Daten deutlich, dass S. Suis Biofilme zur Induktion einer Meningitis beitragen.
Abbildung 1: SEM Bilder der Stamm P1/7 planktonischen Zellen und Biofilm Zustand. Bakterien wurden in THB Medium kultiviert. SEM-Analyse zeigte, dass planktonischen Zellen (A) viel weniger dicht und vor allem dispersen einzeln, während Biofilm Bakterien (B) in den Büscheln gruppiert wurden und mehrere Ebenen, und sie wurden in die extrazelluläre Matrix umhüllt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Biofilme aktivieren die mRNA Expression von CCL2, IL-6, TNF-α und TLR2 im Gehirngewebe Maus in Vivo. Sechs BALB/c Mäuse pro Gruppe wurden jeweils durch die intrakranielle Subarachnoidal-Route der Infektion mit 3 × 107 KBE von planktonischen oder Biofilm Zustand Zellen injiziert. Mäuse wurden in 12 h nach der Infektion eingeschläfert. Die Ergebnisse werden wie die Falte der mRNA Ausdruck in Biofilm Zustand ändern Zelle-infizierten Mäusen mit planktonischen Zelle-infizierten Mäusen im Vergleich. (A) das gen B2m diente als das Referenz-gen; (B) das gen 18 s rRNA diente als das Referenz-gen. Ein Ungepaartes t-Test wurde für statistische Analysen verwendet. ** p ≤0.01, und * p ≤0.05. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: histologischen Untersuchung des Hirngewebes von Mäusen mit Belastung P1/7 infiziert planktonischen Bakterien und Biofilm Zustand Bakterien. A-D, Gehirn Proben von Mäusen mit Biofilm Zustand Bakterien infiziert; E-H, Gehirn Proben von Mäusen mit planktonischen Bakterien infiziert. A, B, E und F: Hirnhaut und Hirnrinde; C und G: Ventrikel; D und H: Zwischenhirn. Δ, Überlastung/Blutungen; □, Nekrose; ○: entzündliche Zelle eindringen. Vergrößerung = 200 X; Maßstabsleiste = 100 µm. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Primer-Name | Sequenz (5' - 3') | Gen-symbol |
| IL-6 nach vorne | CTTCCATCCAGTTGCCTTCT | Il6 |
| IL-6 Rückseite | CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG | Il6 |
| TLR2 nach vorne | CACTATCCGGAGGTTGCATATC | Tlr2 |
| TLR2 rückwärts | GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC | Tlr2 |
| CCL2 nach vorne | CTCACCTGCTGCTACTCATTC | Ccl2 |
| CCL2 rückwärts | ACTACAGCTTCTTTGGGACAC | Ccl2 |
| TNF-α nach vorne | TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT | TNF |
| TNF-α-Rückseite | GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG | TNF |
| Β2m nach vorne | GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT | B2M |
| Β2m rückwärts | TATGTTCGGCTTCCCATTCTC | B2M |
| 18 Jahre nach vorne | GTAACCCGTTGAACCCCATT | 18 s rRNA |
| 18 s rückwärts | CCATCCAATCGGTAGTAGCG | 18 s rRNA |
Tabelle 1: Primer für RT-qPCR.
Tabelle 2: groben histopathologischen Veränderungen im Gehirn von Mäusen, die mit infizierten S. Suis Stamm P1/7. Eine Vierpunkt-grading-System wurde zur histologische Veränderungen zu bewerten, wie im Protokoll Abschnitt 3.3.7 beschrieben. Das Gesamtergebnis wurde als der Summe der Punkte aus verschiedenen histopathologischen Veränderungen berechnet. Im Durchschnitt wurde als Partitur/Gesamtzahl der Mäuse berechnet. Ein Ungepaartes t-Test wurde für statistische Analysen verwendet. ** p ≤0.01.
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Discussion
Die intrakranielle Subarachnoidal-Route der Infektion, die hier beschriebenen hat offensichtliche Vorteile gegenüber anderen Wege der Infektion. Es ermöglicht Ermittler zu studieren, die Host-Bakterium-Interaktion und die Wirkung von bakteriellen Komponenten auf Host Immune Antworten direkt im Gehirn, die bakterielle Eingang in das zentrale Nervensystem zu imitieren. Diese Route der Infektion kann so erweitert werden, für die Untersuchung der Mechanismen der Meningitis verursacht durch andere Bakterien. Darüber hinaus können auch verwendet werden, um die Wirksamkeit von Medikamenten gegen bakterielle Meningitis zu testen.
Um gute Ergebnisse mit diesem Modell zu erhalten, sind die folgenden kritischen Schritte explizit. Biofilmbildung muss unter experimentellen Bedingungen untersucht werden. In der vorliegenden Studie war es mit Rasterelektronenmikroskop Analyse untersucht. Andere Methoden auch lässt sich die Biofilmbildung untersuchen wie Gewebekultur plate Methode und Rohr-Methode21. Einen Tag vor Infektion, müssen Aliquote von planktonischen Zellen und Biofilm Zustand Zellen von-80 ° C zu bestimmen, die KBE aufgetaut werden. Am nächsten Tag sollte auf die entsprechende Dosis nach der KBE für Infektion Bakterien verdünnt werden. Die Mock-infizierten Kontrollgruppe mit PBS muss aufgenommen werden und die Mäuse von der Mock-infizierten Kontrollgruppe injiziert sollte während der Dauer des Experiments Infektion keine Symptome zeigen. Verschiedene Stämme können verschiedene infektiöse Dosis haben, so dass ein Vorversuch wird dringend empfohlen, die entsprechenden infektiöse Dosis zu bestimmen. In der vorliegenden Studie war eine Dosis von 3 × 107 KBE für Infektion verwendet basierend auf unserem Vorversuch. Diese Dosis von Biofilm Bakterien konnte schwere Anzeichen einer Meningitis und späteren Tod in allen 5 Mäusen 48 h nach der Infektion in der Vorversuch zu induzieren.
Die Störung der Blut-Hirn- und Blut-zerebrospinale Flüssigkeit Barrieren durch S. Suis sind ein wichtiger Schritt bei der Entstehung von Meningitis22,23,24. Die intrakranielle Subarachnoidal-Route der Infektion ist nicht geeignet zur Beurteilung der Fähigkeit von S. Suis diese Barrieren durchbrechen. Andere Wege der Infektion, z. B. i.p., i.v. oder i.n., können verwendet werden, um dieses Ziel zu erreichen.
Hier zeigen wir zuerst, dass S. Suis Biofilm zur Induktion von Meningitis mit intrakraniellen Subarachnoidal-Route der Infektion beiträgt. Diese Infektionsmodell weitere Verständnis die Mechanismen von S. Suis Meningitis hilft nicht nur, sondern ist auch geeignet für die Untersuchung der Pathogenese von Meningitis verursacht durch andere Bakterien und die Wirksamkeit neuer Medikamente gegen bakterielle Meningitis.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Key Research und Development Program of China [2017YFD0500102]; die National Natural Science Foundation of China [31572544]; die State Key Laboratory ätiologische Veterinärbiologie [SKLVEB2016KFKT005]; Shanghai-Landwirtschaft angewandte Technologie Entwicklung Programm, China [G2016060201].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
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