Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

FM kleurstof fietsen in de synaps: vergelijken van hoge kalium depolarisatie, elektrische en Channelrhodopsin stimulatie

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57765
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Synaptic Vesikel (SV) fietsen is het mechanisme van de kern van de intercellulaire communicatie in neuronale synapsen. FM kleurstof opname- en release zijn het belangrijkste middel van kwantitatief onderzoek SV endo- en exocytose. Hier, vergelijken wij alle stimulatie methoden om te rijden FM1-43 fietsen in de Drosophila motorische eindplaat (NMJ) model synaps.

Abstract

FM kleurstoffen worden gebruikt voor het bestuderen van de synaptische Vesikel (SV) cyclus. Deze amphipathic sondes hebben een hydrofiele kop en hydrofobe staart, waardoor ze wateroplosbaar met de mogelijkheid om omkeerbaar betreden en verlaten van membraan lipide bilayers. Deze styryl-kleurstoffen zijn relatief niet-belichting fluorescerende in waterig medium, maar de invoeging in het buitenste van de bijsluiter van het plasma-membraan veroorzaakt een > 40 X verhoging van fluorescentie. In neuronale synapsen, zijn FM kleurstoffen geïnternaliseerd tijdens SV endocytose, verhandelde zowel binnen als tussen SV zwembaden en vrijgegeven met SV exocytose, bieden een krachtig hulpmiddel om te visualiseren presynaptische stadia van transmissie. Een primaire genetische model van glutamaterge synapse ontwikkeling en functie is de Drosophila motorische eindplaat (NMJ), waar FM kleurstof imaging is gebruikt uitgebreid te kwantificeren SV dynamiek in een brede waaier van mutant voorwaarden. De NMJ synaptic terminal is gemakkelijk bereikbaar, met een prachtig scala aan grote synaptic los ideaal voor beeldtoepassingen. Hier, wij vergelijken en het contrast van de drie manieren om te stimuleren de Drosophila NMJ rijden activiteit-afhankelijke FM1-43 kleurstof opname/release: 1) bad toepassing van hoge [K+] 2) zuignap elektrode motorische zenuw te depolarize neuromusculaire weefsels stimulatie om te depolarize van de presynaptische zenuw terminal, en 3) gericht transgene expressie van channelrhodopsin varianten voor licht-gestimuleerd, ruimtelijke controle van depolarisatie. Elk van deze methoden heeft voor- en nadelen voor de studie van genetische mutatie gevolgen op de SV-cyclus op de Drosophila NMJ. We zullen bespreken deze voor- en nadelen bij de selectie van de stimulatie aanpak, samen met de methoden die specifiek zijn voor elke strategie. Naast fluorescerende imaging kunnen FM kleurstoffen photoconverted aan elektron-dichte signalen gevisualiseerd met behulp van transmissie-elektronenmicroscopie (TEM) om te studeren van SV cyclus mechanismen op ultrastructureel niveau. Wij bieden de vergelijkingen van confocale en elektronenmicroscopie beeldvorming van de verschillende methoden van Drosophila NMJ stimulatie, om te helpen guide de selectie van toekomstige experimentele paradigma's.

Introduction

Het prachtig gekenmerkt Drosophila larvale motorische eindplaat (NMJ) glutamaterge synapse model is gebruikt synapse formatie en functie met een grote spectrum van genetische verstoringen1te gaan studeren. De motor neuron terminal bestaat uit meerdere takken van de axon, elk met vele uitgebreide synaptic los. Deze ruim varicosities (maximaal 5 µm in diameter) bevat alle van de transmissie-machine, met inbegrip van uniforme glutamaterge synaptische vesikels (SVs; ~ 40 nm diameter) in cytosolische reserve en gemakkelijk-vrij te geven zwembaden2. Deze blaasjes op het basisstation op de presynaptische plasmamembraan fusion site actieve zones (AZs), waar exocytose de glutamaat neurotransmitter release voor trans bemiddelt-synaptic communicatie. Vervolgens worden de SVs opgehaald uit het plasma-membraan via kus-en-run-recycling- of clathrin-gemedieerde endocytose (CME) voor herhaalde exo/endocytose cycli. De Drosophila NMJ is gemakkelijk toegankelijk en geschikt voor zowel isoleren en karakteriseren van SV cyclus mutanten. Met behulp van voorwaartse genetische schermen, hebben nieuwe mutaties geleid tot de identificatie van nieuwe genen kritisch voor de SV cyclus3. Bovendien, omgekeerde genetische benaderingen, beginnend met de reeds bekende genen hebben geleid tot de opheldering van nieuwe mechanismen van de cyclus van de SV door de zorgvuldige beschrijving van mutant fenotypen4fietsen. De Drosophila NMJ is bijna ideaal als een experimentele synaptic voorbereiding voor het ontleden van SV endocytose exocytose HORLOGEMECHANISMES via methoden om optisch track vesikel fietsen tijdens transmissie.

Een waaier van fluorescente markeringen visuele tracking van blaasjes tijdens het fietsen van dynamiek, maar de meest veelzijdige zijn FM kleurstof analogen die is voor het eerst gesynthetiseerd door Mao, F., et al.. 5. structureel, FM kleurstoffen bevatten een hydrofiele kop en een lipofiele staart verbonden via een aromatische ring, met een centrale regio spectrale eigenschappen toekennen. Deze styryl kleurstoffen partitioneren omkeerbaar in membranen, niet 'flip-flop' tussen membraan folders en dus nooit zijn vrij in het cytosol en zijn veel meer tl in membranen dan water5. Omkeerbare inbrengen in een lipide dubbelgelaagde veroorzaakt een verhoging van de 40-fold in fluorescentie6. Bij neuronale synapsen bestaan klassieke FM kleurstof labeling experimenten uit Baden van de synaptische voorbereiding met de kleurstof tijdens depolarizing stimulatie te laden kleurstof via SV endocytose. Externe kleurstof wordt dan gewassen weg en de SV-cyclus wordt gearresteerd in een calcium-vrije ringer-oplossing om het imago van de geladen synapsen7. Een tweede ronde van stimulatie in een bad met kleurstof-vrije triggers FM release via exocytose, een proces dat kan worden gevolgd door het meten van de daling van de intensiteit van de fluorescentie. SV populaties van een enkele blaasje tot zwembaden met honderden blaasjes kunnen kwantitatief gecontroleerde6,7. FM kleurstoffen zijn gebruikt om te ontleden activiteit-afhankelijke mobilisatie van functioneel verschillende SV zwembaden, en te vergelijken kus-en-run vs. CME fietsen8,9. De methode is aangepast om afzonderlijk assay opgeroepen, spontane en miniatuur synaptic cyclus activiteiten (met uiterst gevoelige apparatuur op te sporen van zeer kleine fluorescentie wijzigingen en verminderen photobleaching)10. Testen kunnen worden uitgebreid tot de ultrastructureel niveau door photoconverting de fluorescerende FM-signaal in een elektron-dichte label voor Transmissie Electronenmicroscopie11,12,13,14 .

Historisch, de synaptische preparaten zwemmen in een hoog gehalte aan kalium (hierna te noemen "hoge [K+]") is de methode van keuze voor depolarizing stimulatie om te induceren SV fietsen; de kikker cholinerge NMJ5, variërend tot gekweekt knaagdier hersenen hippocampal neuronen15, de Drosophila glutamaterge NMJ model16,17. Deze hoge [K+] aanpak is eenvoudig, vereist geen gespecialiseerde apparatuur, en daarom de meeste labs toegankelijk is, maar heeft beperkingen voor zowel de toepassing en de interpretatie van de gegevens. Een veel meer fysiologisch geschikte methode is het gebruik van zuiging elektrode elektrische stimulatie van de nervus4,5,12. Deze aanpak drijft actiepotentiaal vermeerdering voor directe stimulatie van de presynaptische zenuw terminal, en resultaten kunnen direct worden vergeleken met elektrofysiologische testen van transmissie functie13,14, 15, maar vereist gespecialiseerde apparatuur en is technisch veel moeilijker. Met de komst van optogenetics heeft het gebruik van neuronale stimulatie van de channelrhodopsin extra voordelen, met inbegrip van strakke Spatio controle van kanaal expressie met behulp van de binaire Gal4/UAS systeem20. Deze aanpak is technisch veel gemakkelijker dan zuig elektrode stimulatie en vereist niets meer dan een zeer goedkope LED lichtbron. Hier, gebruiken we beeldvorming van FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) tot en met zowel vergelijken en het contrast van deze drie methoden van de verschillende stimulatie bij de Drosophila NMJ: eenvoudige hoge [K+ ], uitdagende channelrhodopsin van elektrische en nieuwe benaderingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. de larvale lijm dissectie

  1. Grondig Meng 10 delen van silicone-elastomeer basis met 1 deel van silicone-elastomeer genezen van de agent uit de elastomeer kit (Tabel van materialen).
  2. 22 x 22 mm glas coverslips met de elastomeer en genezen op een hete plaat op 75 ˚C jas voor enkele uren (tot niet meer plakkerig aanvoelt).
  3. Plaats een dekglaasje enkel elastomeer-gecoat glas aan in de op maat gemaakte plexi glas dissectie kamer (Figuur 1, beneden) ter voorbereiding van de larvale dissectie.
  4. De lijm pipetten van borosilicaatglas capillair met behulp van een standaard micro-elektrode trekker te verkrijgen van de gewenste conus en tip grootte voor te bereiden.
  5. Zachtjes breken uit de micropipet tip, en aan het andere eind, koppelen van 2 ft van flexibele kunststof buis (1/32" inwendige diameter, ID 3/32" buitendiameter, OD; 1/32" muur; Tabel van materialen) met mond montage (P2 Pipetteer tip).
  6. Vul een kleine container (0,6 mL Eppendorf buis GLB) met een kleine hoeveelheid (~ 20 µL) lijm (Tabel of Materials) ter voorbereiding van de larvale dissectie.
  7. De kamer vullen met zoutoplossing (in mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl21 CaCl2, 70 sacharose en 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic zuur (HEPES) pH 7,2.
  8. Toevoegen van anti-paard radijs peroxidase (HRP) antilichaam geconjugeerd met Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647, verdund 1:10 uit een voorraad van 1 mg/mL) voor het labelen van de NMJ presynaptische terminal tijdens dissectie21,22.
  9. Met behulp van een fijn penseel (maat 2), een dolende derde instar uit de voedsel-flacon verwijderen en plaatsen op de cover elastomeer-gecoat glas.
  10. Vul het glas micropipet uiteinde met een klein volume van lijm met behulp van negatieve luchtdruk gegenereerd door mond met bijlage (stap 1.5).
  11. Positie larve dorsale kant naar boven met pincet en lijm het hoofd naar het dekglaasje elastomeer beklede aan met een kleine druppel lijm positieve luchtdruk via mond.
  12. Herhaal deze procedure met het achterste uiteinde van de larve, om ervoor te zorgen dat het dier wordt uitgerekt strak tussen de twee bijlagen van de lijm.
  13. Met behulp van schaar (bladen 3 mm; Tabel van materialen), maak een horizontale snede (~ 1 mm) op posterior en een verticale snee langs de dorsale middellijn.
  14. Met behulp van fijne pincet (#5, Tabel of Materials), zachtjes verwijderen dorsale luchtpijp, gut, vet lichamelijk en andere inwendige organen die betrekking hebben op de daaraan gehechte spiermassa.
  15. Herhaal de lijmen procedure voor de vier kleppen van lichaam muur, ervoor zorgend om voorzichtig rekken de muur van de instantie zowel horizontaal als verticaal.
  16. Til het ventrale zenuw snoer (VNC) met behulp van Tang, zorgvuldig de motorzenuwen knip met de schaar en de VNC vervolgens volledig te verwijderen.
  17. Vervangen door de dissectie saline Ca2 +-zoutoplossing (hetzelfde als de bovenstaande dissectie saline zonder de CaCl2) om te stoppen met SV gratis fietsen.

2. optie 1: High [K+] FM kleurstof laden

  1. Van een stamoplossing van FM1-43 (4 mM), voeg 1 µL tot 1 mL van 90 mM KCl oplossing (hoog [K+] in een dissectie zoutoplossing) voor een eindconcentratie van 4 µM.
  2. Met behulp van een precisiepipet, vervangen de Ca2 +-gratis zoutoplossing in de beeldvorming zaal met de hoge [K+] FM kleurstof oplossing voor het stimuleren van SV endocytose kleurstof opname.
  3. Onmiddellijk beginnen met een digitale timer voor de vooraf vastgestelde duur van de hoge [K+] depolarizing stimulatie periode (bijv., 5 min; Figuur 2).
  4. Opmerking de sterke samentrekkingen van de spieren voor de duur van de hoge depolarisatie [K+] om te bevestigen een gezonde larvale voorbereiding.
  5. Wanneer de timerperiode afloopt, snel de hoge [K+] FM kleurstof oplossing verwijderen en vervangen met Ca2 +-gratis zoutoplossing om te stoppen met SV fietsen.
  6. Wassen snel achter elkaar met de Ca2 +-gratis saline (5 x voor 1 min) om ervoor te zorgen de hoge [K+] FM kleurstof oplossing volledig is verwijderd.
  7. Handhaven van de larvale voorbereiding in verse Ca2 +-gratis saline voor onmiddellijke beeldbewerking met de confocal microscoop.

3. beeldvorming: Confocale microscopie

  1. Gebruik een rechtop confocal microscoop met een 40 X water onderdompeling doelstelling naar afbeelding NMJ kleurstof fluorescentie (andere microscopen kunnen worden gebruikt).
  2. Afbeelding muscle 4 NMJ van abdominale segmenten 2-4 (andere NMJs kunnen worden beeld) en het verzamelen van beelden met behulp van de juiste software (Tabel van materialen).
  3. Gebruik een HeNe 633 nm laser te wekken HRP:647 (met long pass filter > 635 nm) en een Argon 488 nm laser te prikkelen FM1-43 (met bandfilter filter 530-600 nm).
  4. Operationeel bepalen optimale winst en verschuiving voor beide kanalen.
    Opmerking: Deze instellingen blijft constant in de rest van het experiment.
  5. Neem een confocal Z-stapel door het hele geselecteerde NMJ van HRP-gemarkeerd boven naar beneden van de synaptische terminal.
  6. Neem nota van de NMJ beeld (segment, kant en spieren) om ervoor te zorgen om de exacte dezelfde NMJ overtollige nadat FM kleurstof lossen.

4. hoge [K+] stimulatie: FM kleurstof lossen

  1. Vervanging van Ca2 +-gratis zoutoplossing met de hoge [K+] saline (zonder FM1-43 kleurstof) naar station depolarisatie, SV exocytose en kleurstof vrijlating.
  2. Onmiddellijk beginnen met een digitale timer voor de vooraf vastgestelde duur van de hoge [K+] stimulatie periode (bijv., 2 min; Figuur 2).
  3. Wanneer de timerperiode afloopt, onmiddellijk de hoge [K+] saline verwijderen en te vervangen met Ca2 +-gratis zoutoplossing om te stoppen met SV fietsen.
  4. Wassen ter vlug successie met Ca2 +-gratis saline (5 x voor 1 min) om ervoor te zorgen de hoge [K+] saline is volledig verwijderd.
  5. Handhaven van de larvale voorbereiding in verse Ca2 +-gratis saline voor onmiddellijke beeldbewerking met de confocal microscoop.
  6. Er zeker van zijn om het imago van de FM1-43 kleurstof fluorescentie bij de dezelfde NMJ hierboven met dezelfde confocal instellingen.

5. optie 2: Elektrische stimulatie FM kleurstof laden

  1. Bereiden een zuig Pipetteer met behulp van de micro-elektrode trekker (Tabel of Materials) te verkrijgen van de vereiste conus en tip van grootte.
  2. Brand-Pools het puntje van de micro-elektrode met een micro-forge totdat een interne motor zenuw kan worden opgezogen met een strakke pasvorm.
  3. Schuif zuig pipet op de elektrode-houder op een micromanipulator en hechten aan de lange flexibele kunststof buis en een spuit.
  4. Stimulator parameters instellen (bijv., 15 V, 20 Hz frequentie, 20 ms duur en het tijdstip van 5 min (Figuur 2) of 1 min (Figuur 3)).
  5. Vervang de Ca2 +-gratis zoutoplossing op de larvale voorbereiding met boven FM1-43 saline (4 µM; 1 mM CaCl2) op de elektrofysiologie tuig.
  6. Zet de voorbereiding op het stadium van de Microscoop en verhogen het werkgebied totdat de larve en zuig pipet focus (40 X water-onderdompeling doelstelling zijn).
  7. Zuigen op een lus van gesneden motorische zenuw innervating van de geselecteerde hemisegment met negatieve luchtdruk gegenereerd door de spuit in de zuig elektrode.
  8. De functie van de zuigkracht elektrode met een korte uitbarsting van stimulatie tijdens het visueel monitoring voor de spiercontractie in de geselecteerde hemisegment te testen.
  9. Het stimuleren van de motorische zenuw met behulp van geselecteerde parameters (stap 5.4) rijden SV endocytose en FM1-43 kleurstof opname (Figuur 2).
  10. Wassen ter vlug successie met Ca2 +-gratis saline (5 x voor 1 min) om ervoor te zorgen dat de oplossing van de kleurstof FM1-43 volledig is verwijderd.
  11. Handhaven van de larvale voorbereiding in verse Ca2 +-gratis saline voor onmiddellijke beeldvorming met behulp van de confocal imaging protocol van bovenaf.
  12. Neem nota van de NMJ beeld (segment, kant en spier) om te zorgen voor toegang tot de exacte dezelfde NMJ na FM kleurstof lossen.

6. elektrische stimulatie: FM kleurstof lossen

  1. Vervang de Ca2 +-gratis zoutoplossing met regelmatige saline (zonder FM1-43 kleurstof) en de voorbereiding terug in de elektrofysiologie tuig werkgebied te plaatsen.
  2. De parameters van de stimulator voor lossing (bv15 V, 20 Hz frequentie, 20 ms duur en het tijdstip van 2 min (Figuur 2) of 20 s (Figuur 3)).
  3. Zuigen de dezelfde motor zenuw in de dezelfde elektrode zoals hierboven beschreven, en vervolgens stimuleren SV exocytose en FM1-43 kleurstof versie te activeren.
  4. Wassen ter vlug successie met Ca2 +-gratis saline (5 x voor 1 min) om ervoor te zorgen dat de externe kleurstof wordt volledig verwijderd.
  5. Handhaven van de larvale voorbereiding in verse Ca2 +-gratis saline voor onmiddellijke beeldbewerking met de confocal microscoop.
  6. Zorgen naar image de FM1-43 kleurstof fluorescentie bij de dezelfde NMJ hierboven met dezelfde confocal instellingen.

7. optie 3: Channelrhodopsin stimulatie FM kleurstof laden

  1. ChR2-uiten larven op levensmiddelen die de ChR2 co-factor all-trans retinal (opgelost in ethanol; 100 µM eindconcentratie) te verhogen.
  2. Plaats de larvale voorbereiding in de zaal plexiglas werkgebied een dissectie Microscoop voorzien van een poort van de camera.
  3. Hechten van een blauwe LED (470 nm; Tabel van materialen) aan een programmeerbare stimulator met behulp van een coaxiale kabel en plaats de LED in de poort van de camera.
  4. Focus de blauwe LED lichtbundel op de ontleed larvale functie met behulp van de Microscoop zoom-functie.
  5. Vervang de Ca2 +-gratis zoutoplossing op de larvale voorbereiding met boven FM1-43 saline (4 µM; 1 mM CaCl2) in het werkgebied optogenetic.
  6. Instellen van de parameters van de LED met behulp van de stimulator (bv15 V, 20 Hz frequentie, 20 ms duur en het tijdstip van 5 min (Figuur 2)).
  7. Start de lichte stimulatie en bijhouden met een timer voor de vooraf vastgestelde duur van de periode van optogenetic stimulatie (bijv., 5 min; Figuur 2).
  8. Wanneer de timer stopt, snel de FM kleurstof oplossing verwijderen en vervangen met Ca2 +-gratis zoutoplossing om te stoppen met de SV fietsen.
  9. Wassen snel achter elkaar met de Ca2 +-gratis saline (5 x voor 1 min) om de FM kleurstof oplossing volledig is verwijderd.
  10. Handhaven van de larvale voorbereiding in verse Ca2 +-gratis saline voor onmiddellijke beeldbewerking met de confocal microscoop met behulp van imaging protocol van bovenaf.
  11. Neem nota van de NMJ beeld (segment, kant en spier) om te zorgen voor toegang tot de exacte dezelfde NMJ na FM kleurstof lossen.

8. Channelrhodopsin stimulatie: FM kleurstof lossen

  1. Vervanging van Ca2 +-gratis zoutoplossing met regelmatige saline (zonder kleurstof FM1-43) in het werkgebied van de Microscoop dissectie met camera poort LED gericht op de larve.
  2. De stimulator parameters instellen voor lossen (bijvoorbeeld 15 V, 20 Hz frequentie, 20 ms duur en het tijdstip van 2 min (Figuur 2)).
  3. Start de lichte stimulatie en bijhouden met een timer voor de vooraf vastgestelde duur van de periode optogenetic stimulatie (bijvoorbeeld 2 min; Figuur 2).
  4. Wanneer de timerperiode afloopt, snel de FM kleurstof oplossing verwijderen en vervangen met Ca2 +-gratis zoutoplossing om te stoppen met de SV fietsen.
  5. Wassen ter vlug successie met Ca2 +-gratis saline (5 x voor 1 min) om ervoor te zorgen dat de externe kleurstof wordt volledig verwijderd.
  6. Handhaven van de larvale voorbereiding in verse Ca2 +-gratis saline voor onmiddellijke beeldbewerking met de confocal microscoop.
  7. Zorgen naar image de FM1-43 kleurstof fluorescentie bij de dezelfde NMJ hierboven met dezelfde confocal instellingen.

9. fluorescentie kwantificering

  1. Laden van de afbeelding in afbeelding J (NIH open bron) en een maximale intensiteit projectie maken door te klikken op afbeelding | Stapels | Z-Project.
  2. Met behulp van de anti-HRP:647 kanaal, ga naar afbeelding | Aanpassen | Drempel en schuif de bovenste werkbalk totdat alleen de NMJ is ge-highlight.
  3. Klik met het gereedschap Toverstaf op de NMJ. Als de NMJ discontinue, houd de Shift-knop en selecteer alle onderdelen.
  4. Wijzig de afbeelding naar het kanaal van de kleurstof FM1-43 en gaan analyseren | Maatregel te verkrijgen van de fluorescentie-meting.
  5. Herhaal stap 9.1-9.4 voor het "gelost" beeld van de dezelfde NMJ (geïdentificeerde segment, kant en spieren).
  6. Nemen voor het verkrijgen van het percentage van de kleurstof die werd gelost, de verhouding van de intensiteit van de fluorescentie gelost/geladen.
    Opmerking: Deze procedure kan worden aangepast voor het analyseren van de fluorescentie op basis van bouton-per-bouton met behulp van de "ovale" of "freehand" selectiegereedschappen. Achtergrond-fluorescentie kan worden afgetrokken door bemonstering van de fluorescentie van de spier. Agenten kunnen ook worden toegevoegd aan het verminderen van deze achtergrond.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figuur 1 toont de werk-stroom voor de activiteit-afhankelijke FM kleurstof imaging protocol. Het experiment begint altijd met de zelfde larvale lijm dissectie, ongeacht de methode van de stimulatie vervolgens gebruikt. Figuur 1a is een schematische voorstelling van een ontleed larve, toont het ventrale zenuw snoer (VNC), zenuwen en herhaalde hemisegmental spier patroon te stralen. De VNC wordt verwijderd en de voorbereiding badend in een oplossing van 4 µM van FM1-43 (Figuur 1b, roze). Het preparaat wordt vervolgens gestimuleerd in aanwezigheid van de kleurstof van de FM met behulp van een van de drie mogelijke opties voor het laden van de kleurstof via activiteit-afhankelijke SV endocytose (figuur 1cI-III). Volgende, FM kleurstof fietsen is gearresteerd met Ca2 +-gratis zoutoplossing en een specifieke NMJ terminal die is geladen met FM kleurstof image is gemaakt met behulp van een confocal microscoop ("geladen afbeelding"; Figuur 1 d). In dit geval, de spier die 4 NMJ is geselecteerd met de schematisch weergegeven: plaatsing van de zenuw, NMJ terminal vertakking en FM-geladen synaptic los. De synaptische voorbereiding wordt voor een tweede keer gebruikend de zelfde methode geselecteerd van boven, maar bij gebrek aan FM kleurstof te rijden SV exocytose en FM1-43 release (Figuur 1e) gestimuleerd. Hetzelfde geïdentificeerd NMJ (spier 4 NMJ in dit voorbeeld) wordt vervolgens opnieuw beeld met behulp van het HRP:647 synaptic label en de resterende FM1-43 vesikel signaal ("gelost afbeelding"; Figuur 1f). De experimentator bepaalt de sterkte en de duur van het laden en lossen van de fasen voor het optimaliseren van de metingen voor een specifieke bepaling of de mutant voorwaarde. Intensiteit van de fluorescentie wordt gekwantificeerd na het laden en lossen (Figuur 1 d, 1f), geladen met het oog op de meting van de synaptische kleurstof endocytose, exocytose en het percentage van FM kleurstof uitgebracht. Analyses kunnen worden gedaan voor de gehele NMJ of één los.

FM kleurstof fietsen kan worden gestimuleerd op drie manieren: 1) hoge [K+] zoute depolarisatie van de hele voorbereiding, 2) zuig elektrode stimulatie van de motorische zenuw, of 3) licht gedreven activering van gerichte channelrhodopsin (ChR2; Figuur 2). Voor een directe side-by-side vergelijking van alle drie de methoden, we gestimuleerd met elke benadering voor 5 min in aanwezigheid van FM1-43 (laden) en vervolgens gedurende 2 min. in de afwezigheid van FM1-43 (lossen), en beeld HRP-label NMJs met behulp van identieke confocal instellingen ( Figuur 2). De hoge [K+] zoute depolarisatie methode volgt het gebruikte FM1-43-protocol voor de Drosophila larvale NMJ23, behalve lijm we in plaats van de pinnen voor de larvale dissectie gebruiken. De lijm vermijdt de interferentie met de doelstellingen van de Microscoop en kan nauwkeuriger bepaling van de muur van het lichaam spanning, maar vereist een matige leercurve. Alle drie de methoden produceren sterke en consistente fluorescerende signalen gedurende de NMJ synaptic bouton arbor en binnen afzonderlijke synaptic los (openingen). De hoge [K+] zoute depolarisatie methode zorgt ervoor dat alle NMJs als FM-geladen in de larve zoals het depolarizes elk neuron in het dier (figuur 2A, midden). De zenuw zuig elektrode elektrische stimulatie methode rijdt alleen in een enkele hemisegment van de larven waarvoor de overeenkomstige innervating motorische zenuw is gestimuleerd (figuur 2B, midden). Ongestimuleerde segmenten in hetzelfde dier zijn te onderscheiden met het label HRP maar bevatten geen waarneembare fluorescente kleurstof laden, en dienen als uitstekende interne controles. De optogenetic ChR2 methode produceert gerichte depolarisatie afhankelijk van de transgene Gal4 bestuurder werkzaam (figuur 2C). De bestuurder was hier een vesiculaire glutamaat transportwagen (vglut) Gal4, zodat alle glutamaterge neuronen zijn depolarized met blauw licht stimulatie, met inbegrip van alle de glutamaterge motorische neuronen. Dientengevolge, worden alle NMJs geladen met FM1-43 kleurstof in dit voorbeeld (figuur 2C, midden). Cel-specifieke stuurprogramma's kunnen worden gebruikt om specifieke NMJs label en laat anderen ongelabelde voor een interne controle.

FM kleurstof lossen werd bereikt via dezelfde methode die werd gebruikt om te laden kleurstof. In de eerste methode, was de larvale voorbereiding gewoon badend in een hoge [K+] zoutoplossing in de afwezigheid van FM1-43 depolarize cellen, station SV exocytose, en lossen van de synaptische terminals (figuur 2A, rechts). Meestal kiezen we een kortere lossen periode (2 min), dus lossen is gedeeltelijke en terminals blijven zichtbaar in het FM-kanaal. Zuig elektrode elektrische stimulatie lossen is aanzienlijk moeilijker, omdat het gaat om terug te keren naar de dezelfde hemisegment, het identificeren van de dezelfde zenuw, en het opnieuw stimuleren dat zenuw in de afwezigheid van FM1-43 te rijden van de kleurstof lossen (figuur 2B , rechts). Merk op dat de kleurstof lossen weer gedeeltelijk was. Het lossen van de ChR2 met zich meebrengt een tweede periode van blauwe LED-verlichting van de larvale voorbereiding in de afwezigheid van FM1-43 te activeren van de kanalen, depolarize van de motorische neuronen en stimuleren SV exocytose kleurstof vrijkomen (figuur 2C, rechts). Met deze tijdschaal van lossen (2 min), depolarisatie elk van deze methoden gelost slechts een percentage van de geladen FM1-43 kleurstof, met de hoge [K+] sterkste en ChR2 zwakste in het rijden van kleurstof release (Figuur 2). We meten de LED licht intensiteit gebruikt (140 μW/mm2), die in de gepubliceerde reeks (20-1000 μW/mm2)24,25,26was. ChR2 wordt het maximaal geactiveerd door ~ 1 mW verlichting van 50-200 mW lichtbronnen, met ChR2 doeltreffendheid ook afhankelijk van de concentratie van de ATR gevoed larve27,28. Dus kan ChR2 stimulatie sterkte worden gemanipuleerd. Bovendien kan de relatie niet blijven waar met andere sterke stimulatie, termijnen of genotypen. Als de experimentator werkt met een mutant die SV endocytose is afgenomen of ongewoon snel exocytose, wellicht de stimulatie parameters worden gewijzigd om een waarneembare signaal na het lossen. Het anti-HRP-label maakt het mogelijk om het identificeren van de NMJ zelfs in de afwezigheid van het FM-signaal, maar dit is niet ideaal voor kwantificering. In principe zou de lossen stimulatie ook van een andere aard dan de laden stimulatie.

Wij onderzocht onlangs het verlies van de secreted synaptische deacylase Notum effecten op de cyclus van de SV met behulp van elektrische stimulatie4. Hier, breiden we deze analyse om te vergelijken 1) kwalitatief [K+] depolarisatie en 2) zuig elektrode motorische zenuw stimulatie methoden (Figuur 3). Wij vinden dat beide methoden geven een soortgelijk resultaat, weergegeven: verminderd FM1-43 kleurstof laden in een Notum null mutant; de mate van het fenotype is echter verschillend tussen de twee methoden. Na de depolarisatie met hoge [K+] saline gedurende vijf minuten is er een grote daling in geladen fluorescentie intensiteit tussen genetische achtergrond controle (w1118) met hoge niveaus en Notum null mutanten (NotumKO ) met een laag (figuur 3A, top). In kwantitatieve metingen, is genormaliseerde intensiteit van de fluorescentie van de FM binnen HRP-geschetst NMJ terminals aanzienlijk verminderd bij gebrek aan Notum (w1118 1,0 ± 0,05 vs. NotumKO 0,57 ± 0,07; n≥13, p < 0.0001; Figuur 3B). Na de elektrische stimulatie bij 20 Hz voor 1 min vinden we een geringe afname van de geladen FM1-43 intensiteit tussen besturingselementen en Notum Null-waarden wanneer het kwantificeren van de hele NMJ fluorescentie (w1118 1,0 ± 0,05 vs. NotumKO 0,86 ± 0,06; n = 8, p = 0,10; Figuur 3A, B). Bij het meten van kleurstof opneming op basis van de bouton-per-bouton, vinden we een significante afname van de kleurstof geladen met beide methoden. In kwantitatieve metingen na stimulatie met hoge [K+] saline, genormaliseerde intensiteit van de fluorescentie van de FM per bouton is sterk gedaald (w1118 1.0 ± 0,02 vs. NotumKO 0.52 ± 0,02; n≥241, p< 0.0001; Figuur 3 c). Na de elektrische stimulatie, genormaliseerde fluorescentie intensiteit per bouton is ook aanzienlijk afgenomen, zij het in een lagere graad (w1118 1.0 ± 0,02 vs. NotumKO 0.83 ± 0,02; n≥127, p< 0,0001; Figuur 3 c).

De resultaten verschillen tussen de twee stimulatie-paradigma's zou kunnen zijn als gevolg van een aantal factoren. Ten eerste, de sterkte van de stimulatie wordt geacht te zijn groter met hoge [K+] in vergelijking met elektrische motor zenuwstimulatie. Elektrofysiologie opnames kunnen niet gebeuren in aanwezigheid van de hoge [K+] saline, maar de larvale neuromusculature is duidelijk krachtig gestimuleerd, zoals spiersamentrekkingen sterke en voortdurende gedurende 5 minuten zwemmen zijn. We weten echter niet de kracht of de frequentie van de stimulatie. De elektrische stimulatie wordt daarentegen veel meer gecontroleerd met de gebruiker die het kiezen van de juiste spanning kracht en frequentie van stimulatie. Ten tweede, de duur van de stimulatie was langer met hoge [K+] in vergelijking met elektrische zenuwstimulatie (Figuur 3). We kozen voor 1 min van 20 Hz elektrische stimulatie na herhaalde proeven. Na 1 min van kleurstof laden was er een sterke en betrouwbare FM1-43-signaal, zodat we die paradigma koos voor onze studie4, hoewel 5 min van stimulatie gaf een nog sterkere fluorescent signaal (Figuur 2). Aldus, de lengte van het paradigma van de stimulatie is waarschijnlijk bij te dragen aan de omvang variabiliteit in FM1-43 laden tussen hoge [K+] en elektrische stimulatie (figuur 3B, C). Hoewel de hoge [K+]-methode bleek een robuustere fenotype voor Notum mutanten, hebben we nog de elektrische methode vanwege de grotere controle4gebruikt. Er zijn vele parameters te bepalen zoals kracht, frequentie en duur van de stimulatie, en deze instellingen moeten worden besloten op basis van de mutant en de vraag. Bijvoorbeeld de keuze van de methode stimulatie kan afhangen van de SV zwembad ondervraagd7 en het mechanisme van activiteit-afhankelijke onderzocht10.

Na FM1-43 laden in de NMJ terminal, kunt een gebruikmaken van fluorescentie kleurstof photoconversion voor de productie van het elektron-dichte signaal voor elektronenmicroscopie (Figuur 4). Bij deze methode wordt wordt de kleurstof-geladen voorbereiding blootgesteld aan intense tl-licht in aanwezigheid van diaminobenzidine (DAB), met de reactieve zuurstof soorten uit de kleurstof van de FM oxiderende de schar als u wilt maken een donkere neerslag (figuur 4A)11. Raadpleeg het artikel JoVE over photoconversion van styryl kleurstoffen voor volledige details12. Het voordeel van deze methode is dat SVs duidelijk worden onthuld op ultrastructureel niveau, hoewel de SV-cyclus is natuurlijk gearresteerd met statische elektronenmicroscoop beeldvorming. Bij gebrek aan stimulatie, synaptic los op de Drosophila NMJ dichtbevolkte met blaasjes worden geladen (~ 40 nm in diameter; Figuur 4B), met de zeldzame gebeurtenis van uitgebreide organellen (>100 nm diameter) geacht fietsen Endosomen. Hoge [K+] zoutoplossing depolarizing stimulatie sterk verandert dit profiel, met een gedeeltelijke uitputting van de SV-bevolking en de snelle accumulatie van talrijke uitgebreide organellen (>100 nm diameter) dacht dat om te bulk ontlenen endocytose van het plasma-membraan (figuur 4C, links). Hoewel vergelijkbare compartimenten bestaan in ongestimuleerde besturingselementen, verhoogt de hoge dichtheid van deze organellen na hoge [K+] zoute depolarisatie de bezorgdheid dat dit kan een niet-fysiologische respons. Zuig elektrode elektrische stimulatie van de motorische zenuw relatief meer efficiënt in het afbreken van de SV-bevolking en leidt niet tot meer van de uitgebreide endosomal blaasjes (Figuur 4 d, links). Dit suggereert dat de bulk endocytose gedreven door hoge [K+] depolarisatie helpt handhaven van de SV bevolking tijdens intenser vraag.

FM1-43 photoconversion kan worden bereikt met behulp van hoge [K+] zoute depolarisatie of zuig elektrode elektrische stimulatie van de motorische zenuw, vergelijken van synaptic ultrastructuur ten opzichte van een rust bouton (Figuur 4). Met hoge [K+] depolarizing stimulatie, zowel individuele SVs en uitgebreide blaasjes (>100 nm diameter) kan worden aangeduid met het elektron-dichte DAB overhaaste volgende licht gestuurde photoconversion (figuur 4C, rechts). Om onbekende redenen is het uitgebreide vesikel membraan doorgaans minder dichtbevolkte gelabelde dan de kleinere SV-membraan. Bovendien, SVs verschijnen vaak gevuld met het DAB neerslag, eerder dan enkel het membraan, maar dit maakt ze veel makkelijker te onderscheiden van de labelloze blaasjes. Zuig elektrode stimulatie van de motorische zenuw, kan de fietsen SV bevolking ook gemarkeerd ten opzichte van labelloze SVs (Figuur 4 d, rechts). Met elektrische stimulatie, vergroot blaasjes (>100 nm diameter) zijn niet detectably gevormd in Los en consequent, de membranen van de vermoedelijke Endosomen zijn niet gelabeld door FM1-43 photoconversion. Als zijn boven, Fietsen SVs meestal gevuld met de DAB neerslag in een enigszins all-or-none mode, en daarom gemakkelijker te onderscheiden van SVs die niet zijn gevormd tijdens de stimulatie (Figuur 4 d, rechts). Wij hebben photoconversion na stimulatie van de ChR2 nog niet geprobeerd. Met verschillende tijdsverloop van stimulatie, FM1-43 kleurstof photoconversion maakt het mogelijk om te bepalen waar de SVs worden gevormd, hoe SVs worden verhandeld en de timing van de beweging tussen de verschillende ruimtelijke mediagroepen binnen de synaptische bouton. De vergelijking van de hoge [K+] en zenuwstimulatie kunt de dissectie van bulk en één SV endocytose mechanismen.

Figure 1
Figuur 1: Een stroomschema met FM1-43 kleurstof protocol op de Drosophila NMJ laden. De larvale lijm dissectie produceert een afgevlakte neuromusculature preparaat, met het ventrale zenuw snoer (VNC) lichaam muur projecteren regiogebonden zenuwen van de ventral midline (Vm) aan de hemisegmentally herhaald spier matrices (stap een). De VNC is gratis knippen, en de hele larvale dissectie is vervolgens geïncubeerd in de roze FM1-43-oplossing (4 µM) in voorbereiding voor stimulatie (stap b). FM1-43 wordt dan geladen met een geselecteerde stimulatie paradigma (stap 3); met de opties van hoge [K+] depolarisatie van de gehele larve (cI), zuignap elektrode stimulatie van een interne motor zenuw (cII) of licht gestuurde activering van zeer gerichte channelrhodopsin (cIII). FM1-43 opneming is gearresteerd met Ca2 +-gratis zoutoplossing en de kleurstof-geladen NMJ beeld (stap d). Een tweede stimulatie is het dan gedaan zonder FM1-43 in het bad te rijden kleurstof synaptic vesikel exocytose (stap e). De dezelfde NMJ is vervolgens opnieuw beeld om te assay de gelost synaptic terminal (stap f). Fluorescerende intensiteit wordt gemeten vanaf zowel geladen en gelost NMJs te kwantificeren endocytose SV en SV exocytose niveaus. Het onderste paneel toont de parameters van de constructie en de afmetingen voor de transparante acrylaat kamer gebruikt voor deze studies. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2: FM kleurstof laden en lossen vergelijking van alle methoden van de stimulatie. Vergelijking van FM1-43 kleurstof laden en lossen in de dolende derde instar NMJ met 1) hoge [K+] depolarisatie van het gehele larvale preparaat (boven), 2) zuignap elektrode elektrische stimulatie van de motorische zenuw (midden) en 3) op licht gestuurde activering van de gerichte channelrhodopsin (ChR2) alleen in motorische neuronen (onder). (A) de larvale NMJ aangeduid met de anti-HRP:647 presynaptische membraan marker (blauw, links), geladen met FM1-43 via hoge [K+] depolarisatie voor 5 min (midden) en vervolgens gelost via hoge [K+] depolarisatie voor 2 min. (B) Vergelijking met zuig elektrode elektrische zenuwstimulatie met dezelfde tijdvakken stimuli voor beide FM1-43 kleurstof laden en lossen. (C) gericht vglut-Gal4>UAS-ChR2-H134R expressie in motorische neuronen geactiveerd met blauw (470 nm) licht voor dezelfde stimuli tijdvakken van FM1-43 kleurstof laden en lossen. Sterretjes verwijzen naar inzetstukken weergeven van hogere vergroting los. De bar van de schaal is 10 µm, met verzonken synaptic los uitgebreid 3.5 X van belangrijkste panelen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 3
Figuur 3: Notum null mutanten Toon verlaagd FM kleurstof laden in synaptic los. FM1-43 in synaptic terminals van het zwerven geladen instar derde NMJ vergelijken de genetische controle (w1118) naar Notum null mutanten (NotumKO). (A) NMJ los aangeduid met hoge [K+] depolarisatie van hele larvale voorbereiding (boven) of zuig elektrode stimulatie van een motorische zenuw (onder) in w1118 (links) en NotumKO (rechts). (B) gekwantificeerde geladen FM1-43 fluorescentie per NMJ als een vergelijking van de hoge [K+] depolarisatie en zuig elektrode stimulatie in w1118 besturingselementen vs. NotumKO mutanten scatterplot. (C) gekwantificeerde geladen fluorescentie op basis van de bouton-per-bouton als een complot van de vak-en-whisker vergelijken hoog [K+] depolarisatie en zuig elektrode stimulatie in w1118 besturingselementen vs. NotumKO . Student van tweezijdige t-tests werden uitgevoerd voor elke vergelijking met p-waarden die worden weergegeven op de grafieken. Balken geven gemiddelde ± SEM gemaakt met Prism (versie 7.0 voor Windows). De elektrische stimulatie gegevens is aangepast met toestemming van Kopke et al.., ontwikkeling 144 (19): 3499-510, 2017. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 4
Figuur 4: Synaptic ultrastructuur met FM kleurstof photoconversion ter gelegenheid van de blaasjes. Fluorescerende FM1-43 kan worden photoconverted aan een geoxideerde diaminobenzidine (DAB) elektron-dichte neerslag voor visualisatie via transmissie-elektronenmicroscopie (TEM). (A) A schematisch diagram van de photoconversion-methode voor het label van de Drosophila NMJ na activiteit-afhankelijke FM1-43 kleurstof laden. (B) vertegenwoordiger TEM afbeelding van een bouton wildtype synaptic in rust (ongestimuleerde). Opmerking de dichte bevolking van uniform en middelgrote SVs. (C) Synaptic los die gestimuleerd hebben al met hoge [K+] zoute depolarisatie voor 5 min, zonder photoconversion (links) of met FM1-43 photoconversion (rechts). Opmerking de aanwezigheid van bulk endosomal structuren, label en ongelabelde. (D) Synaptic los die hebben al elektrisch gestimuleerd met een zenuw zuignap elektrode bij 20 Hz voor 5 min met geen photoconversion (links) of met FM1-43 photoconversion (rechts). Merk op dat de blaasjes kleurstof-geladen veel donkerder dan aangrenzende gelost blaasjes verschijnen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Hoge [K+] zoute depolarizing stimulatie is veruit de eenvoudigste van de drie opties voor activiteit-afhankelijke FM kleurstof fietsen, maar waarschijnlijk de minste fysiologische29. Deze eenvoudige methode depolarizes elke toegankelijk cel in het hele dier, en dus kan geen gerichte studies. Het mogelijk toe te passen lokaal hoog [K+] zoutoplossing met een micropipet, maar dit zal nog steeds depolarize pre/postsynaptisch cellen en waarschijnlijk synapse-geassocieerde glia1. Een andere belangrijke zorg is dat hoge [K+] depolarisatie stations vorming snelle van bulk Endosomen die slechts zelden in ongestimuleerde los gezien. Bulk endosome formatie is echter een actief mechanisme geblokkeerd door mutaties29, met vermelding van een echte fysiologisch proces. Dus, FM1-43 beeldbewerking met hoge [K+] depolarisatie kan worden gebruikt om selectief studie bulk endocytose op synapsen. Zuig elektrode elektrische stimulatie van de motorische zenuw is een veel meer gecontroleerde methode. Het heeft het voordeel dat slechts een enkele axon bundel wordt gestimuleerd, en alleen de presynaptische termini is rechtstreeks depolarized (natuurlijk de spiervezel is dan depolarized door zender actie). Het biedt daarom een grote interne controle van de NMJs in hetzelfde dier dat niet worden gestimuleerd. Deze methode kan men de stimulatie parameters, in tegenstelling tot de hoge [K+] stimulatie methode, waardoor directe vergelijking met electrofysiologie opnames4zorgvuldig te beheren. Echter, deze techniek vereist gespecialiseerde apparatuur en een vrij hoog niveau van technische vaardigheid, en daarom minder toegankelijk is. Licht gestuurde activering van gerichte channelrhodopsin (ChR2) heeft het voordeel van targeting select neuronen30. Deze methode vereist geen vertrouwdheid met electrofysiologie methoden, en met zeer goedkope apparatuur in een laboratorium kan gebeuren, maar deze aanpak vereist fundamentele vertrouwdheid met Drosophila genetica.

De keuze van de parameters van de stimulatie is uitermate belangrijk voor het testen van SV cyclus dynamics opgevraagd binnen een scala van genetische omstandigheden met zeer variabel fenotypen1. Voor alle methoden, de externe [Ca2 +] gebruikt is een belangrijke parameter beheersen de drijvende kracht van SV fietsen. Met de hoge [K+] stimulatie-methode, is een belangrijke keuze [K+] gebruikt, die bepaalt de mate van sterkte van depolarisatie. Metingen van Drosophila haemolymph geven een [K+] van 5 mM en 90 mM is meestal de concentratie meestal geselecteerd voor activiteit stimulatie3,7,15,17 , 31. echter een [K+] variëren van 30-90 mM heeft gewerkt om te variëren van de stimulatie sterkte5,16,32. Een andere kritische parameter beslissing is de lengte van de hoge [K+] stimulatie voor beide FM1-43 laden en lossen. De periode voor laden bepalend of de gehele fietsen SV bevolking effectief wordt geladen, of alleen een subset van actieve blaasjes7. De periode voor het lossen op dezelfde wijze dicteert de veranderingspercentages van SVs exocytose ondergaan in de periode van de stimulatie, die kan onthullen of obscure mutant fenotypen afhankelijk van tarief in het veld AVP frequentie2fietsen. Met zuignap elektrode elektrische motor zenuwstimulatie omvatten parameter keuzes ook stimulatie spanning, frequentie, duur en pulsstand interval. Stoffelijk patroon activiteit is een belangrijke determinant van SV fietsen dynamics7, en verschillende stimulatie patronen selectief verschillende SV zwembaden kunnen mobiliseren. Met gerichte licht-gedreven ChR2 activeren, u kunt kiezen uit al het bovenstaande (met lichte intensiteit variabelen) en extra transgene opties besproken de volgende sectie. Met deze parameter keuzes komt meer experimentele controle, maar ook grotere technische complexiteit.

Channelrhodopsin-2 (ChR2) is een membraan van licht-gated kanaal luchtdoorlatend mono- en divalente kationen33. Als ChR2 stimulatie is geselecteerd, zijn er vele keuzes moeten worden gemaakt met inbegrip van de bestuurder van de Gal4, de UAS-ChR2 constructie en de lichtbron variabelen voor de activering van het kanaal. Gal4 stuurprogramma's variëren van alomtegenwoordige tot zeer specifieke. Bijvoorbeeld, alomtegenwoordige UH1-Gal4 (daughterless) spreek ChR2 in elke cel, terwijl CcapR-Gal4 (Janelia) ChR2 in de spier rijdt 6/7 NMJ maar niet de spier 4 NMJ31,34. Deze selectiviteit kan worden gebruikt als een krachtige interne controle. Er zijn ook vele varianten van de UAS-ChR2, met inbegrip van ChR2-H134R (gebruikt hier; de oorzaken van de toegenomen photocurrents in gemuteerde residu)35, VChR1, ChIEF en veel meer36. Elk van deze varianten kanaal heeft verschillende eigenschappen van licht gating, geleidingsvermogen, ion selectiviteit, kinetiek en desensibilisatie. Opmerking dat sommige constructies bevatten een fluorescerend tag die met FM beeldvorming interfereren kan. Bijvoorbeeld, de UAS-ChR2-H134R die hier gebruikt is gelabeld met mCherry (ex: 587 nm, em: 610 nm), maar produceert geen waarneembare emissie met de FM1-43 (ex: 479 nm, em: 598 nm) imaging filters. Technische parameter keuzes omvatten de lichtbron, golflengte en intensiteit voor activering van het kanaal. Een optie die hier gebruikt is een goedkope blauw-emitting LED, met stimulatie visueel bevestigd door het analyseren van de spiercontracties. We waren ook succesvol in het activeren van ChR2 met behulp van epifluorescence, hoewel een scannen confocale laser niet voldoende was. Epifluorescence kan worden gebruikt in gerichte stimulatie (specifieke segmenten in plaats van het hele dier), maar stimulatie parameters zijn moeilijk te controleren, terwijl de LED verbonden tot een eenvoudige stimulator gemakkelijk zowel de duur en de frequentie van licht verandert pulsen. Het LED licht via de dissectie Microscoop camera poort gericht kunt meer gecontroleerde, intens licht stimulatie.

Het is aan de experimentator om te beslissen al dan niet de ventrale zenuw snoer/hersenen tijdens de stimulatie paradigma intact laten. Wij hebben gekozen voor het verwijderen van de gehele centrale zenuwstelsel voor de vergelijking van de drie methoden waarmee hier, maar soms blijft de upstream bedrading intact15. Een complicatie is dat endogene neurale activiteit plaatsvindt wanneer het zenuwstelsel hele wordt overgelaten. De mate van deze activiteit is zeer variabel van dier op dier, in grote mate afhankelijk van de deskundigheid van de dissectie van de experimentator. Deze variabele activiteit kan bijdragen aan de hoeveelheid FM1-43 kleurstof die wordt geladen en gelost, die daarom niet uitsluitend van de exogene stimulatie in dienst15moeten. Een verwante technische complicatie is dat intact ontleed larven de daaraan gehechte spiermassa in fictieve beweging contract, en deze verplaatsing sterk NMJ imaging verstoort. Deze beweging is verlicht als het centrale zenuwstelsel wordt verwijderd, en ook door de toepassing van Ca2 +-gratis saline tijdens4imaging. Deze benaderingen die hier gebruikt zijn voldoende om uitstekende FM1-43 kleurstof beeldvorming in de NMJ voorbereiding. Echter, sommige onderzoekers kiezen voor drugs te remmen spiercontractie (b.v., ryanodine, philanthotoxin-433), of te gebruiken actiepotentiaal blokkers (bijvoorbeeld tetrodotoxine)37,38. Een bereik van drugs kan worden gebruikt om te manipuleren selectief de SV-cyclus, om te wijzen op bepaalde stappen of accentueren mutant fenotypen te onderzoeken transmissie mechanismen. Bijvoorbeeld, sommige onderzoekers Veratridine (activeert spanning-gated nb+ kanalen39) hebt gebruikt om SV laden in de reserve pool, Cyclosporin A (remt Calcineurin activiteit40) ter verbetering van de SV endocytose, en Forskolin (activeert adenylyl cyclase41, die verbetert de synaptische transmissie42) te verhogen van de exo/endo fietsen zwembad7,43,44. Dergelijke farmacologische manipulaties kunnen aanvullende inzichten bieden. Tot slot, FM1-43 achtergrond kan optreden in verschillende mate gebaseerd op de kwaliteit van de dissectie, wassen van effectiviteit- en stimulatie-protocol. Sommige een afgeleide van de sulfobutylated van β-Cyclodextrine Advasep-745, of de waterige fluorophore sulforhodamine46, niet-specifieke fluorescentie doven en verbetering van de verhouding van signaal-naar-achtergrond toe te voegen.

Er zijn vele technieken die kunnen gepaard gaan met FM fluorescerende imaging aan meer begrip van de SV-cyclus (bijvoorbeeld elektrofysiologie, synaptopHluorin, elektronenmicroscopie). Een voorbeeld hier is FM fluorescentie photoconversion die wordt gebruikt voor het onderzoeken van de SV cyclus in ultrastructurele detail. SVs zijn onderverdeeld in verschillende zwembaden die ruimtelijk en functioneel verschillend2 zijn. De gemakkelijk vrij te geven pool (RRP) bevat blaasjes onmiddellijk vrijgegeven bij acute stimulatie. Een grotere recycling zwembad onderhoudt SV vrijlating onder voorwaarden van matige activiteit. Een interne reserve zwembad (RP) is alleen aangeworven met sterke (schijnbaar in de buurt van niet-fysiologische) stimulatie2. De SV-zwembaden die worden geactiveerd afhankelijk van de soort stimulatie gebruikt47en verslagen van de Drosophila NMJ met behulp van FM photoconversion is gebleken dat belangrijkste inzicht in ruimtelijke en functionele eigenschappen van deze verschillende SV zwembaden48. FM photoconversion kan worden gebruikt voor het bestuderen van SV zwembaden geactiveerd onder verschillende stimulatie paradigma's, en query vragen zoals de lang-besproken mensenhandel interactie tussen Endosomen en SVs49. Als de experimentator geïnteresseerd in FM imaging in combinatie met andere activiteiten-afhankelijke veranderingen in de synaps is, is er een naar verluidt corrigeerbare analogon van de kleurstof FM1-43 (FM1-43FX). Deze sonde moet toelaten dat een om op te lossen de Drosophila NMJ na activiteit-afhankelijke kleurstof laden en vervolgens de follow-up met antilichaam labelen om te testen voor correlaties tussen bouton activiteitenniveau (FM kleurstof fluorescentie) en activiteit-afhankelijke uitdrukking van een proteïne van belang. In de toekomst, het zal uiterst belonen voor het verkennen van extra methoden waarmee de combinatie van FM kleurstof imaging met andere imaging benaderingen in de prachtige Drosophila NMJ model synaps.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs verklaren geen concurrerende belangen.

Acknowledgments

Wij danken Broadie Lab leden voor bijdragen aan dit artikel. Dit werk werd gesteund door de NIH R01s MH096832 en MH084989 naar K.B., en NIH predoctoraal fellowship F31 MH111144 te D.L.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Tags

Neurowetenschappen kwestie 135 Drosophila motorische eindplaat FM1-43 electrofysiologie photoconversion transmissie-elektronenmicroscopie
FM kleurstof fietsen in de synaps: vergelijken van hoge kalium depolarisatie, elektrische en Channelrhodopsin stimulatie
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye… More

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter