Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

העשרה ללא תווית נויטרופילים של הפרשת נגזר המטופל דרכי הנשימה באמצעות לולאה סגורה אינרציאלית מיקרופלואידיקה

Published: June 7, 2018 doi: 10.3791/57673
Automatic Translation
1, 1,2, 3, 1,2, 3,5, 1,2,4
1Research Laboratory of Electronics, Massachusetts Institute of Technology, 2Department of Electrical Engineering and Computer Science, Massachusetts Institute of Technology, 3Department of Medicine, University of Pittsburgh, 4Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 5Vascular Medicine Institute, University of Pittsburgh

Summary

במחקר זה, נדגים שיטה ללא תווית נויטרופילים ההפרדה מן הפרשות דרכי הנשימה קליניים באמצעות לולאה סגורה הפעולה של ספירלה מיקרופלואידיקה אינרציאלית. השיטה המוצעת ירחיב את מבחני קליניים במבחנה למחלות בדרכי הנשימה שונים.

Abstract

הפרשות דרכי הנשימה מכילים מספר רב של תאים הקשורים החיסון, למשל, נויטרופילים, מאקרופאגים לימפוציטים, אשר יכול לשמש כמשאב מרכזי כדי להעריך את מגוון של מחלות, הן במחקר והן למטרות קליניות. עם זאת, בשל אופיו הטרוגנית, צמיגה של ריר החולה, אין כרגע אין שיטה דיסוציאציה אמין זה אינו גורם נזק תאים חיסוניים מארח בהפרשה החולה את דרכי הנשימה. במחקר זה, אנו מציגים את שיטת הכנה לדוגמה המשתמשת מיקרופלואידיקה אינרציאלית להערכת המערכת החיסונית של החולה. בין המאפיינים fluidic הטרוגנית של הדגימות קליני, השיטה המוצעת משחזרת יותר מ 95% של נויטרופילים מ והמדגמים הפרשת דרכי הנשימה הם מדולל 1,000-fold עם מיליליטר של תמיסת מלח נקיים. על ידי צואה הנחל פלט מרוכז למאגר דגימה ראשונית, ריכוז גבוה, שחזור, הטוהר של תאים חיסוניים הינם מסופקים; recirculation נחשב פשרה בניהול משפחתי יחיד המבוססת על המזרק פעולת מיקרופלואידיקה אינרציאלית. הפעולה לולאה סגורה של ספירלה מיקרופלואידיקה מספק לויקוציטים ללא הפרעה פיזית או כימית, כפי שמגלה את phorbol פעילים-12 13-אצטט (PMA)-induced elastase שחרורו של נויטרופילים ממוינים.

Introduction

מאז תאים כמוסות ב כמות גדולה של ריר ב הפרשות דרכי הנשימה, יש כבר הפריע את ההערכה תפקודית של לויקוציטים מאת assay במבחנה . Dithiothreitol (DTT) הוא המאגר פירוק הנפוץ ביותר ועד מביצועם homogenize ברוק עבור ניתוח cytological וזיהוי של המגשרים תוך מתן נסבל הכדאיות של תאים בודדים1,2. עם זאת, DTT יכול להתערב עם משטח מכורך אנטיגנים של דרכי הנשימה נויטרופילים, והתוצאה היא שיבוש תפקוד נויטרופילים כגון elastase myeloperoxidase (MPO) עדכוני2,3. לכן, נערכו מחקרים מעטים של דרכי הנשימה האנושית תפקוד נויטרופילים עם דם היקפיים נויטרופילים, אשר עשויים לגלות מאפיינים פיזיולוגיים של ריאתי4. בינתיים, מיקרופלואידיקה אינרציאלית עשה התקדמות לבודד תאים שונים biomatrices החולה5,6. האיזון בין כוחות מעלית אינרציאלית וגרור דין יישור החלקיק/התא על פי גודלם, אשר מאפשר הפרדה חלקיק ללא תווית7. הקבוצה שלנו הציג בעבר שיטת הכנה מדגם מחזורי גידול תאים8,9, פתוגנים בדם8, תאים הבולם תרבות10,11, 12, ואת אורך חייהם לויקוציטים (PMNs) של דם13,14.

כאן, אנחנו מציגים את פרוטוקול להכין את התאים החיסוניים מ הפרשות דרכי הנשימה של המטופל באמצעות לולאה סגורה מיקרופלואידיקה אינרציאלית במורד הזרם במבחנה assay, כגון וזמינותו elastase נויטרופילים (NE). שיטה זו מספקת גם ריכוז גבוה וגם התאוששות, במיוחד כשמדובר חפיפה משמעותי בכיוון לרוחב של התא/החלקיק שממנו התא/החלקיקים-של-הריבית הוא יוסר, אשר בדרך כלל נצפית בדגימות קליניות. על ידי צואה החומה הפנימית (IW)-ממוקד חלקיקים גדולים או תאים בחזרה אל הצינור מדגם קלט, חלקיק או תא-של-עניין תרכיזים במאגר המקורי, בעוד הרקע נוזלים עם אגרגטים mucin קטנים עוברים דרך המאגר פסולת. למרות המאפיינים fluidic הטרוגנית של דגימות קליניות, השיטה המוצעת משחזרת בעקביות מעל 95% של נויטרופילים מדגימות הפרשת דרכי הנשימה זה הם מדולל 1,000-fold עם פתרון נקי מלוחים (~ 1 מ"ל). לעומת זאת, שיטת פירוק מציג מגוון רחב של PMNs השחזור המחירים בהתאם לבעיה מדגם. הפרוטוקול המוצע לוכדת לויקוציטים באופן ללא תווית עם אין הפרעה פיזית או כימית, אשר מספק את האפשרות לקצור תאים עדין קלינית מאתגר ביומטריה עם נהלים פולשנית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

האוסף מדגם אושרה על ידי אוניברסיטת פיטסבורג מוסדיים ועדת הבדיקה (IRB # PRO16060443, PRO10110387). כל הניסויים מתבצעים תחת אבטחה ארון עם ציוד מגן אישי מתאים.

1. התקן פבריקציה נוספת, הדפס אבן רכה

הערה:15,טכניקות הדפס אבן רכה רגיל16 שימשו כדי ליצור את microchannel polydimethylsiloxane (PDMS).

  1. מערבבים למבשר PDMS ב- 10:1 יחס של הסוכן הבסיס של ריפוי.
  2. למזוג 30 גרם של התערובת קודמן PDMS על העובש אלומיניום במכונה-מיקרו (ראו איור 1 מידות), 20 גרם תערובת מבשר PDMS על 100 מ מ פטרי.
    הערה: הפטרי משמש כדי להפוך את הסרט עבה של PDMS (~ 3 מ מ) עבור השכבה התומכת. השכבה התומכת של PDMS מספק מאפייני השטח הפיזי אחיד ברחבי מיקרופלואידיקה. לחלופין, ניתן להשתמש PDMS דקה בסרט בשקופית זכוכית. העובש מאסטר עם ממדים ערוץ מסוים היה מתוכנן, מפוברק על ידי מיקרו-כרסום בגיליון אלומיניום. הערוץ ספירלה השתמשו במחקר זה היה microchannel לופ 8 ספירלה עם כניסה אחת, שני שקעים, עם רדיוס הגדלת 8 מ"מ עד 24 מ"מ להפרדה יעילה מבוסס בגודל.
  3. למקם את העובש, הפטרי desiccator ואקום כדי דגה עד אין בועות גלויים על פני השטח, בדרך כלל 5-10 דקות לשימוש desiccator הבית-ואקום.
  4. לשחרר את הואקום ולמקם כייר ו הפטרי בתנור 90 מעלות לשעה.
    הערה: פלטה או כלי חימום אחרים יכול לשמש במקום תנור.
  5. להסיר את התבנית הפטרי מן התנור ומאפשרים לה להתקרר בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות.
  6. בזהירות לגזור את קווי המתאר, ניקוב החורים גישה נוזלים על המכשיר באמצעות כבטלן 2 מ מ.
    הערה: הגודל של האגרוף יכול להשתנות בהתאם לגודל של המדריך tubing או נוזלים.
  7. דבקים קלטת לצד ערוץ של המכשיר, סרט עבה של PDMS, לקלף בזהירות עם מלקחיים כדי להסיר אבק.
  8. פנקו את הערוץ צידי ההתקן ואת PDMS רגיל עם פלזמה אוויר ואת הקשר עם השכבה התומכת מוכן של PDMS רגיל (איור 1 א').
  9. מקם את השבב בשקופית זכוכית 50 מ מ x 70 מ מ ומניחים אותו בתנור 70 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות לשפר את הכוח מליטה.

2. והכו אותי הפרשת מהאוסף חולים מונשמים

הערה: הפרשות והכו אותי ניתן להשיג חולים מונשמים במהלך טיפול דרכי הנשימה שגרתית נורמלי באמצעות פרוטוקול שונה בשיטות המקובלות כדי להכיל את המטופל מאוורר סטנדרטי, למבוגרים. הדגימות היו בטל מזוהה, נשלח מיד לעיבוד.

  1. אם השאיפה והכו אותי מותווה, להשתמש צנתר כדי לחלץ הפרשות דרכי הנשימה.
  2. לקדם הקטטר בקפידה במחצית הדרך לתוך הצינור אנדוטרכאליות, להחדיר מ ל תמיסת 0.9% סטרילי של מזרק שמולאו מראש 10 מ"ל.
  3. הצנתר הוא מתקדם באופן מלא, או התנגדות מתקיים, וארוקן את ההפרשות ולאסוף לתוך מיכל איסוף sputum סטרילי.
  4. לאסוף 10 מ"ל של הפרשות והכו אותי במיכל סטרילי sputum ומניחים אותו על קרח. לשלוח דוגמאות מיד לעיבוד.

3. הכנת הדוגמא הפרשת והכו אותי

הערה: כל ניסויים חייב להתבצע תחת אבטחה ארון עם ציוד מגן אישי מתאים.

  1. לפזר 1 מ"ל של דרכי הנשימה דגימות הפרשת ב 9 מ ל תמיסת באגירה פוספט (PBS) בעזרת מזרק פלסטיק 10 מ"ל (עבור דילול 10 x). השתמש פיפטה בוטה כדי homogenize את הדגימה ריר.
  2. מסננים את diluent עם מסננת תא ניילון 40 µm כדי להסיר נתחים גדולים או קרישי דם, אשר יכולים לחסום את החור גישה מיקרופלואידיקה או הערוץ. הנח את הדגימה על הקרח לאחר עיבוד.
  3. לפזר את diluent של כל דגימה באמצעות אמצעי אחסון 100 x מאגר PBS, וכתוצאה מכך 1,000 x ההשעיה מדולל. מקם את הדגימה על הקרח במהלך המבצע כולו דיסוציאציה.

4. הגדרת הניסוי

הערה: כל ניסויים חייב להתבצע תחת אבטחה ארון עם ציוד מגן אישי מתאים.

  1. להרכיב את השבב PDMS עם המדריך נוזלים כדי להחיל זרימה אחידה לכל אחד microchannels את ארבעת ספירלה (איור 1B).
    הערה: בארבעה ערוצי שימשו כדי להגדיל את התפוקה על-ידי parallelization, כמו גם אופטימיזציה של צפיפות ונפח תא של המתלה וכתוצאה מכך. המדריך נוזל הוא מתוכנן ועשה עם stereolithography סוג מדפסת תלת-ממד עם שרף ברורה. הים והנמל עודפים של המדריך נוזלים להשתמש במחברי סכינים סטריליים נקבה, כדי להקל על חיבור ואיטום יציב במהלך המבצע.
  2. להתחבר מחבר סכינים סטריליים זכר 1/16 אינץ לים בקיר הפנימי (IW), יציאת לשקע הקיר החיצוני (איי) של המדריך נוזלים וחבר של צינורות סיליקון ההשעיה הדגימה.
  3. להוסיף טיפים בוטה על שני קצוות כניסת ועודפים להגיע התחתון של המאגר מדגם.
  4. לחבר את משאבת סחרור לאורך צינור כניסת.
  5. למקם את הקצה של כניסת אבובים, IW עודפים אבובים בתוך המאגר מדגם ולמקם סוף לאורך צינור עודפים OW במאגר פסולת (איור 1C, יח).
  6. מקם את הצינור 50 מ של PBS מסונן ללא סידן ומגנזיום ליד המאגר מדגם.
  7. התחל שאיבה בספיקה נמוכה (~ 1 mL/min) לשפר את המכשיר.
    הערה: כאשר בועות נלכדים בערוץ, לדחוף העליון של התעלה עם פינצטה יציבות ולחסל את בועות האוויר. כאשר המכשיר באופן מלא מלא בופר, לשנות את הצינור PBS להכין את הצינור מדגם של הפרשת דרכי הנשימה.
  8. כאשר המדגם מניחים בתוך המאגר הדגימה, להחליף את משאבת סחרור ולהגדיר קצב הזרימה ב- 4 מ ל/דקה (איור 1C, יח).
  9. כאשר אמצעי האחסון מדגם מגיע האחסון המיועדת (~ 1 מ"ל), להפסיק את פעולת ונתק לאורך צינור סיליקון.
    הערה: השיטה המוצעת הוא יעיל יותר בהפחתת נפח גדול של diluent (> 50 מ ל) לאמצעי אחסון צינור מיקרו-צנטריפוגה (~ 1 מ"ל) (איור 2).

5. לזרום Cytometry ניתוח

הערה: כדי להשוות בין השיטות דיסוציאציה (מיקרופלואידיקה ופירוק), cytometry זרימה עם immunofluorescence שימש.

  1. הוספת fluorescein isothiocyanate (FITC) - נוגדנים חד שבטיים העכבר מצומדת האנטי-האדם CD66b, allophycocyanin (APC) - מצומדת העכבר נגד CD45 נוגדנים חד שבטיים המתלים הראשונית (שלב 3.3), וכתוצאה מכך המתלים (שלב 4.9) (200 µL של כל נוגדן) ביחס של 1:25 וי/v.
  2. דגירה בדגימות ב 4 ° C בחושך למשך 30 דקות.
  3. לנתח את שתי דוגמאות על cytometer זרימה כדי לכמת את PMNs.
    הערה: האוכלוסיה היא חיובית כפולה FITC-APC, CD66b חיובי, CD45 חיובי נחשבה לאבן נויטרופילים. שחזור מחושב על ידי היחס בין המספרים בתא סכום של הקלט, וכתוצאה מכך ההשעיה.

6. ניתוח שחרור NE

הערה: כדי להשוות את הפונקציונליות של מבודד נויטרופילים בשיטה מיקרופלואידיקה והמסה, ערכת NE assay שימש.

  1. להוסיף PMA (המסופק בערכה assay) כל השעיה וכתוצאה מכך (שהושג בשלב 4.9) כדי ריכוז סופי של 50 ננומטר.
  2. דגירה בדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים.
  3. Centrifuge את המתלים ב g x 300 למשך 10 דקות.
  4. להעביר 10 µL של כל תגובת שיקוע צלחת 96-ובכן (המסופק בערכה assay).
    הערה: microplate 96-ובכן עם תחתית שטוחה, פוליסטירן שחור יכול לשמש גם כן.
  5. להוסיף 90 µL assay מדולל מאגר (המסופק בערכה assay) כל טוב.
  6. להוסיף 10 µL של המצע elastase (2Rh110 Z-Ala-Ala-Ala-Ala, המסופק בערכה assay).
  7. תקופת דגירה של 1.5 h ב- 37 מעלות צלזיוס.
  8. לקרוא את הצלחת 96-ובכן באמצעות של fluorometer-גל עירור של 485 ננומטר, אורך גל של פליטה של 525 ננומטר.
    הערה: הרמה של NE חולקה על ידי הרוזן נויטרופיל מניתוח cytometry זרימה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

השגנו המתלים החיסון-תא שקוף עם שני DTT mucolysis ו מיקרופלואידיקה דיסוציאציה (איור 3 א). מיקרופלואידיקה דיסוציאציה שנאספו 4.40 x 105 PMNs בממוצע (2.1 x 104 5.60 x 105 PMNs, n = 6) מדגימות את דרכי הנשימה הפרשת מדולל 1,000-fold (הנפח הכולל של 50 מ"ל) ב 1 מ"ל של השעיה נקי. בהשוואה את diluent הראשוני, 94.0% PMNs (CD66b+/CD45+) התגלו ב אמצעי אחסון קטן, באופן עקבי על פני 6 דוגמאות קליניות. עם זאת, שיטת mucolysis DTT מתאוששת 53.5% בממוצע עם דגימה-כדי-sample משמעותי וריאציות (30.8-96.0%) (איור 3B).

בשלב הבא, שחרורו של elastase נבדק עם ערכת assay NE מסחרי כמושג הוכחה-של. ללא גירוי חיצוני, המדגם שהוכנו על ידי שיטת mucolytic הראה ורי גבוה יותר ברמה יותר המדגם מן השיטה מיקרופלואידיקה. ובחום הוסיפו את המתלים המתקבלת מן מיקרופלואידיקה והן הדיסוציאציה mucolytic שיטות לעורר שחרור NE. . בדקנו בכל שיטה עם דרכי הנשימה הפרשת דגימות 6 חולים שונים. תאים חיסוניים מופרדות על-ידי מיקרופלואידיקה הציג פונקציונליות ללא פגע, מציג כמות מוגברת של NE שחרר על-ידי גירוי ובחום. מצד שני, תאים שהוכנו על ידי שיטת הדיסוציאציה mucolytic הראה עלייה לא עקבית של שחרור NE (איור 3C).

Figure 1
איור 1: ספירלה microfluidic ההתקן והגדרות ניסיוני. לצלם תמונות של מיקרופלואידיקה ספירלה (A) ו- (B) המכשיר הורכבה את מתאם fluidic. (ג) תרשים סכמטי של לולאה סגורה הפרדה באמצעות ספירלה מיקרופלואידיקה אינרציאלית. על ידי צואה זרם חלקיקים תא מרוכז (IW outlet) בחזרה לתוך המאגר הדגימה המקורית, תאים הקשורים החיסון רוכזו באמצעי אחסון קטן תוך הנוזל רקע המכיל mucin אגרגטים והיו RBCs קטין ללא הרף להסיר דרך הצינורית פסולת מחובר לשקע. רק רגע. הגדרת הניסוי (D) ואת התמונה פלורסנט של חלקיק 10 מיקרומטר, המסלול (ירוק), בשקע של הערוץ ספירלה (מימין). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: תרשים סכמטי של הכנת הדוגמא הפרשת דרכי הנשימה באמצעות לולאה סגורה מיקרופלואידיקה אינרציאלית. קלינית המושרה הפרשת דרכי הנשימה התפזרו מכנית x 1,000, ףקיהב בופר. Diluent מרוכז על ידי מיקרופלואידיקה, וכתוצאה מכך ~ 1 מ"ל של השעיה תא עם רקע בהיר. הותאם בהיתר. ריו et al., יוצרים האגודה האמריקנית לכימיה (2017)17. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: השוואות נציג של השיטה mucolytic DTT בשיטה הדיסוציאציה microfluidic. (א) הפרשות והכו אותי לטעום (משמאל) ותמונה מיקרוסקופיים לאחר הדיסוציאציה microfluidic. (B) בצילום של המתלים המקוריים, וכתוצאה מכך. (ג) השוואה של נויטרופיל שיעורי ההחלמה בין השיטות mucolytic ו מיקרופלואידיקה. השוואה (D) של שחרור NE של נויטרופילים מופרדים על ידי מיקרופלואידיקה DTT שיטות mucolytic לפני ואחרי גירוי ובחום. שחרור NE נגרמה באופן משמעותי ע י PMA על הדגימה של ההפרדה microfluidic (p < 0.0001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

ב מיקרופלואידיקה אינרציאלית, חלקיק ותאים לשפה במיקום לרוחב מסוים במיקרו-ערוץ מבוסס על שלהם גודל5,18,19,20. בשל ההשפעה המשולבת של הדיקן גררו כוח וכוח הרמה אינרציאלית microchannel מעוקל, חלקיקים גדולים או נויטרופילים (> 10 מיקרומטר) ממוקמים בתוך הערוץ של חלקיקים קטנים, ריר, אגרגטים פסולת קטנים יותר 6 מיקרומטר ממוקמות בחוץ התעלה במהירות זרימה מסוימים תנאים10,11,13,14.

עם זאת, יש פשרה בין ריכוז שחזור ההפרדה בעת שימוש מיקרופלואידיקה, במיוחד כאשר הטווח גודל ההפרדה של החלקיק או התא עניין חופף עם תאים/חלקיקים אחרים. כדי להשיג ריכוז גבוה של חלקיקי מיון, תאים, הטווח ההפרדה צריך להיות צר ודורש עדין עם תצפית מיקרוסקופית עבור כל הפעלה מדגם; זה מגביל את השימוש של אינרציה מיקרופלואידיקה על ביומטריה הטרוגנית, כגון הפרשות דרכי הנשימה.

כאן, אנחנו מציגים שיטה הכנה מדגם של הפרשות דרכי הנשימה קליניים עבור במבחנה מבחני באמצעות לולאה סגורה מיקרופלואידיקה אינרציאלית (איור 1B, ג). פעולת לולאה סגורה על ידי מחזור התא/החלקיק דרך שקע התמקדות מושגת גם גורמים ריכוז גבוה וגם המחירים התאוששות גבוהה. השקע OW זורם לתוך הצינור פסולת, ששקע IW מוזן באופן רציף הצינור הדגימה המקורית. התאים הגדולים מ- 10 מיקרומטר בקוטר נשארים בצינור הדגימה הראשונית, לפיכך, הגדלת הצפיפות תא של המדגם, ואילו הנוזל רקע חוסלה על הצינור פסולת. הקצב דילול גבוה מאפשר סיווג של נוזל רקע, כולל פסולת, ריר. כמו כן, בין מצבו של החולה מדגם, השיטה המוצעת ניתן בצורה אחידה מביצועם של בודד תאים חיסוניים.

DTT היא שהמאגר פירוק mucin בשימוש נרחב cleaves דיסולפידי אג ח בצבירת פרוטאוגליקן להפריד תוכן תא ה21,1,mucilage22. עם זאת, DTT הדיווחים מפריע אנטיגנים משטח תאי הדם הלבנים, אשר יכולים להשפיע על תפקוד ליקוציט2. במחקר שלנו, תוכן סלולרי התאושש על ידי DTT דיסוציאציה היו לא עקביים מדגמים, בגלל היעילות mucolytic לא אחידה ואת סתימת של המסנן. זה הופך להיות יותר קריטי עבור הכנת דוגמאות הראשונית עם כמויות קטנות ודוגמאות הפרשת עבה יחסית את דרכי הנשימה. מצד שני, השיטה באמצעות מיקרופלואידיקה לאפשר התאוששות עקבית של תוכן התא בדגימות החולה הטרוגנית (איור 3C). כפי שמוצג באיור 3B, יכולנו לבודד בעקביות את תוכן התא הפרשה דרכי הנשימה במאגר נקי ללא תלות המקורי במצב לדוגמה, קרי, ארור, עקשן או דומעות. השיטה המוצעת לעומת השיטה המקובלת, יש פחות פסולת בדוגמת התאושש, אשר ממזער הפרעות אפשריות של פסולת ניתוחים הביוכימי במורד הזרם.

שחרור NE נבדק כדי להעריך את תקינות תפקודי נויטרופילים שנתפסו על ידי שתי השיטות העשרה (דמות תלת-ממד). נויטרופילים להסיר זרים מולקולות אורגניות באמצעות NE לשחרר24,23,25. ובחום משמשת להפעלת נויטרופילים במבחנה26. תאים מבודדים על ידי מיקרופלואידיקה את השיטות (DTT) mucolytic היו מגורה עם 50 ננומטר של ובחום. בדקנו בכל שיטה עם דגימות הפרשת דרכי הנשימה האנושית (כאנטי P173, P174, P176, P177, P181 ודגם p182 מיוצר מאלומיניום). דוגמאות מרוכז על ידי מיקרופלואידיקה הראה עלייה NE ידי גירוי PMA עבור כל הדגימות 6. לעומת זאת, רק 3 של הדגימות DTT מטופלים שיכולים לזרז פעילות NE מוגברת לאחר גירוי ובחום. בנוסף, נויטרופילים מבודדים בשיטת mucolytic DTT הראה הרבה פעילות בסיסית גבוהה יותר מאשר נויטרופילים מבודדת על ידי מיקרופלואידיקה. תוצאות אלו הראה הפרעה כימית אפשרי של מכונות NE, קרי, שיבוש של המשטח מאוגד אנטיגן2,3, אשר טוען כי השיטה מיקרופלואידיקה היא שיטה משופרת במובן של שמירה תפקוד נויטרופילים מאשר המגון DTT. השיטה המוצעת דיסוציאציה מפעילה באופן אוטומטי ומצומצם באופן מלא, למזער את החשיפה של דגימות מטופלים עם סכנות פוטנציאליות של הסביבה החיצונית.

עם זאת, השיטה המוצעת דורשת קצב זרימה גבוהה ולכן חיבור fluidic יציב. גם, עקב התנודות הטבועה של המשאבה מחזור סינון, הממד עודפים IW חייב להיות גדול יותר הממד עודפים OW, אחרת עלולה לסכן תפוקה. אנו מצפים כי השיטה המוצעת יספק תפוקה גבוהה יותר אם יש משאבה זרימת הדם יכולה לספק קצב זרימה יציבה יותר.

על-ידי מתן פרוטוקול דיסוציאציה ללכוד נויטרופילים מן הפרשות דרכי הנשימה קליני, השיטה שהוצגו במחקר זה הוא צפוי להרחיב את היקף מחקר קליני על מחלות בדרכי הנשימה, אסטמה, דלקת ריאות, סיסטיק פיברוזיס, וכרוני מחלת ריאות חסימתית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים הגישו בקשה לרישום פטנט על טכנולוגיה המתוארים כאן.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי NIH/NIAID (R21AI119042) כמו גם תכנית NIH ממעט מדגם U24 assay (U24-AI118656).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PDMS precursor Dow corning 184 SIL ELAST KIT 3.9KG 10:1 ratio of base and curing agent
VWR gravity convection oven VWR 414005-128 PDMS precursor to be cured in 90 deg.
100mm petri dish VWR 89000-324 Fabrication of PDMS Supporting layer
Harris Uni-core puncher Sigma-aldrich WHAWB100076 2mm diameter or other depending on the tubing size
Air plasma machine Femto Science Cute Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base.
2” x 3” glass slide TED PELLA, INC. 2195 To support PDMS device
Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 Cole-Parmer EW-96410-14 Tubing for microfluidics and peristlatic pump
1/16 inch Luer connector, male Harvard apparatus PC2 72-1443 Connector for fluid guide
50mL Falcon tube Corning 21008-940 sample collection & preparation
Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium Corning 45000-446  Buffer solution to dilute sample
Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm HALYARD HEALTH 22113 Tracheal seceation suction catheter
0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe BD PosiFlush NHRIC: 8290-306547 For tracheal seceation collection from the patients
SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL Simport 1176R36 Sterile sputum (airway secretion) collection container
Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL BD BD309604 To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube
BD  Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok  Tip BD To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube
40µm nylon cell strainer  Falcon 21008-949 To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel.
Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) Cole-Parmer HV-07522-30 operation of microfluidics
BD LSR II flow cytometer BD Bioscience LSR II flow cytometer Quantification of cell recovery ratio
Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody BD Bioscience 561927 Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis
Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody BD Bioscience 561864 Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis
Plate reader Thermo Fisher scientific Varioskan Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525
Neutrophil elastase assay kit Cayman Chemical 600610 Neutrophil functionality assessment
Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm PolyScience, Inc. 18140-2 Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
  2. van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, Suppl 4. 143-154 (2005).
  3. Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
  4. Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
  5. Di Carlo, D. Inertial microfluidics. Lab Chip. 9 (21), 3038-3046 (2009).
  6. Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
  7. Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
  8. Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
  9. Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
  10. Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
  11. Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
  12. Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
  13. Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
  14. Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
  15. Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
  16. Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
  17. Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
  18. Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
  19. Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
  20. Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
  21. Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
  22. Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
  23. Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
  24. Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
  25. Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
  26. Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).

Tags

אימונולוגיה זיהום גיליון 136 מיקרופלואידיקה אינרציאלית הפרשת דרכי הנשימה ללא תווית התא מיון biofluid הטרוגנית העשרה נויטרופילים הכנת הדוגמא החולה
העשרה ללא תווית נויטרופילים של הפרשת נגזר המטופל דרכי הנשימה באמצעות לולאה סגורה אינרציאלית מיקרופלואידיקה
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ryu, H., Choi, K., Qu, Y., Kwon, T., … More

Ryu, H., Choi, K., Qu, Y., Kwon, T., Lee, J. S., Han, J. Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics. J. Vis. Exp. (136), e57673, doi:10.3791/57673 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter