Summary
本协议描述了大鼠的手术迷路切除术, 是研究前庭系统的有效方法。
Abstract
为了研究前庭系统或前庭代偿过程, 已经开发了一些方法来引起前庭损伤, 包括手术或化学迷路切除术和前庭神经切断术。手术迷路切除术是一种相对简单、可靠、快速的方法。本文介绍了大鼠迷路切除术的手术技术。耳后切开术在全麻下进行, 以暴露外耳道和鼓膜, 在无镫的情况下, 鼓膜和听骨被取出。镫动脉位于镫和椭圆形窗口之间, 是一种脆弱的结构, 必须保留以获得明确的手术领域。一个孔 fenestrate 的前庭是由一个2.1 毫米的钻头, 比镫。然后, 100% 乙醇注射通过这个孔和吸气几次。显微镜下细致的解剖和细致的出血控制是获得可靠结果的必要条件。手术后立即看到前庭丢失的症状, 如眼球震颤、头部倾斜和滚动运动。rotarod 或旋转椅试验可用于客观、定量地评价前庭功能。
Introduction
前庭器官对平衡和眼睛控制是必不可少的。正常的前庭功能取决于两个内耳内前庭器官的对称传入信号。前庭虚或丢失诱发头晕、眼球震颤和体位失衡。急性损伤后, 前庭功能在几天内自发恢复, 这个过程称为前庭补偿1,2。前庭补偿的静态缺陷是一个恢复的过程中与自然休息活动的不平衡的同侧前庭核。动态缺陷的前庭补偿主要实现通过感官和行为替换 (使用视觉或体感输入)3。这些过程对神经可塑性研究有吸引力4,5。
在前庭代偿过程中, 研究了前庭系统和神经可塑性的机制, 如外科和化学迷路切除术和前庭神经切断术 5, 6 ,7,8。前庭神经切断术是一种诱导完全前庭丢失的方法, 但它是一个更困难和侵入性的程序, 可能诱发脑损伤8, 9.这种方法需要更大的手术技巧和花费更多的时间比迷路切除术。包括庆大霉素、arsanilate 和丁卡因在内的化学迷路切除术更容易, 并能产生可靠的结果10, 11, 12.然而, 耳蜗也可能受损, 前庭丢失可能会随着时间的推移而发展11。此外, 化学物质对大脑的影响, 应该保留, 以准确评估, 是不清楚的。外科迷路切除术首次在1842年的动物研究中被引入15, 并在1936年16 的大鼠中首次报告。该技术已用于许多动物研究5,17,18,19。外科迷路切除术是一种特定的、可靠的、相对简单的方法。13,14此外, 术后立即看到前庭损伤的症状。在这里, 我们描述了我们的手术技术的大鼠迷路切除术。
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Protocol
这项研究是按照首尔国立大学医院 (14-0148-C1A1) 的机构动物护理和使用委员会的规定进行的, 由实验室动物护理评估和鉴定协会认证。国际。
注: 对 7-8 周龄 (200/250 克) 大 (SD) 雄性大鼠进行实验。实验开始前1周, 每只动物都适应实验室的条件。这些动物被安置在温度和湿度控制的房间里, 有一个恒定的12小时:12 小时的光: 黑暗的循环, 免费获得食物和水。
1. 迷路切除术
- 用无菌垫覆盖蒸压手术器械。用70% 乙醇消毒操作区域。在手术期间使用不育的悬垂和保持不育的条件。
- 穿长袍, 面具 (捂住鼻子和嘴巴), 盖 (盖头), 和一副不育的手套。手术器械必须与无菌表面接触。
- 注射 tiletamine-zolazepam 麻醉 (40 毫克/千克体重) 肌肉到大腿内侧或腹腔, 甲苯噻嗪 (10 毫克/千克体重) 肌肉或腹腔。
注: 其他全麻方式, 包括异氟醚吸入, 也可使用。 - 把老鼠放在暖和的垫子上 (最初设置在42摄氏度)。将润滑剂眼膏应用于大鼠双眼, 防止麻醉时眼部干燥。
- 把老鼠放在右手边。在手术区用发剪刀刮毛。用70% 乙醇消毒现场。
- 注射1% 盐酸利多卡因皮入左耳后区。
- 使用手术刀刀片 #15, 做一个〜5.0 厘米耳后切口。将肌肉和筋膜分开, 用虹膜剪刀将外部听觉管暴露出来 (图 1A)。使用刀片 #15 或虹膜剪刀稍微打开外部听觉通道 (图 1B)。广泛暴露鼓膜 (图 2A)。
- 在显微镜下 (7.5X 或 12.5X) 下, 用镊子除去鼓膜和听骨, 镫除外。用刀片 #15 或虹膜剪刀将水环脊上的肌肉分离 (图 2B)。
- 使用一个钻头在低速 (< 3000 rpm) 与钻石 (2.1 或1.4 毫米), 钻鼓膜泡骨周围的出口点面神经 (图 3A)。确定 stapedial 动脉。注意不要在钻孔过程中损伤 stapedial 动脉。
- 继续钻孔优于 stapedial 动脉的前庭, 暴露圆窗和骨侧半圆管。在壶腹附近打开侧半圆管。继续在半圆管的平面上钻孔, 钻上半圆形运河的壶腹。
- 用18克或22克针吸入前庭的内容。注入并吸入1厘米3 100% 乙醇3x。
- 闭合的肌肉和皮肤在两个层次的简单打断缝合。
- 不要让动物无人看管, 直到它恢复了足够的意识来维持胸骨卧床。保持鼠暖, 直到它唤醒使用加热垫或热灯。觉醒后, 把老鼠移动到一个单独的笼子里, 在一个有通常环境条件的房间里。
- 根据需要管理抗生素 (例如, Cefazoline 20 毫克/千克, 甲氧苄西林磺酰胺100µL 皮下, 或青霉素 30万);止痛药 (不是阿片类药物;例如, 也可以给出 Metacam 2 毫克/千克, 卡洛芬5毫克/公斤皮下)。
2. 假手术
- 对于假手术作为控制, 执行相同的外科手术和术后手术 (如1节), 包括外部听觉管和鼓膜 (步骤 1.7) 的暴露, 鼓膜和听骨的去除, 以及水环脊上的肌肉支队 (步骤 1.8), 但不要打开半圆管或注射乙醇。
3. 检查前庭功能的丧失
注意: 前庭功能的丧失可以使用行为或前庭功能测试来评估。13,17,18行为测试包括对体位不对称和眼球震颤的评估。
- 确定体位不对称, 包括自发或诱发滚转, 下降到左侧, 或左右移动, 而倾斜向损伤侧18。请参阅视频 1。
- 通过视觉检查自愿眼球运动来识别眼球震颤。当自发眼球震颤不在静止状态时, 在动物的头上轻轻地吹空气18。请参阅视频 2。
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Representative Results
手术的成功由行为测试证实。所有动物都表现出单侧前庭功能丧失的典型行为。自发滚轧在手术后立即明显, 是由头部的空气粉扑引起的, 或者是在早期恢复阶段 (视频 1) 轻触身体。3 d 手术后, 动物们绕着损伤的一侧移动, 偶尔会落到左边。自发眼球震颤观察在 2 d (录影 2)。在3维内观察诱发眼球震颤。
手术通常需要 < 30 分钟。在50次手术过程中, 2 只老鼠在手术期间死亡, 3 人在术后 1 d。总体而言, 损失率为 10% (5 例在50次手术期间死亡)。所有的死亡都是由于 stapedial 动脉受伤造成的。我们注意到1周内没有延迟死亡和感染。手术后的几天, 大鼠的口腔摄取量和体重下降都很糟糕。
图 1: 左耳的耳后切口.(A) 耳后切口, 在颞肌 (*) 和 sternomastoid 肌 (†) 之间发现面神经 (↑)。(B) 然后, 外部听觉渠道 (↑) 被轻微地打开了, 并且外在耳朵的软骨从锥体骨头分离了。刻度条2毫米适用于所有面板。请单击此处查看此图的较大版本.
图 2: 暴露前庭的骨壁.(A) 在打开外部听觉管后, 在鼓膜下面看到锤骨 (*)。(B) 在鼓膜和听骨切除后 (镫除外), 人工耳蜗海角 (*) 被识别, 水环脊上的肌肉升高 (†)。刻度条2毫米适用于所有面板。请单击此处查看此图的较大版本.
图 3: 前庭开窗.(A) 在鼓膜后侧壁切除后, 面部神经的出口点周围的骨骼被钻孔。stapedial 动脉 (↑) 和圆的窗口 (Δ) 在耳蜗海角之上 (*) 被暴露了。(B) 在外侧前庭钻孔后, 半圆形运河的壶腹在前庭残余物中明显可见 (↑), 如耳蜗海角的下位位置 (*)。刻度条2毫米适用于所有面板。请单击此处查看此图的较大版本.
视频1。自发桶滚动。迷路切除术 2 d 的 SD 大鼠先前显示自发的桶状滚动。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载)
视频2。自发眼球震颤。迷路切除术 2 d 的 SD 大鼠曾出现自发性眼球震颤。请单击此处查看此视频。(右键单击可下载)
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Discussion
这项技术是一个有效的方法, 以创造突然, 永久性, 完整的前庭功能损失。这可以用来研究前庭病理, 如前庭神经炎, 声学肿瘤和梅尼埃的疾病。许多研究已经使用这种技术来研究前庭细胞核的神经元可塑性或相关的中心进程5,17,18,19。
最关键的步骤为成功的手术是 1) 保存的 stapedial 动脉, 2) 仔细钻孔的准确位置, 和 3) 细致出血控制。大耳后切口可引起大的外部伤口, 这会扰乱治疗侧的腿部运动。然而, 一个小切口限制手术领域和导致手术采取更长的时间。正确的撤回对于保持足够的手术视图13至关重要。耳后切口后, 面神经可在泡上方和二腹肌肌与胸锁乳突肌之间进行鉴别, 并在前相接的面上运行。耳后动脉和大耳神经向相反方向运行。任何损伤的面神经导致面部麻痹的手术后。为了达到更广泛的手术视野, 避免镫动脉损伤, 我们更倾向于切除上级外听觉管壁, 然后接近镫动脉17,19。与延髓方法相比, 这种方法与更大的感染风险相关联, 这不表现为打开外部听觉管壁或去除鼓膜 (这会使中耳暴露在外部环境)。根据我们的经验, 长期后遗症 (一般动物的表现, 它的喂养和饮用习惯, 恢复体重增加, 和感染状态) 没有明显的差异, 动物之间的 transtympanic 方法这里描述和延髓方法17,20。打开泡会损伤附着的肌肉, 有时会导致一些出血。在大鼠中, 镫动脉交叉靠近前庭开窗的部位。然而, 在人类胚胎发生过程中, 镫动脉消失。当手术范围狭窄时, 控制出血不容易, 田间可以快速填充血液。为了避免这种情况, 一些作者在镫的动脉中凝固了。虽然它的作用不明确, 一些作者不喜欢凝聚镫动脉14 , 因为它可能提供内耳, 中枢神经系统 (膝上 lemniscus, 和梯形体), 和面神经在大鼠14 ,21。如果出血发生, 我们用小棉签压缩动脉, 然后使用足够的吸入电凝固。
小的毛刺对于在前庭上做一个洞很有用。小钩或针可以用来代替毛刺。机械钻削系统会导致较少的开窗损伤, 并有助于取得一致的结果。没有乙醇灌溉, 我们观察了迷路切除术13、17之后的变量行为响应.乙醇灌溉和抽吸确保迷宫的末期损坏。13前庭神经的钝电凝聚可以执行通过此孔22。适当的放大是必不可少的, 显微镜是强制性的, 在大多数情况下。
迷路切除术中内耳也被破坏, 导致耳聋。没有办法保护内耳安全。化学迷路切除术可以保持动物的听觉, 但会产生可变结果8。前庭神经切断术也会对耳蜗神经造成损伤8。为了在对照组进行假手术, 我们去除了鼓膜和听骨没有镫, 导致轻度传导性听力没有任何前庭损伤13。
可以使用几种行为和前庭功能测试来确认迷路切除术已成功执行13、14.在手术后, 眼睛的偏斜偏差可以被观察到。从麻醉后恢复, 自发眼球震颤, 滚动运动, 头部倾斜可以看到。通过尾部挂起旋转是最可靠的测试17,20。这些赤字在几天内恢复缓慢17,20。自发眼球震颤, 快速运动到对侧侧将消失在 3-4 d 后的程序。头倾斜将保持几个月。前庭功能测试 (如旋转椅测试或 rotarod 测试) 可以提供更客观和定量的数据23,24。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
这项研究得到了韩国卫生技术 & 发展研究所 (KHIDI) 的资助, 由大韩民国卫生部 & 福利部提供资金 (赠款号: HI15C2651)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASPIRATOR KB-012 | KOH BONG & CO., LTD. | KB-012 | Medical aspirator |
| Blade: #15 | Fine Science Tools | #10015-00 | Blades for #7 Scalpel Handles, #15 |
| Carbon Steel Burrs | Fine Science Tools | #19007-05 | shaft diameter: 2.3 mm, length: 44 mm, package of 10 burrs |
| Carl Zeiss Surgical GmbH | Carl Zeiss | #6627100863 | Surgical microscope |
| Dumont #3c | Fine Science Tools | #11231-20 | Standard tip 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | #11252-00 | |
| Dumont #7B | Fine Science Tools | #11270-20 | Serrated 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Extra Fine Bonn: straight | Fine Science Tools | #14084-08 | Iris scissors, best suited for microdissection under high magnification |
| Fine Iris Scissors: straight | Fine Science Tools | #14094-11 | Made from martensitic stainless steel, combined with molybdenum and vanadium |
| Finger Loop Ear Punch | Fine Science Tools | #24212-01 | 1 mm. Provides stability and control for researchers using the numbering system |
| Hartman | Fine Science Tools | #13002-10 | Tip width: 1 cm, serrated, 10 cm |
| Short Scalpel Handle #7 Solid | Fine Science Tools | #10003-12 | #7 short, 12 cm |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | #18000-03 | Replacement tip, straight knife, keeps bleeding to a minimum and therefore provides a surgical field clear of clamps and hemostats |
| Strong 207S | SAESHIN | 207S | Powerful torque at low speed, available with speed or on/off foot controller |
| Suction Tubes | JEUNGDO B&P CO., LTD. | H-1927-8 | Frazier, 18 cm |
| VICRYL | ETHICON | W9570T | Synthetic absorbable sterile surgical suture |
| Weitlaner-Locktite | Fine Science Tools | #17012-13 | Maximum spread: 4.5 cm, 2 x 3 blunt teeth, 11 cm |
| Zoletil | Virbac, France | Tiletamine-zolazepam | |
| Rompun | Bayer | Xylazine | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Septra | Pfizer | Trimethoprim-sulfonamide |
References
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