Summary
In questa ricerca, dimostriamo un metodo privo di etichetta del neutrofilo separazione da clinica delle secrezioni bronchiali mediante operazione di ciclo chiuso della microfluidica inerziale a spirale. Il metodo proposto sarebbe espandere i dosaggi clinici in vitro per varie malattie respiratorie.
Abstract
Delle secrezioni bronchiali contengono un gran numero di cellule immuno-correlati, ad esempio, neutrofili, macrofagi e linfociti, utilizzabile come una risorsa importante per valutare una varietà di malattie polmonari, sia per scopi di ricerca e clinici. Tuttavia, a causa della natura eterogenea e viscosa del paziente muco, non c'è attualmente nessun metodo di dissociazione affidabile che non danneggia le cellule immuni ospite nella secrezione paziente delle vie respiratorie. In questa ricerca, vi presentiamo un metodo di preparazione del campione che utilizza microfluidica inerziale per la valutazione del sistema immunitario del paziente. Indipendentemente dalla proprietà fluidica eterogenee dei campioni clinici, il metodo proposto consente di recuperare oltre il 95% dei neutrofili da campioni di secrezione delle vie respiratorie che vengono diluiti 1.000 con millilitri di soluzione fisiologica pulito. Di ricircolo nel flusso di output concentrato al serbatoio del campione iniziale, un'alta concentrazione, il recupero e la purezza delle cellule immunitarie sono forniti; ricircolo è considerato un compromesso per l'operazione di basata su siringa di singolo conduzione della microfluidica inerziale. L'operazione di regolazione della spirale microfluidica fornisce leucociti senza disturbo fisico o chimico, come dimostrato da phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)-indotto rilascio dell'elastasi dei neutrofili ordinati.
Introduction
Poiché le celle sono incapsulate in una grande quantità di muco nelle secrezioni delle vie respiratorie, la valutazione funzionale dei leucociti mediante saggio in vitro è stata ostacolata. Ditiotreitolo (DTT) è il più comune buffer di lisi di dissociare e omogeneizzare l'espettorato per l'analisi citologica e rilevamento dei mediatori fornendo al contempo tollerabile attuabilità delle cellule isolate1,2. Tuttavia, DTT può interferire con gli antigeni di superficie associato dei neutrofili delle vie respiratorie, causando l'interruzione della funzione del neutrofilo ad esempio elastasi e mieloperossidasi (MPO) versione2,3. Pertanto, sono stati condotti pochi studi di funzione del neutrofilo umano della via aerea con neutrofili periferici di anima, che non possono rivelare le caratteristiche fisiologiche della polmonare4. Nel frattempo, microfluidica inerzia ha fatto progressi nell'isolare cellule da vari pazienti BIOMATRICI5,6. L'equilibrio tra le forze inerziali ascensore e Dean trascinamento consente di allineare la particella/cella in base alle loro dimensioni, che permette la separazione di particelle privo di etichetta7. Il nostro gruppo precedentemente introdotto un metodo di preparazione del campione per la circolazione del tumore le cellule8,9, agenti patogeni nel sangue8, cellule da una sospensione cultura10,11, 12ed i leucociti polimorfonucleari (PMNs) dal sangue13,14.
Qui, presentiamo un protocollo per preparare le cellule immuni dalle secrezioni delle vie aeree di un paziente con circuito chiuso inerziale microfluidica per un'analisi a valle in vitro , ad esempio, il saggio di elastasi del neutrofilo (NE). Questo metodo fornisce alta concentrazione e il recupero, soprattutto quando c'è una sovrapposizione significativa nella direzione laterale della cella/particella da cui la cellula/particelle di interesse deve essere rimosso, che è osservata comunemente in campioni clinici. Di ricircolo interno parete (IW)-messo a fuoco grandi particelle o cellule torna al tubo di campionamento, la particella o cella di interesse concentrati nel serbatoio originale, mentre fluidi di sfondo con aggregati di piccole mucina passano attraverso il serbatoio di scarico. Nonostante la proprietà fluidica eterogenee dei campioni clinici, il metodo proposto recupera costantemente superiore al 95% dei neutrofili da campioni di secrezione delle vie respiratorie che vengono diluiti 1.000 con una soluzione pulita Salina (~ 1 mL). Al contrario, il metodo di lisi presenta una vasta gamma di PMNs tassi di recupero a seconda delle condizioni del campione. Proposta di protocollo cattura leucociti in modo privo di etichetta senza nessun danno fisico o chimico, che fornisce la possibilità di raccogliere le cellule delicate da clinicamente impegnativo biometria con procedure mini-invasive.
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Protocol
La raccolta del campione è stata approvata dall'Università di Pittsburgh Institutional Review Board (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Tutti gli esperimenti sono eseguiti sotto una cappa di biosicurezza con i dispositivi di protezione personale.
1. dispositivo fabbricazione e Litografia Soft
Nota: Litografia soft Standard tecniche15,16 sono stati utilizzati per creare il microchannel di polidimetilsilossano (PDMS).
- Mescolare il precursore PDMS in un rapporto di 10:1 di base e polimerizzazione di agente.
- Versare 30 g della miscela precursore PDMS sullo stampo in alluminio micro-lavorato (vedere la Figura 1 per le dimensioni) e 20 g della miscela precursore PDMS sul 100mm di Petri.
Nota: La capsula di Petri è utilizzato per rendere la pellicola spessa di PDMS (~ 3 mm) per strato di supporto. Strato di supporto di PDMS fornisce proprietà superficie fisica uniformi in tutta la microfluidica. In alternativa, può essere utilizzato un sottile film PDMS su vetrino. Lo stampo master con dimensioni canale specifico è stato progettato e fabbricato da micro-fresatura sul foglio di alluminio. Il canale spirale utilizzato in questo studio era un microchannel 8-anello a spirale con un ingresso e due uscite, con il raggio aumentando da 8 mm a 24 mm per la separazione efficiente basato su dimensioni. - Inserire lo stampo e la capsula di Petri in un essiccatore sotto vuoto per degassare fino a quando non ci sono bolle sono visibili sulla superficie, in genere 5-10 min uso casa-vuoto per un essiccatore.
- Rilasciare il vuoto e inserire lo stampo e la capsula di Petri in forno a 90 ° C per 1 h.
Nota: Una piastra riscaldante o altri strumenti di riscaldamento possono essere utilizzati invece di un forno. - Rimuovere la muffa e la capsula di Petri dal forno e lasciar raffreddare a temperatura ambiente per 10 min.
- Accuratamente tagliare il contorno e perforare i fori di accesso fluido sul dispositivo utilizzando un perforatore di 2 mm.
Nota: La dimensione del punzone può variare a seconda delle dimensioni della guida tubolare o fluida. - Aderire un nastro sul lato del canale del dispositivo e pellicola spessa di PDMS e sbucciare accuratamente con una pinza per rimuovere la polvere.
- Trattare entrambi i lati del canale del dispositivo e pianura PDMS con plasma ad aria e legame con strato di supporto preparato di pianura PDMS (Figura 1A).
- Posizionare il chip sul vetrino 50 x 70 mm e metterlo in forno a 70 ° C per almeno 30 min migliorare la forza di legame.
2. tracheale secrezione raccolta dai pazienti ventilati meccanicamente
Nota: Secrezioni tracheali possono essere ottenute da pazienti ventilati meccanicamente durante la cura normale routine delle vie respiratorie utilizzando un protocollo modificato rispetto ai metodi convenzionali per accogliere il paziente ventilato standard, adulto. I campioni sono stati de-identificati e inviati immediatamente per l'elaborazione.
- Se l'aspirazione trachea è indicato, è possibile utilizzare un catetere per estrarre delle secrezioni bronchiali.
- Far avanzare il catetere attentamente a metà strada nel tubo endotracheale e instillare 5 mL di soluzione salina normale sterile 0,9% da una siringa preriempita da 10 mL.
- Quando il catetere viene fatto avanzare completamente o si incontra resistenza, aspirare le secrezioni e raccogliere in un contenitore di raccolta dell'espettorato sterili.
- Raccogliere 10 mL di secrezioni tracheali in un contenitore sterile dell'espettorato e posizionarlo sul ghiaccio. Inviare campioni immediatamente per l'elaborazione.
3. preparazione del campione tracheale secrezione
Nota: Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti sotto una cappa di biosicurezza con i dispositivi di protezione personale.
- Disperdere 1ml di campioni di secrezione delle vie respiratorie in 9 mL di tampone fosfato salino (PBS) utilizzando una siringa di plastica da 10 mL (per una diluizione di 10 x). Utilizzare una pipetta smussata per omogeneizzare il campione di muco.
- Ceppo il diluente con un colino di cella di nylon 40 µm per rimuovere grandi blocchi o coaguli di sangue, che possono bloccare il foro di accesso di microfluidica o il canale. Posizionare il campione sul ghiaccio dopo l'elaborazione.
- Disperdere il diluente di ciascun campione utilizzando un volume di 100 x di tampone PBS, risultante in un 1.000 x sospensione diluita. Posizionare il campione sul ghiaccio durante l'operazione di dissociazione intero.
4. organizzazione sperimentale
Nota: Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti sotto una cappa di biosicurezza con i dispositivi di protezione personale.
- Assemblare il PDMS chip con la guida fluida da applicare flusso uniforme a ciascuno dei microcanali quattro spirale (Figura 1B).
Nota: I quattro canali sono stati utilizzati per aumentare il throughput di parallelizzazione, nonché ottimizzazione della densità delle cellule e del volume della sospensione risultante. La guida fluida è progettata e realizzata con una stampante 3D del tipo di stereolitografia con resina trasparente. L'ingresso e la porta di uscita della guida fluida utilizzare connettori Luer femmina per facilità di connessione e stabile tenuta durante l'operazione. - Collegare un connettore Luer maschio da 1/16 pollici per l'ingresso e la presa di parete interna (IW) porta di uscita del muro esterno (OW) della guida fluida e un tubo in silicone per la sospensione del campione.
- Inserire le punte smussate a ciascuna estremità dell'ingresso e uscite per raggiungere il fondo del serbatoio del campione.
- Collegare la pompa peristaltica con il tubo di aspirazione.
- Posizionare l'estremità della tubazione di aspirazione e tubo di uscita di IW nel serbatoio del campione e posizionare l'estremità del tubo di uscita di OW nel serbatoio dei rifiuti (Figura 1, D).
- Posizionare il tubo da 50 mL di filtrato PBS senza calcio e magnesio al serbatoio del campione.
- Inizi a pompare ad un tasso di flusso debole (~ 1 mL/min) per innescare il dispositivo.
Nota: Quando bolle vengono catturate nel canale, spingere la parte superiore del canale con la pinzetta per destabilizzare ed eliminare bolle d'aria. Quando il dispositivo è completamente riempito con soluzione tampone, sostituire il tubo di PBS per preparare la provetta del campione di secrezione delle vie respiratorie. - Quando il campione è posto nel serbatoio del campione, accendere la pompa peristaltica e impostare la velocità di flusso a 4 mL/min (Figura 1, D).
- Quando il volume del campione raggiunge il volume designato (~ 1 mL), spegnere l'apparecchio e scollegare la tubazione del silicone.
Nota: Il metodo proposto è più efficiente a ridurre un grande volume di diluente (> 50 mL) in un volume di micro-provetta (~ 1 mL) (Figura 2).
5. analisi di citometria a flusso di
Nota: Per confrontare i metodi di dissociazione (microfluidica e Lisi), citometria a flusso con immunofluorescenza è stato utilizzato.
- Aggiungere isotiocianato di fluorescina (FITC) - anticorpo monoclonale di topo coniugato anti-umano CD66b e allophycocyanin (APC) - mouse anti-CD45 anticorpo monoclonale umano alle sospensioni iniziale (punto 3.3) e sospensioni risultante (passo 4.9) (200 µ l di coniugato di ciascun anticorpo) nel rapporto di 01:25 v/v.
- Incubare i campioni a 4 ° C al buio per 30 min.
- Analizzare entrambi i campioni su un citometro a flusso per quantificare il PMNs.
Nota: La popolazione che è positiva doppia FITC-APC, CD45 e CD66b positivo era considerata neutrofili. Recupero è stato calcolato dal rapporto tra il numero totale delle cellule dell'input e la sospensione risultante.
6. NE rilascio analisi
Nota: Per confrontare le funzionalità dell'isolato del neutrofilo dal metodo microfluidica e Lisi, un kit di test NE è stato utilizzato.
- Aggiungere PMA (fornito nel kit di dosaggio) per ogni sospensione risultante (ottenuta al punto 4.9) ad una concentrazione finale di 50 nM.
- Incubare i campioni a 37 ° C per 2 h.
- Centrifugare le sospensioni a 300 x g per 10 min.
- Trasferire 10 µ l di ciascun supernatante a una piastra a 96 pozzetti (fornita nel kit di dosaggio).
Nota: Una micropiastra da 96 pozzetti con fondo piatto e polistirolo nero può essere utilizzata come bene. - Aggiungere 90 µ l di tampone diluito (fornito nel kit di dosaggio) in ciascun pozzetto.
- Aggiungere 10 µ l del substrato dell'elastasi (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, fornito nel kit di dosaggio).
- Incubare per 1,5 h a 37 ° C.
- Leggere la piastra a 96 pozzetti utilizzando un fluorometro ad una lunghezza d'onda di eccitazione di 485 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 525 nm.
Nota: Il livello di NE era diviso per il numero PMN dall'analisi di citometria a flusso.
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Representative Results
Abbiamo raggiunto trasparente cellula immunitaria sospensioni con entrambi dissociazione di mucolysis e microfluidica DTT (Figura 3A). Dissociazione di microfluidica raccolti in media 4,40 x 105 PMNs (2.1 x 104 a 5.60 x 105 PMNs, n = 6) dalle vie respiratorie secrezione campioni diluiti 1.000 (volume totale di 50 mL) in 1 mL di sospensione pulito. Rispetto per il DILUENTE iniziale, PMNs 94,0% (CD66b+/CD45+) sono stati recuperati in un piccolo volume, costantemente sopra 6 campioni clinici. Tuttavia, il metodo di mucolysis DTT ha mostrato un recupero del 53,5% in media con variazioni significative di campione a campione (30,8-96,0%) (Figura 3B).
Successivamente, il rilascio dell'elastasi è stato esaminato con un kit di test NE commerciale come un proof-of-concept. Senza stimolazione esterna, il campione preparato con il metodo mucolitico ha mostrato una più alta NE livello rispetto al campione dal metodo di microfluidica. PMA è stato aggiunto alle sospensioni risultante da entrambi i metodi di dissociazione mucolitico per innescare il rilascio NE e microfluidica. Abbiamo testato ogni metodo con campioni di secrezione delle vie respiratorie da 6 diversi pazienti. Cellule del sistema immunitario separate con microfluidica presentato funzionalità intatta, mostrando una maggiore quantità di NE rilasciare dalla stimolazione di PMA. D'altra parte, cellule preparate con il metodo di dissociazione mucolitico ha mostrato un aumento incoerente di rilascio NE (Figura 3).
Figura 1: dispositivo microfluidico spirale e impostazioni sperimentali. Immagini di fotografia di microfluidica spirale (A) e (B), il dispositivo assemblato con l'adattatore fluidico. (C) diagramma schematico della separazione di ciclo chiuso utilizzando microfluidica inerziale a spirale. Di ricircolo il flusso di particelle/cella concentrato (presa di IW) nuovamente dentro il serbatoio del campione originale, cellule immuno-correlati sono state concentrate in un piccolo volume mentre il fluido di sfondo contenenti aggregati di mucina e minori RBCs era continuamente rimossi attraverso il tubo di scarico collegato alla presa di OW. (D) messa a punto sperimentale e l'immagine fluorescente di una particella di 10 µm, la traiettoria (verde) e l'uscita del canale a spirale (alto a destra). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: diagramma schematico della preparazione di campioni di secrezione delle vie respiratorie mediante regolazione inerziale microfluidica. Clinicamente ha indotto la secrezione delle vie respiratorie dislocata meccanicamente nel volume x 1.000 di soluzione tampone. Il diluente è concentrato microfluidica, conseguente ~ 1 mL di sospensione cellulare con lo sfondo chiaro. Adattato con permesso da Ryu et al., Copyright (2017) American Chemical Society17. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: confronti rappresentativi del metodo per il metodo di dissociazione di microfluidica mucolitico DTT. Secrezioni tracheali (A) campione (sinistra) e immagine microscopica dopo la dissociazione di microfluidica. (B) immagine fotografica delle sospensioni originali e finali. (C) confronto dei tassi di recupero PMN tra i metodi mucolitici e microfluidica. (D) confronto tra NE rilascio di neutrofili separati dai metodi mucolitici DTT prima e dopo stimolazione con PMA e microfluidica. NE rilascio significativamente è stata innescata da PMA sul campione dalla separazione di microfluidica (p < 0.0001). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In inerziale microfluidica, particelle e cellule localizzano in una certa posizione laterale in un micro-canale basato sul loro formato5,18,19,20. Dovuto all'effetto combinato del decano trascina la forza e la forza inerziale ascensore nel microchannel curvo, particelle di grandi dimensioni o i neutrofili (> 10 µm) sono situati all'interno del canale e piccole particelle, aggregati di muco e detriti più piccolo di 6 µm sono posizionati di fuori del canale a determinate velocità di flusso condizioni10,11,13,14.
Tuttavia, c'è un trade-off tra la concentrazione e il recupero della separazione quando si utilizza microfluidica, soprattutto quando l'intervallo di grandezza di separazione della particella o la cella di interesse si sovrappone con altre cellule/particelle. Per ottenere un'alta concentrazione di particelle ordinate e cellule, la gamma di separazione deve essere stretto e richiede una messa a punto con l'osservazione microscopica per ogni esempio di esecuzione; Questo limita l'utilizzo della microfluidica inerziale sulla biometria eterogenea, ad esempio delle secrezioni bronchiali.
Qui, presentiamo un metodo di preparazione del campione di secrezioni clinica delle vie respiratorie per le analisi in vitro usando microfluidica inerziale del ciclo chiuso (Figura 1B, C). Il funzionamento di ciclo chiuso di ricircolo della particella/cella attraverso una presa di messa a fuoco realizzato entrambi i fattori di alta concentrazione e tassi di recupero ad alta. L'outlet di OW scorre nel tubo di scarico e la presa di IW è sempre alimentata con la provetta del campione originale. Le cellule superiori ai 10 µm di diametro rimangono nella provetta del campione iniziale, quindi, aumentando la densità delle cellule del campione, mentre il fluido di sfondo viene eliminato per il tubo di scarico. Il tasso di diluizione alta permette di liquidazione del fluido sfondo, tra cui detriti e muco. Inoltre, indipendentemente dalla condizione di campione, il metodo proposto può uniformemente dissociare e isolare le cellule immuni.
DTT è un buffer di lisi di mucina ampiamente usato che idrolizza i legami bisolfurico nel proteoglycan aggregazione per separare il contenuto della cella da mucillagine1,21,22. Tuttavia, DTT riferito interferisce con gli antigeni di superficie delle cellule di anima bianche, che possono influenzare la funzione del leucocita2. Nel nostro studio, il contenuto cellulare recuperato dalla dissociazione DTT era contradditori attraverso campioni, a causa della non uniforme mucolitico efficienza e intasamento del filtro. Questo diventa più critico per la preparazione di campioni iniziali con piccoli volumi e campioni di secrezione delle vie aeree relativamente spessa. D'altra parte, il metodo utilizzando microfluidica abilitato il recupero costante del contenuto della cella in campioni di pazienti eterogenei (Figura 3). Come illustrato in Figura 3B, potremmo isoliamo costantemente il contenuto della cella della secrezione delle vie respiratorie in un tampone pulito indipendentemente dallo stato del campione originale, vale a dire, sanguinoso, tenace o acquoso. Rispetto al metodo convenzionale, il metodo proposto ha meno detriti nel campione recuperato, che minimizza la possibile interferenza di detriti in analisi biochimiche a valle.
NE rilascio è stata esaminata per valutare l'integrità funzionale dei neutrofili catturati da entrambi i metodi di arricchimento (Figura 3D). Neutrofili rimuovere stranieri rilasciare molecole organiche attraverso NE23,24,25. PMA viene comunemente utilizzata per attivare i neutrofili in vitro26. Le cellule isolate dai metodi (DTT) mucolitici e la microfluidica sono state stimolate con 50 nM di PMA. Abbiamo testato ogni metodo con campioni di secrezione della via aerea umana (etichettati come P173, P174, P176, P177, P181 e P182). Campioni concentrati di microfluidica hanno mostrato un aumento a NE di stimolazione di PMA per tutti e 6 i campioni. Al contrario, solo 3 dei campioni DTT trattati potrebbe indurre attività NE aumentata dopo stimolazione con PMA. Inoltre, i neutrofili isolati dal metodo mucolitico DTT ha mostrato molto più alta attività della linea di base che i neutrofili isolati di microfluidica. Questi risultati hanno mostrato chimici possibili disturbi dell'apparato NE, vale a dire, la rottura della superficie associato antigene2,3, che suggerisce che il metodo di microfluidica è un metodo migliore in termini di preservare la funzione del neutrofilo di omogeneizzazione di DTT. Il metodo proposto dissociazione opera anche in maniera automatizzata e completamente indipendente, riducendo al minimo l'esposizione dei campioni dei pazienti con potenziali pericoli dell'ambiente esterno.
Tuttavia, il metodo proposto richiede un'alta portata e, quindi, una connessione stabile e fluidica. Inoltre, a causa della fluttuazione inerente della pompa peristaltica, la dimensione di uscita IW deve essere maggiore rispetto alla quota di sbocco di OW, altrimenti la velocità effettiva può essere compromessa. Ci aspettiamo che il metodo proposto fornirà un throughput più elevato se c'è una pompa di circolazione che può fornire una portata più stabile.
Fornendo un protocollo di dissociazione per catturare i neutrofili da clinica delle secrezioni bronchiali, il metodo presentato in questo studio è previsto di estendere la portata della ricerca clinica sulle malattie respiratorie, come polmonite, asma, fibrosi cistica e cronica malattia polmonare ostruttiva.
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Disclosures
Gli autori hanno presentato una domanda di brevetto sulla tecnologia descritta qui.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato supportato da NIH/NIAID (R21AI119042) così come il programma di dosaggio NIH U24 campione con parsimonia (U24-AI118656).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
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