Summary
Dans cette recherche, nous démontrons une méthode de séparation neutrophiles exempte d’étiquette de sécrétions des voies respiratoires clinique utilisant opération de boucle fermée de spirale microfluidics inertiel. La méthode proposée élargirait les essais cliniques in vitro pour diverses maladies respiratoires.
Abstract
Les sécrétions des voies aériennes contiennent un grand nombre de cellules immunitaires, par exemple, les neutrophiles, les macrophages et lymphocytes, qui peuvent être utilisés comme une ressource majeure pour évaluer une variété de maladies pulmonaires, tant pour la recherche et à des fins cliniques. Toutefois, en raison de la nature hétérogène et visqueuse de mucus patients, il n’y a actuellement aucune méthode fiable de dissociation qui n’endommage pas les cellules immunitaires de l’hôte dans la sécrétion bronchique patients. Dans cette recherche, nous présentons une méthode de préparation d’échantillon qui utilise microfluidics inertiel pour évaluation immunitaire du patient. Quelles que soient les propriétés fluidiques hétérogènes des échantillons cliniques, la méthode proposée remet plus de 95 % de neutrophiles d’échantillons de sécrétion des voies respiratoires qui sont dilués 1000 avec millilitres de solution saline propre. Par recirculation le flux de sortie concentrée vers le réservoir de l’échantillon initial, une forte concentration, la récupération et la pureté des cellules immunitaires sont fournis ; recirculation est considéré comme un compromis à l’opération d’axée sur la seringue unique-run de microfluidique inertielle. L’opération de boucle fermée de spirale microfluidics fournit des leucocytes sans perturbation physique ou chimique, comme en témoigne le phorbol 12-myristate 13-acétate (PMA)-induite par le communiqué de l’élastase des neutrophiles triés.
Introduction
Étant donné que les cellules sont encapsulées dans une grande quantité de mucus dans les sécrétions des voies respiratoires, l’évaluation fonctionnelle des leucocytes par un test in vitro a été entravée. Le dithiothréitol (DTT) est la plus courant tampon de lyse à dissocier et homogénéiser les crachats pour analyse cytologique et la détection des médiateurs tout en assurant la viabilité tolérable de cellules isolées1,2. Cependant, DTT peut interférer avec les antigènes de surface-bondissent des neutrophiles des voies respiratoires, entraînant l’interruption des neutrophile fonction telles que l’élastase et la myéloperoxydase (MPO) version2,3. Par conséquent, peu d’études sur les neutrophiles fonction pulmonaire humain ont été menées avec les neutrophiles circulants, qui peuvent ne pas révéler les caractéristiques physiologiques de pulmonaire4. Pendant ce temps, microfluidique inertielle a progressé à isoler les cellules de différents patients biomatrices5,6. L’équilibre entre les forces de levage inertiel et Dean drag aligne la particule/cellule selon leur taille, qui permet la séparation de particules libres label7. Notre groupe précédemment introduit une méthode de préparation d’échantillon pour faire circuler la tumeur cellules8,9, les agents pathogènes dans le sang8, les cellules une suspension culture10,11, 12et polynucléaires (PN) du sang13,14.
Ici, nous introduisons un protocole visant à préparer les cellules immunitaires dans les sécrétions des voies aériennes du patient à l’aide de boucle fermée microfluidics inertiel pour un dosage en aval in vitro , tels que l’essai de l’élastase neutrophile (NE). Cette méthode fournit la forte concentration et récupération, surtout quand il y a un chevauchement significatif dans le sens latéral de la cellule/particule dont la cellule/particule d’intérêt doit être enlevé, qui est fréquemment observé dans les échantillons cliniques. Par la paroi intérieure (IW) de recirculation-axé sur les grosses particules ou cellules vers le tube d’échantillonnage en entrée, la particule ou cellule d’intérêts concentrés dans le réservoir d’origine, tandis que les fluides de fond avec des agrégats de mucine petits traversent le réservoir de déchets. Malgré les propriétés fluidiques hétérogènes d’échantillons cliniques, la méthode proposée récupère constamment au-dessus de 95 % des neutrophiles, des échantillons de sécrétion des voies respiratoires qui sont dilués 1000 avec une solution saline propre (~ 1 mL). En revanche, la méthode de lyse propose une large gamme de PMN taux de recouvrement selon l’état de l’échantillon. La proposition de protocole capture des leucocytes dans une manière sans étiquette sans perturbation physique ou chimique, qui prévoit la possibilité de récolter des cellules délicates de contester cliniquement biométrie aux procédures minimalement invasives.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Le prélèvement des échantillons a été approuvé par l’Université de Pittsburgh Institutional Review Board (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Toutes les expériences sont réalisées sous une armoire avec les équipements de protection individuelle approprié de biosécurité.
1. dispositif Fabrication et la lithographie douce
NOTE : Lithographie douce Standard techniques15,16 ont servi à créer le MICROCANAL polydiméthylsiloxane (PDMS).
- Mélanger le précurseur PDMS dans un rapport de 10:1 de base et polymérisation agent.
- Verser 30 g du mélange PDMS précurseur sur le moule en aluminium micro-usinés (voir Figure 1 pour les dimensions) et 20 g de mélange PDMS précurseur sur le 100 mm boîte de Pétri.
Remarque : La boîte de Pétri est utilisé pour faire le film épais de PDMS (~ 3 mm) pour la couche de support. La couche de support du PDMS fournit des propriétés de surface physiques uniformes tout au long de la microfluidique. Par ailleurs, une fine pellicule PDMS sur la lame de verre peut être utilisée. Le moule principal avec des dimensions de canal spécifique a été conçu et fabriqué par micro-fraisage sur la feuille d’aluminium. Le canal de spirale utilisé dans cette étude était une microchannel 8-boucle spirale avec une entrée et deux sorties, dont le rayon augmente de 8 mm à 24 mm pour une séparation efficace axée sur les entreprises. - Placez le moule et le plat de Pétri dans un dessiccateur à vide pour dégazer jusqu'à ce qu’aucune bulle n’est visibles sur la surface, généralement de 5 à 10 min. utiliser un chambre à vide pour le dessiccateur.
- Libérer le vide et placer le moule et le plat de Pétri dans un four à 90 ° C pendant 1 h.
Remarque : Une plaque chauffante ou autres outils de chauffage peuvent être utilisés au lieu d’un four. - Retirer le moule et le plat de Pétri du four et laisser refroidir à température ambiante pendant 10 min.
- Soigneusement découper le contour et percez les trous d’accès fluide sur le périphérique à l’aide d’un perforateur de 2 mm.
Remarque : La taille du poinçon peut varier selon la taille du guide tube ou fluide. - Collez une bande pour le côté du chenal de l’appareil et la pellicule de PDMS et peler soigneusement avec une pince pour enlever la poussière.
- Traiter les deux le côté du chenal de l’appareil et le PDMS plain air plasma et lien avec la couche de support préparée de plaine PDMS (Figure 1 a).
- Placez le jeton sur la lame de verre de 50 mm x 70 mm et le placer dans un four à 70 ° C pendant au moins 30 min renforcer la force de liaison.
2. Collection de sécrétion trachéale chez les Patients sous ventilation mécanique
NOTE : Sécrétions trachéales peuvent être obtenues chez des patients sous ventilation mécanique pendant les soins des voies respiratoires courantes normales en utilisant un protocole modifié de méthodes conventionnelles pour accueillir le patient ventilé standard, adult. Des échantillons ont été rendus anonymes et envoyés immédiatement à la transformation.
- Aspiration trachéale est indiquée, utiliser un cathéter pour extraire les sécrétions des voies aériennes.
- Avancez la sonde soigneusement à mi-chemin dans le tube endotrachéal et instiller 5 mL de 0,9 % du sérum physiologique d’une seringue préremplie de 10 mL.
- Lorsque le cathéter est avancé entièrement ou résistance est rencontrée, aspirer les sécrétions et la recueillir dans un récipient de collecte des expectorations stérile.
- Collecter 10 mL des sécrétions trachéales dans un récipient stérile expectorations et placez-le sur la glace. Envoyer des échantillons immédiatement pour le traitement.
3. préparation d’échantillons de sécrétion trachéale
Remarque : Toutes les expériences doivent être exécutés sous une meuble avec les équipements de protection individuelle approprié de biosécurité.
- Disperser, 1 mL d’échantillons de sécrétion bronchique dans 9 mL d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à l’aide d’une seringue en plastique de 10 mL (pour une dilution de 10 x). Utiliser une pipette émoussée pour homogénéiser l’échantillon de mucus.
- Le diluant de la souche avec une passoire de cellule en nylon de 40 µm pour enlever les gros morceaux ou des caillots de sang, qui peuvent bloquer le trou d’accès de microfluidique ou le canal. Placer l’échantillon sur la glace après le traitement.
- Disperse le diluant de l’échantillon à l’aide d’un volume de 100 x de tampon PBS, résultant en un 1000 x suspension diluée. Placer l’échantillon sur la glace lors de l’opération entière de dissociation.
4. expérimental
Remarque : Toutes les expériences doivent être exécutés sous une meuble avec les équipements de protection individuelle approprié de biosécurité.
- Assembler la puce PDMS avec le guide fluide d’appliquer l’écoulement uniforme à chacun des microcanaux quatre spirale (Figure 1 b).
Remarque : Quatre canaux ont été utilisés pour augmenter le débit de parallélisation, ainsi que l’optimisation de la densité cellulaire et de volume de la suspension qui en résulte. Le guide de fluide est conçu et fabriqué avec une imprimante 3D de type stéréolithographie avec résine transparente. L’entrée et l’orifice de sortie du fluid guide utilisent des raccords Luer femelles pour faciliter la connexion et étanchéité stable pendant l’opération. - Branchez un raccord Luer mâle de 1/16 de pouce à l’entrée, la sortie de la paroi interne (IW) et l’orifice de sortie du mur extérieur (OW) du guide fluid et un tube en silicone à la suspension de l’échantillon.
- Insérer des conseils émoussés à chaque extrémité de l’entrée et les points de vente pour atteindre le fond du réservoir échantillon.
- Branchez la pompe péristaltique avec le tuyau d’arrivée.
- Placer l’extrémité du tuyau d’arrivée et tube de sortie IW dans le réservoir de l’échantillon et placer l’extrémité de la tubulure de sortie OW dans le réservoir de déchets (Figure 1, D).
- Placer le tube de 50 mL de PBS filtrée sans calcium et de magnésium dans le réservoir de l’échantillon.
- Commencer à un faible débit (~ 1 mL/min) pour amorcer le dispositif de pompage.
Remarque : Lorsque les bulles sont capturées dans le canal, appuyez sur la partie supérieure du canal avec la pince à déstabiliser et à éliminer les bulles d’air. Lorsque l’appareil est entièrement rempli de solution tampon, changer le tube de PBS pour préparer le tube d’échantillon de sécrétion bronchique. - Lorsque l’échantillon est placé dans le réservoir de l’échantillon, mettre en marche la pompe péristaltique et régler le débit à 4 mL/min (Figure 1, D).
- Lorsque le volume de l’échantillon atteint le volume désigné (~ 1 mL), l’arrêter et débrancher le tuyau de silicone.
Remarque : La méthode proposée est plus efficace pour réduire un volume important de diluant (> 50 mL) dans un volume de tube à centrifuger-micro (~ 1 mL) (Figure 2).
5. analyse en cytométrie en flux
Remarque : Pour comparer les méthodes de dissociation (microfluidique et lyse), cytométrie de flux avec l’immunofluorescence a été utilisé.
- Ajouter l’isothiocyanate de fluorescéine (FITC) - anticorps monoclonal de souris conjugués anti-humain CD66b et allophycocyanin (APC) - conjugué anti-human CD45 anticorps monoclonal de souris aux suspensions initiales (étape 3.3) et des suspensions qui en résulte (étape 4,9) (200 µL des doses d’anticorps) dans une proportion de 01:25 v/v.
- Incuber les échantillons à 4 ° C dans l’obscurité pendant 30 min.
- Analyser les deux échantillons sur un cytomètre en flux pour quantifier l’APF.
NOTE : La population positive double FITC-APC, CD66b positive et positive de CD45 était censée être neutrophiles. Récupération a été calculée par le rapport entre le total du nombre de cellules de l’entrée et la suspension qui en résulte.
6. NE version analyse
Remarque : Pour comparer les fonctionnalités de l’isolé neutrophiles par la méthode microfluidique et lyse, un kit de dosage NE servait.
- Ajouter des PMA (fourni dans le kit de test) à chaque suspension qui en résulte (obtenue à l’étape 4,9) à une concentration finale de 50 nM.
- Incuber les échantillons à 37 ° C pendant 2 h.
- Centrifuger les suspensions à 300 x g pendant 10 min.
- Transférer 10 µL de chaque surnageant dans une plaque à 96 puits (fournie dans le kit de dosage).
Remarque : Une microplaque 96 puits avec un fond plat et le polystyrène noir peut être utilisée aussi bien. - Ajouter 90 µL de tampon dilué (fourni dans le kit de dosage) dans chaque puits.
- Ajouter 10 µL de substrat élastase (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, fourni dans le kit de dosage).
- Incuber pendant 1,5 h à 37 ° C.
- Lire la plaque à 96 puits à l’aide d’un fluorimètre à une longueur d’onde d’excitation de 485 nm et une longueur d’onde d’émission de 525 nm.
Remarque : Le niveau de NE a été divisé par le nombre PMN de l’analyse de cytométrie de flux.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Nous avons réalisé des suspensions de cellules immunitaires transparentes avec les deux DTT mucolysis et microfluidique dissociation (Figure 3 a). Microfluidique dissociation recueillies 4,40 x 105 PN en moyenne (2.1 x 104 à 5,60 x 105 PN, n = 6) des voies aériennes sécrétion échantillons dilués 1000 (volume total de 50 mL) dans 1 mL de suspension propre. Par rapport au diluant initial, 94,0 % PN (CD66b+/CD45+) ont été récupérés dans un petit volume, toujours sur 6 échantillons cliniques. Cependant, la méthode de mucolysis DTT ont montré une récupération de 53,5 % en moyenne avec des variations importantes d’échantillon (30,8-96,0 %) (Figure 3 b).
Ensuite, la libération de l’élastase a été étudiée avec un kit de dosage NE commerciale comme une preuve de concept. Sans stimulation externe, l’échantillon préparé par la méthode mucolytique ont montré un plus élevé NE niveau que l’échantillon de la méthode de la microfluidique. PMA a été ajouté pour les suspensions qui en résulte de la microfluidique et méthodes de dissociation mucolytiques pour déclencher la libération de NE. Nous avons testé chaque méthode avec des échantillons de sécrétion bronchique de 6 différents patients. Les cellules immunitaires séparés avec microfluidics présenté fonctionnalité intacte, montrant une plus grande quantité de NE libérer par la stimulation de la PMA. En revanche, les cellules préparées par la méthode de dissociation mucolytiques ont montré une augmentation incompatible de libération de la NE (Figure 3).
Figure 1 : dispositif microfluidique en spirale et des paramètres expérimentaux. Photographier des images de microfluidique spirale (A) et (B) l’appareil assemblés avec l’adaptateur fluidique. (C) schéma de principe de séparation de circuit fermé utilisant la spirale microfluidics inertiel. Par recirculation le flux de particules/cellule concentré (sortie IW) dans le gisement d’échantillon initial, les cellules immunitaires étaient concentrées dans un petit volume tandis que le fluide fond contenant des agrégats de mucine et RBCs mineures ont été continuellement supprimé par le tube de déchets branché sur la prise de OW. (D) montage expérimental et l’image fluorescente d’une particule de 10 µm, la trajectoire (verte) et la sortie du canal en spirale (en haut à droite). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : schéma de principe de la préparation des échantillons sécrétion bronchique à l’aide de la boucle fermée microfluidics inertielle. Sur le plan clinique induit la sécrétion bronchique dispersée mécaniquement dans 1 000 x Band de solution tampon. Le diluant se concentre en microfluidique, entraînant environ 1 mL de suspension cellulaire avec le fond clair. Adapté avec la permission de Ryu et al., droit d’auteur (2017) American Chemical Society17. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : comparaisons représentatifs de la méthode mucolytique TNT à la méthode de dissociation microfluidiques. Sécrétions trachéales (A) l’échantillon (gauche) et image microscopique après la dissociation de la microfluidique. (B) image photographique des suspensions originales et qui en résulte. (C) la comparaison des taux de récupération PMN entre les méthodes mucolytiques et microfluidique. (D) Comparaison de libération de NE des neutrophiles séparés par la microfluidique et méthodes mucolytiques TNT avant et après stimulation des PMA. Libération de NE a été significativement déclenchée par AGP sur l’échantillon de séparation microfluidique (p < 0,0001). S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
En microfluidique inertielle, particules et cellules localiser à une certaine position latérale dans une micro-chaîne basée sur leur taille5,18,19,20. En raison de l’effet combiné du doyen glisser la force et la force inertielle ascenseur à microcanaux incurvé, grosses particules ou neutrophiles (> 10 µm) sont situés à l’intérieur du canal et petites particules, agrégats de mucus et les débris plus petit que 6 µm sont positionnés dehors du chenal à une vitesse de certaines conditions de10,11,13,14.
Cependant, il y a un compromis entre la concentration et la récupération de la séparation lors de l’utilisation de la microfluidique, surtout lorsque le calibre de la séparation de la particule ou de la cellule d’intérêt les chevauchements avec d’autres cellules/particules. Pour atteindre une concentration élevée de particules triés et de cellules, la gamme de séparation doit être étroite et nécessite une mise au point avec l’observation microscopique pour chaque échantillon de plaque ; Cela limite l’utilisation de l’inertie microfluidics sur la biométrie hétérogène, tels que les sécrétions des voies aériennes.
Ici, nous introduisons un PROCEDE de preparation d’échantillon de sécrétions des voies respiratoires clinique pour des dosages in vitro à l’aide de la boucle fermée inertielle microfluidics (Figure 1 b, C). L’opération de boucle fermée par recirculation de la particule/cellule grâce à une prise de mise au point atteint les facteurs de concentration élevé et taux de récupération élevé. La prise de OW se jette dans le tube de déchets, et la prise de IW est alimentée en permanence dans le tube échantillon original. Plus de 10 µm de diamètre des cellules restent dans le tube d’échantillon initial, ainsi, augmenter la densité des cellules de l’échantillon, tandis que le fluide fond est éliminé pour le tube de déchets. Le taux de dilution élevé permet de dégagement du fluide fond, y compris des débris et du mucus. Aussi, quel que soit l’état de l’échantillon du patient, la méthode proposée peut uniformément dissocier et isoler les cellules immunitaires.
DTT est un tampon de lyse de mucine largement utilisé qui clive les liaisons disulfide protéoglycane agrégation de séparer le contenu de la cellule du mucilage1,21,22. Cependant, TNT aurait été interfère avec les antigènes de surface des globules blancs, qui peuvent affecter la fonction leucocytaire2. Dans notre étude, les contenus cellulaires récupérés par une dissociation de la TNT sont incompatibles dans les trois échantillons, en raison de la non uniforme efficacité mucolytique et de colmatage du filtre. Cela devient plus critique pour la préparation des échantillons initiaux avec de petits volumes et échantillons de sécrétion bronchique relativement épaisse. En revanche, la méthode à l’aide de la microfluidique a permis la récupération cohérente du contenu de la cellule dans les échantillons de patients hétérogènes (Figure 3). Comme illustré à la Figure 3 b, nous pourrions toujours isoler le contenu de la cellule de la sécrétion bronchique dans un tampon propre indépendamment de l’état d’échantillon original, c'est-à-dire, sanglante, tenace ou larmoyants. Par rapport à la méthode conventionnelle, la méthode proposée a moins de débris dans l’échantillon récupéré, ce qui minimise les interférences possibles des débris dans des analyses biochimiques en aval.
Libération de NE a été examinée afin d’évaluer l’intégrité fonctionnelle des neutrophiles capturées par les deux méthodes d’enrichissement (Figure 3D). Neutrophiles supprimer étrangers des molécules organiques par le biais de NE libérer23,24,25. AGP est couramment utilisé pour activer des neutrophiles in vitro26. Les cellules isolées de la microfluidique et les méthodes (DTT) mucolytiques sont stimulées avec 50 nM de PMA. Nous avons testé chaque méthode avec échantillons de sécrétion pulmonaire humain (étiquetées P173, P174, P176, P177, 181 et P182). Échantillons concentrés par microfluidique ont montré une augmentation dans le nord-est, par la stimulation de la PMA pour toutes les 6 échantillons. En revanche, seulement 3 des échantillons traité de TNT pouvait induire une activité accrue NE après stimulation des PMA. En outre, les neutrophiles isolées par la méthode mucolytique TNT ont montré beaucoup activité de base plus élevée que les neutrophiles isolé en microfluidique. Ces résultats révèlent une possible perturbation chimique de la machinerie NE, par exemple, la perturbation de la surface lié antigène2,3, ce qui suggère que la méthode de la microfluidique est une méthode améliorée en termes de préservation de la neutrophile fonction que l’homogénéisation de la TNT. La méthode de dissociation proposée exploite également de manière automatique et entièrement, réduisant au minimum l’exposition des échantillons de patients avec des risques potentiels de l’environnement extérieur.
Toutefois, la méthode proposée exige un débit élevé et, par conséquent, une connexion stable fluidique. En outre, en raison de la fluctuation inhérente de la pompe de circulation péristaltique, la dimension de sortie IW doit être supérieure à la dimension de sortie OW, débit peut être compromis. Nous espérons que la méthode proposée des débits plus élevés s’il y a une pompe de circulation qui peut fournir un débit plus stable.
En fournissant un protocole de dissociation pour capturer les neutrophiles de sécrétions des voies aériennes clinique, la méthode présentée dans la présente étude est prévu d’étendre la portée de la recherche clinique sur les maladies respiratoires, telles que la pneumonie, l’asthme, la fibrose kystique et chronique maladie pulmonaire obstructive.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Les auteurs ont déposé une demande de brevet sur la technologie décrite ici.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par NIH/NIAID (R21AI119042) ainsi que du programme de test de NIH U24 échantillon épargnant (U24-AI118656).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
References
- Hamid, Q., et al. Methods of sputum processing for cell counts, immunocytochemistry and in situ hybridisation. European Respiratory Journal. 20 (Supplement 37), 19S-23S (2002).
- van Overveld, F. J., et al. Effects of homogenization of induced sputum by dithiothreitol on polymorphonuclear cells. J Physiol Pharmacol. 56, Suppl 4. 143-154 (2005).
- Qiu, D., Tan, W. C. Dithiothreitol has a dose-response effect on cell surface antigen expression. J Allergy Clin Immunol. 103 (5 Pt 1), 873-876 (1999).
- Usher, L. R., et al. Induction of Neutrophil Apoptosis by the Pseudomonas aeruginosa Exotoxin Pyocyanin: A Potential Mechanism of Persistent Infection. The Journal of Immunology. 168 (4), 1861-1868 (2002).
- Di Carlo, D.
- Martel, J. M., Toner, M. Inertial focusing dynamics in spiral microchannels. Phys Fluids. 24 (3), 32001 (2012).
- Zhang, J., et al. Fundamentals and applications of inertial microfluidics: a review. Lab Chip. 16 (1), 10-34 (2016).
- Hou, H. W., Bhattacharyya, R. P., Hung, D. T., Han, J. Direct detection and drug-resistance profiling of bacteremias using inertial microfluidics. Lab Chip. 15 (10), 2297-2307 (2015).
- Warkiani, M. E., et al. Ultra-fast, label-free isolation of circulating tumor cells from blood using spiral microfluidics. Nat Protoc. 11 (1), 134-148 (2016).
- Warkiani, M. E., Tay, A. K., Guan, G., Han, J. Membrane-less microfiltration using inertial microfluidics. Sci Rep. 5, 11018 (2015).
- Warkiani, M. E., Wu, L., Tay, A. K., Han, J. Large-Volume Microfluidic Cell Sorting for Biomedical Applications. Annu Rev Biomed Eng. 17, 1-34 (2015).
- Kwon, T., et al. Microfluidic Cell Retention Device for Perfusion of Mammalian Suspension Culture. Sci Rep. 7 (1), 6703 (2017).
- Wu, L., Guan, G., Hou, H. W., Bhagat, A. A., Han, J. Separation of leukocytes from blood using spiral channel with trapezoid cross-section. Anal Chem. 84 (21), 9324-9331 (2012).
- Guan, G., et al. Spiral microchannel with rectangular and trapezoidal cross-sections for size based particle separation. Sci Rep. 3, 1475 (2013).
- Kotz, K., Cheng, X., Toner, M. PDMS Device Fabrication and Surface Modification. J Vis Exp. (8), e319 (2007).
- Duffy, D. C., McDonald, J. C., Schueller, O. J. A., Whitesides, G. M. Rapid Prototyping of Microfluidic Systems in Poly(dimethylsiloxane). Analytical Chemistry. 70 (23), 4974-4984 (1998).
- Ryu, H., et al. Patient-Derived Airway Secretion Dissociation Technique To Isolate and Concentrate Immune Cells Using Closed-Loop Inertial Microfluidics. Anal Chem. 89 (10), 5549-5556 (2017).
- Mach, A. J., Di Carlo, D. Continuous scalable blood filtration device using inertial microfluidics. Biotechnol Bioeng. 107 (2), 302-311 (2010).
- Di Carlo, D., Irimia, D., Tompkins, R. G., Toner, M. Continuous inertial focusing, ordering, and separation of particles in microchannels. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (48), 18892-18897 (2007).
- Xiang, N., et al. Fundamentals of elasto-inertial particle focusing in curved microfluidic channels. Lab Chip. 16 (14), 2626-2635 (2016).
- Lotvall, J., et al. Asthma endotypes: a new approach to classification of disease entities within the asthma syndrome. J Allergy Clin Immunol. 127 (2), 355-360 (2011).
- Houston, N., et al. Sputum neutrophils in cystic fibrosis patients display a reduced respiratory burst. J Cyst Fibros. 12 (4), 352-362 (2013).
- Janoff, A., Scherer, J. Mediators of inflammation in leukocyte lysosomes. IX. Elastinolytic activity in granules of human polymorphonuclear leukocytes. J Exp Med. 128 (5), 1137-1155 (1968).
- Kawabata, K., Hagio, T., Matsuoka, S. The role of neutrophil elastase in acute lung injury. Eur J Pharmacol. 451 (1), 1-10 (2002).
- Rubin, B. K. Plastic Bronchitis. Clin Chest Med. 37 (3), 405-408 (2016).
- Kokot, K., Teschner, M., Schaefer, R. M., Heidland, A. Stimulation and inhibition of elastase release from human neutrophils dependent on the calcium messenger system. Miner Electrolyte Metab. 13 (2), 133-140 (1987).
