Summary
Nesta pesquisa, vamos demonstrar um método de separação de neutrófilos rótulo livre de secreções clínico das vias aéreas utilizando a operação de circuito fechado de microfluídica inercial espiral. O método proposto poderia expandir os ensaios clínicos em vitro para várias doenças respiratórias.
Abstract
Secreções das vias respiratórias contêm um grande número de células imune-relacionados, por exemplo, os neutrófilos, macrófagos e linfócitos, que podem ser usados como um recurso importante para avaliar uma variedade de doenças pulmonares, tanto para fins clínicos e de pesquisa. No entanto, devido à natureza heterogênea e viscosa do muco do paciente, não há atualmente nenhum método de dissociação confiável que não danifica as células imunes do anfitrião na secreção das vias aéreas de pacientes. Nesta pesquisa, apresentamos um método de preparação de amostra que usa microfluídica inercial para avaliação imunológica do paciente. Independentemente das heterogêneas fluídico propriedades das amostras clínicas, o método proposto se recupera mais de 95% de neutrófilos de amostras de secreção das vias aéreas que são diluídas 1,000-fold com mililitros de solução salina limpo. Recirculando o fluxo de saída concentrada para o reservatório de amostra inicial, uma alta concentração, recuperação e pureza das células imunes são fornecidos; recirculação é considerada um trade-off para o single-executar operação baseada em seringa de microfluídica inercial. A operação de circuito fechado de microfluídica espiral fornece leucócitos sem perturbação física ou química, como demonstrado pelo phorbol myristate 12 13-acetato (PMA)-induzida liberação de elastase de neutrófilos classificadas.
Introduction
Uma vez que as células são encapsuladas em uma grande quantidade de muco nas secreções das vias respiratórias, a avaliação funcional dos leucócitos por um ensaio em vitro tem sido prejudicada. Ditiotreitol (DTT) é o mais comum do lysis dissociar e homogeneizar o muco para análise citológica e detecção de mediadores proporcionando viabilidade tolerável de células isoladas1,2. No entanto, TDT pode interferir com antígenos de superfície limite de neutrófilos de vias aéreas, resultando em interrupção da função dos neutrófilos, tais como elastase e mieloperoxidase (MPO) versão2,3. Portanto, foram realizados poucos estudos da função dos neutrófilos via aérea humana com os neutrófilos do sangue periférico, que não podem revelar as características fisiológicas do pulmonar4. Enquanto isso, inercial microfluídica tem feito progressos em isolar as células de vários pacientes biomatrices5,6. O equilíbrio entre as forças inerciais elevador e Dean arrastar alinha a partícula/célula de acordo com seu tamanho, o que permite a separação de partículas livre de rótulo7. Nosso grupo anteriormente introduziu um método de preparação de amostra para circulação de células de tumor8,9, patógenos no sangue8, células de uma suspensão cultura10,11, 12e leucócitos polimorfonucleares (PMN) de sangue13,14.
Aqui, apresentamos um protocolo para preparar as pilhas imunes de secreções de vias aéreas do paciente usando microfluídica inercial de loop fechado para um ensaio a jusante em vitro , tais como o ensaio de neutrófilos elastase (NE). Este método fornece alta concentração e recuperação, especialmente quando existe uma sobreposição significativa na direção lateral da célula/partícula do qual o célula/partícula de interesse está a ser removido, que é comumente observada em amostras clínicas. Recirculando a parede interna (IW)-concentrado de partículas grandes ou células de volta para o tubo de entrada de amostra, a partícula ou célula de interesse concentrados no reservatório original, enquanto fluidos de fundo com agregados de mucina pequenas passam através do reservatório de resíduos. Apesar das propriedades fluídico heterogêneas de amostras clínicas, o método proposto recupera consistentemente acima de 95% de neutrófilos de amostras de secreção das vias aéreas que são diluídas 1,000-fold com uma solução salina limpo (~ 1 mL). Por outro lado, o método de Lise apresenta uma ampla gama de PMN taxas de recuperação, dependendo da condição da amostra. O protocolo proposto captura leucócitos de uma forma livre de rótulo sem interrupções físicas ou químicas, que prevê a possibilidade de colher células delicadas de contestar clinicamente biometria com procedimentos minimamente invasivos.
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Protocol
A coleta de amostra foi aprovada pela Universidade de Pittsburgh institucional Review Board (IRB # PRO16060443, PRO10110387). Todos os experimentos são executados sob uma armário com o equipamento de proteção pessoal adequado de biossegurança.
1. dispositivo fabricação e litografia macia
Nota: Litografia macia padrão técnicas15,16 foram usados para criar o microchannel polydimethylsiloxane (PDMS).
- Misture o precursor PDMS na proporção de 10:1 do agente de cura e base.
- Coloque 30 g de mistura de precursor de PDMS sobre o molde de alumínio micro usinadas (ver Figura 1 para dimensões) e 20 g de mistura de precursor de PDMS sobre o prato de Petri de 100mm.
Nota: A placa de Petri é usado para fazer a película grossa de PDMS (~ 3 mm) para a camada de apoio. A camada de suporte de PDMS fornece propriedades de superfície físicas uniformes em toda a microfluidics. Alternativamente, uma fina película PDMS sobre a lâmina de vidro pode ser usada. O mestre molde com dimensões de canal específico foi projetado e fabricado pela micro fresagem na folha de alumínio. O canal espiral utilizado neste estudo foi um 8-loop espiral microchannel com uma entrada e duas saídas, com o raio aumentando de 8 mm a 24 mm para separação eficiente baseado em tamanho. - Coloque o molde e o prato de Petri no exsicador de vácuo para desgaseificar até sem bolhas são visíveis na superfície, tipicamente 5-10 min. Use um casa-vácuo para o dessecador.
- Liberar o vácuo e coloque o molde e o prato de Petri em um forno de 90 ° C por 1h.
Nota: Uma placa de aquecimento ou outras ferramentas de aquecimento podem ser usadas em vez de um forno. - Retire o molde e o prato de Petri do forno e deixe-a esfriar em temperatura ambiente por 10 min.
- Cuidadosamente corte o contorno e buracos o acesso fluido no dispositivo usando um perfurador de 2 mm.
Nota: O tamanho do perfurador pode variar dependendo do tamanho do guia de tubagens ou fluido. - Aderir uma fita para o lado de canal do dispositivo e película grossa de PDMS e descasque cuidadosamente com a pinça para remover a poeira.
- Trate os dois do lado do canal do dispositivo e PDMS simples com ar plasma e vínculo com a camada de apoio preparado de PDMS liso (figura 1A).
- Coloque o chip sobre a lâmina de vidro de 50 x 70 mm e colocá-lo em um forno de 70 ° C durante pelo menos 30 min aumentar a força de ligação.
2. coleta de secreção traqueal de pacientes ventilados mecanicamente
Nota: Secreção traqueal pode ser obtida pacientes mecanicamente ventilados durante cuidados com vias aéreas rotina normal usando um protocolo modificado de métodos convencionais para acomodar o paciente ventilado padrão, adulto. Amostras foram de identificado e enviadas imediatamente para processamento.
- Se a aspiração traqueal é indicada, use um cateter para extrair as secreções das vias respiratórias.
- Avance o cateter cuidadosamente na metade do caminho para dentro do tubo endotraqueal e instilar 5 mL de solução salina normal 0,9% estéril de uma seringa pré-cheia 10ml.
- Quando o cateter é avançado totalmente, ou resistência, aspirar as secreções e coletar em um recipiente de coleta de escarro estéril.
- Coletar 10 mL de secreção traqueal em um recipiente estéril de escarro e colocá-lo no gelo. Envie amostras imediatamente para processamento.
3. preparação da amostra de secreção traqueal
Nota: Todas as experiências devem ser realizadas sob uma armário com o equipamento de proteção pessoal adequado de biossegurança.
- Disperse a 1 mL de amostras de secreção das vias respiratórias em 9 mL de tampão fosfato salino (PBS) utilizando uma seringa de plástico de 10 mL (para uma diluição de 10 x). Use uma pipeta contundente para homogeneizar a amostra de muco.
- Coe o diluente com um coador de célula de nylon de 40 µm para remover pedaços grandes ou coágulos de sangue, que pode bloquear o canal ou o furo de acesso microfluídica. Coloque a amostra no gelo após o processamento.
- Disperse o diluente de cada amostra utilizando um volume de 100 x de tampão PBS, resultando em um 1.000 x suspensão diluída. Coloque a amostra no gelo durante a operação inteira da dissociação.
4. experimental Setup
Nota: Todas as experiências devem ser realizadas sob uma armário com o equipamento de proteção pessoal adequado de biossegurança.
- Monte o chip PDMS com o fluido guia para aplicar fluxo uniforme para cada um dos microcanais quatro espiral (figura 1B).
Nota: Quatro canais foram usado para aumentar a taxa de transferência por paralelização, bem como a otimização da densidade volume e célula da suspensão resultante. O guia do fluido é projetado e feito com uma impressora 3D tipo de estereolitografia com resina transparente. A entrada e a porta de saída do fluido guia usam conectores Luer fêmea para facilidade de conexão e selagem estável durante a operação. - Ligue um conector Luer macho de 1/16 de polegada para a entrada da tomada da parede interna (IW) e a abertura de saída de parede exterior (OW) do guia de fluido e um tubo de silicone para suspensão da amostra.
- Inserir dicas contundente para cada extremidade da entrada e saídas para atingir o fundo do reservatório de amostra.
- Conecte a bomba peristáltica com a tubulação de entrada.
- Coloque a extremidade da tubulação de entrada e tubulação de saída de IW no reservatório de amostra e coloque a extremidade do tubo de saída OW no reservatório de resíduos (Figura 1, D).
- Coloca o tubo de 50 mL de PBS filtrada sem cálcio e magnésio no reservatório de amostra.
- Comece a bombear em uma baixa taxa de fluxo (~ 1 mL/min) para aprontar o dispositivo.
Nota: Quando as bolhas são capturadas no canal, empurre a parte superior do canal com a pinça para desestabilizar e eliminar as bolhas de ar. Quando o dispositivo é totalmente preenchido com solução tampão, mude o tubo de PBS para preparar o tubo de amostra de secreção das vias respiratórias. - Quando a amostra é colocada no reservatório de amostra, ligar a bomba peristáltica e definir a taxa de fluxo em 4 mL/min (Figura 1, D).
- Quando o volume de amostra atinge o volume designado (~ 1 mL), pare a operação e desconecte o tubo do silicone.
Nota: O método proposto é mais eficiente em reduzir um grande volume de diluente (> 50 mL) em um volume do microtubo (~ 1 mL) (Figura 2).
5. fluxo Cytometry Analysis
Nota: Para comparar os métodos de dissociação (microfluídica e Lise), citometria de fluxo com imunofluorescência foi usada.
- Adicionar o isotiocianato de fluoresceína (FITC) - anticorpo monoclonal de rato conjugado anti-humano CD66b e allophycocyanin (APC) - rato anti-humano CD45 anticorpo monoclonal para as suspensões iniciais (passo 3.3) e suspensões resultantes (etapa 4.9) (200 µ l de conjugado de cada anticorpo) na proporção de 01:25 v/v.
- Incube as amostras a 4 ° C, no escuro por 30 min.
- Analise as duas amostras em um citômetro de fluxo para quantificar o PMN.
Nota: A população que é positivo duplo FITC-APC, CD66b positivo e CD45 positivo foi considerada neutrófilos. Recuperação foi calculada pelo quociente do número total de célula da entrada e a suspensão resultante.
6. análise de lançamento NE
Nota: Para comparar a funcionalidade de isolados dos neutrófilos pelo método microfluídica e lise, um kit de ensaio NE foi usado.
- Adicionar PMA (fornecido no kit de ensaio) para cada suspensão resultante (obtido na etapa 4.9) a uma concentração final de 50 nM.
- Incube as amostras a 37 ° C por 2 h.
- Centrifugar as suspensões em 300 x g durante 10 minutos.
- Transferi 10 µ l de cada sobrenadante para uma placa de 96 poços (fornecida no kit de ensaio).
Nota: Uma microplaca de 96 poços, com um fundo plano e poliestireno preto pode ser usada também. - Adicione 90 µ l de tampão diluído ensaio (fornecido no kit de ensaio) a cada poço.
- Adicione 10 µ l de substrato a elastase (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, fornecido no kit de ensaio).
- Incubar durante 1,5 h a 37 ° C.
- Leia a placa de 96 poços, usando um dados um comprimento de onda de excitação de 485 nm e um comprimento de onda de emissão de 525 nm.
Nota: O nível de NE foi dividido pela contagem de PMN, a partir da análise de citometria de fluxo.
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Representative Results
Atingimos o transparentes imune-pilha suspensões com ambos dissociação de mucolysis e microfluídica DTT (Figura 3A). Dissociação de microfluídica coletados 4,40 x 105 PMN em média (2.1 x 104 para 5,60 x 105 PMN, n = 6) de vias aéreas secreção amostras diluídas 1,000-fold (volume total de 50 mL) em 1 mL de suspensão limpo. Em comparação com o diluente inicial, 94,0% PMN (CD66b+/CD45+) foram recuperados em um pequeno volume, consistentemente ao longo de 6 amostras clínicas. No entanto, o método de mucolysis DTT mostrou uma recuperação de 53,5% em média com variações significativas de amostra-de-amostra (30,8-96,0%) (Figura 3B).
Em seguida, a liberação de elastase foi examinada com um kit de ensaio NE comercial como um prova de conceito. Sem estímulo externo, a amostra preparada pelo método mucolítico mostrou uma NE maior nível do que a amostra do método microfluídica. PMA foi adicionado para as suspensões resultantes da microfluídica e métodos de dissociação mucolítico para desencadear a liberação de NE. Testamos cada método com amostras de secreção das vias aéreas de 6 pacientes diferentes. Células do sistema imunológico separadas com microfluídica apresentaram funcionalidade intacta, mostrando um aumento da quantidade de NE lançar pela estimulação do PMA. Por outro lado, células, elaboradas pelo método de dissociação mucolítico mostraram um aumento inconsistente de lançamento NE (Figura 3).
Figura 1: espiral microfluidic configurações de dispositivo e experimentais. Imagens de fotografia de microfluídica de espiral (A) e (B), o dispositivo montado com o adaptador fluídico. (C) diagrama esquemático da separação de loop fechado usando espiral microfluídica inercial. Recirculando o fluxo de partículas/célula concentrado (tomada de IW) volta para o reservatório de amostra original, células imune-relacionados foram concentradas em um pequeno volume enquanto o fluido de fundo contendo agregados de mucina e hemácias menores foram continuamente removido através do tubo de resíduos conectado à tomada OW. (D) instalação Experimental e a imagem fluorescente de uma partícula de 10 µm, a trajetória (verde) e a saída do canal espiral (superior direito). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: diagrama esquemático da preparação de amostras de secreção das vias aéreas usando loop fechado inercial microfluídica. Clinicamente induzida a secreção das vias respiratórias dispersada mecanicamente em volume de x 1.000 de solução-tampão. O diluente é concentrado por microfluídica, resultando em ~ 1 mL de suspensão de células com o fundo claro. Adaptado com permissão de Ryu et al, Copyright de American Chemical Society (2017)17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: comparações representativas do método mucolítico TDT para o método de dissociação microfluidic. Secreções traqueais (A) da amostra (esquerda) e imagem microscópica após a dissociação microfluidic. (B) a imagem fotográfica das suspensões originais e resultantes. (C) comparação das taxas de recuperação PMN entre os métodos mucolítico e microfluídica. (D) comparação de NE liberação de neutrófilos separados pelo microfluídica e TDT mucolítico métodos antes e após a estimulação de PMA. Lançamento NE significativamente foi desencadeado pela PMA da amostra de separação microfluidic (p < 0,0001). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Em microfluídica inercial, partículas e células localiza-se em uma certa posição lateral em um micro-channel baseado em seu tamanho5,18,19,20. Devido ao efeito combinado do reitor arrastar a força e a força inercial elevador na curva microchannel, partículas grandes ou neutrófilos (> 10 µm) estão localizados dentro do canal e pequenas partículas, agregados de muco e detritos menor que 6 µm são posicionados fora o canal em certa velocidade de fluxo condições10,11,13,14.
No entanto, há um trade-off entre a concentração e a recuperação da separação quando usando microfluídica, especialmente quando a escala do tamanho de separação da partícula ou a célula de interesse sobrepõe-se com outras células/partículas. Para alcançar uma alta concentração de células e partículas classificadas, o intervalo de separação precisa ser estreita e requer um ajuste fino com observação microscópica para executar cada amostra; Isso limita o uso de microfluídica inercial na biometria heterogênea, tais como as secreções das vias respiratórias.
Aqui, apresentamos um método de preparação de amostra de secreções clínico das vias aéreas para ensaios em vitro usando microfluídica inercial de circuito fechado (figura 1B, C). A operação de loop fechado por recirculação da partícula/célula através de uma tomada de focagem alcançado tanto fatores de alta concentração e taxas de recuperação alto. Saída do OW flui para o tubo de resíduos, e a saída de IW é alimentada continuamente para o tubo de amostra original. As células maiores que 10 µm de diâmetro permanecem no tubo de amostra inicial, assim, aumentando a densidade celular da amostra, enquanto o líquido do fundo é eliminado para o tubo de resíduos. A taxa de diluição elevada permite afastamento do líquido do fundo, incluindo os restos e muco. Além disso, independentemente da condição da amostra do paciente, o método proposto pode uniformemente dissociar e isolar as células imunes.
TDT é uma lise de mucina amplamente utilizado que cliva ligações dissulfureto em proteoglycan agregação para separar o conteúdo da célula a mucilagem1,21,22. No entanto, TDT declaradamente interfere com os antígenos de superfície de células brancas do sangue, que podem afetar a função de leucócitos2. Em nosso estudo, o conteúdo celular recuperado pela dissociação de TDT eram inconsistente através de amostras, por causa de não-uniforme eficiência mucolítico e entupimento do filtro. Isso se torna mais crítico para a preparação de amostras iniciais com volumes pequenos e amostras de secreção das vias aéreas relativamente grossa. Por outro lado, o método usando microfluídica habilitado a recuperação consistente do conteúdo da célula em amostras de pacientes heterogêneos (Figura 3). Como mostrado na Figura 3B, pudéssemos isolar consistentemente o conteúdo da célula da secreção de vias aéreas em um buffer limpa independentemente do estado de amostra original, ou seja, sangrento, tenaz ou aguado. Em comparação com o método convencional, o método proposto tem menos detritos na amostra recuperada, o que minimiza possíveis interferências de detritos em análises bioquímicas a jusante.
Lançamento NE foi examinado para avaliar a integridade funcional dos neutrófilos capturados por ambos os métodos de enriquecimento (Figura 3D). Os neutrófilos remover estrangeiros moléculas orgânicas através de NE versão23,24,25. PMA é comumente usado para ativar os neutrófilos em vitro26. Células isoladas pela microfluídica e os métodos (TDT) mucolítico foram estimuladas com 50 nM de PMA. Nós testamos cada método com amostras de secreção de via aérea humana (rotuladas como P173, P174, P176, P177, P181 e P182). Amostras de concentrados por microfluídica mostraram um aumento no NE pela estimulação do PMA para todas as 6 amostras. Em contraste, apenas 3 das amostras TDT Tratado podem induzir aumento da atividade NE após estimulação de PMA. Além disso, os neutrófilos isolados pelo método mucolítico TDT mostraram muita actividade de base maior do que os neutrófilos isolados por microfluídica. Estes resultados mostraram possível distúrbio químico da maquinaria NE, ou seja, perturbação da superfície limite antígeno2,3, que sugere que o método de microfluídica é um método de melhoria em termos de preservação do função dos neutrófilos de homogeneização de TDT. O método de dissociação proposto também opera de forma automática e totalmente contida, minimizando a exposição de amostras de doentes com perigos potenciais do ambiente externo.
No entanto, o método proposto requer uma taxa de fluxo elevada e, portanto, uma conexão estável e fluídico. Também, devido à flutuação inerente da bomba peristáltica de circulação, a dimensão de tomada de IW deve ser maior que a dimensão de tomada OW, caso contrário a taxa de transferência pode ser comprometida. Esperamos que o método proposto proporcionará maior rendimento se houver uma bomba de circulação que pode fornecer uma taxa de fluxo mais estável.
Ao fornecer um protocolo de dissociação para capturar os neutrófilos de secreções de vias aéreas clínica, o método apresentado neste estudo é esperado para expandir o escopo de pesquisa clínica em doenças respiratórias, como pneumonia, asma, fibrose cística e crônica doença pulmonar obstrutiva.
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Disclosures
Os autores entraram com um pedido de patente na tecnologia descrita aqui.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo NIH/NIAID (R21AI119042) bem como o programa de ensaio NIH U24 amostra poupadores (U24-AI118656).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PDMS precursor | Dow corning | 184 SIL ELAST KIT 3.9KG | 10:1 ratio of base and curing agent |
| VWR gravity convection oven | VWR | 414005-128 | PDMS precursor to be cured in 90 deg. |
| 100mm petri dish | VWR | 89000-324 | Fabrication of PDMS Supporting layer |
| Harris Uni-core puncher | Sigma-aldrich | WHAWB100076 | 2mm diameter or other depending on the tubing size |
| Air plasma machine | Femto Science | Cute | Surface plasma treatment for PDMS device to bottom base. |
| 2” x 3” glass slide | TED PELLA, INC. | 2195 | To support PDMS device |
| Masterflex spooled platinum-cured silicone tubing, L/S 14 | Cole-Parmer | EW-96410-14 | Tubing for microfluidics and peristlatic pump |
| 1/16 inch Luer connector, male | Harvard apparatus | PC2 72-1443 | Connector for fluid guide |
| 50mL Falcon tube | Corning | 21008-940 | sample collection & preparation |
| Phosphate-Buffered Saline, 1X Without Calcium and Magnesium | Corning | 45000-446 | Buffer solution to dilute sample |
| Halyard Closed suction Catheter, Elbow, 14F/ channel 4.67mm | HALYARD HEALTH | 22113 | Tracheal seceation suction catheter |
| 0.9% Sterile Normal saline, 10mL pre-filled syringe | BD PosiFlush | NHRIC: 8290-306547 | For tracheal seceation collection from the patients |
| SecurTainer™ III Specimen Containers, 20mL | Simport | 1176R36 | Sterile sputum (airway secretion) collection container |
| Syringe with Luer-Lok Tip, 10mL | BD | BD309604 | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube |
| BD Blunt Fill Needle, with BD Luer-Lok Tip | BD | To pipette homogenize the mucus sample and reach the bottom of sample tube | |
| 40µm nylon cell strainer | Falcon | 21008-949 | To remove large chunk or blood clots, which can block the microfluidics access hole or the channel. |
| Peristaltic pump (Masterflex L/S Digital Drive) | Cole-Parmer | HV-07522-30 | operation of microfluidics |
| BD LSR II flow cytometer | BD Bioscience | LSR II flow cytometer | Quantification of cell recovery ratio |
| Fluorescein isothiocyanate (FITC)-conjugated mouse anti-human CD66b monoclonal antibody | BD Bioscience | 561927 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Allophycocyanin (APC)-conjugated mouse anti-human CD45 monoclonal antibody | BD Bioscience | 561864 | Immunostaining of neutrophils for Flow cytometer analysis |
| Plate reader | Thermo Fisher scientific | Varioskan | Plate reader for neutrophil elastase assay, ex485/em525 |
| Neutrophil elastase assay kit | Cayman Chemical | 600610 | Neutrophil functionality assessment |
| Fluoresbrite YG Microspheres 10.0µm | PolyScience, Inc. | 18140-2 | Fluorescent particles to express white blood cell trajectory in microfluidics |
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