Summary
In dieser Forschung zeigen wir markierungsfreie Neutrophilenzahl Trennverfahren von klinischen Atemwege Sekrete mit geschlossenen Regelkreis der Spirale inertial Mikrofluidik. Die vorgeschlagene Methode würde die klinische in-vitro- Tests für verschiedene Erkrankungen der Atemwege zu erweitern.
Abstract
Atemwege Sekrete enthalten eine große Anzahl von immunvermittelte Zellen, z. B.Neutrophile, Makrophagen und Lymphozyten, die als eine wichtige Ressource verwendet werden können, um eine Vielzahl von Lungenerkrankungen, sowohl für Forschung und klinische Zwecke zu bewerten. Aufgrund der heterogenen und Viskose von Patienten Schleim ist jedoch derzeit keine zuverlässige Dissoziation-Methode, die die Host Immunzellen in die Patienten Airway-Sekretion nicht schadet. In dieser Studie stellen wir eine Probe Vorbereitung Methode, die trägen Mikrofluidik immun Beurteilung des Patienten verwendet. Unabhängig von den heterogenen strömungstechnischen Eigenschaften der klinischen Proben, die vorgeschlagene Methode erholt mehr als 95 % der Neutrophilen Atemwege Sekretion Proben, die 1,000-fold verdünnt werden mit Milliliter sauber Kochsalzlösung. Durch Rezirkulation konzentrierte Ausgabedatenstrom Erstmuster-Reservoir, sind eine hohe Konzentration, die Wiederherstellung und die Reinheit der Immunzellen zur Verfügung gestellt; Rezirkulation gilt einen Kompromiss für den Einzel-Lauf Spritze ansässige Betrieb des inertialen Mikrofluidik. Der geschlossene Betrieb der Spirale Mikrofluidik bietet Leukozyten ohne physikalische oder chemische Störungen, wie Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) zeigt-induzierte sortierte neutrophile Elastase Freilassung.
Introduction
Da Zellen in einer großen Menge von Schleim in den Atemwegen Sekrete gekapselt sind, hat die funktionelle Beurteilung der Leukozyten durch eine in-vitro- Assay behindert. Dithiothreitol (DTT) ist der häufigste Lyse-Puffer zu distanzieren und homogenisieren Sputum für zytologische Analyse und Erkennung von Mediatoren und bietet gleichzeitig erträglich Lebensfähigkeit der isolierten Zellen1,2. Jedoch kann DVB-t stören Oberfläche-gebundene Antigene der Atemwege Neutrophilen, wodurch die Störung der Neutrophilen Funktion wie z. B. die Elastase und Myeloperoxidase (MPO)2,3. Daher wurden nur wenige Studien der menschlichen Atemwege Neutrophilenzahl Funktion mit peripherem Blut neutrophile durchgeführt, die nicht die physiologischen Eigenschaften der pulmonalen4verraten kann. Unterdessen hat sich träge Mikrofluidik Fortschritte bei der Isolierung von Zellen aus verschiedenen Patienten Biomatrices5,6. Das Gleichgewicht zwischen inertial Aufzug Kräfte und Dean ziehen richtet die Partikel/Zelle gemäß ihrer Größe die markierungsfreie Partikel Trennung7ermöglicht. Unsere Gruppe zuvor führte eine Probe Zubereitungsart für zirkulierenden Tumor Zellen8,9, Krankheitserreger im Blut8, Zellen aus einer Suspension Kultur10,11, 12, und Polymorphkernige Leukozyten (PMNs) von Blut13,14.
Hier stellen wir ein Protokoll um Immunzellen des Patienten Airway Sekrete mit geschlossenen inertial Mikrofluidik für einen nachgeschalteten in-Vitro -Assay, wie der Neutrophilen Elastase (NE)-Test vorzubereiten. Diese Methode bietet hohe Konzentration und Erholung, vor allem wenn es eine deutliche Überschneidung in seitlicher Richtung der Zelle/Teilchen aus dem die Zelle/Partikel des Interesses ist zu entfernen, die häufig in klinischen Proben beobachtet wird. Durch Rezirkulation der inneren Mauer (IW)-große Partikel oder Zellen zurück zu der Eingabe Probenröhrchen, die Partikel oder Zelle-of-Interest-Konzentrate im ursprünglichen Behälter konzentrieren, während Hintergrund Flüssigkeiten mit kleinen Mucin Aggregate durch den Abfall Behälter übergeben. Trotz der heterogenen strömungstechnischen Eigenschaften von klinischen Proben, erholt sich die vorgeschlagene Methode konsequent über 95 % der Neutrophilen aus Atemwege Sekretion Proben, die 1,000-fold verdünnt werden mit einer sauberen Kochsalzlösung (~ 1 mL). Im Gegensatz dazu stellt die Lyse-Methode eine breite Palette von PMNs Verwertungsquoten je nach dem Zustand der Probe. Das vorgeschlagene Protokoll erfasst Leukozyten in gewissem markierungsfreie ohne physikalische oder chemische Unterbrechung, bietet die Möglichkeit, empfindliche Zellen aus klinisch gegen Biometrie mit minimal-invasiven Eingriffen zu ernten.
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Protocol
Die Musterkollektion wurde von der University of Pittsburgh Institutional Review Board (IRB # PRO16060443, PRO10110387) genehmigt. Alle Experimente werden unter einen Schrank mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung Biosafety durchgeführt.
1. Gerät Fertigung und weiche Lithographie
Hinweis: Standard weichen Lithographie Techniken15,16 dienten der Microchannel Polydimethylsiloxan (PDMS) zu erstellen.
- Mischen Sie den PDMS-Vorläufer im Verhältnis 10:1 von base und Aushärtung Agent.
- 30 g der PDMS Vorläufer Mischung auf der Mikro-gefräst aus Aluminium Form Gießen (siehe Abbildung 1 für Dimensionen) und 20 g der PDMS Vorläufer Mischung auf 100 mm Petrischale.
Hinweis: Die Petrischale wird verwendet, um den dicken Film von PDMS (~ 3 mm) für die Tragschicht zu machen. Die tragende Schicht des PDMS bietet einheitliche physikalische Oberflächeneigenschaften während der Mikrofluidik. Alternativ kann eine Dünnschicht des PDMS auf der Glas-Folie verwendet werden. Der master-Form mit bestimmten Kanal Abmessungen wurde entworfen und hergestellt durch Mikrofräsen auf der Alu-Blech. In dieser Studie verwendete Spirale-Kanal war ein 8-Schleife Spirale mikrokanal mit einem ein- und zwei Ausgänge mit dem Radius von 8 mm bis 24 mm für effiziente Größe-basierte Trennung erhöhen. - Legen Sie die Form und die Petrischale in einem Vakuum Exsikkator zu entgasen, bis keine Luftblasen an der Oberfläche, in der Regel ca. 5-10 min. Einsatz ein Haus-Vakuum für die Exsikkator sichtbar sind.
- Lassen Sie das Vakuum und legen Sie die Form und die Petrischale in einem 90 ° C Ofen für 1 h.
Hinweis: Eine Herdplatte oder andere Heizung Werkzeuge können anstelle von einem Ofen verwendet werden. - Die Form und die Petrischale aus dem Ofen nehmen und bei Raumtemperatur für 10 min. abkühlen lassen.
- Vorsichtig die Umrisse schneiden Sie aus und Lochen Sie der flüssigen Zugriff auf das Gerät mit einem 2 mm-Puncher.
Hinweis: Die Größe des Stempels kann variieren je nach Größe des Handbuchs Rohre oder Flüssigkeit. - Befestigen Sie ein Klebeband auf die Kanal-Seite des Gerätes und Dickschicht PDMS und schälen Sie sorgfältig mit der Pinzette um Staub zu entfernen.
- Sowohl die Kanal-Seite des Gerätes und schlichte PDMS mit Luft-Plasma und Verbundenheit mit der vorbereiteten Tragschicht schlicht PDMS (Abbildung 1A) zu behandeln.
- Platzieren Sie den Chip auf der 50 x 70 mm-Glas-Folie und legen Sie sie in einem Ofen 70 ° C für mindestens 30 min um die Haftfestigkeit zu verbessern.
(2) trachealen Sekretion Sammlung von mechanisch beatmeten Patienten
Hinweis: Trachealen Sekrete aus mechanisch beatmeten Patienten während der normalen Routine Atemwege Betreuung erhalten Sie über ein Protokoll von den herkömmlichen Methoden geändert, der standard, Erwachsene belüfteten Patient unterzubringen. Proben wurden de-identifiziert und sofort zur Verarbeitung gesendet.
- Wenn trachealen streben angegeben ist, verwenden Sie einen Katheter Atemwege Sekrete zu extrahieren.
- Den Katheter vorsichtig halb in den Endotrachealtubus vorantreiben und 5 mL 0,9 % sterile normale Kochsalzlösung aus einer vorgefüllten 10 mL Spritze zu vermitteln.
- Wenn der Katheter ist voll ausgereift, oder Widerstand traf, die Sekrete abzusaugen und in einem sterilen Auswurf Sammelbehälter sammeln.
- Sammle 10 mL trachealen Sekrete in einem sterilen Sputum Container und auf Eis legen. Senden Sie die Proben sofort zur Bearbeitung.
(3) trachealen Sekretion Probenvorbereitung
Hinweis: Alle Experimente müssen unter einen Schrank mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung Biosafety durchgeführt werden.
- 1 mL der Atemwege Sekretion Proben in 9 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einer Kunststoff 10 mL Spritze (für ein 10 X Verdünnung) zu verteilen. Verwenden Sie eine stumpfe Pipette, um die Schleim-Probe zu homogenisieren.
- Belasten Sie das Verdünnungsmittel mit einem 40 µm Nylon Zelle Sieb entfernen große Stücke oder Blutgerinnsel, die die Mikrofluidik Zugangsöffnung oder den Kanal blockieren können. Legen Sie die Probe auf dem Eis nach der Verarbeitung.
- Das Verdünnungsmittel jeder Probe mit einem 100 X Volumen von PBS-Puffer, wodurch eine 1.000 x verdünnten Suspension zu zerstreuen. Legen Sie die Probe auf dem Eis während der gesamten Dissoziation-Operation.
(4) Versuchsaufbau
Hinweis: Alle Experimente müssen unter einen Schrank mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung Biosafety durchgeführt werden.
- Montieren des PDMS-Chips mit dem Fluid Guide, gleichförmige Strömung zu jedem der vier Spirale Mikrokanäle (Abbildung 1 b) anzuwenden.
Hinweis: Vier Kanäle wurden verwendet, um den Durchsatz zu erhöhen durch Parallelisierung sowie Optimierung der Lautstärke und Zelle Dichte die entstandene Suspension. Der flüssige Guide ist entworfen und hergestellt mit einem Stereolithographie Art 3D-Drucker mit klaren Harz. Einlass und Auslass des flüssigen Guide verwenden Luer-Anschluss-Buchsen für einfache Verbindung und stabile Abdichtung während der Operation. - Verbinden Sie einen Luer-Anschluss-Stecker 1/16-Zoll mit Einlauf, der inneren Steckdose (IW) und der Außenwand (OW) Auslassöffnung des flüssigen Guide und verbinden ein Silikonschlauch zur Probe Aussetzung.
- Legen Sie die stumpfe Spitzen an beiden Enden der zu- und Abgänge zu den unteren Rand der Probe-Stausee erreichen.
- Die Peristaltische Pumpe mit dem Zulauf-Schlauch anschließen.
- Stecken Sie das Ende der Zulauf Schlauch und IW-Auslass-Schlauch in der Probe-Stausee und das Ende des Schlauches OW Outlet in den Abfall Behälter (Abbildung 1, D).
- Ort der 50 mL-Tube von gefilterten PBS ohne Kalzium und Magnesium auf die Probe-Stausee.
- Pumpen mit einer low-Flow-Rate (~ 1 mL/min) an das Gerät zu starten.
Hinweis: Wenn Luftblasen im Kanal erfasst werden, drücken Sie die Spitze des Kanals mit der Pinzette zu destabilisieren und Luftblasen zu beseitigen. Wenn das Gerät vollständig mit Pufferlösung gefüllt ist, ändern Sie die PBS-Röhre um die Atemwege Sekretion Probenröhrchen vorzubereiten. - Wenn die Probe in der Probe-Stausee befindet, Peristaltische Pumpe einschalten und Einstellen der Durchflussmenge bei 4 mL/min (Abbildung 1, D).
- Wenn das Probenvolumen benannten Volumen (~ 1 mL) erreicht, beenden Sie den Betrieb und trennen Sie den Silikonschlauch.
Hinweis: Die vorgeschlagene Methode ist effizienter zu verringern eine große Menge an Verdünnungsmittel (> 50 mL) in ein Mikro-Zentrifugenröhrchen Volumen (~ 1 mL) (Abbildung 2).
(5) Flow Cytometry Analysis
Hinweis: Um die Dissoziation Methoden (Mikrofluidik und Lyse) zu vergleichen, wurde Durchflusszytometrie mit Immunfluoreszenz verwendet.
- Fügen Sie Fluorescein erfolgt (FITC) - konjugierten Maus Anti-Human CD66b monoklonaler Antikörper und Allophycocyanin (APC) - Maus Anti-Human CD45 monoklonaler Antikörper, die ersten Aussetzungen (Schritt 3.3) und daraus resultierende Suspensionen (Schritt 4,9) (200 µL konjugiert jeder Antikörper) im Verhältnis von 01:25 V/V.
- Inkubieren Sie die Proben bei 4 ° C im Dunkeln für 30 min.
- Analysieren Sie beide Proben auf einem Durchflusszytometer, die PMNs zu quantifizieren.
Hinweis: Die Bevölkerung, die doppelt positiven FITC-APC, CD66b positiv und CD45 positiven galt als neutrophile. Erholung wurde durch das Verhältnis der Ergebniszelle Zahlen die Eingabe und die entstandene Suspension berechnet.
6. NE Release Analyse
Hinweis: Um die Funktionalität des isolierten zu vergleichen war Neutrophilenzahl von der Mikrofluidik und Lyse-Methode eine NE-Assay-Kit verwendet.
- PMA (zur Verfügung gestellt, in dem Assay Kit) hinzufügen jedes entstandene Suspension (erhältlich bei Schritt 4,9), eine Endkonzentration von 50 nM.
- Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 2 h.
- Zentrifugieren Sie die Suspensionen bei 300 X g für 10 min.
- Übertragen Sie 10 µL jeder überstand auf eine 96-Well-Platte (zur Verfügung gestellt, in dem Assay Kit).
Hinweis: Eine 96-Well-Mikrotestplatte mit einem flachen Boden und schwarzem Polystyrol kann auch verwendet werden. - Jedes gut fügen Sie 90 µL verdünnter testpuffer (zur Verfügung gestellt, in dem Assay Kit hinzu).
- Fügen Sie 10 µL des Substrats Elastase (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, im Assay Kit enthalten).
- 1,5 h bei 37 ° c inkubieren
- Lesen Sie die 96-Well-Platte mit einem Fluorometer bei einer Erregung Wellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 525 nm.
Hinweis: Die Höhe der NE teilte der PMN-Graf von Flow-zytometrie-Analyse.
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Representative Results
Wir erreichten transparentere immun-Zellsuspensionen mit beiden DVB-t-Mucolysis und Mikrofluidik Dissoziation (Abb. 3A). Mikrofluidik Dissoziation gesammelt 4,40 x 105 PMNs im Durchschnitt (2,1 x 104 bis 5,60 x 105 PMNs n = 6) von den Atemweg Sekretion Proben 1,000-fold verdünnt (50 mL Gesamtvolumen) in 1 mL Suspension sauber. Im Vergleich zu dem ursprünglichen Verdünnungsmittel, 94,0 % PMNs (CD66b+/CD45+) wurden geborgen, in einem kleinen Volumen konstant über 6 klinischen Proben. Jedoch zeigte die DVB-t-Mucolysis-Methode eine 53,5 % Erholung im Durchschnitt mit erheblichen Schwankungen der Probe zu Probe (30,8-96,0 %) (Abb. 3 b).
Als nächstes wurde die Freisetzung von Elastase als ein Proof-of-Concept mit einem kommerziellen NE Assay Kit untersucht. Ohne externe Stimulation zeigte die Probe vorbereitet durch die schleimlösende Methode NE höhere Ebene als die Probe aus der Mikrofluidik-Methode. PMA wurde die resultierenden Suspensionen aus der Mikrofluidik und schleimlösende Dissoziation Methoden zum Auslösen der NE Version hinzugefügt. Wir haben jede Methode mit Atemwege Sekretion Proben von 6 verschiedenen Patienten getestet. Immunzellen mit Mikrofluidik getrennt präsentiert intakt Funktionalität, zeigen eine erhöhte Menge an NE Freigabe durch PMA Stimulation. Auf der anderen Seite stieg Zellen vorbereitet durch die schleimlösende Dissoziation Methode inkonsistent NE Version (Abbildung 3).
Abbildung 1: Spirale mikrofluidischen Gerät und experimentelle Einstellungen. Foto Bilder von (A) Spirale Mikrofluidik und (B) das Gerät mit dem fluidischen Adapter montiert. (C) schematische Darstellung der geschlossenen Abscheidung mittels Spirale inertial Mikrofluidik. Durch Rezirkulation des Partikel/Zelle konzentriert Streams (IW Steckdose) wieder in der ursprünglichen Probe-Stausee, immunvermittelte Zellen konzentrierten sich in einem kleinen Volumen während der Hintergrund Flüssigkeit mit Mucin Aggregate und kleinere RBCs wurden kontinuierlich entfernt durch das Abwasser Rohr an den OW-Steckdose angeschlossen. (D) Versuchsaufbau und die fluoreszierende Image ein 10 µm Partikel, die Flugbahn (grün) und der Ausgang des Spiral-Kanal (rechts oben). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Atemwege Sekretion Probenvorbereitung mit geschlossenen inertial Mikrofluidik. Klinisch induzierte Atemwege Sekretion mechanisch in 1.000 X Volumen Pufferlösung zerstreut. Das Verdünnungsmittel ist durch Mikrofluidik, wodurch ~ 1 mL Zellsuspension mit dem klaren Hintergrund konzentriert. Adaptiert mit Erlaubnis von Ryu Et Al., Copyright (2017) American Chemical Society17. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Repräsentative Vergleiche der DTT schleimlösende Methode der mikrofluidischen Dissoziation Methode. (A) Trachealen Sekrete probieren (links) und mikroskopische Bild nach mikrofluidischen Dissoziation. (B) Lichtbildaufnahmen des ursprünglichen und daraus resultierende Suspensionen. (C) Vergleich von PMN Wiederfindungsraten zwischen die schleimlösende und Mikrofluidik-Methoden. (D) Vergleich der NE Freigabe der getrennten Neutrophilen durch die Mikrofluidik und DTT schleimlösende Methoden vor und nach der PMA Stimulation. NE Version erheblich von der PMA auf der Probe von mikrofluidischen Trennung ausgelöst wurde (p < 0,0001). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Inertial Mikrofluidik lokalisieren Partikel- und Zellen an einer bestimmten seitlichen Position in einem Mikro-Kanal anhand ihrer Größe5,18,19,20. Durch die kombinierte Wirkung des Dekans zu ziehen, Kraft und die trägen Auftriebskraft im gekrümmten Microchannel, große Partikel oder Neutrophilen (> 10 µm) befinden sich in den Kanal und kleine Partikel Schleim Aggregate und Trümmer kleiner als 6 µm positioniert außerhalb des Kanals bei bestimmten Strömungsgeschwindigkeit Bedingungen10,11,13,14.
Allerdings gibt es ein Kompromiss zwischen Konzentration und Erholung der Trennung bei der Mikrofluidik, Verwendung, vor allem, wenn die Trennung Größenbereich des Teilchens oder die Zelle von Interesse mit anderen Zellen/Teilchen überschneidet. Um eine hohe Konzentration von sortierten Partikel und Zellen zu erreichen, die Trennung muss eng sein und erfordert eine Feinabstimmung mit mikroskopischen Beobachtung für jedes Beispiel ausführen; Dies schränkt die Verwendung von inertial Mikrofluidik auf heterogenen Biometrie, z. B. Atemwege Sekrete.
Hier stellen wir eine klinische Atemwege Sekrete Beispielmethode Vorbereitung für in-vitro- Assays mit geschlossenen inertial Mikrofluidik (Abbildung 1 b, C). Die geschlossenen Regelkreis durch Rezirkulation der Partikel/Zelle durch eine Fokussierung Auslass erreicht hohe Konzentration Faktoren und hohe Verwertungsquoten. OW-Steckdose fließt das Abwasser Rohr, und das IW-Outlet ist das ursprüngliche Probenröhrchen kontinuierlich zugeführt. Zellen, die größer als 10 µm im Durchmesser bleiben in der Erstmuster-Röhre, so erhöhen die Zelldichte der Probe, während die Hintergrund Flüssigkeit mit dem Abwasser Rohr beseitigt ist. Die hohe Verdünnung ermöglicht Clearance von Hintergrund-Flüssigkeit, einschließlich Schmutz und Schleim. Auch, unabhängig vom Zustand der Patientenprobe das vorgeschlagene Verfahren kann gleichmäßig distanzieren und Immunzellen zu isolieren.
DVB-t ist eine weit verbreitete Mucin Lyse Puffer, der Disulfid-Bindungen in Proteoglykan Aggregation Zellinhalt von Schleim1,21,22trennen spaltet. DVB-t-stört jedoch angeblich den Oberflächenantigenen weißer Blutkörperchen, die Leukozyten Funktion2beeinflussen können. In unserer Studie waren die zelluläre Inhalt wiederhergestellt, indem DVB-t-Dissoziation widersprüchlich über Proben, wegen ungleichmäßiger schleimlösende Effizienz und verstopfen des Filters. Dies wird immer wichtiger für die Vorbereitung der Erstmuster mit kleinen Mengen und relativ dicken Atemwege Sekretion Proben. Auf der anderen Seite aktiviert die Methode mit Mikrofluidik die konsequente Verwertung von Zellinhalt in heterogenen Patientenproben (Abbildung 3). Wie in Abbildung 3 bgezeigt, könnten wir konsequent den Zellinhalt der Atemwege Sekretion in einem sauberen Puffer unabhängig vom ursprünglichen Probe Zustand, d.h., blutigen, zäh oder dünnflüssig isolieren. Im Vergleich zu der konventionellen Methode, hat die vorgeschlagene Methode weniger Ablagerungen in der wiederhergestellten Probe, die wodurch mögliche Störungen von Schutt in nachgeschalteten biochemische Analysen minimiert wird.
NE Freigabe wurde untersucht, um die Funktionsfähigkeit der erfassten Neutrophilen bewerten durch beide Anreicherungsverfahren (Abbildung 3D). Neutrophile entfernen ausländischen organische Moleküle durch NE release23,24,25. PMA wird häufig verwendet, um neutrophile in-vitro-26zu aktivieren. Zellen, die durch die Mikrofluidik und schleimlösende (DTT) Methoden isoliert wurden angeregt, mit 50 nM von PMA. Wir haben jede Methode mit menschlichen Atemwege Sekretion Proben (bezeichnet als P173, P174, P176, P177, P181 und P182) getestet. Proben durch Mikrofluidik konzentriert zeigten eine Zunahme in NE durch PMA Stimulation für alle 6 Proben. Im Gegensatz dazu könnte nur 3 der DVB-t behandelt Proben erhöhte NE Tätigkeit nach PMA-Stimulation induzieren. Darüber hinaus zeigte die Neutrophilen isoliert von der DVB-t schleimlösende Methode viel höhere Grundlinie Aktivität als die Neutrophilen durch Mikrofluidik isoliert. Diese Ergebnisse zeigten mögliche chemische Störung der NE Maschinen, d. h. Störungen der Oberfläche gebunden Antigen2,3, was darauf hindeutet, dass die Mikrofluidik-Methode eine verbesserte Methode für den Erhalt ist der Neutrophilenzahl Funktion als DVB-t-Homogenisierung. Die vorgeschlagenen Dissoziation-Methode funktioniert auch in einer automatisierten und vollständig geschlossene Weise, Minimierung der Exposition von Patientenproben mit möglichen Gefahren der äußeren Umgebung.
Die vorgeschlagene Methode erfordert jedoch eine hohe Fließgeschwindigkeit und damit eine stabile fluidische Verbindung. Auch aufgrund der inhärenten Fluktuation der peristaltischen Umwälzpumpe, die IW Outlet Dimension muss größer sein als die OW-Outlet-Dimension, ansonsten Durchsatz beeinträchtigt werden. Wir erwarten, dass die vorgeschlagene Methode höheren Durchsatz liefern wird, ist eine Zirkulationspumpe, die eine stabilere Durchflussrate bieten kann.
Durch die Bereitstellung einer Dissoziation Protokoll um neutrophile aus klinischen Atemwege Sekrete zu erfassen, wird in dieser Studie vorgestellten Methode voraussichtlich den Umfang der klinischen Forschung auf Erkrankungen der Atemwege wie Lungenentzündung, Asthma, Mukoviszidose, erweitern und chronische obstruktive Lungenerkrankung.
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Disclosures
Die Autoren haben die hier beschriebene Technik patent angemeldet.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von NIH/NIAID (R21AI119042) sowie NIH U24 Probe Sparing-Assay-Programm (U24-AI118656) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
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