Summary
כאן, אנו מתארים את המסלול subarachnoidal תוך-גולגולתי של זיהום בעכברים ללמוד את התפקידים של biofilms בסטרפטוקוקוס suis דלקת קרום המוח. מודל זיהום זה מתאים גם לימוד בפתוגנזה של אחרים דלקת קרום המוח ואת היעילות של תרופות חדשות נגד דלקת קרום המוח.
Abstract
סטרפטוקוקוס suis הוא לא רק פתוגן חיידקי העיקרי של חזירים ברחבי העולם, אלא גם סוכן שפוגעות המתעוררים. בני אדם, חזירים, דלקת קרום המוח היא ביטוי מרכזי של ס' suis זיהומים. מודל מתאים לזיהום הוא כלי חיוני להבין את המנגנונים של מחלות הנגרמות על ידי פתוגנים. מספר מסלולים של זיהום בעכברים פותחו ללמוד בפתוגנזה של ס' suis זיהום. עם זאת, המסלולים בקרום הבטן תוך-אפי, תוך ורידי של זיהום אינם מתאימים ללמוד את התפקידים של רכיבים משטח ס suis דלקת קרום המוח ישירות במוח, כגון מטריצות מ biofilms. למרות intracisternal חיסון זה משמש ס suis זיהום, מדויק ההזרקה לא תואר. . הנה, התוואי subarachnoidal תוך-גולגולתי של זיהום תוארה במודל של עכברים לחקור את התפקידים של biofilms ב ס suis דלקת קרום המוח. תאים פלנקטוניים suis ס או תאים המדינה biofilm הוזרקו ישירות לתוך מרחב תת-עכבישי של עכברים דרך ההזרקה ממוקם 3.5 מ מ rostral מ bregma. ניתוח histopathological, ביטוי מוגבר mRNA של TLR2 ו ציטוקינים של רקמת המוח של עכברים הזריק biofilm המדינה תאים לציין בבירור כי ס suis biofilm ממלא תפקידים סופית ב ס suis דלקת קרום המוח. המסלול של זיהום יש יתרונות ברורים על פני נתיבים אחרים של זיהום, המאפשר חקר האינטראקציה מארח-חיידק. יתר על כן, הוא מאפשר את ההשפעה של רכיבים חיידקי על תגובות חיסוניות מארח ישירות במוח לפנות לבדיקה, ולא מחקה חיידקי הכניסה לתוך מערכת העצבים המרכזית. ניתן להאריך את המסלול הזה של זיהום על חקירת המנגנון של דלקת קרום המוח הנגרמת על ידי חיידקים אחרים. בנוסף, זה יכול לשמש גם כדי לבדוק את היעילות של תרופות נגד דלקת קרום המוח.
Introduction
סטרפטוקוקוס suis (ס' suis) הוא פתוגן חיידקי העיקרי של חזירים ברחבי העולם, גורמות למחלות חמורות כולל דלקת קרום המוח, דלקת ריאות, אלח דם, דלקת פנים הלב, דלקת מפרקים1. . זה גם סוכן שפוגעות המתעוררים. עד כה, דווח כי תשעה אשר נגרמו מהזנים אליהם יכול לגרום לזיהום אצל בני אדם, כולל אשר נגרמו מהזנים אליהם 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24, ו 31-2,-3,-4. בני אדם, חזירים, דלקת קרום המוח הוא אחד הסימנים הקליניים העיקריים של ס' suis זיהומים. וייטנאם ותאילנד, suis ס הוא הגורם העיקרי של דלקת קרום המוח מבוגרים5. חיידקים פתוגנים המועברים במזון הם מיקרואורגניזמים לדבוק אחד בשני, מרוכזים-ממשק; הם חיוניים עבור התקפה אלימה חיידקי, הישרדות סביבות מגוונות, וכן עמידות לאנטיביוטיקה5. Biofilms מוקפים בדרך כלל מטריצה חוץ-תאית, המכיל בדרך כלל סוכרים, חלבונים ו- DNA6. האחרון הוא מסוגל להפיק תגובות דלקתיות המארח ו- ייצור ציטוקינים7. ביופילמים דווח מעורבים דלקת קרום המוח streptococcal במחקרים קודמים. Biofilms לתרום דלקת קרום המוח agalactiae סטרפטוקוקוס במודל דג אמנון, התגלה בתוך ברקמות המוח ביופילמים סביב קרום המוח משטחים ויוו דרך חיסון אינטרה-בטן8. במהלך דלקת קרום המוח, pneumoniae סטרפטוקוקוס נמצא במצב כמו biofilm, חיידקים במצב כזה biofilm היו יותר יעיל וגורם לדלקת קרום המוח בהעכבר זיהום דגם9. בנוסף, קודמות שלנו לומדים, המדינה biofilm המשויך ס suis במוח העכבר תורמת התקפה אלימה חיידקי על ידי ניתוח הישרדות10. עם זאת, עדות ישירה עבור biofilm מעורבות דלקת קרום המוח suis ס דורש חקירה.
מודלים חייתיים של זיהום suis ס פותחו בעכברים באמצעות בקרום הבטן (i.p.)11, תוך-אפי (i.n.)12, תוך ורידית (עירוי)13המסלולים intracisternal (אי. סי) של זיהום14, 15 , 16. עם זאת, המסלולים i.p. i.n., עירוי של זיהום אינם מתאימים ללמוד את התפקידים של רכיבים משטח ס suis דלקת קרום המוח ישירות במוח. אלה כוללים מטריצה חוץ-תאית מ biofilms. למרות חיסון הנצרך שימש ס suis זיהום, ההזרקה מדויק תואר לא בעיתונים האלו. לעומת זאת, הקואורדינטות stereotaxic של ההזרקה עבור חיסון subarachnoidal תוך-גולגולתי בבירור תואר המחקר הקודם17. פעולה זו מותרת זיהוי קל של הנקודה חיסון, יותר פשטני נסיוני. בנוסף, תוואי subarachnoidal תוך-גולגולתי זיהום מחקה חיידקי הכניסה לתוך מערכת העצבים המרכזית את הסינוסים או באוזן התיכונה17, ואת הקשר בין האוזן התיכונה לבין דלקת קרום המוח הנגרמת על ידי suis ס הוכח על ידי מדסן ואח18. יתר על כן, על-ידי החלת התוואי subarachnoidal תוך-גולגולתי של זיהום בעכברים, הראו כי ס' suis rss04 RNA קטנים תורמת דלקת קרום המוח שלנו המחקר הקודם10.
בהווה לומדים, שימש את נתיב subarachnoidal תוך-גולגולתי של זיהום בעכברים כדי לחקור את התפקידים של biofilms ב ס suis דלקת קרום המוח. עכברים נדבקו בנגיף פלנקטוניים תאים או biofilm תאים המדינה של ס' suis דרך זו של זיהום. ניתוח histopathological וביטוי mRNA מוגברת של TLR2, ציטוקינים מרקמות המוח של עכברים הזריק biofilm המדינה תאים לציין בבירור כי ס' suis biofilm תורמת דלקת קרום המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הניסויים זיהום העכבר היו שאושרו על-ידי מעבדה חיה ניטור הוועדה של מחוז ג'יאנגסו, סין וביצע באוניברסיטה מעבדה חיה מרכז נאנג'ינג חקלאית (היתר המספר: SYXK (סו) 2017-0007).
1. הכנת חיידקים
הערה: ס' suis serotype 2 מעודו P1/7 הופרדה מרשת חזיר חולה עם דלקת קרום המוח19. זן P1/7 גדל טוד יואיט מרק (THB, הנוסחה לליטר THB: הלב אינפוזיה, 3.1 g; neopeptone, 20.0 g דקסטרוז, 2.0 g; נתרן כלורי, 2.0 g; ניתרן פוספט, 0.4 g; נתרן פחמתי, 2.5 g), מצופה על אגר טוד יואיט (THA, הנוסחה לליטר THA: הלב אינפוזיה, 3.1 g; neopeptone, 20.0 g; דקסטרוז, 2.0 g; נתרן כלורי, 2.0 g; ניתרן פוספט, 0.4 g; סודיום קרבונט, 2.5 g; אגר, 15.0 g)-CO 37 ° C ו-5%2.
- אוסף של זן תאים פלנקטוניים P1/7
- לאסוף 5 מ של תאים פלנקטוניים מתרבות יומן באמצע שלב (OD600= 0.6), צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 8000 × g, ולאחר מכן לשטוף 3 פעמים עם PBS.
- Resuspend התאים עם 5 מ של גליצרול 25% ב- THB, aliquot לתוך צינורות 5, ולאחר מכן אחסן ב-80 מעלות צלזיוס.
- אוסף של זן P1/7 biofilm המדינה תאים
- . קח 20 מ של תרבות לילה ולהוסיף 180 מ של THB טריים; לחלק את התרבות מדולל 10 צלחות עגולות תרבות באופן שווה, ואז לשים את הצלחות באינקובטור ב 37 ° C 5% CO2 במשך 24 שעות ביממה.
- לאחר דגירה, לנער את הצלחת בעדינות כדי resuspend את החיידקים לא פעלה בהתאם להצהרה לצלחת, ולאחר מכן למחוק את תגובת שיקוע על ידי השאיפה.
הערה: לנער בעדינות את הצלחת ולהימנע resuspending המשקע. - הוסף 5 מ של PBS כדי לקצור biofilm המדינה תאים resuspend המשקע לחלוטין, ואז להעביר את הדגימה צינור חדש.
- Sonicate התאים המדינה biofilm מן השלב האחרון עם הפרמטרים הבאים: 60 W, מחזורי 4, 5 s s ביום ו- 10 הנחה.
- צנטריפוגה למשך 3 דקות ב 8000 × g ולאחסן את תגובת שיקוע ב-80 מעלות צלזיוס.
הערה: תגובת שיקוע עשוי להכיל רכיבים biofilm, זה יכול לשמש כדי resuspend את החיידקים biofilm לפני זיהום כמתואר בניסויים בבעלי חיים (שלב 3). - Resuspend המשקע עם 10 מ ל 25% גליצרול ב- THB ולאחר מכן אחסן התאים המדינה biofilm ב-80 מעלות צלזיוס.
2. סריקה ניתוח מיקרוסקופ אלקטרונים (SEM)
- לתקן biofilm שנאספו המדינה תאים ותאים פלנקטוניים באמצעות paraformaldehyde 4% עבור 12-24 h-4 מעלות צלזיוס.
- לשטוף את הדגימות במהירות עם מים מזוקקים, מייבשים את דגימות ברצף לריכוז הגוברת של אתנול (25%, 50%, 70%, 90% ו 100%) במשך 30 דקות בכל הפתרונות.
- דבקים הדגימות מיובשים מתכת מחזיקי עם סרט הדבקה דו-צדדי, ולבסוף מעיל אותם ב המאייד עם זהב, פלדיום.
- לצפות את הדוגמאות על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים סריקה באמצעות הפרמטרים הבאים: בובה (תוספת המתח גבוה) = 10 kV; WD (עובד מרחק) = 7.0 או 8.0 מ מ; הגדלה = 5000 ×; האות A = SE1.
3. חיה ניסויים
- השתמש SPF 6 בת נקבה עכברים BALB/c במחקר זה. להדביק עכברים כל דרך תוואי זיהום של מי ההזרקה הוא 3.5 מ מ ממוקם rostral של bregma subarachnoidal תוך-גולגולתי. הקואורדינטות stereotaxic של ההזרקה בבירור שתוארו על-ידי Chiavolini et al17.
- ניתוח histopathological, להדביק לשתי קבוצות של עכברים (5 עכברים לכל קבוצה) באמצעות תאים פלנקטוניים או biofilm המדינה תאים במינון של 3 × 107 המושבה יוצרי יחידות (CFU), עכברים 5 אחר הוזרקו PBS כפקד.
- עבור זיהוי של mRNA ביטוי TLR2 ציטוקינים במוח, להדביק שתי קבוצות נוספות של עכברים (6 עכברים לכל קבוצה) באמצעות תאים פלנקטוניים או biofilm המדינה תאים במינון של 3 × 107 CFU.
- לקבוע את מספר החיידקים קיימא על ידי ציפוי דילולים טורי ל- THA.
- המתת חסד כל העכברים-12 שעות לאחר הפגיעה למחקר נוסף.
הערה: גליצרול במדיום מניות להסירו לפני זיהום. הן פלנקטוניים תאים ותאים biofilm המדינה התאוששה-80 ° C נשטפים 3 פעמים עם PBS. לאחר מכן, פלנקטוניים תאים resuspended עם PBS, מדולל על המינון המתאים עבור דלקת; biofilm המדינה תאים resuspended עם תגובת שיקוע השמור (משלב 1.2.5), מדולל על המינון המתאים עבור זיהום. אמצעי האחסון עבור זיהום לא צריכה להיות µL יותר מ-50.
- מזהה את הביטוי mRNA של TLR2, ציטוקינים רקמת המוח
- לחלץ את הרנ א הכולל רקמת המוח באמצעות ערכת חילוץ RNA.
- עבור כל העכבר, להשתמש רקמת המוח כולו עבור חילוץ RNA. לחלק את רקמת המוח כל צינורות 5. לקחת רקמת המוח 100 מ ג ולהוסיף 1 מ"ל של פירוק פתרון כל שפופרת המכילה המטריקס lysing שסופקו על-ידי ערכת.
- לעבד את צינור מהמגן 40 s בקביעה של 6.0, ולאחר מכן צנטריפוגה הצינור-12000 × g ו- 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
- לאחר צנטריפוגה, להעביר את השלב העליון צינור microcentrifuge.
- דגירה המדגם שהועברו במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר; להוסיף 300 µL של סם הרדמה, מערבולת 10 s, ולאחר מכן תקופת דגירה של 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- הצינור-12000 × centrifuge g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 5 דק. להעביר את השלב העליון צינור חדש.
- להוסיף 500 µL של כוהל מוחלט קר הצינור, לפני היפוך זה עבור 5 פעמים ולאחר מכן לאחסן את הדגימה ב-20 מעלות צלזיוס במשך לפחות שעה.
- הצינור-12000 × centrifuge g ו- 4 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ולהסיר תגובת שיקוע. לשטוף את גלולה עם 500 µL של אתנול 75% קר ללא RNase H2O.
- הסר האתנול, אוויר יבש בגדר למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, ואת resuspend הרנ א ב 100 µL ללא RNase H2O.
- דגירה של RNA למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר וקבע את ריכוז ה-RNA באמצעות bioanalyzer של RNA.
- לבצע סינתזה cDNA, כולל חיסול של הדנ א (gDNA), באמצעות thermocycler עם ערכת ריאגנט שעתוק במהופך (RT).
- להוסיף 1 µg של RNA שפופרת המכילה µL 2 5 מאגר חיסול x gDNA, 1 µL של אנזים חיסול gDNA ונטול RNase H2O עד µL ' מגיע ל 10 נפח. דגירה למשך 2 דקות ב 42 º C.
- להוסיף 10 µL של מיקס מאסטר (µL 1 של האנזים RT לערבב אני, µL 1 של RT פריימר מיקס, µL 4 5 x 2 מאגר ולאחר 4 µL נטולת RNase H2O) לפתרון התגובה מהבית האחרון צעד, ואז מערבבים בעדינות. פנה/י מיד עם התגובה RT: 37 ° C 15 דקות ואז 85 ° C 5 s.
- לבצע את ניתוח כמותי PCR (RT-qPCR) בזמן אמת באמצעות מכונת זמן אמת PCR עם ערכת SYBR RT-qPCR. הוספת 10 µL של 2 x אנזים, µL 0.8 של פריימר לפנים, µL 0.8 של פריימר הפוכה, µL 0.4 של 50 x רוקס הפניה לצבוע II, µL 2 תבנית cDNA, נטולת RNase H2O עד הנפח הכולל של 20 µL.
- לרוץ כל מדגם שהפקידים באמצעות תרמית הפרמטרים הבאים: 30 s ב 94 ° C, ואחריו 40 מחזורי 5 s ב 95 ° C, ו- 34 s-60 ° C, עם שלב הגמר של 15 s ב 95 ° C, 1 דקות ב- 60 ° C , ו-15 s ב 95 ° C. צבעי יסוד RT-qPCR מפורטים בטבלה 1. משק בית גנים ב'2מ' , 18s rRNA שימשו את הפקדים הפנימיים.
- לחשב את השינוי היחסי קיפול מבוסס על שיטה 2-ΔΔCt .
- לחלץ את הרנ א הכולל רקמת המוח באמצעות ערכת חילוץ RNA.
-
תצפית סעיפים היסטולוגית
- לאחר קיבוע 24 שעות עם 10% פורמלין, לשחזר את רקמת המוח קבוע לתוך בגדלים המתאימים של חתיכות רקמה 2-3 מ מ.
- לשים את חתיכות רקמה במגרה ההטבעה, לטבול פתרון חדש מקבע התייבשות עם מייבש ואקום אוטומטי.
- להוציא את הרקמה קבוע, מייבשים אותו ברצף להגדיל את ריכוזי אתנול (70%, 80%, 95%, 95% ו 100%) במשך 30 דקות כל פתרון.
- Transparentize הדגימה עם קסילן למשך 15 דקות, וטבול אותו שמן פראפין ב 60 מעלות צלזיוס במשך 90 דקות ולאחר מכן הטבע באמצעות מכונת ההטבעה.
- לחתוך את הרקמה בלוק מוטבע פרפין מיקרומטר 3 פרוסות, אריח הפרוסה על המים ב 45 מעלות צלזיוס ולאחר מכן לייבש אותו באוויר.
- דגירה בסעיף 3 h ב 60 מעלות צלזיוס, יחתים אותו באמצעות haematoxylin אאוזין (הוא) שיטה, לאטום אותו עם מסטיק נייטרלי.
- לבחון את השינויים histopathological של המוח עם מיקרוסקופ אופטי. מערכת לדירוג ארבע נקודות שימש להעריך את השינויים היסטולוגית. השתמש מבחן אינטראקצית t לניתוח סטטיסטי.
גודש/דימום: נעדר, ציון 0; שטח קטן של מוקד גודש/דימום, ציון 1; שטח גדול של גודש מוקד/דימום, או אתרים מרובים של שטח קטן של מוקד גודש/דימום, ציון 2; עד שלושה אתרים גדולים מוקד גודש/דימום, ציון 3; טשטוש גודש/דימום, ציון 4.
ונמק: נעדר, ציון 0; מוקדי נמק, ציון 1; טשטוש מופע של 1-10 תאים עם נמק, ציון 2; מוקדי נמק confluent, ציון 3; נמק confluent נרחב, ציון 4.
חדירה לתא דלקתי: נעדר, ציון 0; מוקד ומעטות חדירות, ציון 1; הסתננות המולטי או חדירות עם היווצרות של אגרגטים, ציון 2; עד 3 יחידות, ציון 3; יותר מ-4 אגרגטים, ציון 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SEM ניתוח בוצע לבחון ביופילמים בתנאים ניסיוני. כפי שמוצג באיור1, יש הבדל משמעותי ביופילמים בין תאים פלנקטוניים (איור 1א') ותאים המדינה biofilm (איור 1B). ניתוח SEM הראה כי חיידקים biofilm היו במקבצים ואת שכבות מרובות והם היו עטוף של מטריצה חוץ-תאית, בעוד חיידקים פלנקטוניים היו הרבה פחות צפופה והתפזרו בעיקר בנפרד.
הרכיבים של מטריצות של biofilms, כגון ה-DNA, מסוגלים להפיק תגובות דלקתיות מארח וייצור ציטוקין. מאז TLR2 ציטוקינים CCL2, IL-6, ו- TNF-α מעורבים המוח תגובות דלקתיות קשורה לדלקת קרום המוח לפי הקודם מחקרים10,11,20, ה-mRNA ביטוי של גנים אלה הושווה אין ויוו עבור עכברים נגועים עם תאים פלנקטוניים ואלה נגוע biofilm המדינה תאים. הדבר נעשה על מנת לחקור את השפעת biofilms על התגובה דלקתית רקמת המוח מאתר. כמוצג באיור 2, ב 12 שעות לאחר הפגיעה, הביטוי של TLR2, CCL2, IL-6, ו- TNF-α של המוח של עכברים נגועים היה גבוה באופן משמעותי עבור תאים המדינה biofilm לעומת תאים פלנקטוניים.
עכברים נגועים בחיידקים biofilm הראה סימנים חמורים יותר של דלקת קרום המוח (עמידה נוקשה, אטקסיה או עוויתות) מאשר אלה עם יצורי חיידקים. בדיקה היסטולוגית של רקמת המוח של עכברים נגועים עם זן ס suis ש-p1/7 הראה גודש/דימום ונמק, תאים דלקתיים חדירת קרומי המוח, קליפת המוח, החדרים, או diencephalon (איור 3) . לעומת עכברים נגועים בחיידקים פלנקטוניים (איור 3E-H), 12 שעות לאחר הפגיעה, חמור הרבה יותר שינויים פתולוגיים נצפו ברקמת המוח של עכברים נגועים בחיידקים biofilm (איור 3י-ם), כולל שטחים גדולים של גודש/דימום, נמק או חדירה אינטנסיבית תאים דלקתיים. השינויים הפתולוגיים ברוטו במוח של עכברים נגועים פלנקטוניים, חיידקים biofilm נרשם בטבלה מס ' 2. השינויים הפתולוגיים וגם תסמינים נוירולוגים נצפו של עכברים הזריק PBS. יחדיו, נתונים אלה מראים בבירור כי ס' suis biofilms לתרום אינדוקציה של דלקת קרום המוח.
איור 1: תמונות SEM של זן P1/7 פלנקטוניים תאים ותאים biofilm המדינה. חיידקים היו בתרבית THB בינוני. ניתוח SEM הראה כי פלנקטוניים תאים (א) היו הרבה פחות צפופה והתפזרו בעיקר בנפרד, ואילו חיידקים biofilm (B) היו מקובצים באשכולות במקבצים שכבות מרובות והם היו עטוף של מטריצה חוץ-תאית. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: Biofilms להפעיל את הביטוי mRNA של CCL2, IL-6, TNF-α ו TLR2 ברקמת המוח העכבר ויוו. עכברים BALB/c 6 לכל קבוצה הוזרקו כל דרך המסלול subarachnoidal תוך-גולגולתי של זיהום עם 3 × 107 CFU פלנקטוניים תאים או biofilm המדינה תאים. עכברים היו מורדמים ב 12 שעות לאחר הפגיעה. התוצאות מוצגים כמו הקיפול לשנות ה-mRNA הביטוי במדינה biofilm עכברים נגועים תא לעומת עכברים נגועים תא פלנקטוניים. (א) הגן B2m שימש הגן הפניה; (ב) את הגן 18s rRNA שימש את הגן הפניה. אינטראקצית t-מבחן שימש לשם ניתוח סטטיסטי. * * p ≤0.01, ו * p ≤0.05. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: ניתוח היסטולוגית של רקמת המוח של עכברים נגועים עם זן P1/7 פלנקטוניים חיידקים ובקטריות המדינה biofilm. A-D, המוח דגימות עכברים נגועים בחיידקים המדינה biofilm; E-H, המוח דגימות עכברים נגועים בחיידקים פלנקטוניים. A, B, E ו- f: קרומי המוח ואת קליפת המוח; C ו- g: החדרים; D ו- h: diencephalon. Δ, גודש/דימום; □, נמק; ○: חדירת תאים דלקתיים. הגדלה = 200 X; סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
| פריימר שם | רצף (5' - 3') | סמל הגן |
| IL-6 קדימה | CTTCCATCCAGTTGCCTTCT | Il6 |
| IL-6 הפוכה | CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG | Il6 |
| TLR2 קדימה | CACTATCCGGAGGTTGCATATC | Tlr2 |
| TLR2 הפוך | GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC | Tlr2 |
| CCL2 קדימה | CTCACCTGCTGCTACTCATTC | Ccl2 |
| CCL2 הפוך | ACTACAGCTTCTTTGGGACAC | Ccl2 |
| TNF-α קדימה | TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT | Tnf |
| TNF-α הפוכה | GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG | Tnf |
| Β2m קדימה | GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT | B2m |
| Β2m הפוך | TATGTTCGGCTTCCCATTCTC | B2m |
| 18s קדימה | GTAACCCGTTGAACCCCATT | 18s rRNA |
| 18s הפוכה | CCATCCAATCGGTAGTAGCG | 18s rRNA |
טבלה 1: צבעי יסוד RT-qPCR.
בטבלה 2: שינויים histopathological דוחה המוח של עכברים נגועים עם ס suis זן P1/7- מערכת לדירוג ארבע נקודות שימש כדי להעריך שינויים היסטולוגית, כפי שמתואר פרוטוקול סעיף 3.3.7. הציון מחושב כסכום של ציונים משינויים histopathological שונים. הממוצע מחושב הציון/המספר הכולל של עכברים. אינטראקצית t-מבחן שימש לשם ניתוח סטטיסטי. * * p ≤0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המסלול subarachnoidal תוך-גולגולתי של זיהום המתוארים כאן יש יתרונות ברורים על פני נתיבים אחרים של זיהום. היא מאפשרת החוקרים ללמוד את האינטראקציה החיידק המארח ו השפעת רכיבי חיידקי על תגובות חיסוניות מארח ישירות במוח, המחקות חיידקי הכניסה לתוך מערכת העצבים המרכזית. לפיכך, ניתן להאריך את המסלול הזה של זיהום על חקירת המנגנון של דלקת קרום המוח הנגרמת על ידי חיידקים אחרים. בנוסף, זה יכול לשמש גם כדי לבדוק את היעילות של תרופות נגד דלקת קרום המוח.
על מנת לקבל תוצאות טובות בעזרת המודל, השלבים הקריטיים הבאים הם מפורשים. ביופילמים צריך להיבדק בתנאים ניסיוני. במחקר הנוכחי, זה נבדק באמצעות ניתוח לסרוק בעזרת מיקרוסקופ אלקטרון. שיטות אחרות יכול לשמש גם כדי לבחון את ביופילמים, כגון תרביות רקמה צלחת בשיטה של השיטה, שפופרת-21. יום אחד לפני זיהום, aliquots של תאים פלנקטוניים והן תאים המדינה biofilm צריך להיות הקרת מ- 80 ° C כדי לקבוע את CFU. למחרת, צריך להיות מדולל חיידקים המינון המתאים על פי CFU זיהום. קבוצת הביקורת הנגועים ואימץ הזריק PBS צריך להיות כלול והעכברים מהקבוצה ואימץ נגוע השליטה צריך להציג אין ביטויים במהלך משך הניסוי זיהום. זנים שונים ייתכן זיהומיות במינונים שונים, כך ניסוי ראשוני מומלץ מאוד כדי לקבוע את המינון המתאים זיהומיות. במחקר הנוכחי, מנה של 3 × 107 CFU זיהום שימש בהתבסס על הניסוי הראשוני שלנו. המינון של חיידקים biofilm הצליח לגרום סימנים קשים של דלקת קרום המח ומוות עוקבות בעכברים 5 כל 48 שעות לאחר זיהום בניסוי ראשוני.
השיבוש של דם-מוח או מחסומים נוזל הדם-cerebrospinal על ידי suis ס הם צעד חשוב בגרימת דלקת קרום המוח22,23,24. המסלול subarachnoidal תוך-גולגולתי של זיהום אינה מתאימה להערכת היכולת של ס' suis לפרוץ מחסומים אלה. נתיבים אחרים של זיהום, כגון i.p., עירוי או i.n., יכול לשמש כדי להשיג מטרה זו.
. הנה, נדגים קודם ס suis biofilm תורמת תנאי הגיוס של דלקת קרום המוח באמצעות תוואי subarachnoidal תוך-גולגולתי של זיהום. מודל זיהום זה לא רק מסייעת להבין את המנגנונים של דלקת קרום המוח ס suis נוסף אלא גם מתאים ללמוד בפתוגנזה של דלקת קרום המוח הנגרמת על ידי חיידקים אחרים את היעילות של תרופות חדשות נגד דלקת קרום המוח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי מחקר מפתח הלאומי, תוכנית פיתוח של סין [2017YFD0500102]; הקרן הלאומית למדע הטבעי של סין [31572544]; המדינה מפתח המעבדה לביולוגיה Etiological וטרינרי [SKLVEB2016KFKT005]; החקלאות שנגחאי להחיל תוכנית פיתוח טכנולוגיה, סין [G2016060201].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
- Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen? Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
- Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45 (2014).
- Kerdsin, A., et al. Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).
- Hatrongjit, R., et al. First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand. BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).
- Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis. Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).
- Isiaku, A. I., et al. Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish. Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).
- Oggioni, M. R., et al. Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).
- Xiao, G., et al. Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model. Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).
- Seitz, M., et al. A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2. Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).
- Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).
- Williams, A. E., Blakemore, W. F. Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).
- Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection. Pathogens. 5 (3), (2016).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiology. 4, 36 (2004).
- Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs. Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).
- Holden, M. T., et al. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis. PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).
- Dominguez-Punaro Mde, L., et al. In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis. Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).
- Hassan, A., et al. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).
- Vanier, G., et al. New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).
- Takeuchi, D., et al. The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis. Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).
