Summary
En esta investigación, se demuestra un método de separación libre de etiqueta neutrófilo de clínica las secreciones mediante la operación de circuito cerrado de la microfluídica inercial espiral. El método propuesto expandiría los ensayos clínicos en vitro para diversas enfermedades respiratorias.
Abstract
Las secreciones contienen una gran cantidad de células de inmune, por ejemplo, neutrófilos, macrófagos y linfocitos, que se pueden utilizar como un recurso importante para evaluar una variedad de enfermedades pulmonares, tanto para fines de investigación y clínicos. Sin embargo, debido a la naturaleza heterogénea y viscosa de moco paciente, hay actualmente ningún método confiable de disociación que no daña las células inmunes del anfitrión en la secreción de la vía aérea paciente. En esta investigación, presentamos un método de preparación de muestra que utiliza la inercia microfluídica para evaluación inmunológica del paciente. Independientemente de las propiedades fluídicas heterogéneas de las muestras clínicas, el método propuesto recupera más del 95% de los neutrófilos de las muestras de secreción de las vías respiratorias que se diluyen 1,000-fold ml de solución salina limpia. Por el flujo de salida concentrado para el depósito de la muestra inicial de recirculación, se proporcionan una alta concentración, recuperación y pureza de las células inmunes; recirculación se considera una relación inversa a la solo jeringa basado funcionamiento de la microfluídica inercial. La operación de circuito cerrado de la microfluídica espiral proporciona leucocitos sin perturbación física o química, como lo demuestra el forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)-inducida por la liberación de elastasa de neutrófilos ordenados.
Introduction
Puesto que las células están encapsuladas en una gran cantidad de moco en las secreciones de la vía aérea, la evaluación funcional de los leucocitos por un análisis en vitro ha sido obstaculizada. Ditiotreitol (DTT) es el más común buffer de lisis a disociar y homogeneizar el esputo para análisis citológico y la detección de mediadores al tiempo que proporciona viabilidad tolerable de células aisladas1,2. Sin embargo, TDT puede interferir con antígenos enlazados a la superficie de los neutrófilos en las vías respiratorias, dando por resultado la interrupción de la función del neutrófilo como elastasa y mieloperoxidasa (MPO) liberan2,3. Por lo tanto, se han realizado pocos estudios de la función del neutrófilo humano vía aérea con los neutrófilos de sangre periférica, que no pueden revelar las características fisiológicas de pulmonar4. Mientras tanto, microfluídica inercia ha hecho avances en el aislamiento de las células de varios pacientes biomatrices5,6. El equilibrio entre las fuerzas inerciales elevación y arrastre de Dean alinea la partículas de la célula según su tamaño, que permite la separación de partículas sin etiqueta7. Nuestro grupo ya presentó un método de preparación de muestra para hacer circular el tumor las células8,9, patógenos en sangre8, las células de una suspensión cultura10,11, 12y leucocitos polimorfonucleares (PMNs) de sangre13,14.
Aquí, presentamos un protocolo para preparar las células inmunes de las secreciones de las vías respiratorias de un paciente mediante microfluídica inercial de lazo cerrado para un análisis de aguas abajo en vitro , tales como el ensayo de elastasa (NE). Este método proporciona alta concentración y recuperación, especialmente cuando hay una superposición significativa en el sentido lateral de la célula/partícula de que la célula/partículas de interés debe eliminarse, que es comúnmente observado en muestras clínicas. Por la pared interna (IW) de recirculación-enfocadas grandes partículas o células hacia el tubo de muestra de entrada, la partícula o célula de interés concentrados en el depósito original, mientras que fluidos de fondo con agregados de mucina pequeños pasan por el depósito de residuos. A pesar de las heterogéneas propiedades fluídicas de muestras clínicas, el método propuesto se recupera constantemente sobre el 95% de los neutrófilos de las muestras de secreción de las vías respiratorias que se diluyen 1,000-fold con una solución salina limpia (~ 1 mL). Por el contrario, el método de lisis presenta una amplia gama de PMNs tasas de recuperación dependiendo de la condición de la muestra. El protocolo propuesto captura leucocitos de manera libre de etiqueta sin interrupciones físicas o químicas, que ofrece la posibilidad de cosechar células delicadas de desafío clínico biometría con procedimientos mínimamente invasivos.
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Protocol
La colección de la muestra fue aprobada por la Junta de revisión institucional de la Universidad de Pittsburgh (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Todos los experimentos se realizan bajo una seguridad de la biotecnología con el equipo de protección personal adecuado.
1. dispositivo fabricación y litografía blanda
Nota: Las técnicas de litografía blanda estándar15,16 se usaron para crear el microchannel de polidimetilsiloxano (PDMS).
- El precursor PDMS en una proporción 10:1 de agente de la base y curado de la mezcla.
- Verter 30 g de la mezcla de precursores PDMS en el molde de aluminio micro-trabajado a máquina (ver figura 1 para las dimensiones) y 20 g de la mezcla de precursores PDMS en la placa de Petri de 100 mm.
Nota: La placa de Petri se utiliza para hacer la película gruesa de PDMS (~ 3 mm) para la capa de apoyo. La capa soporte de PDMS proporciona uniforme superficie física a lo largo de la microfluídica. Como alternativa, puede utilizar una fina capa PDMS en la diapositiva de cristal. El molde maestro con dimensiones de canal específico fue diseñado y fabricado por micro-fresado en la hoja de aluminio. El canal caracol utilizado en este estudio fue un microcanal 8-bucle espiral con una entrada y dos salidas, con el radio aumenta desde 8 mm a 24 mm para la separación eficiente basado en el tamaño. - Coloque el molde y la placa de Petri en un desecador de vacío desgasificación hasta que las burbujas no son visibles en la superficie, típicamente 5-10 minutos uso una aspiradora de casa para el desecador.
- Libere el vacío y colocar el molde y la placa de Petri en un horno de 90 ° C durante 1 h.
Nota: Pueden utilizarse en lugar de un horno de una placa caliente u otras herramientas de calefacción. - Retire el molde y el plato de Petri del horno y déjelo enfriar a temperatura ambiente durante 10 minutos.
- Cuidadosamente corte el contorno y los agujeros de acceso fluido en el dispositivo usando un punzón de 2 mm.
Nota: El tamaño de la perforación puede variar dependiendo del tamaño de la guía de la tubería o fluido. - Pegue una cinta al lado de canal del dispositivo y capa gruesa de PDMS y pelar cuidadosamente con unas pinzas para quitar el polvo.
- Tratar ambos lados de la canal del dispositivo y PDMS llano con aire plasma y vínculo con la capa soporte preparada de PDMS llano (figura 1A).
- Coloca la ficha en el portaobjetos de cristal de 50 x 70 mm y colocar en un horno de 70 ° C durante al menos 30 min para mejorar la fuerza de Unión.
2. la colección de secreción traqueal de pacientes con ventilación mecánica
Nota: Las secreciones traqueales pueden obtenerse de pacientes con ventilación mecánica durante la rutina normal de la vía aérea utilizando un protocolo modificado de los métodos convencionales para acomodar a la paciente ventilado estándar, adulto. Las muestras se identificaron y enviadas inmediatamente para su procesamiento.
- Si se indica la aspiración traqueal, utilizar un catéter para extraer las secreciones de las vías respiratorias.
- Haga avanzar el catéter cuidadosamente a medio camino en el tubo endotraqueal e infundir 5 mL de solución salina estéril 0,9% de una jeringa precargada 10 mL.
- Cuando el catéter se avanza completamente, o resistencia, aspirar las secreciones y recoger en un recipiente estéril de esputo.
- Recoger 10 mL de secreciones traqueales en un contenedor estéril de esputo y coloque en hielo. Enviar las muestras inmediatamente para su procesamiento.
3. preparación de la muestra de secreción traqueal
Nota: Todos los experimentos deben realizarse bajo una seguridad de la biotecnología con el equipo de protección personal adecuado.
- Dispersar 1 mL de las muestras de secreción de las vías respiratorias en 9 mL de tampón fosfato salino (PBS) con una jeringa de plástico de 10 mL (para una dilución de 10 x). Utilice una pipeta embotada para homogeneizar la muestra de moco.
- Colar el diluyente con un filtro de célula de nylon 40 μm para eliminar trozos grandes o coágulos de sangre, que pueden bloquear el canal o el orificio de acceso de microfluídica. Coloque la muestra en hielo después de su transformación.
- Dispersar el diluyente de cada muestra utilizando un volumen de 100 x de tampón PBS, dando por resultado una 1.000 x suspensión diluida. Coloque la muestra en el hielo durante la operación de disociación completa.
4. experimental configuración
Nota: Todos los experimentos deben realizarse bajo una seguridad de la biotecnología con el equipo de protección personal adecuado.
- Montar el chip PDMS con la guía del fluido al flujo uniforme se aplica a cada uno de los microcanales de cuatro espirales (figura 1B).
Nota: Cuatro canales se utilizan para aumentar el rendimiento por paralelización y optimización de la densidad de célula y el volumen de la suspensión resultante. Guía de fluidos está diseñado y fabricado con una impresora 3D tipo de estereolitografía con resina transparente. La entrada y el orificio de salida de la guía de fluido usan conectores Luer hembra para facilitar la conexión y el lacre estable durante la operación. - Conecte un conector Luer macho de 1/16 de pulgada a la entrada, la salida de pared interna (IW) y el orificio de salida de pared exterior (OW) de la guía de líquido y un tubo de silicona a la suspensión de la muestra.
- Insertar puntas romas y a cada extremo de las entradas y salidas para llegar a la parte inferior del depósito de muestra.
- Conecte la bomba peristáltica con la tubería de entrada.
- Coloque el extremo de la tubería de entrada y el tubo de salida de IW en el depósito de la muestra y coloque el extremo de la tubería de salida de OW en el depósito de residuos (figura 1, D).
- Coloque el tubo de 50 mL de PBS filtrada sin calcio y magnesio en el depósito de la muestra.
- Inicio de bombeo con un caudal bajo (~ 1 mL/min) para preparar el dispositivo.
Nota: Cuando las burbujas se plasman en el canal, presione la parte superior de la canal con la pinza para desestabilizar y eliminar burbujas de aire. Cuando el dispositivo se llena completamente con solución tampón, cambiar el tubo de PBS para preparar el tubo de muestra de secreción de las vías respiratorias. - Cuando la muestra se coloca en el depósito de la muestra, encienda la bomba peristáltica y fijar el caudal a 4 mL/min (figura 1, D).
- Cuando el volumen de la muestra alcanza el volumen designado (~ 1 mL), detener el funcionamiento y desconecte el tubo de silicona.
Nota: El método propuesto es más eficiente en la reducción de un gran volumen de diluyente (> 50 mL) en un volumen de tubo de microcentrífuga (~ 1 mL) (figura 2).
5. Análisis de citometría de flujo de
Nota: Para comparar los métodos de disociación (microfluídica y lisis), citometría de flujo con inmunofluorescencia fue utilizada.
- Añadir el conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC) - anticuerpo monoclonal de ratón conjugado antihumano CD66b y allophycocyanin (APC) - anti-humano CD45 anticuerpo monoclonal de ratón a las suspensiones iniciales (paso 3.3) y suspensiones que resulta (paso 4.9) (200 μL de cada anticuerpo) en una proporción de 1:25 v/v.
- Incubar las muestras a 4 ° C en la oscuridad durante 30 minutos.
- Análisis de ambas muestras en un citómetro de flujo para cuantificar los PMNs.
Nota: La población que es positivo doble FITC-APC, CD66b positivas y CD45 positivo consideró neutrófilos. Recuperación se calculó mediante el cociente de los números de celular total de la entrada y la suspensión resultante.
6. Análisis de liberación de NE
Nota: Para comparar la funcionalidad de los aislados neutrófilos por el método de microfluidos y lisis, un kit de ensayo NE fue utilizado.
- Agregar PMA (proporcionado en el kit de ensayo) a cada suspensión resultante (obtenido en paso 4.9) para una concentración final de 50 nM.
- Incubar las muestras a 37 ° C por 2 h.
- Centrifugar la suspensión a 300 x g durante 10 minutos.
- Transferir 10 μl de cada sobrenadante a una placa de 96 pocillos (proporcionada en el kit de ensayo).
Nota: Una microplaca de 96 pocillos con fondo plano y poliestireno negro puede ser utilizada también. - Agregar 90 μl de tampón de ensayo diluido (proporcionado en el kit de ensayo) a cada pocillo.
- Añadir 10 μl del substrato de elastasa (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, proporcionadas en el kit de ensayo).
- Incubar durante 1,5 h a 37 ° C.
- Lea la placa de 96 pozos utilizando un Fluorímetro en una longitud de onda de excitación de 485 nm y una longitud de onda de emisión de 525 nm.
Nota: El nivel de NE se dividió por el recuento PMN a partir del análisis de citometría de flujo.
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Representative Results
Hemos conseguido transparentes suspensiones de células inmune tanto TDT mucolysis y microfluídica la disociación (Figura 3A). Disociación de microfluídica recogidos en promedio 4.40 x 105 PMNs (2.1 x 104 a 5.60 x 105 PMNs, n = 6) de las vías respiratorias secreción muestras diluidas 1,000-fold (volumen total de 50 mL) en 1 mL de suspensión limpio. En comparación con el inicial Diluyente, 94.0% PMNs (CD66b+/CD45+) fueron recuperados en un pequeño volumen, constantemente sobre muestras clínicas 6. Sin embargo, el método de mucolysis TDT mostraron una recuperación de 53.5% en promedio con variaciones de-muestras (30.8-96.0%) (Figura 3B).
A continuación, la liberación de elastasa fue examinada con un kit de ensayo NE comercial como una prueba de concepto. Sin estimulación externa, la muestra preparada por el método mucolítico demostraron un NE de mayor nivel que la muestra por el método de microfluidos. PMA fue añadida a las suspensiones resultantes de los métodos de disociación mucolítico para desencadenar la liberación de NE y microfluídica. Probamos cada método con muestras de secreción de las vías respiratorias de pacientes diferentes 6. Las células inmunitarias con la microfluídica presentaron funcionalidad intacta, mostrando un aumento en la cantidad de NE liberación por estímulo de PMA. Por otro lado, las células preparadas por el método de disociación mucolítico mostraron un aumento inconsistente de liberación NE (figura 3).
Figura 1: dispositivo de microfluidos espiral y ajustes experimentales. Imágenes de fotografía de microfluídica de espiral (A) y (B) el dispositivo montado con el adaptador fluídico. (C) esquema de separación de circuito cerrado mediante microfluídica inercial espiral. Por recirculación de la corriente de la partícula celular concentrado (salida de IW) hacia el depósito original de la muestra, las células inmunes relacionadas se concentraron en un pequeño volumen mientras que el líquido del fondo que contiene agregados de mucina y hematíes menores fueron continuamente quitar con el tubo de desagüe conectado a la salida de OW. Montaje Experimental (D) y la imagen fluorescente de una partícula de 10 μm, la trayectoria (verde) y la salida del canal caracol (parte superior derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: esquema de la preparación de la muestra de la secreción de las vías respiratorias mediante microfluídica inercial de lazo cerrado. Clínicamente inducida por la secreción de las vías respiratorias dispersada mecánicamente en 1.000 volumen x de solución tampón. El diluyente es concentrado por la microfluídica, dando por resultado ~ 1 mL de la suspensión celular con el fondo claro. Adaptado con permiso de Ryu et al., derecho de autor (2017) Sociedad Americana de química17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: comparaciones representante del método mucolítico TDT para el método de disociación microfluídicos. Secreciones traqueales (A) de la muestra (izquierda) e imagen microscópica después de la disociación de microfluidos. (B) imagen fotográfica de las suspensiones originales y resultantes. (C) comparación de las tasas de recuperación PMN entre los métodos mucolíticos y microfluídica. (D) comparación de NE liberación de neutrófilos separadas por los métodos mucolíticos de TDT antes y después del estímulo de PMA y microfluídica. Versión NE significativamente fue provocado por el PMA en la muestra de la separación de microfluidos (p < 0.0001). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En microfluídica inercial, partículas y células de localización en una determinada posición lateral en un canal de micro basado en su tamaño5,18,19,20. Debido al efecto combinado del Decano arrastre fuerza y la fuerza inercial elevación curvada microchannel, partículas grandes o de neutrófilos (> 10 μm) se encuentran dentro del canal y pequeñas partículas, agregados de moco y residuos menor que 6 μm se colocan fuera del canal a cierta velocidad de flujo condiciones10,11,13,14.
Sin embargo, existe una relación inversa entre la concentración y la recuperación de la separación cuando use microfluídica, especialmente cuando el rango de tamaño de la separación de la partícula o la celda de interés se superpone con las otras células/partículas. Para lograr una alta concentración de partículas ordenadas y las células, la separación debe ser estrecha y requiere una puesta a punto con observación microscópica para cada serie de muestras; Esto limita el uso de la microfluídica inercial de biometría heterogéneo, tales como las secreciones de las vías respiratorias.
Aquí, presentamos un método de preparación de la muestra clínica de las vías respiratorias secreciones para en vitro ensayos mediante microfluídica inercial de lazo cerrado (figura 1B, C). La operación de circuito cerrado de recirculación de la partícula de la célula a través de un enfoque había logrado factores de alta concentración y alta recuperación. La salida de OW desemboca en el tubo de desagüe, y la salida de IW se alimenta continuamente al tubo de muestra original. Las células más grandes que 10 μm de diámetro permanecen en el tubo de muestra inicial, por lo tanto, aumentar la densidad celular de la muestra, mientras que el líquido del fondo es eliminado en el tubo de desagüe. La tasa de dilución alta permite la separación del líquido del fondo, incluyendo residuos y moco. Además, independientemente de la condición de la muestra del paciente, el método propuesto puede uniformemente disociar y aislar las células inmunes.
TDT es un buffer de lisis de mucina ampliamente utilizado que hiende disulfuro en agregación de proteoglicanos para separar contenido celda del mucílago1,21,22. Sin embargo, TDT al parecer interfiere con los antígenos de superficie de leucocitos, que pueden afectar la función del leucocito2. En nuestro estudio, el contenido celular recuperado por disociación de TDT fueron consistentes entre las muestras, debido a no uniforme eficacia mucolítica y obstrucción del filtro. Esto se vuelve más crítico para la preparación de las muestras iniciales con volúmenes pequeños y muestras de secreción de la vía aérea gruesa. Por otro lado, el método mediante microfluídica permitió la constante recuperación del contenido de la celda en muestras heterogéneas de pacientes (figura 3). Como se muestra en la figura 3B, constantemente nos podríamos aislar el contenido celular de la secreción de las vías respiratorias en un tampón limpio sin importar el estado de muestra original, es decir, sangre, tenaz o acuosa. En comparación con el método convencional, el método propuesto tiene menos residuos en la muestra recuperada, que reduce al mínimo la posible interferencia de partículas en los análisis bioquímicos aguas abajo.
Versión NE fue examinado para evaluar la integridad funcional de neutrófilos capturados por ambos métodos de enriquecimiento (figura 3D). Neutrófilos quitar exterior moléculas orgánicas a través de NE liberan23,24,25. PMA se utiliza comúnmente para activar neutrófilos en vitro26. Células aisladas de la microfluídica y el mucolíticos métodos (DTT) fueron estimuladas con 50 nM de PMA. Probamos cada método con muestras de secreción de la vía aérea humana (con P173, P174, P176, P177, P181 y P182). Muestras de concentrado de microfluídica mostraron un aumento de la NE por el estímulo de la PMA para todas las 6 muestras. En cambio, sólo 3 de las muestras de TDT Tratado podría inducir aumento de la actividad NE después del estímulo de PMA. Además, los neutrófilos aislados por el método mucolítico TDT demostraron mucha actividad basal más alta que los neutrófilos aislados de microfluídica. Estos resultados mostraron posible alteración química de la maquinaria NE, es decir, la interrupción de la superficie límite antígeno2,3, que sugiere que el método de microfluidos es un método mejorado en cuanto a la preservación de la función del neutrófilo de homogeneización de la TDT. El método propuesto de disociación también funciona de manera automatizada y totalmente independiente, reduciendo al mínimo la exposición de muestras de pacientes con riesgos potenciales del entorno externo.
Sin embargo, el método propuesto requiere un alto flujo y, por tanto, una conexión fluídica estable. Además, debido a la fluctuación inherente de la bomba peristáltica de la circulación, la dimensión de salida IW debe ser mayor que la dimensión de salida de OW, de lo contrario se puede comprometer rendimiento. Esperamos que el método propuesto proporcionará un mayor rendimiento si hay una bomba de circulación que puede proporcionar un caudal más estable.
Proporcionando un protocolo de disociación para capturar neutrófilos de clínica las secreciones, el método presentado en este estudio está previsto ampliar el alcance de la investigación clínica en enfermedades respiratorias, como neumonía, asma, fibrosis quística y crónica enfermedad pulmonar obstructiva.
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Disclosures
Los autores han presentado una solicitud de patente sobre la tecnología descrita aquí.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por NIH/NIAID (R21AI119042) así como el programa de ensayo NIH U24 muestra escasamente (U24-AI118656).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
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