Summary
Este protocolo describe el labyrinthectomy quirúrgica de una rata, que es un método útil para el estudio del sistema vestibular.
Abstract
Para estudiar el sistema vestibular o el proceso de compensación vestibular, se han desarrollado varios métodos para causar daño vestibular, que incluye labyrinthectomy quirúrgica o química y la neurectomía vestibular. Labyrinthectomy quirúrgica es un método relativamente simple, confiable y rápido. Aquí, describimos la técnica quirúrgica para rata labyrinthectomy. Bajo anestesia general se realiza una incisión postauricular para exponer el canal auditivo externo y la membrana timpánica, después de que la membrana timpánica y los huesecillos se quitan sin estribo. La arteria del estribo, que está situada entre el estribo y la ventana oval, es una estructura vulnerable y debe ser preservada para obtener un campo quirúrgico claro. A la ventana del vestíbulo se realiza un orificio con una broca de taladro de 2,1 mm superior al del estribo. Entonces, 100% de etanol es inyectado a través de este orificio y aspira varias veces. Meticulosa disección bajo un microscopio y un esmerado control de sangrado son esenciales para obtener resultados fiables. Los síntomas de la pérdida vestibular, como nistagmo, inclinación de cabeza y un movimiento de balanceo, se observan inmediatamente después de la cirugía. La prueba rotarod o rotación de la silla puede utilizarse en forma objetiva y cuantitativamente evaluar la función vestibular.
Introduction
El órgano vestibular es esencial para el control del equilibrio y el ojo. Una función vestibular normal depende simétricas señales aferentes de los órganos vestibulares en los dos oídos internos. Hipofunción vestibular o pérdida induce mareo, nistagmo y desequilibrio postural. Después de daño agudo, la función vestibular se recupera espontáneamente en varios días, un proceso conocido como compensación vestibular1,2. La compensación vestibular de déficit estático es un proceso de recuperación relacionados con el desequilibrio de la actividad espontánea de reposo entre los núcleos vestibulares ipsolaterales y contralaterales. La compensación vestibular de déficit dinámico se logra principalmente a través de sustitución sensorial y de comportamiento (usando entradas visuales o somatosensoriales)3. Estos procesos son atractivos para los estudios de plasticidad neuronal4,5.
Se han desarrollado una serie de métodos para estudiar el sistema vestibular y los mecanismos que sustentan la plasticidad neuronal durante la compensación vestibular, labyrinthectomy química y quirúrgica como neurectomía vestibular5,6 ,7,8. Neurectomía vestibular es la manera de inducir pérdida vestibular completa, pero es un procedimiento más invasivo y difícil y puede inducir daño cerebral8,9. Este método requiere mayor habilidad quirúrgica y toma más tiempo que labyrinthectomy. Labyrinthectomy química incluyendo gentamicina, arsanilate y tetracaína, es más fácil y puede producir resultados confiables10,11,12. Sin embargo, también puede dañar la cóclea y pérdida vestibular puede desarrollar con el tiempo11. Además, los efectos de las sustancias químicas en el cerebro, que deben preservarse para la evaluación precisa, son claros. Labyrinthectomy quirúrgico introdujo por primera vez en estudios en animales en 184215 y primero fue divulgado en la rata en 193616. Esta técnica se ha utilizado desde entonces en muchos animales estudios5,17,18,19. Labyrinthectomy quirúrgica es un método específico, fiable y relativamente sencilla. 13 , 14 por otra parte, los síntomas de daño vestibular se observan inmediatamente después de la cirugía. Aquí, Describimos nuestra técnica quirúrgica para la rata labyrinthectomy.
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Protocol
Este estudio fue realizado conforme a cuidado institucional del Animal y uso Comité de Seúl Universidad Hospital Nacional (14-0148-C1A1), que está acreditado por la Asociación para la evaluación y la acreditación de laboratorio Animal Care Internacional.
Nota: Los experimentos fueron realizados en ratas macho Sprague-Dawley (SD) de 7-8 semanas de edad (200/250 g). Cada animal se aclimata a las condiciones del laboratorio durante 1 semana antes del inicio del experimento. Los animales fueron alojados en una sala de control de temperatura y humedad con una constante de 12-h:12-h luz: oscuridad del ciclo con libre acceso al alimento y al agua.
1. Labyrinthectomy
- Cubrir los instrumentos quirúrgicos autoclave con un paño estéril. Desinfectar la zona de corte con etanol al 70%. Utilice un paño estéril y mantener las condiciones estériles durante la cirugía.
- Una bata, mascarilla (a cubierta de la nariz y la boca), cap (para cubrir la cabeza) y un par de guantes estériles. Los instrumentos quirúrgicos sólo deben entrar en contacto con superficies estériles.
- Inyectar anestésico tiletamina-zolazepam (40 mg/kg de peso corporal) por vía intramuscular en el muslo medial o por vía intraperitoneal y xilacina (10 mg/kg de peso corporal) por vía intramuscular o por vía intraperitoneal.
Nota: Otros modos de la anestesia general, incluyendo la inhalación isoflurano, también pueden ser utilizados. - Colocar la rata en una cubierta térmica de colchón (establecido inicialmente a 42 ° C). Aplique ungüento oftálmico lubricante en ambos ojos de la rata para evitar la sequedad del ojo bajo anestesia.
- Colocar la rata en su lado derecho. Afeitarse la piel en el área quirúrgica con cortar el pelo. Desinfectar el sitio con etanol al 70%.
- Inyectar por vía subcutánea el clorhidrato de lidocaína 1% en el área retroauricular izquierda.
- Usando una hoja de bisturí #15, hacer una incisión ~5.0 cm retroauricular. Separar el músculo y la fascia para exponer el canal auditivo externo con tijeras de Iris (figura 1A). Abrir ligeramente el conducto auditivo externo utilizando la hoja #15 o las tijeras de Iris (figura 1B). Ampliamente exponer la membrana timpánica (figura 2A).
- Bajo el microscopio (7.5 X o 12.5 X), retire la membrana timpánica y los huesecillos con la excepción del del estribo, utilizando las pinzas. Soltar los músculos en el canto lambdoidal con hoja #15 o las tijeras de Iris (figura 2B).
- Usando un taladro a baja velocidad (< 3000 rpm) con fresas de diamante (2.1 o 1,4 mm), perforar el hueso de la bulla timpánica alrededor del punto de salida del nervio facial (Figura 3A). Identificar la arteria estapédica. Tenga cuidado para no dañar la arteria stapedial durante el proceso de perforación.
- Seguir perforando el vestíbulo superior de la arteria stapedial y exponen la ventana redonda y el huesuda del canal semicircular lateral. Abra el canal semicircular lateral cerca de la ampolla. Continuar en el plano del canal semicircular lateral de perforación y perforar la ampolla del canal semicircular superior.
- Aspire el contenido del portal usando una aguja 18 G o 22 G. Inyectar y aspirar de 1 cm3 de etanol al 100% 3 x.
- Cerca de los músculos y la piel en dos capas con suturas interrumpidas simples.
- No descuide un animal hasta que ha recuperado la conciencia suficiente para mantener el recumbency esternal. Mantener la rata caliente hasta que despierta con una almohadilla eléctrica o una lámpara de calor. Después de despertar, mover la rata en una jaula individual en una sala con las condiciones ambientales generalmente.
- Administrar antibióticos (p. ej., cefazolina 20 mg/kg, trimetoprima-sulfonamida 100 μl por vía subcutánea, o penicilina 300.000 IU) según sea necesario en el día 1; un analgésico (no un opioide; por ejemplo, Metacam Carprofen 2 mg/kg 5 mg/kg por vía subcutánea) también se puede dar.
2. simulacro de cirugía
- Para la cirugía simulada como control, realizar los mismos procedimientos quirúrgicos y post quirúrgicos (según la sección 1), incluyendo la exposición del canal auditivo externo y la membrana timpánica (paso 1.7), la eliminación de la membrana timpánica y los huesecillos y la la separación de los músculos en la lambdoidal ridge (paso 1,8), pero no abra el canal semicircular o inyectar etanol.
3. comprobar la pérdida de la función Vestibular
Nota: La pérdida de la función vestibular puede ser evaluada usando cualquiera de los dos pruebas de la función vestibular o comportamiento. 13 , 17 , 18 pruebas conductuales incluyen la evaluación de la asimetría postural y nistagmo.
- Identificar asimetría postural que incluye espontáneo o evocado barril-balanceo, cayendo a la izquierda, o moverse mientras que se inclina hacia el lado lesionado18. Ver Video 1.
- Identificar nistagmo mediante una inspección visual de los movimientos oculares voluntarios. Cuando no existe nistagmo espontáneo en el estado de reposo, soplo aire suavemente sobre la cabeza de los animales18. Ver Video 2.
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Representative Results
El éxito de la cirugía fue validado por pruebas de comportamiento. Todos los animales exhibieron el comportamiento típico de una pérdida unilateral de la función vestibular. Barril-balanceo espontáneo fue evidente inmediatamente después de la cirugía, siendo evocada por un soplo de aire sobre la cabeza o un ligero toque al cuerpo en la fase de recuperación temprana (Video 1). 3 d después de la cirugía, los animales mueve alrededor que se inclina hacia el lado lesionado con ocasionales caídas a la izquierda. Nistagmo espontáneo fue observada dentro de 2 d (Video 2). Se observa nistagmo evocado dentro d 3.
La cirugía generalmente se requiere < 30 min. En el transcurso de 50 cirugías, 2 ratas murieron durante la operación y 3 en 1 d de la cirugía. En general, la tasa de pérdida fue del 10% (5 muertes durante y después de 50 cirugías). Todas las muertes fueron causadas por una lesión en la arteria estapédica. Observó ninguna muerte retrasada y ninguna infección dentro de 1 semana. Durante varios días después de la cirugía, las ratas pueden exhibir una pobre oral ingesta y pérdida de peso.
Figura 1: incisión poste-auricular de la oreja izquierda. Se hizo incisión postauricular (A) A, y el nervio facial (↑) fue identificado entre el músculo de los temporalis (*) y el músculo esternocleidomastoideo (†). (B) entonces, conducto auditivo externo (↑) se abrió ligeramente y el cartílago de la oreja fue separado del hueso piramidal. La barra de escala de 2 mm se aplica a todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: exposición de la pared huesuda del vestíbulo. (A) después de abrir el canal auditivo externo amplio, el martillo (*) fue visto por debajo de la membrana timpánica. (B) después del retiro de la membrana timpánica y los huesecillos (con la excepción del del estribo), fue identificado el promontorio coclear (*) y los músculos en el canto lambdoidal elevan (†). La barra de escala de 2 mm se aplica a todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: fenestración Vestibular. (A) después de la eliminación de la pared lateral posterior de la cavidad timpánica, el hueso alrededor del punto de salida del nervio facial fue perforada. La arteria stapedial (↑) y la ventana redonda (Δ) sobre el promontorio coclear (*) fueron expuestas. (B) después de la perforación hacia fuera el portal lateral, la ampolla de los canales semicirculares era evidente en el remanente vestibular (↑), como era la ubicación inferior del promontorio coclear (*). La barra de escala de 2 mm se aplica a todos los paneles. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Video de 1. Espontánea barril rodante. La rata de SD que labyrinthectomy 2 d previamente mostró espontáneo barril rodante. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
Video 2. Nistagmo espontáneo. La rata de SD que labyrinthectomy 2 d previamente demostró nistagma espontáneo. Por favor haga clic aquí para ver este video. (Clic derecho para descargar)
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Discussion
Esta técnica es un método útil para crear pérdida de la función vestibular brusca, permanente y completa. Esto podría utilizarse para estudiar patologías vestibulares, como la neuritis vestibular, tumor acústico y la enfermedad de Meniere. Muchos estudios han utilizado esta técnica para estudiar la plasticidad neuronal de los núcleos vestibulares o el proceso central relacionados con5,17,18,19.
The Most pasos críticos para una cirugía exitosa están 1) la preservación de la arteria stapedial, 2) cuidado de perforar en la posición precisa y control sangrado 3) meticuloso. Una incisión postauricular grande puede causar un gran externo de la herida, que perturba el movimiento de las piernas en la parte tratada. Sin embargo, una pequeña incisión limita el campo quirúrgico y esto hace que tome más tiempo. Una retracción adecuada es esencial para mantener una suficiente visión quirúrgica13. Después de la incisión postauricular, puede identificarse el nervio facial por encima de la bulla y entre el músculo digástrico y el músculo esternocleidomastoideo, ejecución anterior inferiorly a la cara. La arteria retroauricular y el nervio auricular mayor en la dirección opuesta. Cualquier daño al nervio facial ocasiona parálisis facial después del procedimiento. Para lograr una más amplia visión quirúrgica y evitar una lesión de la arteria del estribo, preferimos retirar la pared superior del canal auditivo externo y luego el enfoque superior a del estribo arteria17,19. Este enfoque se asocia con un mayor riesgo de infección en comparación con el enfoque ventrolateral, que no cuentan con la apertura de la pared externa del canal auditivo o la eliminación de la membrana del tímpano (que expone el oído medio a la externa medio ambiente). En nuestra experiencia, las secuelas a largo plazo (el rendimiento animal, sus hábitos de alimentación y bebidas, la reanudación de la ganancia de peso y el estado de la infección) no difieren notablemente entre animales sometidos al enfoque transtimpánicos aquí descrito y el enfoque ventrolateral17,20. Apertura de la ampolla puede dañar el músculo conectado y a veces dan lugar a un sangrado. En la rata, la arteria del estribo cruza cerca del sitio de fenestración vestibular. En los seres humanos, sin embargo, la arteria del estribo desaparece durante la embriogénesis. Cuando el campo quirúrgico es estrecho, no es fácil controlar el sangrado, y el campo puede llenar rápidamente de sangre. Para evitar esto, algunos autores coagulan la arteria del estribo antes de hacer el agujero. Aunque su papel no está claro, algunos autores prefieren no coagular la arteria del estribo del14 porque puede suministrar el oído interno, del sistema nervioso central (del ganglio geniculado, lemnisco medial y cuerpo trapezoide) y del nervio facial en la rata14 ,21. Si se presenta sangrado, comprime la arteria con un hisopo de algodón y luego usa coagulación eléctrica con suficiente succión.
Pequeñas rebabas son útil para hacer un agujero en el vestíbulo. Un pequeño gancho o una aguja podría utilizarse en lugar de una fresa. Un sistema de perforación mecánico provoca menos trauma hueco y ayuda a obtener resultados consistentes. Sin riego de etanol, observamos las respuestas del comportamiento variable después labyrinthectomy13,17. Aspiración e irrigación de etanol aseguran de que el laberinto es terminal. 13 embotado coagulación eléctrica del nervio vestibular puede ser realizada a través de este agujero22. Aumento adecuado es esencial, y un microscopio es obligatorio en la mayoría de los casos.
El medio y el oído interno también se dañan durante el labyrinthectomy, dando lugar a sordera. No hay manera para conservar el oído interno con seguridad. Labyrinthectomy química puede preservar la audición del animal pero produce resultados variables8. Neurectomía vestibular también puede causar daño al nervio coclear8. Para realizar la operación simulada en el grupo control, retiramos la membrana timpánica y huesecillos sin el estribo, que dio lugar a auditiva conductiva leve sin cualquier daño vestibular13.
Varias pruebas de la función vestibular y de comportamiento pueden utilizarse para confirmar que el labyrinthectomy ha sido realizada con éxito13,14. Inmediatamente después del procedimiento, puede observarse una desviación oblicua del ojo. Después de la recuperación de la anestesia, se observan nistagmo espontáneo, un movimiento de balanceo e inclinación de cabeza. Rotación por cola colgando es la más confiable prueba de17,20. Estos déficits se recuperan lentamente dentro de varios días17,20. Nistagmo espontáneo con un movimiento rápido hacia el lado contralateral desaparecerá en 3-4 d después del procedimiento. La inclinación de la cabeza se mantendrá durante varios meses. Pruebas de función vestibulares, como una prueba de la silla de rotación o una prueba del rotarod, puede proporcionar más objetivo y cuantitativo datos23,24.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Esta investigación fue apoyada por una donación de Corea salud tecnología R & D proyectos a través de la Corea salud industria desarrollo Institute (KHIDI), financiado por el Ministerio de salud y bienestar, República de Corea (número: HI15C2651).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ASPIRATOR KB-012 | KOH BONG & CO., LTD. | KB-012 | Medical aspirator |
| Blade: #15 | Fine Science Tools | #10015-00 | Blades for #7 Scalpel Handles, #15 |
| Carbon Steel Burrs | Fine Science Tools | #19007-05 | shaft diameter: 2.3 mm, length: 44 mm, package of 10 burrs |
| Carl Zeiss Surgical GmbH | Carl Zeiss | #6627100863 | Surgical microscope |
| Dumont #3c | Fine Science Tools | #11231-20 | Standard tip 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Dumont #5SF | Fine Science Tools | #11252-00 | |
| Dumont #7B | Fine Science Tools | #11270-20 | Serrated 0.17 x 0.10 mm, 11 cm |
| Extra Fine Bonn: straight | Fine Science Tools | #14084-08 | Iris scissors, best suited for microdissection under high magnification |
| Fine Iris Scissors: straight | Fine Science Tools | #14094-11 | Made from martensitic stainless steel, combined with molybdenum and vanadium |
| Finger Loop Ear Punch | Fine Science Tools | #24212-01 | 1 mm. Provides stability and control for researchers using the numbering system |
| Hartman | Fine Science Tools | #13002-10 | Tip width: 1 cm, serrated, 10 cm |
| Short Scalpel Handle #7 Solid | Fine Science Tools | #10003-12 | #7 short, 12 cm |
| Small Vessel Cauterizer | Fine Science Tools | #18000-03 | Replacement tip, straight knife, keeps bleeding to a minimum and therefore provides a surgical field clear of clamps and hemostats |
| Strong 207S | SAESHIN | 207S | Powerful torque at low speed, available with speed or on/off foot controller |
| Suction Tubes | JEUNGDO B&P CO., LTD. | H-1927-8 | Frazier, 18 cm |
| VICRYL | ETHICON | W9570T | Synthetic absorbable sterile surgical suture |
| Weitlaner-Locktite | Fine Science Tools | #17012-13 | Maximum spread: 4.5 cm, 2 x 3 blunt teeth, 11 cm |
| Zoletil | Virbac, France | Tiletamine-zolazepam | |
| Rompun | Bayer | Xylazine | |
| Rimadyl | Pfizer | Carprofen | |
| Septra | Pfizer | Trimethoprim-sulfonamide |
References
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