Hier beschrijven we een procedure om te testen de cel migratie in vitro met een geautomatiseerde optische camera Microscoop. De kras assay is wijd verbeid gebruikt wanneer de sluiting van de kras gedurende een ingestelde periode wordt gevolgd. De optische Microscoop kunt betrouwbare en goedkope detectie van cel migratie.
Cel migratie is een belangrijk proces invloed op vele aspecten van de gezondheid, zoals wondgenezing en kanker, en het is dus cruciaal voor de ontwikkeling van methoden om te bestuderen van de migratie. De kras assay is al lang de meest voorkomende in vitro methode voor het testen van verbindingen met de eigenschappen van de anti – en pro – migration vanwege zijn lage kosten en eenvoudige procedure. Een vaak gemeld probleem van de test is echter de accumulatie van cellen over de rand van de kras. Bovendien, om gegevens te verkrijgen van de bepaling, beelden van verschillende belichtingen moeten worden genomen over een periode van tijd op exact dezelfde plek om te vergelijken van de bewegingen van de migratie. Analyse van de verschillende programma’s kunnen worden gebruikt voor het beschrijven van de kras sluiting, maar ze zijn arbeidsintensief, onjuist, en krachten cycli van temperatuurveranderingen. Wij tonen in deze studie, een geoptimaliseerde methode voor het testen van het migratie-effect, bijvoorbeeld met de natuurlijk voorkomende eiwitten mens – en runderen-lactoferrine en hun N-terminale peptide Lactoferricin op de epitheliale cellijn HaCaT. Een cruciale optimalisatie is te wassen en kras in PBS, die de bovengenoemde accumulatie van cellen langs de rand elimineert. Dit kan worden verklaard door de verwijdering van kationen, waarvan is gebleken dat een effect op Keratinocyt cel verbinding. Om te zorgen voor echte detectie van migratie, werd vooraf behandelen met mitomycine C, een DNA-synthese-inhibitor, toegevoegd aan het protocol. Tot slot tonen wij de geautomatiseerde optische camera, die elimineert buitensporige temperatuur cycli, handenarbeid met kras sluiting analyse, terwijl de verbetering op de reproduceerbaarheid en het waarborgen van de analyse van identieke secties van de kras na verloop van tijd.
Migratie is een belangrijk proces die invloeden van verschillende fysiologische aspecten. In de wondgenezing vergemakkelijkt de migratie opnieuw epithelization van de huid. In niet-genezende wonden, zoals chronische wonden, opportunistische bacteriën veroorzaken infectie van de wond en open wonden zijn ideaal voor bacteriën groei en vorming van biofilms1,2. Biofilm is een van de oorzaken van de ontwikkeling van resistente bacteriën, één van de grootste bedreigingen voor onze moderne samenleving-3. In de wondgenezing, kunnen niet de immuuncellen de biofilm doordringen. Bij kanker is migratie van de kankercellen een cruciale stap van metastase, die de belangrijkste doodsoorzaak voor patiënten met stevige tumors4,5. Het is daarom van cruciaal belang om de studie van de migratie te kunnen.
De kras bepaling wordt vaak gebruikt voor het testen van cel migratie, want het is goedkoop en gemakkelijk uit te voeren op aanhangend cellijnen, zoals fibroblast, endotheel, en6,7van de lijnen van de epitheliale cellen. Vandaag, er bestaan verschillende methoden voor het uitvoeren van krassen8, en verschillende materialen hebben gemeld moet worden gebruikt, met inbegrip van tandenstokers9, cel schrapers10, lasers11en12van de elektrische stromen. Alle methodes hebben verschillende voor- en nadelen, en de methode moet worden vastgesteld volgens de cel type, begroting en analyse tool. Als voorbeeld, als het gebruikte celtype vereist coating, manuele druk verwijdering, bijvoorbeeld met een tandenstoker of pipette uiteinde, invloed zal hebben op migratie binnen het gebied, een andere methode moet worden gebruikt. In deze studie zullen we ons richten op handmatige schrapen.
Een nadeel voor handmatige schrapen is de variatie van de grootte, vormen van de krassen en accumulatie van cel aan de randen van de kras. Er zijn veel protocollen, en een zeer geciteerde papier adviseert verhoogde snelheid en/of grondig wassen na het krassen van13. Bovendien hebben verschillende methoden zijn gebruikt om te minimaliseren van proliferatie, aangezien de proliferatie van de cellen kan niet onderscheiden van migratie worden en daarom vals-positieve resultaten van de migratie geven kan. Sommige meldden methoden zijn serum honger voorafgaand aan de kras14 en daalt de hoeveelheid serum15. Geen van deze methoden kan er echter voor zorgen dat er geen wildgroei is. Daarom, rapporteren we een voorbehandeling van de cellen met mitomycine C om echte resultaten van de migratie. Mitomycine C is een antibioticum dat remt de synthese van DNA door de vorming van een covalente binding met het DNA, die verhindert dat het DNA scheiden van16. Door vooraf te behandelen met mitomycine C en wassen met PBS voor krassen, toont de gedetecteerde sluiting van de kloof de echte migratie van de cellen (Figuur 1).
Een kenmerk van alle methoden is de noodzaak van een systeem voor het analyseren van het proces van migratie17. Een gemeenschappelijk en een goedkope methode voor het analyseren van de vooruitgang is het gebruik van een licht-veld microscoop om beelden te nemen van de kras op vooraf bepaalde tijdstippen, gevolgd door een analyse van de sluiting van de kloof in een afbeelding software18,19. Deze methode is tijdrovend, onbetrouwbaar met betrekking tot het nemen van foto’s op de zelfde plek en de focus, en de beweging van incubator naar camera dwingt cycli van temperatuurveranderingen terwijl foto’s zijn genomen. Andere methoden zijn ontwikkeld voor het detecteren van migratie door het meten van de stroom. De huidige veranderingen, cellen bestrijken meer ruimte op de plaat, die wordt gelezen als een verhoging van de impedantie-20. De omgeving van de cellen wordt niet beïnvloed door het meten van impedantie, en de methode wordt daarom beschouwd als niet-invasieve. Deze methode berust op gespecialiseerde platen met gouden elektroden, die duur zijn, maar ze inschakelen detectie van vele processen, zoals de naleving van de cellulaire, proliferatie, migratie en celdood. Een groot nadeel van deze methode is dat de impedantie-meting geeft niet direct aan migratie, aangezien factoren zoals temperatuur een grote impact op de impedantie hebben. Wijzigingen in de impedantie kunnen worden veroorzaakt door verschillende factoren die niet worden beoordeeld door de software, de analyse van de gegevens moeilijker te maken. Het ontbreken van visualisatie vereist daarom een conventionele lichte Microscoop om te controleren of de migratie.
Om te overwinnen veel van de nadelen van de beschikbare technieken, we gebruiken een real-time automatische optische camera. De optische camera is een detectiesysteem met een hoge gegevensdoorvoer Microscoop in een klein platform met een lens, verlichting unit en een digitale camera. Het heeft een ingebouwde software, die migratie en proliferatie o.a. kunt testen. U wilt opsporen migratie, worden twee algoritmen gebruikt om de groei en de kinetiek van de migratie van de cellen, die de verspreiding en de wond genezing analyse, respectievelijk heten te analyseren. De proliferatie analyse is gebaseerd op een in twee stappen afbeelding segmentatie algoritme dat textuur analyse om te detecteren het verschil tussen cel bedekte gebieden (getoond in het geel) van toepassing is en lege achtergrond gebieden door geavanceerde histogram analyse. De wond genezing analyse is gebaseerd op een drie-stappen-algoritme dat de cel enkelgelaagde detecteert, zoekt de kloof van de wond en bepaalt de breedte van de tussenruimte. Deze stappen zijn uitgevoerd op gebruiker-bepaald tijd-punten, en de gegevens worden gepresenteerd als overdekte ruimte, Breedte tussenruimte en gap omgeving. Een van de grote voordelen van deze machine is dat hierdoor beeldvorming van Adherente cellen door vloeistof vanwege de hoek van de camera-21. De camera lenstakes bewogen beelden die worden geprojecteerd naar een z-stack van een enkel z-vliegtuig genereren om ervoor te zorgen dat de foto’s in-focus (Figuur 2 zijn). z-stacks worden gegenereerd door het samenvoegen van de reeks van foto’s (bijvoorbeeld 40) genomen loodrecht naar de rand van de wond, en over de gehele wond. De z-stacks kunt vastleggen van de diepte van de cellaag evenals een vliegtuig in-focus over de wond. Bovendien kan de reeks beelden samen worden gebracht aan een video-collectie van de beelden, met de klik van een knoop.
We tonen een geoptimaliseerde protocol voor de detectie van de migratie in de Keratinocyt cellijn HaCaT. We testten lactoferrine en de N-terminale peptide, Lactoferricin, van mens en koeien, voor het analyseren van hun effect op de migratie, zoals deze moleculen hebben aangetoond dat tal van toepassingen als antimicrobiële en immune modulerende moleculen22 , 23. de vier stoffen werden vergeleken met onbehandelde HaCaT cellen en epidermale groeifactor (EGF) werd gebruikt als positieve controle.
Het belang van de migratie in studies van de ontwikkeling, wondgenezing, immunologie en kanker heeft geleid tot verschillende methoden om te studeren van migratie. Migratie kan een expressie van de uitbreiding of de sluiting van de kloof door de cellen. Meestal de sluiting van de kras wordt getest, zoals het is makkelijker om te groeien van cellen in een enkelgelaagde en breng een kras dan groeit de cellen in een specifiek formulier8. Onze studie toont een geoptimaliseerde methode voor handmatige …
The authors have nothing to disclose.
Deense Raad voor onafhankelijk onderzoek, technologie en productie, verlenen #4005-00029
oCelloScope | BioSense Solution ApS | Optical camera | |
UniExplorer software | BioSense Solution ApS | (8.0.0.7144 (RL3)) | |
HaCaT cell | Donated from Bispebjerg Hospital | ||
DMEM (1x) + GlutaMAX | Gibco | 31966-021 | Medium for HaCaT |
FBS | Gibco | 10270 | Fetal bovine serum |
PBS | Gibco | D837 | Without Mg+ and Ca2+ |
Pencillin-Streptomycin | Sigma | P0781 | Antibiotics |
Trypsin (10x) | Sigma | T3924 | |
Mitomycin C | Tocris | 3258 | Inhibits proliferation |
Microtiter plate | Greiner Bio-one | 677 180 | |
Incubator | Panasonic | 37°C, 5% CO2 | |
Hemocytometer | Assistent | Türk (0.1 mm) | |
Pipet boy | Accu-Jet pro |