Summary
Här beskriver vi intrakraniell subarachnoidal rutten av infektion hos möss att studera roller av biofilmer i Streptococcus suis meningit. Denna infektion modell passar också studerar patogenesen av andra Bakteriell meningit och effekten av nya läkemedel mot bakteriell meningit.
Abstract
Streptococcus suis är inte bara stora bakteriella patogener av svin i hela världen, men också en framväxande zoonotiskt agens. Människor och svin är meningit en viktig manifestation av S. suis infektioner. En lämplig infektion modell är ett viktigt verktyg att förstå mekanismerna av sjukdomar orsakade av patogener. Flera vägar av infektion i möss har utvecklats för att studera patogenesen av S. suis infektion. Intraperitoneal, intranasalt och intravenös vägar på infektion är dock inte lämplig för att studera S. suis ytan komponenter i hjärnhinneinflammation direkt i hjärnan, såsom den extracellular matrisen från biofilmer roller. Även om intracisternal inympning har använts för S. suis infektion, har exakt injektionsstället inte beskrivits. Här, beskrevs intrakraniell subarachnoidal rutten av infektion i en musmodell för att undersöka rollerna av biofilmer i S. suis meningit. S. suis plankton celler eller biofilm staten celler injicerades direkt i subaraknoidalrummet möss genom injektionsstället ligger 3,5 mm rostralt från bregma. Histopatologisk analys och ökat mRNA-uttryck av TLR2 och cytokiner av hjärnvävnad från möss som injicerats med biofilm staten celler anges tydligt att S. suis biofilm spelar slutgiltiga roller i S. suis meningit. Denna väg för infektion har uppenbara fördelar över andra vägar av infektion, möjliggör studiet av värd-bakterien interaktionen. Dessutom tillåter det effekten av bakteriella komponenter på värd immunsvar direkt i hjärnan för att bedömas, och härmar bakteriell hänrycka in i det centrala nervsystemet. Denna väg av infektion kan förlängas för att undersöka mekanismerna av hjärnhinneinflammation som orsakas av andra bakterier. Det kan dessutom också användas för att testa effekten av läkemedel mot bakteriell meningit.
Introduction
Streptococcus suis (S. suis) är stora bakteriella patogener av svin i världen, vilket orsakar svåra sjukdomar inklusive hjärnhinneinflammation, lunginflammation, septikemi, endokardit och artrit1. Det är också en framväxande zoonotiskt agens. Hittills har det rapporterats att nio serotyper kan orsaka infektion hos människa, inklusive serotyper 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 och 312,3,4. Människor och svin är meningit en av de största kliniska tecknen på S. suis infektioner. I Vietnam och Thailand är S. suis den största orsaken till meningit hos vuxna5. Mikrobiell biofilmer är mikroorganismer som fäster vid varandra och är koncentrerade på ett gränssnitt; de är viktiga för bakteriell virulens, överlevnad i olika miljöer och antibiotikaresistens5. Biofilmer är oftast omgivna av en extracellulär matrix som generellt innehåller polysackarider, proteiner och DNA6. Det sistnämnda är kunna framkalla värd inflammatoriskt svar och cytokin produktion7. Biofilm bildning har rapporterats vara inblandade i streptokocker meningit i tidigare studier. Biofilmer bidra till Streptococcus agalactiae meningit i tilapia fisk modell och biofilm bildning har avslöjats inom hjärnans vävnader och runt meningeal ytor i vivo genom intraabdominella inympning8. Under meningit, Streptococcus pneumoniae är i en biofilm-liknande tillstånd och bakterier i sådan biofilm stat var effektivare för att framkalla meningit hos en mus infektion modell9. Dessutom i vår tidigare studie, biofilm staten är associerad med S. suis i mus hjärnan bidrar till bakteriell virulens av överlevnad analys10. Direkta bevis för biofilm inblandning i S. suis meningit kräver dock ytterligare utredning.
Djurmodeller av S. suis infektion har utvecklats hos möss med intraperitoneal (IP)11, intranasalt (i.n.)12, intravenös (i.v.)13och intracisternal (i.c.) rutter för infektion14, 15 , 16. i.p., i.n. och i.v. vägar på infektion är dock inte lämplig för att studera rollerna av S. suis ytan komponenter i hjärnhinneinflammation direkt i hjärnan. Dessa inkluderar extracellulär matrix från biofilmer. Även om i.c. inympningen användes för S. suis infektion, har exakt injektionsstället inte beskrivits i dessa papper. Däremot har de stereotaxic koordinaterna för injektionsstället för intrakraniell subarachnoidal inympningen tydligt beskrivits i en tidigare studie17. Detta gjorde det möjligt för enkel igenkänning av inokuleringspunkten och mer förenklade experimentellt protokoll. Dessutom härmar intrakraniell subarachnoidal rutten av infektion bakteriell hänrycka in i det centrala nervsystemet från bihålorna eller mellanörat17, och förhållandet mellan mellanörat och hjärnhinneinflammation orsakad av S. suis har påvisats genom Madsen et al18. Dessutom, genom att tillämpa intrakraniell subarachnoidal rutten av infektion hos möss, vi har visat att S. suis små RNA rss04 bidrar till hjärnhinneinflammation i vår tidigare studie10.
I förevarande studie, intrakraniell subarachnoidal rutten av infektion användes i möss för att undersöka rollerna av biofilmer i S. suis meningit. Möss var infekterade med plankton celler eller biofilm staten celler av S. suis av denna väg för infektion. Histopatologisk analys och ökat mRNA-uttryck av TLR2 och cytokiner från hjärnvävnaden hos möss som injicerats med biofilm staten celler tydligt anges att S. suis biofilm bidrar till hjärnhinneinflammation.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Mus infektion experimenten godkändes av den laboratorium djur övervakning kommittén i Jiangsu-provinsen, Kina och utföras i laboratorium djur Center av Nanjing jordbruket universitetet (tillståndsnummer: SYXK (Su) 2017-0007).
1. beredning av bakterier
Obs: S. suis serotyp 2 virulent stam P1/7 isolerades från en diseased gris med meningit19. Stam P1/7 odlades i Todd-Hewitt buljong (THB, formel per liter THB: hjärtat Infusion, 3,1 g; neopeptone, 20,0 g dextros, 2,0 g, natriumklorid, 2,0 g; dinatriumfosfat, 0,4 g; natriumkarbonat, 2,5 g) och guldpläterade på Todd-Hewitt agar (THA, formel per liter THA: Hjärtat Infusion, 3,1 g; neopeptone, 20,0 g; dextros, 2,0 g; natriumklorid, 2,0 g; dinatriumfosfat, 0,4 g; natriumkarbonat, 2,5 g; agar, 15,0 g) vid 37 ° C och 5% CO2.
- Samling av stam P1/7 plankton celler
- Samla 5 mL av plankton celler från mitten av log fas kultur (OD600= 0,6), Centrifugera i 3 min vid 8000 × g och sedan tvätta 3 gånger med PBS.
- Omsuspendera cellerna med 5 mL 25% glycerol i THB, alikvotens in 5 rören, och sedan lagra vid-80 ° C.
- Samling av stam P1/7 biofilm staten celler
- Ta 20 mL av en övernattning kultur och tillsätt till 180 mL färsk THB; Dela den utspädda kulturen i 10 runda kultur plattor lika, och sedan sätta plattorna i en inkubator vid 37 ° C i 5% CO2 för 24 h.
- Efter inkubation, skaka plattan försiktigt för att resuspendera bakterier som inte har följt till plattan, och sedan Kassera supernatanten genom aspiration.
Obs: Skaka plattan försiktigt och undvika omblandning av sediment. - Tillsätt 5 mL PBS att skörda biofilm staten celler, Omsuspendera sedimenten helt och sedan överföra provet till en ny tub.
- Sonikera biofilm staten cellerna från det sista steget med följande parametrar: 60 W, 4 cykler, 5 s på och 10 s off.
- Centrifugera i 3 min vid 8000 × g och lagra supernatanten vid-80 ° C.
Obs: Supernatanten kan innehålla biofilm komponenter och den kan användas för att resuspendera biofilm bakterierna innan infektion som beskrivs i djurförsök (steg 3). - Återsuspendera sediment med 10 mL 25% glycerol i THB och sedan lagra biofilm staten cellerna vid-80 ° C.
2. scanning Electron Microscopy (SEM) analys
- Fixa den insamlade biofilm staten och plankton celler använder 4% PARAFORMALDEHYD för 12-24 h vid 4 ° C.
- Skölj av prov snabbt med destillerat vatten och torka av prov sekventiellt med en ökande koncentrationen av etanol (25%, 50%, 70%, 90% och 100%) i 30 min i varje lösning.
- Följa de torkade proverna för att metall hållare med dubbelhäftande tejp och slutligen kappa dem i en förångare med guld och palladium.
- Respektera proverna genom ett svepelektronmikroskop med följande parametrar: EHT (Extra hög spänning) = 10 kV; WD (arbetsavstånd) = 7.0 eller 8.0 mm; Förstoringen = 5000 ×; Signalera A = SE1.
3. djur experiment
- Använd SPF 6-vecka-gammal BALB/c honmöss i denna studie. Infektera alla möss genom intrakraniell subarachnoidal rutten av infektion vars injektionsstället är beläget 3,5 mm rostralt från bregma. De stereotaxic koordinaterna för injektionsstället beskrevs tydligt av Chiavolini et al17.
- För histopatologisk analys, infektera två grupper av möss (5 möss per grupp) med plankton celler eller biofilm staten celler vid en dos på 3 × 107 kolonibildande enheter (CFU), och en annan 5 möss injicerades med PBS som kontroll.
- För detektion av mRNA-uttryck av TLR2 och cytokiner i hjärnan, infektera två ytterligare grupper av möss (6 möss per grupp) celler med plankton celler eller biofilm staten vid en dos på 3 × 107 CFU.
- Bestäm antalet livskraftiga bakterier genom plätering seriespädningar vidare till THA.
- Avliva alla möss på 12 h efter infektion för vidare forskning.
Obs: Glycerol i lager medium måste tas bort innan infektion. Både plankton och biofilm staten celler återhämtat sig från-80 ° C tvättas 3 gånger med PBS. Då kommer plankton celler resuspended med PBS och utspädd till den lämpliga dosen för infektion. biofilm staten celler resuspended med lagrade supernatanten (från steg 1.2.5) och utspädd till den lämpliga dosen för infektion. Volymen för infektion bör inte vara mer än 50 µL.
- Att påvisa mRNA uttryck för TLR2 och cytokiner i hjärnvävnad
- Extrahera den total-RNA från hjärnvävnaden använder ett RNA extraktion kit.
- För varje mus, använda hela hjärnvävnad för att extrahera RNA. Dela hela hjärnvävnad i 5 rör. Ta upp till 100 mg hjärnvävnad och tillsätt 1 mL lysis lösning i varje rör innehållande lysing matrisen som tillhandahålls av satsen.
- Bearbeta röret i en Homogenisatorer för 40 s vid en inställning av 6.0, och sedan Centrifugera röret vid 12000 × g och 4 ° C i 5 min.
- Efter centrifugering, överföra den övre fasen till ett nytt mikrocentrifug rör.
- Inkubera överförda provet för 5 min i rumstemperatur; Tillsätt 300 µL kloroform, virvel för 10 s, och sedan Inkubera i 5 min i rumstemperatur.
- Centrifugera röret på 12000 × g- och 4 ° C i 5 min. överföra den övre fasen till en ny tub.
- Tillsätt 500 µL kallt absolut etanol till röret, innan Invertera det för 5 gånger, och sedan lagra provet vid-20 ° C i minst 1 h.
- Centrifugera röret på 12000 × g- och 4 ° C i 15 min och ta bort supernatanten. Tvätta pelleten med 500 µL kallt 75% etanol i RNase-fri H2O.
- Ta bort etanol, lufttorka pelleten för 5 min i rumstemperatur, och återsuspendera RNA i 100 µL av RNase-fri H2O.
- Inkubera RNA för 5 min i rumstemperatur och bestämma den RNA-koncentrationen med en RNA-bioanalyzer.
- Utföra cDNA syntes, inklusive eliminering av genomisk DNA (gDNA), med en termocykler med en omvänd Transkription (RT) reagens kit.
- Lägga till 1 µg av RNA i en tub innehållande 2 µL av 5 x gDNA eliminering buffert, 1 µL gDNA eliminering enzym och RNase-fri H2O tills den volym når 10 µL. Inkubera i 2 min på 42 ° C.
- Tillsätt 10 µL av master mix (1 µL RT enzym blanda I, 1 µL RT Primer Mix, 4 µL 5 x buffert 2, och 4 µL RNase-fri H2O) till reaktion lösning från sist steg och blanda försiktigt. Omedelbart gå vidare med den RT-reaktionen: 37 ° C i 15 min och sedan 85 ° C för 5 s.
- Utföra kvantitativ realtids PCR (RT-qPCR) analys med en Real-Time PCR-maskin med ett SYBR RT-qPCR kit. Tillsätt 10 µL 2 x enzym, 0.8 µL av forward primer, 0.8 µL av reverse primer, 0.4 µL 50 x ROX referens Dye II, 2 µL av cDNA mall och RNase-fri H2O fram till en total volym på 20 µL.
- Kör varje prov i tre exemplar med följande termiska parametrar: 30 s vid 94 ° C, följt av 40 cykler av 5 s vid 95 ° C, och 34 s vid 60 ° C, med en sista etapp 15 s vid 95 ° C, 1 min vid 60 ° C , och 15 s vid 95 ° C. Grundfärger för RT-qPCR listas i tabell 1. Städning gener B2m och 18s rRNA användes som interna kontroller.
- Beräkna den relativa faldig förändring utifrån metoden 2-ΔΔCt .
- Extrahera den total-RNA från hjärnvävnaden använder ett RNA extraktion kit.
-
Observation av histologiska sektioner
- Efter 24 h fixering med 10% formalin, rekonstruera fast hjärnvävnaden i lämpliga storlekar av vävnad bitar på 2-3 mm.
- Lägg vävnad bitarna i en inbäddning kassett och fördjupa i en ny fixativ lösning för uttorkning med en automatisk vakuum dehydrator.
- Ta ut fasta vävnaden och torkar det sekventiellt i ökande koncentrationer av etanol (70%, 80%, 95%, 95% och 100%) i 30 min i varje lösning.
- Transparentize provet med xylen i 15 min, doppa den i flytande paraffin vid 60 ° C i 90 min och sedan bädda in med hjälp av en infällningsram maskin.
- Skär paraffin block inbäddade vävnaden i 3 µm skivor, kakel slice på vatten vid 45 ° C och sedan torka den i luften.
- Inkubera i avsnittet för 3 h vid 60 ° C, färga det med hematoxylin och eosin (han) metod och försegla det med neutral tandköttet.
- Observera de histopatologiska förändringarna i hjärnan med ett optiskt mikroskop. En fyra-peka betygssystem användes för att utvärdera histologiska förändringar. Använd ett oparat t -test för statistisk analys.
Överbelastning/blödning: frånvarande, Poäng 0; litet område av fokal överbelastning/blödning, poäng 1; stort område av fokal överbelastning/blödning eller flera platser av litet område av fokal överbelastning/blödning, betyg 2; upp till tre stora fokal överbelastning/blödning platser, betyg 3. diffus överbelastning/blödning, betyg 4.
Necrosis: frånvarande, Poäng 0; fokal nekros, poäng 1; diffus förekomsten av 1-10 nekrotiska celler, betyg 2; Foci av konfluenta nekros, betyg 3. omfattande konfluenta nekros, betyg 4.
Infiltration av inflammatoriska celler: frånvarande, Poäng 0; några och fokal infiltration, poäng 1; multifokal infiltration eller infiltreringar med bildandet av aggregat, betyg 2; upp till tre aggregat, betyg 3. och mer än fyra aggregat, betyg 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SEM analys utfördes för att undersöka biofilm bildning de experimentella villkor. Som visas i figur 1, finns det en betydande skillnad i biofilm bildning mellan plankton (figur 1A) och biofilm staten celler (figur 1B). SEM analys visade att biofilm bakterier fanns i klumpar och flera lager och de var inneslutet i den extracellulära matrixen, medan plankton bakterier var mycket mindre tät och främst spridda individuellt.
Komponenterna i den extracellulära matrixen av biofilmer, såsom DNA, kan framkalla värd inflammatoriskt svar och cytokin produktion. Sedan TLR2 och cytokiner CCL2, är IL-6 och TNF-α involverade i cerebrala inflammatoriska svar relaterade till meningit enligt tidigare studier10,11,20, mRNA uttryck av dessa gener jämfördes invivo för möss som infekterats med plankton celler och de smittade med biofilm staten celler. Detta gjordes för att undersöka effekten av biofilmer på inflammatorisk reaktion i murina hjärnvävnad. Som visas i figur 2, på 12 h efter infektion, uttrycket av TLR2, CCL2, IL-6 och TNF-α från hjärnan hos infekterade möss var signifikant högre för biofilm staten celler jämfört med plankton celler.
Möss som infekterats med biofilm bakterier visade mycket allvarligare tecken på hjärnhinneinflammation (stel kroppshållning, ataxi eller konvulsioner) än dem som smittats med plankton bakterier. Histologisk undersökning av hjärnvävnad från möss som infekterats med S. suis stam P1/7 visade överbelastning/blödning, nekros och infiltration av inflammatoriska celler i hjärnhinnorna, hjärnbarken, ventriklarna eller diencephalon (figur 3) . Jämfört med möss som infekterats med plankton bakterier (figur 3E-H), 12 h efter infektion, långt mer allvarliga patologiska förändringar observerades i hjärnvävnad från möss som infekterats med biofilm bakterier (figur 3A-D), inklusive stora områden av överbelastning/blödning, nekros eller infiltration intensiva inflammatoriska celler. De brutto patologiska förändringarna i hjärnan från möss infekterade med plankton och biofilm bakterier spelades i tabell 2. Varken patologiska förändringar eller neurologiska symtom observerats från möss som injicerats med PBS. Sammantaget visar dessa uppgifter tydligt att S. suis biofilmer bidra till induktion av meningit.
Figur 1: SEM-bilder av stam P1/7 plankton och biofilm staten celler. Bakterier var odlade i THB medium. SEM analys visade att plankton celler (A) var mycket mindre tät och främst spridda individuellt, medan biofilm bakterier (B) var grupperade i klumpar och flera lager och de var inneslutet i den extracellulära matrixen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: biofilmer aktivera mRNA uttryck för CCL2, IL-6 och TNF-α TLR2 i mus hjärnvävnad i vivo. Sex BALB/c-möss per grupp injicerades varje genom intrakraniell subarachnoidal rutten av infektion med 3 × 107 CFU av plankton celler eller biofilm staten celler. Möss var euthanized på 12 h efter infektion. Resultaten presenteras som luckan ändra av mRNA uttryck i biofilm tillstånd cell-infekterade möss jämfört med plankton cell-infekterade möss. (A) genen B2m användes som Referensgenen; (B) genen 18s rRNA användes som Referensgenen. Ett oparat t-test användes för statistisk analys. ** p ≤0.01, och * p ≤0.05. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: histologisk analys av hjärnvävnaden av möss som infekterats med stam P1/7 plankton bakterier och biofilm staten bakterier. A-D, hjärnan prover från möss som infekterats med biofilm staten bakterier; E-H, hjärnan prover från möss som infekterats med plankton bakterier. A, B, E och F: hjärnhinnor och hjärnbarken; C och G: ventriklarna; D och H: diencephalon. Δ, överbelastning/blödning; □, nekros; ○: infiltration av inflammatoriska celler. Förstoringen = 200 X; skalstapeln = 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Primer namn | Sekvens (5' - 3') | Gen symbol |
| IL-6 fram | CTTCCATCCAGTTGCCTTCT | KLT |
| IL-6 omvänd | CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG | KLT |
| TLR2 framåt | CACTATCCGGAGGTTGCATATC | Tlr2 |
| TLR2 omvänd | GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC | Tlr2 |
| CCL2 fram | CTCACCTGCTGCTACTCATTC | Ccl2 |
| CCL2 omvänd | ACTACAGCTTCTTTGGGACAC | Ccl2 |
| TNF-α framåt | TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT | TNF |
| TNF-α omvänd | GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG | TNF |
| Β2m fram | GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT | B2m |
| Β2m omvänd | TATGTTCGGCTTCCCATTCTC | B2m |
| 18s framåt | GTAACCCGTTGAACCCCATT | 18S rRNA |
| 18s omvänd | CCATCCAATCGGTAGTAGCG | 18S rRNA |
Tabell 1: Grundfärger för RT-qPCR.
Tabell 2: brutto histopatologiska förändringarna i hjärnan från möss som infekterats med S. suis stam P1/7. En fyra-peka betygssystem användes för att utvärdera histologiska förändringar, som beskrivs i protokollet avsnitt 3.3.7. Den totala poängen beräknas som summan av poängen från olika histopatologiska förändringar. Genomsnittligt beräknades som Poäng/antalet möss. Ett oparat t-test användes för statistisk analys. ** p ≤0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Intrakraniell subarachnoidal rutten av infektion som beskrivs här har uppenbara fördelar över andra vägar av infektion. Det gör att utredarna att studera värd-bakterien interaktionen och effekten av bakteriella komponenter på värd immunsvar direkt i hjärnan, som härma bakteriell hänrycka in i det centrala nervsystemet. Denna väg av infektion kan således förlängas för att undersöka mekanismerna av hjärnhinneinflammation som orsakas av andra bakterier. Det kan dessutom också användas för att testa effekten av läkemedel mot bakteriell meningit.
För att få bra resultat med hjälp av denna modell, är följande kritiska steg explicit. Biofilm bildning behöver undersökas under experimentella förhållanden. I den aktuella studien undersökte med svepelektronmikroskop analys. Andra metoder kan också användas för att undersöka biofilm bildning, såsom vävnadsodling tallrik metod och tube metod21. En dag innan infektion, behöver alikvoter av både plankton och biofilm staten celler tinas upp från-80 ° C till avgöra CFU. Nästa dag, ska bakterier spädas till den lämpliga dosen enligt CFU för infektion. Mock-smittade kontrollgruppen injiceras med PBS behov inkluderas och mössen från mock-smittade kontrollgruppen bör uppvisar inga manifestationer under infektion experimentet. Olika stammar kan ha olika infektiösa doser, så ett förberedande experiment rekommenderas starkt att bestämma lämplig infektiös dos. I den aktuella studien användes en dos av 3 × 107 CFU för infektion baserat på vårt preliminära experiment. Denna dos av biofilm bakterier kunde inducera allvarliga tecken på hjärnhinneinflammation och efterföljande död i alla 5 möss 48 h efter infektion i det förberedande experimentet.
Störningar av den blod-hjärn eller blod-ryggmärgsvätskan flytande barriärer av S. suis är ett viktigt steg i att orsaka meningit22,23,24. Intrakraniell subarachnoidal rutten av infektion är inte lämplig för att utvärdera S. suis förmåga att bryta igenom dessa hinder. Andra vägar på infektion såsom i.p., i.v. eller i.n., kan användas för att uppnå detta mål.
Här visar vi först att S. suis biofilm bidrar till induktion av meningit med intrakraniell subarachnoidal rutten av infektion. Denna infektion modell inte bara hjälper till att ytterligare förstå mekanismerna bakom S. suis meningit men är också lämplig för studerar patogenesen av hjärnhinneinflammation som orsakas av andra bakterier och effekten av nya läkemedel mot bakteriell meningit.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av bidrag från nationella nyckel forskning och utveckling Program i Kina [2017YFD0500102]; Nationella naturvetenskapliga grunden för Kina [31572544]; Statliga centrala laboratoriet för veterinärmedicinska etiologisk biologi [SKLVEB2016KFKT005]; Shanghai jordbruk tillämpas teknik utveckling Program, Kina [G2016060201].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
- Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen? Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
- Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45 (2014).
- Kerdsin, A., et al. Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).
- Hatrongjit, R., et al. First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand. BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).
- Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis. Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).
- Isiaku, A. I., et al. Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish. Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).
- Oggioni, M. R., et al. Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).
- Xiao, G., et al. Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model. Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).
- Seitz, M., et al. A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2. Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).
- Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).
- Williams, A. E., Blakemore, W. F. Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).
- Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection. Pathogens. 5 (3), (2016).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiology. 4, 36 (2004).
- Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs. Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).
- Holden, M. T., et al. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis. PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).
- Dominguez-Punaro Mde, L., et al. In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis. Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).
- Hassan, A., et al. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).
- Vanier, G., et al. New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).
- Takeuchi, D., et al. The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis. Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).
