Summary
Dieses Protokoll beschreibt die chirurgische Labyrinthectomy einer Ratte, die eine nützliche Methode für das Studium des vestibulären Systems ist.
Abstract
Das vestibuläre System oder den vestibulären vergütungsprozess studieren, haben eine Reihe von Methoden entwickelt, um vestibulären Schäden, einschließlich der chirurgischen oder chemische Labyrinthectomy und vestibulären Neurectomy verursachen. Chirurgische Labyrinthectomy ist eine relativ einfache, zuverlässige und schnelle Methode. Hier beschreiben wir die Operationstechnik für Ratte Labyrinthectomy. Ein postauricular Schnitt erfolgt unter Vollnarkose zu entlarven, den äußeren Gehörgang und das Trommelfell, wonach das Trommelfell und die Gehörknöchelchen ohne die Steigbügel entfernt sind. Die Steigbügel Arterie, die sich zwischen den Steigbügel und des ovalen Fensters befindet, ist eine gefährdete Struktur und muss bewahrt werden, um eine klare OP-Feld zu erhalten. Ein Loch, fenestrate erfolgt das Vestibül mit einem 2,1-mm-Bohrer Bohrer überlegen die Steigbügel. Dann ist 100 % Ethanol durch dieses Loch eingespritzt und mehrmals abgesaugt. Sorgfältige Dissektion unter einem Mikroskop und sorgfältiger Blutstillung sind unerlässlich, um zuverlässige Ergebnisse zu erhalten. Symptome des vestibulären Verlust, wie Nystagmus, Kopf kippen und eine Rollbewegung, sind unmittelbar nach der Operation zu sehen. Der Rotarod oder Rotation-Stuhl-Test kann verwendet werden, um Objektiv und quantitativ die vestibuläre Funktion bewerten.
Introduction
Die vestibuläre Organ ist unerlässlich für Gleichgewicht und Auge. Eine normale vestibuläre Funktion hängt symmetrisch afferenten Signale aus der vestibulären Organe in den zwei inneren Ohren. Vestibuläre Unterfunktion oder Verlust induziert Schwindel, Nystagmus und Haltungs-Ungleichgewicht. Nach einer akuten Schädigung erholt sich die vestibuläre Funktion spontan innerhalb weniger Tage ein Prozess genannt vestibulären Kompensation1,2. Die vestibuläre Kompensation der statischen Defizite ist ein Prozess der Genesung, die im Zusammenhang mit dem Ungleichgewicht der spontanen ruheaktivität zwischen der ipsilateralen und kontralaterale vestibuläre Kerne. Die vestibuläre Kompensation der dynamischen Defizite erfolgt hauptsächlich über sensorische und Verhaltensstörungen Substitutionen (mit visuellen oder somatosensorische Eingänge)3. Diese Prozesse sind attraktiv für neuronale Plastizität Studien4,5.
Eine Reihe von Methoden wurden entwickelt, um das Gleichgewichtsorgan und die Mechanismen zugrunde liegenden neuronalen Plastizität während vestibuläre Kompensation, wie chirurgische und chemische Labyrinthectomy und vestibulären Neurectomy5,6 studieren ,7,8. Vestibulären Neurectomy ist gewissermaßen vestibulären Totalverlust zu induzieren, aber es ist ein schwieriger und invasive Verfahren und kann verursachen Hirnschäden8,9. Diese Methode erfordert größere chirurgische Geschick und dauert länger als Labyrinthectomy. Chemische Labyrinthectomy einschließlich Gentamycin, Arsanilate und Tetracaine, ist einfacher und kann liefern zuverlässige Ergebnisse10,11,12. Jedoch die Cochlea beschädigt werden und vestibulären Verlust kann entwickeln im Laufe der Zeit11. Darüber hinaus sind die Auswirkungen von Chemikalien auf das Gehirn, die für die genaue Auswertung erhalten werden soll, ist unklar. Chirurgische Labyrinthectomy wurde erstmals in tierexperimentellen Studien in 184215 und wurde zuerst bei der Ratte in 193616berichtet. Diese Technik wird inzwischen in vielen Tier-Studien5,17,18,19. Chirurgische Labyrinthectomy ist eine spezifische, zuverlässige und relativ einfache Methode. 13 , 14 im übrigen, die Symptome der vestibulären Schäden gelten unmittelbar nach der Operation. Hier beschreiben wir unsere OP-Technik für Ratte Labyrinthectomy.
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Protocol
Diese Studie wurde durchgeführt, im Einklang mit den institutionellen Animal Care und Verwendung Ausschuss der Seoul National University Hospital (14-0148-C1A1), die von der Vereinigung für die Begutachtung und Akkreditierung of Laboratory Animal Care akkreditiert ist International.
Hinweis: Die Experimente wurden an Sprague-Dawley (SD) männlichen Ratten von ca. 7-8 Wochen alt (200/250 g) durchgeführt. Jedes Tier wurde bis 1 Woche vor Beginn des Experiments Laborbedingungen akklimatisiert. Die Tiere lebten in einem Raum Temperatur und Feuchtigkeit kontrolliert mit einer Konstanten 12-H:12-h hell: Dunkel-Zyklus mit freiem Zugang zu Nahrungsmitteln und Trinkwasser.
1. Labyrinthectomy
- Decken Sie die autoklaviert chirurgische Instrumente mit einem sterilen Pad. Im OP-Bereich mit 70 % Ethanol zu desinfizieren. Verwenden Sie ein steriles Tuch und erhalten Sie sterile Bedingungen während der Operation zu.
- Eine Kleid zu tragen, Maske (zur Abdeckung Nase und Mund), Kappe (Kopfbedeckung), und ein paar sterile Handschuhe. Die chirurgischen Instrumente darf nur mit sterilen Oberflächen in Berührung kommen.
- Injizieren von tiletamin-Zolazepam Betäubung (40 mg/kg Körpergewicht) intramuskulär in den medialen Oberschenkel oder intraperitoneal, und Xylazin (10 mg/kg Körpergewicht) intramuskulär oder intraperitoneal.
Hinweis: Andere Formen der Vollnarkose, einschließlich Isofluran Inhalation können auch verwendet werden. - Legen Sie die Ratte auf eine Erwärmung (anfänglich bei 42 ° C). Beide Augen der Ratte, Augentrockenheit unter Narkose zu verhindern zuweisen Sie Schmiermittel Augensalbe.
- Legen Sie die Ratte auf der rechten Seite. Das Fell im Operationsbereich mit Haarschneidemaschinen zu rasieren. Desinfizieren Sie die Website mit 70 % Ethanol.
- Injizieren Sie 1 % Lidocain Hydrochlorid in der linken retroaurikulärer Bereich subkutan.
- Mit einem Skalpellklinge #15, machen Sie einen ~5.0 cm retroaurikulärer Schnitt. Trennen Sie den Muskel und Faszie, die äußeren Gehörgang mit Iris-Schere (Abbildung 1A) verfügbar zu machen. Öffnen Sie leicht den äußeren Gehörgang mit der Klinge #15 oder die Iris-Schere (Abbildung 1 b). Setzen Sie häufig das Trommelfell (Abbildung 2A).
- Unter dem Mikroskop (7,5 X oder 12,5 X) das Trommelfell und die Gehörknöchelchen mit Ausnahme der Steigbügel, mit der Pinzette zu entfernen. Lösen Sie die Muskeln auf dem Lambdoidal Grat mit der Klinge #15 oder die Iris-Schere (Abb. 2 b).
- Mit einem Bohrer mit niedriger Drehzahl (< 3000 u/min) mit einem Diamantschleifer (2.1 oder 1,4 mm) Bohren die Mittelohrchirurgie Bulla Knochen um den Punkt des Ausganges des Nervus facialis (Abb. 3A). Die stapedial Arterie zu identifizieren. Achten Sie darauf, nicht um die stapedial Arterie während des Bohrens zu beschädigen.
- Weiter Bohren das Vestibül der stapedial Arterie überlegen und das runde Fenster und die knöchernen Seitenkanal Semicircular aufdecken. Öffnen Sie den Seitenkanal Semicircular in der Nähe der Ampulle. Weiter in der Ebene der Seitenkanal Semicircular Bohren und Bohren der Ampulle des überlegenen Semicircular Kanals.
- Aspirieren Sie der Inhalt der Vorhalle mit einer 18-G oder 22 G Nadel. Spritzen und Aspirieren Sie 1 cm3 100 % Ethanol 3 X.
- Schließen Sie die Muskeln und die Haut in zwei Schichten mit einfachen unterbrochenen Nähten.
- Nicht unbeaufsichtigt lassen ein Tier bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat. Halten Sie die Ratte warm, bis es erwacht mit einem Heizkissen oder eine Wärmelampe. Nach dem Erwachen, bewegen Sie sich die Ratte zu einem einzelnen Käfig in einem Raum mit den üblichen Umgebungsbedingungen.
- Verwalten von Antibiotika (z.B., Cefazoline 20 mg/kg, Trimethoprim-Sulfonamide 100 µL subkutan, oder Penicillin 300.000 IU) Bedarf an Tag 1; Analgetikum (kein Opioid; z.B., Allgemeinbefinden 2 mg/kg, Carprofen 5 mg/kg subkutan) können auch gegeben werden.
(2) Sham Chirurgie
- Für die Farce Chirurgie als ein Steuerelement, führen Sie die gleichen chirurgischen und postoperativen Verfahren (gemäß Ziff. 1), einschließlich der Exposition von den äußeren Gehörgang und das Trommelfell (Schritt 1.7), die Entfernung der das Trommelfell und die Gehörknöchelchen und die Ablösung der Muskeln auf der Lambdoidal Grat (Schritt 1,8), aber nicht öffnen Semicircular Kanal oder Ethanol zu injizieren.
3. Überprüfen Sie den Verlust der vestibulären Funktion
Hinweis: Der Verlust der vestibulären Funktion kann mit entweder Verhaltens- oder vestibulären Funktionstests beurteilt werden. 13 , 17 , 18 Behavioral Tests umfassen die Bewertung der posturalen Asymmetrie und Nystagmus.
- Identifizieren Sie Haltungsschäden Asymmetrie, die spontane oder evozierte Lauf-Rollen, fallen auf der linken Seite, oder sich bewegen und beugte sich zu der lesioned Seite18enthält. Sehen Sie Video 1.
- Nystagmus durch eine visuelle Inspektion der freiwillige Augenbewegungen zu identifizieren. Beim spontanen Nystagmus fehlt im Ruhezustand, Blätterteig Luft sanft über den Kopf des tierischen18. Sehen Sie Video 2.
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Representative Results
Der Erfolg der Operation wurde durch behavioral Tests validiert. Alle Tiere ausgestellt, das typische Verhalten von einem einseitigen Verlust der vestibulären Funktion. Spontane Lauf-Rollen zeigte sich unmittelbar nach der Operation, hervorgerufen durch einen Luftstoß über den Kopf oder eine leichte Berührung mit dem Körper in der frühen Phase der Erholung (Video 1). 3-d nach der Operation, die Tiere auf der lesioned Seite mit gelegentlichen gelehnt bewegt fällt auf der linken Seite. Spontanen Nystagmus wurde innerhalb von 2-d (Video 2) beobachtet. Evozierten Nystagmus wurde innerhalb von 3-d beobachtet.
Die Operation in der Regel erforderlich < 30 min. Im Laufe von 50 Operationen starb 2 Ratten während der Operation und 3 innerhalb von 1 Tag der Operation. Alles in allem war die Verlustrate 10 % (5 Todesfälle während/nach 50 Operationen). Alle Todesfälle wurden durch eine Verletzung an der stapedial Arterie verursacht. Wir festgestellt, dass kein Verzögerter Tod und keine Infektion innerhalb von 1 Woche. Seit einigen Tagen nach der Operation können die Ratten einen schlechte orale Aufnahme und Gewicht Verlust aufweisen.
Abbildung 1: Post-auricular Einschnitt des linken Ohres. (A) A postauricular Einschnitt gemacht wurde, und den Gesichtsnerv (↑) wurde zwischen der Temporalis Muskel (*) und dem Sternomastoid Muscle (†) identifiziert. (B) dann, den äußeren Gehörgang (↑) war leicht geöffnet und der Knorpel des äußeren Ohres wurde vom pyramidalen Knochen getrennt. Der Maßstab von 2 mm gilt für alle Paneele. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Belichtung der knöchernen Wand des Vestibüls. (A) nach dem Öffnen der äußeren Gehörgang Breite, galt der Malleus (*) unter dem Trommelfell. (B) nach der Entfernung der das Trommelfell und die Gehörknöchelchen (mit Ausnahme der Steigbügel), wurde das Cochlea-Vorgebirge (*) identifiziert und die Muskeln auf dem Grat des Lambdoidal erhöht (†). Der Maßstab von 2 mm gilt für alle Paneele. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: vestibuläre Fenestration. (A) nach der Entfernung von der hinteren Seitenwand des Trommelfell Hohlraum, den Knochen um den Punkt des Ausganges des Nervus facialis gebohrt wurde. Die stapedial Arterie (↑) und das runde Fenster (Δ) über die Cochlea-Vorgebirge (*) ausgesetzt waren. (B) nach dem Bohren, die seitlichen Vorraum, der Ampulle von den Bogengängen der vestibulären Überrest (↑), wurde als minderwertig Lage mit dem Cochlea-Vorgebirge (*). Der Maßstab von 2 mm gilt für alle Paneele. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Video 1. Spontane Fass Rollen. Die SD-Ratte, die Labyrinthectomy 2 d unterzog sich zeigte zuvor spontan Fass ins Rollen. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
Video 2. Spontanen Nystagmus. Die SD-Ratte, die Labyrinthectomy 2 d unterzog sich zeigte zuvor spontanen Nystagmus. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video anzusehen. (Rechtsklick zum download)
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Discussion
Diese Technik ist eine nützliche Methode für die Erstellung von plötzlichen, dauerhafte und vollständige vestibulären Funktionsverlust. Dies ließe sich vestibuläre Erkrankungen, wie z. B. vestibuläre Neuritis, eine akustische Tumor und Morbus Menière zu studieren. Viele Studien haben diese Technik verwendet, um die neuronale Plastizität des vestibulären Kerne oder der dazugehörigen zentralen Prozess5,17,18,19zu studieren.
The Most wichtige Schritte für eine erfolgreiche Operation sind (1) die Erhaltung der stapedial Arterie, (2) eine sorgfältige Bohrungen in die genaue Position und (3) sorgfältige Blutstillung. Ein großer postauricular Schnitt kann dazu führen, dass eine große äussere Wunde, die stört die Beinbewegung auf der behandelten Seite. Allerdings ein kleiner Schnitt schränkt das Operationsfeld und bewirkt, dass den Vorgang länger dauern. Eine ordnungsgemäße Rücknahme ist wesentlich, ein ausreichender chirurgischer Sicht13beizubehalten. Nach der postauricular Schnitt Nervus facialis oberhalb der Bulla und zwischen den digastric Muskel und den sternocleidomastoideus-Muskel, läuft anterior inferior auf das Gesicht erkennbar. Die retroaurikulärer Arterie und der größere auricular Nerv in die entgegengesetzte Richtung laufen. Schäden an den Gesichtsnerven verursacht Gesichtslähmung nach dem Eingriff. Damit eine größere chirurgische Blick und eine Steigbügel Arterie Verletzungen zu vermeiden, bevorzugen wir die überlegene äußeren Gehörgang Wand und dann Ansatz überlegen die Steigbügel Arterie17,19zu entfernen. Dieser Ansatz ist ein größeres Risiko einer Infektion im Vergleich zu den ventrolateralen Ansatz, der nicht vorkommt, die Öffnung der Mauer äußeren Gehörgang oder die Entfernung von dem Trommelfell (das Mittelohr an den externen macht zugeordnet (Umwelt). Nach unserer Erfahrung die Langzeitfolgen (allgemeine Tierleistung, seine Fütterung und trinkenden Gewohnheiten, die Wiederaufnahme der Gewichtszunahme und der Infektionsstatus) unterscheiden sich nicht vor allem zwischen den Tieren ausgesetzt, der hier beschriebene Ansatz Transtympanic und die ventrolateralen Ansatz17,20. Eröffnung der Bulla beschädigen der angehängten Muskel und manchmal führen einige Blutungen. Bei der Ratte kreuzt die Steigbügel Arterie nah an dem Aufstellungsort des vestibulären Fenestration. Beim Menschen jedoch verschwindet die Steigbügel Arterie in der Embryogenese. Das Operationsfeld schmal ist, es ist nicht leicht, die Blutung zu kontrollieren, als das Feld kann rasch mit Blut füllen. Um dies zu vermeiden, einige Autoren gerinnen die Steigbügel Arterie vor das Loch. Obwohl seine Rolle nicht klar ist, möchte ich einige Autoren nicht die Steigbügel Arterie14 gerinnen, weil es das Innenohr, zentralen Nervensystems (gekniet Ganglion, medialen Lemniscus und trapezförmigen Körper) und facialis in der Ratte14 liefern können ,21. Wenn Blutungen auftreten, wir komprimieren die Arterie mit einem kleinen Wattestäbchen und elektrische Koagulation mit ausreichender Absaugung verwenden.
Eine kleine Klette ist nützlich, um ein Loch in der Vorhalle. Einem kleinen Haken oder einer Nadel könnte anstatt einen Grat verwendet werden. Eine mechanische Bohrsystem führt zu weniger Fenestration Trauma und hilft, um konsistente Ergebnisse zu erhalten. Ohne Ethanol Bewässerung beobachteten wir Variable Verhaltensreaktionen nach Labyrinthectomy13,17. Ethanol-Bewässerung und Absaugung sicherstellen, dass das Labyrinth unheilbar beschädigt ist. 13 stumpf elektrische Koagulation des Nervus Vestibular durchgeführt über dieses Loch22werden können. Richtige Vergrößerung ist wichtig, und ein Mikroskop ist in den meisten Fällen zwingend erforderlich.
Die Mittel- und Innenohr beschädigt sind auch während der Labyrinthectomy, was zu Taubheit. Es gibt keine Möglichkeit, das innere Ohr sicher zu bewahren. Chemische Labyrinthectomy kann das Tier Anhörung erhalten, sondern liefert unterschiedliche Ergebnisse8. Vestibulären Neurectomy kann auch die Cochlear Nerv8beschädigen. Um den Schein in der Kontrollgruppe Vorgang, entfernten wir das Trommelfell und die Gehörknöchelchen ohne Steigbügel, milde leitfähige Verhandlung ohne jede vestibulären Schäden13geführt.
Einige Verhaltens- und vestibulären Funktionstests können verwendet werden, um bestätigen, dass die Labyrinthectomy wurde erfolgreich durchgeführt,13,14. Unmittelbar nach dem Eingriff kann eine skew Abweichung des Auges beobachtet werden. Nach der Wiederherstellung aus der Narkose spontanen Nystagmus, eine Rollbewegung und Kopf kippen zu sehen. Rotation Schwanz hängen ist der zuverlässigste Test17,20. Diese Defizite erholen sich langsam innerhalb von mehreren Tagen17,20. Spontanen Nystagmus mit schnellen Bewegung auf der kontralateralen Seite wird innerhalb von 3-4-d nach dem Eingriff verschwinden. Den Kopf kippen bleiben für mehrere Monate. Vestibuläre Funktionstests, z. B. eine Drehung-Stuhl-Test oder ein Rotarod Test, bieten mehr objektiven und quantitativen Daten23,24.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Forschung wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus den Korea Health Technology R & D Project durch das Korea Gesundheit Industrie Entwicklung Institut (KHIDI), finanziert vom Ministerium für Gesundheit & Wohlbefinden, Republik Korea (gewähren Nummer: HI15C2651).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASPIRATOR KB-012 | KOH BONG & CO., LTD. | KB-012 | Medical aspirator |
| Blade: #15 | Fine Science Tools | #10015-00 | Blades for #7 Scalpel Handles, #15 |
| Carbon Steel Burrs | Fine Science Tools | #19007-05 | shaft diameter: 2.3 mm, length: 44 mm, package of 10 burrs |
| Carl Zeiss Surgical GmbH | Carl Zeiss | #6627100863 | Surgical microscope |
| Dumont #3c | Fine Science Tools | #11231-20 | Standard tip 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | #11252-00 | |
| Dumont #7B | Fine Science Tools | #11270-20 | Serrated 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Extra Fine Bonn: straight | Fine Science Tools | #14084-08 | Iris scissors, best suited for microdissection under high magnification |
| Fine Iris Scissors: straight | Fine Science Tools | #14094-11 | Made from martensitic stainless steel, combined with molybdenum and vanadium |
| Finger Loop Ear Punch | Fine Science Tools | #24212-01 | 1 mm. Provides stability and control for researchers using the numbering system |
| Hartman | Fine Science Tools | #13002-10 | Tip width: 1 cm, serrated, 10 cm |
| Short Scalpel Handle #7 Solid | Fine Science Tools | #10003-12 | #7 short, 12 cm |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | #18000-03 | Replacement tip, straight knife, keeps bleeding to a minimum and therefore provides a surgical field clear of clamps and hemostats |
| Strong 207S | SAESHIN | 207S | Powerful torque at low speed, available with speed or on/off foot controller |
| Suction Tubes | JEUNGDO B&P CO., LTD. | H-1927-8 | Frazier, 18 cm |
| VICRYL | ETHICON | W9570T | Synthetic absorbable sterile surgical suture |
| Weitlaner-Locktite | Fine Science Tools | #17012-13 | Maximum spread: 4.5 cm, 2 x 3 blunt teeth, 11 cm |
| Zoletil | Virbac, France | Tiletamine-zolazepam | |
| Rompun | Bayer | Xylazine | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Septra | Pfizer | Trimethoprim-sulfonamide |
References
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