Summary
本研究以螺旋惯性微流体闭环操作为例, 对临床气道分泌物无标签的中性粒细胞分离方法进行了论证。该方法将扩大临床对各种呼吸道疾病的体外测定。
Abstract
气道分泌物含有大量与免疫相关的细胞,例如, 白细胞、巨噬细胞和淋巴细胞, 可作为评估各种肺部疾病的主要资源, 用于研究和临床目的。然而, 由于患者粘液的异质性和粘性, 目前尚无可靠的离解方法, 不损害患者气道分泌物的宿主免疫细胞。在本研究中, 我们介绍了一种利用惯性微流体进行患者免疫评估的样品制备方法。无论临床样品的非均质流体特性如何, 该方法均能从气道分泌物样品中恢复95% 以上的中性粒细胞, 稀释1000倍于干净生理盐水的毫升。通过将浓缩输出流循环到初始样品库, 提供了高浓度、回收率和纯度的免疫细胞;再循环被认为是一个权衡的单一运行的基于注射器的惯性微流体操作。螺旋微流体的闭环操作提供无物理或化学干扰的白细胞, 佛波 12-酯 13-醋酸酯 (PMA) 诱导的弹性蛋白酶释放排列的中性粒细胞。
Introduction
由于细胞被封装在气道分泌物中的大量粘液中,体外测定对白细胞的功能评估受到了阻碍。Dithiothreitol () 是最常见的裂解缓冲液, 用于分离和融汇用于细胞学分析和检测的痰液, 同时为隔离细胞提供可耐受的生存能力1,2。然而, 德勤可能干扰气道中性粒细胞的表面束缚抗原, 导致中性粒细胞功能紊乱, 如弹性蛋白酶和髓 (过氧化物) 释放2,3。因此, 对人气道中性粒细胞功能的研究很少与外周血中性粒细胞有关, 这可能无法揭示4肺的生理特性。同时, 惯性微流体已取得进展, 隔离细胞从不同的病人 biomatrices5,6。惯性升力和迪恩阻力之间的平衡根据其大小对颗粒/细胞进行调整, 允许无标签粒子分离7。我们小组以前介绍了一个样品制备方法为循环肿瘤细胞8,9, 病原体在血液8, 细胞从悬浮培养10,11, 12, 和中性粒细胞 (PMNs) 从血液13,14。
在这里, 我们引入了一个协议, 用闭环惯性微流体来制备病人呼吸道分泌物的免疫细胞, 如中性粒细胞弹性蛋白酶 (NE) 测定。这种方法提供高浓度和恢复, 特别是当细胞/粒子的横向方向有明显的重叠, 细胞/粒子的利益将被删除, 这是通常观察到的临床样本。通过将内壁 (爱德) 聚焦的大颗粒或细胞回流到输入样品管, 粒子或细胞的兴趣集中在原储层, 而带有小粘着骨料的背景流体通过废物库。尽管临床样品的非均质流体特性, 该方法从气道分泌物样品中恢复到95% 以上的中性粒细胞, 稀释1000倍于干净的盐水溶液 (~ 1 毫升)。与此相反, 裂解方法根据样品条件提供了 PMNs 回收率的范围。拟议的议定书以无标签的方式捕获白细胞, 没有物理或化学干扰, 这就提供了从临床上具有挑战性的生物特征识别中获得微妙细胞的可能性, 并具有微创程序。
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Protocol
样本收集是由匹兹堡大学机构审查委员会 (IRB PRO16060443, PRO10110387) 批准的。所有实验均在安全柜内进行, 并配备适当的个人防护设备。
1. 器件制造和软光刻
注: 标准软光刻技术15、16用于创建烷微通道。
- 在10:1 的碱基和固化剂的配比中混合了该聚硅烷前驱体。
- 在微机械加工的铝模上倒入30克的前体细胞混合物 (见图 1为尺寸) 和 20 g 的在 100 mm 培养皿上的前体混合物。
注: 培养皿用于制作支撑层的厚膜 (3 毫米)。在微流体的支撑层提供了均匀的物理表面特性。另外, 还可以使用玻璃滑梯上的一层薄薄的塑料薄膜。利用铝板上的微铣削设计制造了具有特定通道尺寸的主模。本研究采用的螺旋通道是一个8环的螺旋微通道, 其中一个入口和两个插座, 半径从8毫米增加到24毫米, 以有效的大小为基础的分离。 - 将模具和培养皿放入真空干燥, 直到表面上没有气泡, 通常为 5-10 分钟. 使用干燥的房子真空。
- 释放真空, 将模具和培养皿放在90摄氏度烤箱中1小时。
注: 可使用热板或其他加热工具代替烤箱。 - 从烤箱中取出模具和培养皿, 让它在室温下冷却10分钟。
- 小心地剪下轮廓, 用2毫米冲床在设备上打上流体通路孔。
注: 冲床的大小可以根据油管或流体导轨的大小而变化。 - 将胶带粘附在设备的通道侧, 并将其厚膜涂上, 并用镊子小心剥离以除去灰尘。
- 将该设备的通道侧和普通的与空气等离子和粘结的纯聚硅烷 (图 1A) 制成的支撑层。
- 将芯片放置在50毫米 x 70 毫米玻璃上, 并将其放置在70摄氏度烤箱中, 以提高粘结强度。
2. 机械通气病人的气管分泌物收集
注: 气管分泌物可以从机械通气的病人在正常例行气道护理, 使用从常规方法修改的协议, 以适应标准, 成人通气病人。样品被取消辨认并且立刻被送去处理。
- 如果表示气管吸入, 使用导管提取气道分泌物。
- 将导管小心的中途插入气管导管, 并从预先填充的10毫升注射器中注入5毫升0.9% 无菌生理盐水。
- 当导管完全推进, 或抵抗被满足, 吸入分泌物并收集成无菌痰收集容器。
- 收集10毫升的气管分泌物在一个无菌的痰容器, 并把它放在冰上。立即发送样品进行处理。
3. 气管分泌物样品制备
注: 所有实验必须在安全柜内进行, 并配备适当的个人防护设备。
- 使用塑料10毫升注射器 (用于10x 稀释), 分散1毫升的气道分泌物样品在9毫升磷酸盐缓冲盐水 (PBS)。用钝吸管融汇粘液样本。
- 将稀释剂与40µm 尼龙细胞过滤器一起去除大块或血块, 这样可以阻断微流体进入孔或通道。加工后将样品放在冰上。
- 使用100x 体积的 PBS 缓冲器分散每个样品的稀释剂, 导致1,000x 稀释悬浮。在整个离解操作过程中把样品放在冰上。
4. 实验设置
注: 所有实验必须在安全柜内进行, 并配备适当的个人防护设备。
- 将该芯片与流体导轨组装, 将均匀流动应用于四螺旋微 (图 1B)。
注: 四通道通过并行化提高了吞吐量, 并优化了由此产生的悬浮液的体积和细胞密度。流体导向是设计和制造的光固化成形型3D 打印机与透明树脂。该流体导向器的入口和出口端使用女性鲁尔接头, 便于连接和在操作过程中保持稳定的密封。 - 将1/16 英寸的男性鲁尔连接器连接到进气道、内壁 (爱德) 插座和流体导轨的外壁 (下) 出口端, 并将硅胶管连接到样品悬浮液中。
- 向入口和插座的每一端插入钝尖, 到达样品库的底部。
- 将蠕动泵与进油管连接。
- 将进油管和爱德出口油管的末端放置在样品库中, 并将其出口油管的末端放置在废物库中 (图 1C, D)。
- 将经过过滤的 PBS 的50毫升管放置在样品库中, 不含钙和镁。
- 以低流速 (~ 1 毫升/分钟) 开始泵浦, 以使该装置成为质数。
注: 当气泡在通道中捕获时, 将通道顶部与镊子, 以稳定和消除气泡。当设备完全充满缓冲液时, 改变 PBS 管, 准备气道分泌样管。 - 当样品放置在样品库中时, 在蠕动泵上切换, 并将流速设置为4毫升/分 (图 1C, D)。
- 当试样体积达到指定体积 (~ 1 毫升) 时, 停止操作并断开硅胶管。
注: 该方法更有效地减少了大量稀释剂 (> 50 毫升) 成微离心管容积 (~ 1 毫升) (图 2)。
5. 流式细胞仪分析
注: 比较分离方法 (微流体和裂解), 采用免疫荧光法进行流式细胞术。
- 添加异硫氰酸荧光素 (FITC)-共轭小鼠抗人 CD66b 单克隆抗体和复方阿司匹林 (APC)-共轭小鼠抗人 CD45 单克隆抗体的初始悬浮 (步骤 3.3) 和结果悬浮 (步骤 4.9) (200 µL每个抗体) 的比率为1:25 伏/v。
- 在黑暗中孵化4摄氏度的样品30分钟。
- 在流式细胞仪上分析两个样本以量化 PMNs。
注: FITC-APC 双阳性、CD66b 阳性和 CD45 阳性的人群被认为是中性粒细胞。恢复是由输入的总细胞数和由此产生的悬浮的比率来计算的。
6. NE 释放分析
注: 用微流体和裂解法比较孤立中性粒细胞的功能, 采用 NE 测定试剂盒。
- 在检测试剂盒中添加一个 (在步骤4.9 中获得的) 到最后浓度为 50 nM 的。
- 将样品孵化37摄氏度, 2 小时。
- 离心机悬浮在 300 x g 为10分钟。
- 将每个上清的10µL 转移到96井板上 (在化验试剂盒中提供)。
注:96-井微板块与平底和黑聚苯乙烯可以使用以及。 - 在每个井中添加90µL 稀释化验缓冲器 (在化验试剂盒中提供)。
- 添加10µL 弹性蛋白酶基底 (Z-阿拉巴马-阿拉巴马 2Rh110, 提供的化验试剂盒)。
- 在37摄氏度孵育1.5 小时。
- 阅读96井板使用一个荧光计在 485 nm 的激发波长和发射波长 525 nm。
注: 从流式细胞术分析中, NE 的水平除以中性粒度计数。
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Representative Results
我们实现了透明的免疫细胞悬浮与 mucolysis 和微流体离解 (图 3A)。微流体离解收集了 4.40 x 105 PMNs 平均 (2.1 x 104到 5.60 x 105 PMNs, n = 6) 从气道分泌样品稀释了1000倍 (50 毫升总容量) 在1毫升清洁悬浮。与最初稀释剂相比, 94.0% PMNs (CD66b+/CD45+) 在一个小体积内被回收, 持续超过6个临床样本。然而, mucolysis 方法显示, 平均回收率为 53.5% (30.8-96.0%)。(图 3B)。
接下来, 用商业 NE 检测试剂盒作为概念证明, 对弹性蛋白酶的释放进行了研究。无外界刺激, mucolytic 法制备的样品比微流体法的样品具有更高的 NE 水平。从微流体和 mucolytic 离解方法中加入了可引发的悬浮液, 从而触发 NE 释放。我们用6种不同的患者的气道分泌物检测每种方法。免疫细胞与微流体分离提供了完整的功能, 显示了更多的 NE 释放的由 PMA 刺激。另一方面, mucolytic 离解法制备的细胞显示 NE 释放的不一致增加 (图 3C)。
图 1: 螺旋微流控装置和实验设置.照片 (A) 螺旋微流体和 (B) 装置与射流适配器组装。(C) 采用螺旋惯性微流体的闭环分离原理示意图。通过将颗粒/细胞浓缩液回流回原样品库, 免疫相关细胞集中在小体积内, 而含有粘蛋白聚集物的背景流体和小红细胞连续通过连接到输出插座的废物管中取出。(D) 实验设置和10µm 粒子的荧光图像, 轨迹 (绿色) 和螺旋通道 (右上角) 的出口。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 采用闭环惯性微流体的气道分泌物样品制备原理图.临床诱导气道分泌物机械分散在1,000x 容积的缓冲液中。稀释剂由微流体浓缩, 产生1毫升的细胞悬浮, 具有明显的背景。适用于龙等人的许可, 版权所有 (2017) 美国化学学会17。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: mucolytic 法与微流控分离法的代表性比较.(A) 微流控分离后气管分泌物样本 (左) 和显微图像。(B) 原始和由此产生的悬浮物的照相图像。(C) 比较 mucolytic 和微流体方法之间的中性粒细胞回收率。(D) 微流体和德勤 mucolytic 方法对分离中性粒细胞 NE 释放的比较。从微流控分离 (p < 0.0001) 的样品中, NE 释放明显触发。请单击此处查看此图的较大版本.
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Discussion
在惯性微流体中, 粒子和细胞以5、18、19、20的大小在微通道中的某一侧向位置定位。由于在弯曲微通道中, 系主任阻力和惯性升力的联合作用, 大颗粒或中性粒细胞 (> 10 µm) 位于通道内, 小颗粒、粘液骨料和小于6µm 的碎片被定位在渠道外面在某些流速情况10,11,13,14。
然而, 当使用微流体时, 分离的浓度和回收率之间存在权衡, 特别是当粒子或感兴趣细胞的分离尺寸范围与其他细胞/粒子重叠时。为了达到高浓度的排序颗粒和细胞, 分离范围需要狭窄, 需要一个微调与微观观察为每个样品运行;这限制了惯性微流体在异质生物特征识别上的应用, 如气道分泌物。
在这里, 我们介绍了一个临床气道分泌物样品制备方法的体外检测使用闭环惯性微流体 (图 1B, C)。通过聚焦出口回流粒子/电池的闭环操作实现了高浓度因子和高回收率。出水口流入废料管, 并将其出口连续送入原样品管。直径大于10µm 的细胞留在最初的样品管中, 从而增加了样品的细胞密度, 而背景流体被排除在废物管上。高稀释率允许清除背景流体, 包括碎片和粘液。同时, 无论患者样本的情况如何, 该方法均可对免疫细胞进行均匀分离和隔离。
德勤是一种广泛使用的粘液裂解缓冲剂, 它将聚糖聚合中的二硫化物键分离成粘液1、21、22的细胞含量。然而, 据报道, 德勤干扰白细胞表面抗原, 这可能影响白细胞功能2。在我们的研究中, 由于不均匀的 mucolytic 效率和过滤器堵塞, 在不同的样品中, 通过德勤分离恢复的细胞含量不一致。这对制备小体积和相对较厚的气道分泌样品的初始样品变得更为关键。另一方面, 使用微流体的方法使异构患者样本中细胞内容的一致恢复 (图 3C)。如图 3B所示, 我们可以始终将气道分泌物的细胞内容隔离在干净的缓冲区中, 而不管原始的样本状态,即血腥、顽固或水样。与传统方法相比, 所提出的方法在回收样品中的碎片较少, 减少了下游生化分析中碎片的可能干扰。
通过两种浓缩方法对 NE 释放进行了研究, 以评估捕获的中性粒细胞的功能完整性 (图 3D)。中性粒细胞通过 NE 释放23,24,25去除外来有机分子。在体外26, 常用于激活中性粒细胞。用 50 nM 微流体和 mucolytic 方法分离的细胞进行了刺激。我们用人体气道分泌物样本 (标记为 P173、P174、P176、P177、P181 和 P182) 对每种方法进行了测试。以微流体为主要样本的样品在6例中均有增加。与此相反, 只有3的经处理的样品可以诱发的 NE 活性增加后, 在该刺激。另外, mucolytic 法分离的中性粒细胞比微流体分离的中性粒细胞的基线活性高得多。这些结果表明, NE 机械可能存在化学干扰,即表面束缚抗原2、3的破坏, 这表明微流体方法是一种改进的方法, 以保持中性粒细胞功能优于同质化。建议的离解方法也以全自动和完全包含的方式运作, 尽量减少病人样本的暴露和外部环境的潜在危害。
然而, 所提出的方法需要高流速, 因此, 一个稳定的射流连接。此外, 由于蠕动循环泵的固有波动, 爱德出口尺寸必须大于输出尺寸, 否则吞吐量可能会受损。我们预计, 如果有循环泵, 可以提供更稳定的流量, 建议的方法将提供更高的吞吐量。
通过提供一种从临床气道分泌物中捕获中性粒细胞的离解协议, 本研究提出的方法将扩大呼吸道疾病的临床研究范围, 如肺炎、哮喘、囊性纤维化和慢性阻塞性肺疾病。
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Disclosures
作者已经在这里描述的技术申请了专利申请。
Acknowledgments
这项工作得到了 nih/NIAID (R21AI119042) 以及 nih U24 样本保留化验计划 (U24-AI118656) 的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, Suppl 4. 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D.
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
