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Neuroscience

Tinte de FM ciclismo en la sinapsis: comparación de potasio alto despolarización, eléctrico y Channelrhodopsin estimulación

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57765
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Vesícula sináptica (SV) ciclismo es el mecanismo principal de comunicación intercelular en las sinapsis neuronales. Liberación y absorción del tinte de FM son los medios primarios de análisis cuantitativo de la SV endo - y exocitosis. Aquí, comparamos todos los métodos de estimulación para conducir bicicleta en la sinapsis de Drosophila Unión neuromuscular (NMJ) modelo FM1-43.

Abstract

FM colorantes se utilizan para estudiar el ciclo de la vesícula sináptica (SV). Estas sondas anfipáticos tienen una cabeza hidrofílica y cola hidrofóbica, haciéndolos hidrosolubles con la capacidad reversible entrar y salir de bicapas de lípidos de membrana. Estos tintes styryl son relativamente no-fluorescentes en medio acuoso, pero causa la inserción en el prospecto externo de la membrana plasmática una > 40 X aumento en fluorescencia. En las sinapsis neuronales, tintes de FM son internalizados durante la endocitosis SV, víctimas de la trata dentro y entre piscinas SV y lanzado con exocitosis SV, proporcionando una potente herramienta para visualizar etapas presinápticas de la neurotransmisión. Un modelo genético primario de desarrollo de sinapsis glutamatérgica y de la función es la Drosophila Unión neuromuscular (NMJ), donde FM teñir la proyección de imagen se ha utilizado extensivamente para cuantificar la dinámica de la SV en una amplia gama de condiciones mutantes. La terminal sináptica NMJ es fácilmente accesible, con una hermosa gama de grandes botones sinápticos ideales para aplicaciones de imagen. Aquí, comparar y contrastar las tres formas de estimular la Drosophila NMJ conducir dependiente de actividad FM1-43 tinte absorción/release: aplicación 1) baño de alto [K+] despolarizar los tejidos neuromusculares, 2) nervio motor electrodo de succión estímulo para despolarizar el nervio presynaptic terminal y 3) objetivo expresión transgénica de channelrhodopsin variantes para el control espacial, estimulado por la luz de despolarización. Cada uno de estos métodos tiene ventajas y desventajas para el estudio de los efectos de la mutación genética en el ciclo SV en la Drosophila NMJ. Vamos a discutir las ventajas y desventajas para ayudar a la selección del enfoque de estimulación, junto con las metodologías específicas para cada estrategia. Además de la proyección de imagen fluorescente, tintes de FM pueden ser photoconverted a las señales de electrón-densos visualizados mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM) para estudiar mecanismos de ciclo SV a nivel ultraestructural. Proporcionamos las comparaciones de confocal y microscopia electrónica de la proyección de imagen de los diferentes métodos de estimulación de la NMJ de Drosophila , para ayudar a guiar la selección de futuros paradigmas experimentales.

Introduction

El modelo glutamatérgica y sinapsis maravillosamente caracterizada Drosophila Unión neuromuscular larvaria (NMJ) se ha utilizado para estudiar la formación de sinapsis y función con un vasto espectro de perturbaciones genéticas1. El terminal de la neurona de motor consiste en múltiples ramas del axón, cada uno con muchos botones sinápticos ampliadas. Estas várices de gran capacidad (hasta 5 μm de diámetro) contienen toda la maquinaria de la neurotransmisión, incluyendo vesículas sináptica glutamatérgica uniforme (SVs; ~ 40 nm de diámetro) en la reserva citosólica y fácilmente liberable piscinas2. Estas vesículas atracan en las membrana plasmática presináptica fusión sitio zonas activas (AZs), donde exocitosis interviene en la liberación de neurotransmisores de glutamato para trans-comunicación sináptica. Posteriormente, la Superintendencia se recupera de la membrana del plasma vía reciclaje beso-y-funcione o endocitosis mediada por clatrina (CME) para los ciclos repetidos de exo/endocitosis. La Drosophila NMJ es fácilmente accesible y adecuado para aislar y caracterizar a mutantes de ciclo SV. Utilizando pantallas genéticas adelantados, mutaciones han conducido a la identificación de nuevos genes críticos para la SV ciclo3. Por otra parte, enfoques genéticos inversos a partir de genes ya conocidos han llevado al esclarecimiento de nuevos mecanismos de ciclo SV por la cuidada Descripción de mutante ciclismo fenotipos4. La Drosophila NMJ es casi ideal como una preparación experimental sináptica para diseccionar los mecanismos de endocitosis y exocitosis SV mediante métodos que ópticamente vesícula de pista de ciclismo durante la neurotransmisión.

Una gama de marcadores fluorescentes permiten seguimiento visual de las vesículas durante el ciclo de la dinámica, pero el más versátil es análogos de tinte de la FM que primero es sintetizado por Mao, f el., et al. 5. estructuralmente, FM tintes contienen una cabeza hidrofílica y una cola lipofílica conectados a través de un anillo aromático, con una región central que confieren propiedades espectrales. Estos styryl tintes reversible de la partición en las membranas, no 'flip-flop' entre los folíolos de la membrana y así nunca son libres en el citosol y son mucho más fluorescentes en las membranas de agua5. Inserción reversible en una bicapa de lípidos provoca un 40-fold aumento en fluorescencia6. En las sinapsis neuronales, clásica FM tinte etiquetado los experimentos consisten en bañar la preparación sináptica con el tinte durante la despolarización estimulación cargar tinte mediante endocitosis SV. Tinte externo luego es lavado y el ciclo SV es detenido en una solución de ringer sin calcio a la imagen cargada sinapsis7. Una segunda ronda de estímulo en un baño de tinte provoca liberación de FM a través de exocitosis, un proceso que puede seguirse midiendo la disminución de la intensidad de fluorescencia. Poblaciones de SV de una sola vesícula a piletas que contienen cientos de vesículas pueden ser monitoreada cuantitativamente6,7. Tintes de FM se han utilizado para disecar movilización dependiente de actividad de piscinas SV funcionalmente distintas y comparar kiss y gestión vs CME ciclismo8,9. El método ha sido modificado por separado ensayo evocado, ciclo sináptica espontánea y miniatura actividades (con equipo altamente sensible para detectar cambios de fluorescencia muy pequeña y reducir el fotoblanqueo)10. Análisis pueden ampliarse a nivel ultraestructural por photoconverting la señal de FM fluorescente en una etiqueta de electrón-densos para transmisión microscopia electrónica11,12,13,14 .

Históricamente, preparaciones sináptica bañarse en una alta concentración de potasio (en lo sucesivo denominado "alto [K+]") ha sido el método de elección para despolarización estimulación para inducir SV ciclismo; desde la rana colinérgicos NMJ5, cultivadas roedores cerebro neuronas hippocampal15, a la Drosophila glutamatérgica NMJ modelo16,17. Este enfoque [K+] alta es simple, no requiere ningún equipo especializado y por lo tanto es accesible a la mayoría de los laboratorios, pero tiene limitaciones de aplicación y la interpretación de los datos. Un método mucho más fisiológico apropiado es utilizar electrodo de succión estimulación eléctrica del nervio4,5,12. Este enfoque conduce a potencial de acción propagación para la estimulación directa del nervio presináptico terminal y resultados pueden ser directamente comparados con los ensayos electrofisiológicos de neurotransmisión función13,14, 15, pero requiere equipo especializado y es técnicamente mucho más difícil. Con el advenimiento de optogenetics, el uso de la estimulación neuronal channelrhodopsin tiene ventajas adicionales, incluyendo el estricto control spatiotemporal de la expresión del canal utilizando el binario de sistema de Gal4/UAS20. Este enfoque es técnicamente mucho más fácil que el estímulo de succión del electrodo y requiere nada más que una fuente de luz LED muy barata. Aquí, utilizamos proyección de imagen de FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) dibromuro de piridinio) a comparar y contrastar estos tres métodos diferentes de estimulación en la Drosophila NMJ: alta simple [K+ ], desafiando channelrhodopsin eléctricos y nuevos enfoques.

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Protocol

1. larvas pegamento disección

  1. Mezclar bien 10 partes de elastómero de silicona base con 1 parte de elastómero de silicona curado a agente del kit del elastómero (Tabla de materiales).
  2. Capa de cubreobjetos de vidrio de 22 x 22 mm con el elastómero y el cura sobre una placa caliente a 75 ° c durante varias horas (hasta que ya no es pegajoso al tacto).
  3. Coloque un cubreobjetos de vidrio solo revestimiento de elastómero en la sala de disección de cristal plexi a medida (figura 1, abajo) en preparación para la disección de la larva.
  4. Preparar las pipetas de pegamento de tubo capilar de vidrio borosilicato con un extractor de microelectrodo estándar para obtener la deseada forma cónica y punta de tamaño.
  5. Suavemente la punta de la micropipeta y el otro extremo de la rotura, fijar 2 pies de tubo de plástico flexible (1/32" diámetro interior, ID 3/32" diámetro, OD exterior; pared de 1/32"; Tabla de materiales) con boca de conexión (punta de pipeta P2).
  6. Llene un recipiente (tubo tapón de 0.6 mL Eppendorf) con un volumen pequeño (~ 20 μl) de la cola (Tabla de materiales) en preparación para la disección de la larva.
  7. Llenar la cámara con solución salina (en mM): NaCl 128, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 sacarosa y pH ácido 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic 5 (HEPES) 7.2.
  8. Añadir el anticuerpo de la peroxidasa (HRP) de rábano contra conjugado a Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647, diluido 1:10 de un stock de 1 mg/mL) para el etiquetado de la NMJ terminal presináptica durante disección21,22.
  9. Con un pincel fino (tamaño 2), quitar un errante tercer instar del frasco de comida y coloque en el vidrio de cubierta de revestimiento de elastómero.
  10. Llene la punta de una micropipeta de vidrio con un pequeño volumen de adhesivo utilizando presión de aire negativa generada por boca con accesorio (criterio 1.5).
  11. Lado dorsal de la larva de posición, hasta con pinzas y pegamento de la cabeza a cubreobjetos recubierto de elastómero con una pequeña gota de adhesivo utilizando presión de aire positiva por vía oral.
  12. Repita este procedimiento con el extremo posterior de la larva, asegurándose de que el animal se estira tenso entre las dos conexiones de pegamento.
  13. Con unas tijeras (las láminas de 3 mm; Tabla de materiales), hacer un corte horizontal (~ 1 mm) en la parte posterior y un corte vertical a lo largo de la línea media dorsal.
  14. Con unas pinzas finas (#5, Tabla de materiales), suavemente Retire la tráquea dorsal, tripa, grasa corporal y otros órganos internos que cubre la musculatura.
  15. Repita el procedimiento de pegado para las cuatro aletas de pared del cuerpo, asegúrese de estirar suavemente la pared del cuerpo tanto horizontal como verticalmente.
  16. Levantar la cuerda ventral del nervio (VNC) con unas pinzas, cortar con cuidado los nervios del motor con las tijeras y retire completamente el VNC.
  17. Reemplazar la solución salina de disección con Ca2 +-libre de solución salina (igual que el fisiológico de disección anterior sin el CaCl2) dejar SV ciclismo.

2. opción 1: Alta [K+] tinte de FM carga

  1. De una solución madre FM1-43 (4 mM), añadir 1 μl a 1 mL de 90 mM de solución de KCl (alto [K+] en solución salina de disección) para una concentración final de 4 μm.
  2. Mediante una pipeta, reemplazar el Ca2 +-solución salina libre de la cámara de proyección de imagen con la solución de tinte [K+] FM alta para estimular la absorción de tinte de endocitosis SV.
  3. Inmediatamente iniciar un temporizador digital para la duración predeterminada de los altos [K+] período de estímulo de despolarización (e.g., 5 min; Figura 2).
  4. Para confirmar una preparación larvas sana, tenga en cuenta las fuertes contracciones de la musculatura para la duración de la despolarización [K+] alto.
  5. Cuando termina el período de tiempo, rápidamente Retire la solución de tinte [K+] FM alta y reemplazar con Ca2 +-solución salina libre dejar SV ciclismo.
  6. Lavado en rápida sucesión con la Ca2 +-libre de solución salina (5 x 1 min) para la solución de tinte [K+] FM alta se retira completamente.
  7. Mantener la preparación larvas frescas Ca2 +-solución salina libre de inmediato imágenes con el microscopio confocal.

3. la proyección de imagen: Microscopio Confocal

  1. Usar un microscopio confocal vertical con un 40 X objetivo de inmersión de agua para fluorescencia de tinte imagen NMJ (pueden usarse otros microscopios).
  2. Imagen del músculo 4 NMJ de segmentos abdominales 2-4 (otros NMJs pueden ser reflejadas) y recoger imágenes utilizando el software apropiado (Tabla de materiales).
  3. Utiliza un láser de HeNe 633 nm para excitar HRP:647 (con filtro largo > 635 nm) y un láser de argón 488 nm para excitar el FM1-43 (con bandpass filtro 530-600 nm).
  4. Determinar operacionalmente óptima ganancia y offset para ambos canales.
    Nota: Estos ajustes se mantienen constantes durante el resto del experimento.
  5. Tomar una pila confocal de Z a través de la NMJ seleccionado todo desde la parte superior marcado con HRP en parte inferior de la terminal sináptica.
  6. Atentamente el NMJ reflejada (segmento, lateral y músculo) para asegurar exceso a la exacta misma NMJ después FM tinte descarga.

4. alta [K+] estímulo: FM tinte descarga

  1. Reemplazar Ca2 +-solución salina gratis con el alta [K+] una solución salina (sin tinte FM1-43) a despolarización de la unidad, liberación de exocitosis y tinte SV.
  2. Inmediatamente iniciar un temporizador digital para el período determinado de la alta estimulación [K+] (por ej., 2 min; Figura 2).
  3. Cuando termina el período de tiempo, quite las altas Salinas [K+] inmediatamente y reemplazar con Ca2 +-solución salina libre dejar SV ciclismo.
  4. Lavado en rápida sucesión con Ca2 +-libre de solución salina (5 x 1 min) para asegurar la alta [K+] una solución salina se quita totalmente.
  5. Mantener la preparación larvas frescas Ca2 +-solución salina libre de inmediato imágenes con el microscopio confocal.
  6. Asegúrese de la fluorescencia del tinte FM1-43 en el mismo NMJ señalada con la misma configuración confocal de imágenes.

5. opción 2: Estimulación eléctrica FM tinte carga

  1. Preparar una pipeta de succión utilizando el tirador de microelectrodo (Tabla de materiales) para obtener el ahusamiento requerido y punta de tamaño.
  2. Fuego-pula la punta del microelectrodo con una fragua de micro hasta un solo nervio motor puede ser aspirado con un ajuste apretado.
  3. Deslice la pipeta de succión sobre el soporte de electrodo de un micromanipulador y coloque en el tubo largo flexible de plástico y una jeringa.
  4. Definir los parámetros del estimulador (por ej., 15 V, frecuencia de 20 Hz, 20 ms de duración y tiempo de 5 minutos (figura 2) o 1 minuto (figura 3)).
  5. Reemplazar el Ca2 +-solución salina gratis en la preparación de larvas con sobre solución salina FM1-43 (4 μm; 1 mM CaCl2) en la plataforma de electrofisiología.
  6. Colocar la preparación sobre la platina del microscopio y levantar la etapa hasta que la larva y pipeta de succión estén en foco (objetivo de inmersión en agua de 40 X).
  7. Chupar un bucle de corte nervios motores que inervan el hemisegment seleccionado con presión de aire negativa generada por la jeringa en el electrodo de succión.
  8. Prueba de la función de electrodo de succión con una corta ráfaga de estimulación mientras visualmente para la contracción del músculo en la hemisegment seleccionada.
  9. Estimular el nervio motor con los parámetros seleccionados (paso 5.4) para conducir la endocitosis SV y absorción de tinte FM1-43 (figura 2).
  10. Lavado en rápida sucesión con Ca2 +-libre de solución salina (5 x 1 min) para la solución de tinte FM1-43 se retira completamente.
  11. Mantener la preparación larvas frescas Ca2 +-solución salina gratis imagen inmediata usando el protocolo de imagen confocal desde arriba.
  12. Tomar buena nota de la NMJ reflejada (segmento lateral y músculo) para garantizar el acceso a la exacta misma NMJ después de la descarga de tinte de FM.

6. electroestimulación: FM tinte descarga

  1. Reemplazar el Ca2 +-sin solución salina con solución salina normal (sin tinte FM1-43) y coloque la preparación en la etapa de la plataforma de electrofisiología.
  2. Definir los parámetros del estimulador para descarga (por ejemplo, 15 V, 20 Hz frecuencia, duración de 20 ms y el tiempo de 2 min (figura 2) o 20 s (figura 3)).
  3. Aspirar el mismo nervio motor en el mismo electrodo que el anterior y luego estimular exocitosis SV y liberación de tinte FM1-43.
  4. Lavado en rápida sucesión con Ca2 +-libre de solución salina (5 x 1 min) para asegurar el tinte externo se retira completamente.
  5. Mantener la preparación larvas frescas Ca2 +-solución salina libre de inmediato imágenes con el microscopio confocal.
  6. Asegúrese de la fluorescencia del tinte FM1-43 en el mismo NMJ señalada con la misma configuración confocal de imágenes.

7. opción 3: Channelrhodopsin estimulación tinte FM carga

  1. Criar las larvas expresar ChR2 en alimentos que contienen el retinal a todo-trans-ChR2 cofactor (disuelto en etanol; concentración final de 100 μm).
  2. Colocar la preparación larval en la cámara de plexiglás en una etapa de disección microscopio equipada con un puerto de cámara.
  3. Conecte un LED azul (470 nm; Tabla de materiales) un estimulador programable usando un cable coaxial y coloque el LED en el puerto de la cámara.
  4. Enfocar el haz de luz de LED azul en la función larvas disecado utilizando la función de zoom del microscopio.
  5. Reemplazar el Ca2 +-solución salina gratis en la preparación de larvas con sobre solución salina FM1-43 (4 μm; 1 mM CaCl2) en la etapa de optogenetic.
  6. Configure los parámetros del LED usando el estimulador (por ejemplo, 15 V, 20 Hz frecuencia, duración de 20 ms y el tiempo de 5 minutos (figura 2)).
  7. Iniciar la estimulación ligera y seguir con un temporizador para el período determinado de la estimulación optogenetic (p. ej., a 5 minutos; Figura 2).
  8. Cuando el temporizador se detiene, rápidamente Retire la solución de tinte de FM y reemplazar con Ca2 +-solución salina libre dejar SV ciclismo.
  9. Lavado en rápida sucesión con la Ca2 +-libre de solución salina (5 x 1 min) para la solución de tinte de FM se quita totalmente.
  10. Mantener la preparación larvas frescas Ca2 +-solución salina libre de inmediato imágenes con el microscopio confocal usando protocolo de la imagen de arriba.
  11. Tomar buena nota de la NMJ reflejada (segmento lateral y músculo) para garantizar el acceso a la exacta misma NMJ después de la descarga de tinte de FM.

8. Channelrhodopsin estimulación: tinte FM descarga

  1. Reemplazar Ca2 +-libre solución salina con solución salina normal (sin tinte FM1-43) en la platina del microscopio de disección con puerto LED de la cámara se centró en la larva.
  2. Definir los parámetros del estimulador para descarga (por ejemplo, 15 V, 20 Hz frecuencia, duración de 20 ms y el tiempo de 2 minutos (figura 2)).
  3. Iniciar la estimulación ligera y seguir con un temporizador para el período determinado de la estimulación optogenetic (p. ej., 2 min; Figura 2).
  4. Cuando termina el período de tiempo, rápidamente Retire la solución de tinte de FM y reemplazar con Ca2 +-solución salina libre dejar SV ciclismo.
  5. Lavado en rápida sucesión con Ca2 +-libre de solución salina (5 x 1 min) para asegurar el tinte externo se retira completamente.
  6. Mantener la preparación larvas frescas Ca2 +-solución salina libre de inmediato imágenes con el microscopio confocal.
  7. Asegúrese de la fluorescencia del tinte FM1-43 en el mismo NMJ señalada con la misma configuración confocal de imágenes.

9. cuantificación de la fluorescencia

  1. Cargar la imagen en Image J (NIH Abra la fuente) y crear una proyección de intensidad máxima en imagen | Pilas | Z proyecto.
  2. Con el anti-HRP:647 canal, vaya a imagen | Ajustar | Umbral y deslice la barra de herramientas superior hasta que se resalte sólo el NMJ.
  3. Con la herramienta varita mágica, haga clic en el NMJ. Si el NMJ es discontinua, mantenga pulsado el botón Shift y selecciona todas las partes.
  4. Cambiar la imagen al canal de tinte FM1-43 e ir a Analyze | Medir para obtener la medición de la fluorescencia.
  5. Repita los pasos 9.1-9.4 para la imagen "descarga" de la misma NMJ (segmento identificado, lateral y músculo).
  6. Para obtener el porcentaje de colorante que se descargó, tomar el cociente de las intensidades de fluorescencia descargado/cargado.
    Nota: Este procedimiento puede ser modificado para analizar la fluorescencia sobre una base de bouton por bouton utilizando las herramientas de selección "oval" o "a pulso". Fluorescencia del fondo puede restarse mediante el muestreo de la fluorescencia del músculo. Los agentes también pueden agregarse para reducir este fondo.

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Representative Results

La figura 1 muestra el flujo de trabajo para el tinte de FM dependientes de la actividad de protocolo. El experimento comienza siempre con la misma disección cola larvaria, independientemente del método de estimulación utilizado posteriormente. Figura 1a es un diagrama esquemático de una larva disecada, el cordón nervioso ventral (VNC), irradiando los nervios y hemisegmental repetido patrón de músculo. La VNC se retira y la preparación bañada en una solución de 4 μm de FM1-43 (Figura 1b, rosa). La preparación entonces se estimula en presencia de colorante de FM usando una de las tres opciones posibles para cargar el tinte a través de endocitosis SV dependiente de actividad (figura 1cI-III). Siguiente, FM tinte ciclismo es arrestado con Ca2 +-solución salina gratis y un terminal NMJ específico que ha sido cargado con el tinte de la FM es fotografiada utilizando un microscopio confocal ("imagen cargada"; Figura 1 d). En este caso, el músculo que 4 NMJ es seleccionado con la colocación de demostración esquemática del nervio, ramificación terminal NMJ y FM carga botones sinápticos. La preparación sináptica es estimulada por segunda vez utilizando el mismo método seleccionado anteriormente, pero en ausencia de tinte FM exocitosis SV y liberación FM1-43 (Figura 1e). La misma identificó NMJ (músculo NMJ 4 en este ejemplo) entonces es reflejada nuevamente utilizando la etiqueta sináptica HRP:647 y residual señal de vesícula FM1-43 ("Descargar imagen"; Figura 1f). El experimentador determina la intensidad y la duración de la carga y descarga de las fases para optimizar las medidas para un análisis específico o la condición mutante. Intensidad de la fluorescencia se cuantifica después de carga y descarga (Figura 1D, 1f) obtener las medidas de tinte sináptica endocitosis, exocitosis y el porcentaje de carga de tinte de FM libertad. Análisis pueden hacerse para el NMJ toda o solo botones.

Tinte de FM ciclismo puede ser estimulado de tres maneras: despolarización salina 1) alto [K+] de toda preparación, electrodo 2) succión estimulación del nervio motor o 3) luz activación conducida de channelrhodopsin específica (ChR2; Figura 2). De una lado a lado la comparación directa de los tres métodos, estimulados con cada enfoque por 5 min en presencia de FM1-43 (cargando) y luego por 2 min en ausencia de la FM1-43 (descarga) y reflejada NMJs marcado con HRP con idéntica configuración confocal ( Figura 2). El método de despolarización salina [K+] alta sigue el protocolo de FM1-43 ampliamente utilizado para el Drosophila larvas NMJ23, excepto usamos pegamento en lugar de pernos para la disección de la larva. El pegamento evita la interferencia con los objetivos del microscopio y permite la determinación más precisa de la tensión de la pared del cuerpo, pero requiere una curva de aprendizaje moderada. Los tres métodos producen señales fluorescentes fuertes y consistentes a lo largo de eje de bouton sináptico de la NMJ a botones sinápticos individuales (inserciones). El método de despolarización salina [K+] alta causa NMJs todos estar cargado de FM a lo largo de la larva que despolarizan cada neurona en el animal (figura 2A, centro). El método de estimulación eléctrica del nervio electrodo de succión conduce solamente en un solo hemisegment de las larvas para que las inervan correspondiente del nervio de motor ha sido estimulado (figura 2B, centro). Segmentos sin estimular en el mismo animal son distinguibles con la etiqueta HRP pero no contienen ningún colorante fluorescente observable cargando y sirven como excelentes controles internos. Optogenetic método de ChR2 produce despolarización específica dependiente de transgénicos Gal4 conductor empleado (figura 2). Aquí, el conductor era un transportador de glutamato vesicular (vglut) Gal4, por lo que todas las neuronas glutamatérgicos son despolarizadas con el estímulo de luz azul, incluyendo todas las neuronas de motor glutamatérgica. Como resultado, NMJs todos se cargan con el FM1-43 tinte en este ejemplo (figura 2, medio). Controladores específicos de la célula pueden utilizarse para marcar NMJs específicas y dejar otros sin etiqueta para un control interno.

FM descarga de tinte se logró mediante el mismo método que se utiliza para cargar el tinte. En el primer método, la preparación de larvas fue simplemente bañada en alto [K+] solución salina en ausencia de FM1-43 para despolarizar las células, exocitosis SV en coche y descarga de las terminales sinápticas (figura 2A, derecha). Normalmente seleccionamos un período más corto de descargando (2 min), así que descarga es parcial y terminales permanecen visibles en el canal de FM. Electrodo de succión estimulación eléctrica descarga es considerablemente más difícil, porque implica volver a la hemisegment mismo, identificando el mismo nervio y volver a estimular ese nervio en la ausencia de la FM1-43 para descarga (tinte defigura 2B , derecha). Tenga en cuenta que la descarga de tinte otra vez era parcial. La descarga de ChR2 implica un segundo período de iluminación de LED azul de la preparación larval en la ausencia de la FM1-43 para activar los canales, despolarizar las neuronas motoras y estimular la liberación de tinte SV exocitosis (figura 2, derecha). Con esta escala de tiempo de descarga (min 2), cada uno de estos despolarización métodos descargaban sólo un porcentaje de colorante cargado de FM1-43, con alta [K+] más fuertes y más débiles, en comunicado de colorante (figura 2) que conduce de ChR2. Medimos el LED intensidad de la luz utilizada (140 μW/m2), que estaba en la gama publicados (20-1000 μW/m2)24,25,26. ChR2 máximo se activa mediante iluminación de ~ 1 mW de fuentes de luz de 50-200 mW, con ChR2 efectividad también depende de la concentración de ATR a larva27,28. Así, se puede manipular fuerza de estímulo de ChR2. Por otra parte, la relación no puede permanecer con otras fortalezas de estimulación, plazos o genotipos. Si el experimentador está trabajando con un mutante que ha disminuido la endocitosis de la SV o inusualmente rápida exocitosis, los parámetros de estimulación deba modificarse para mantener una señal observable después de la descarga. La etiqueta anti-HRP permite identificar el NMJ incluso en la ausencia completa de la señal de FM, pero esto no es ideal para la cuantificación. En principio, también podría ser la estimulación de la descarga de un tipo diferente de la estimulación de la carga.

Recientemente se estudió la pérdida de los efectos de Notum deacylase sináptico secretado en el ciclo SV usando estimulación eléctrica4. Aquí, hacemos llegar este análisis para comparar 1) alto [K+] 2) succión y despolarización electrodo nervio motor estimulación métodos (figura 3). Encontramos que ambos métodos dan un resultado similar, mostrando reducción FM1-43 tinte cargando en un mutante nulo Notum ; sin embargo, el grado del fenotipo es distinto entre los dos métodos. Después de la despolarización con solución salina [K+] alto durante cinco minutos, hay una gran disminución en la intensidad de fluorescencia cargado entre control de la genética (w1118) con altos niveles y mutantes nulos Notum (NotumKO ) con niveles bajos (Figura 3A, parte superior). En las mediciones cuantificadas, normalizado intensidad de fluorescencia de FM dentro de las terminales de la NMJ de HRP-contorneado se reduce significativamente en la ausencia de Notum (w1118 1.0 ± 0,05 vs NotumKO 0,57 ± 0.07; n≥13, p < 0.0001; Figura 3B). Después del estímulo eléctrico a 20 Hz durante 1 min, encontramos una insignificante disminución de carga intensidad de FM1-43 entre controles y Notum nulos cuando la cuantificación de la fluorescencia NMJ entera (w1118 1.0 ± 0,05 vs NotumKO 0,86 ± 0,06; n = 8, p = 0,10; Figura 3A, B). Medición de tinte incorporación en una base de bouton por bouton, encontramos una disminución significativa en tinte con ambos de los métodos. En medidas cuantificadas después del estímulo con solución salina [K+] alto, normalizado intensidad de fluorescencia de FM por bouton se redujo significativamente (w1118 1.0 ± 0,02 vs NotumKO 0,52 ± 0,02; n≥241, p< 0.0001; Figura 3). Aunque en un grado inferior después del estímulo eléctrico, intensidad de fluorescencia normalizado por bouton disminuyó también significativamente (w1118 1.0 ± 0,02 vs NotumKO 0,83 ± 0,02; n≥127, p< 0.0001; Figura 3).

Las diferencias de resultado entre los dos paradigmas de estimulación podrían deberse a varios factores. En primer lugar, la fuerza del estímulo se presume mayor con alta [K+] comparado con el estímulo eléctrico del nervio motor. Grabaciones de electrofisiología no se puede hacer en presencia de las altas Salinas [K+], pero la larvas neuromusculature es claramente ser robusta estimulado, como las contracciones musculares son fuertes y continuas durante todo el período de baño de 5 minutos. Sin embargo, no sabemos la fuerza o la frecuencia de la estimulación. En cambio, la estimulación eléctrica es mucho más controlada con el usuario seleccionar la fuerza de tensión exacta y la frecuencia de estimulación. En segundo lugar, la duración de la estimulación fue mayor con alta [K+] comparado con el estímulo eléctrico del nervio (figura 3). Elegimos 1 min de 20 Hz de estimulación eléctrica después de repetidos ensayos. Después de 1 minuto de carga colorante, hubo una fuerte y confiable señal FM1-43, así que elegimos ese paradigma para nuestro estudio4, aunque 5 minutos de estimulación dio una aún más fuerte señal fluorescente (figura 2). Por lo tanto, la longitud del paradigma estímulo probablemente contribuye a la variabilidad de la magnitud de carga FM1-43 entre alta [K+] y la estimulación eléctrica (figura 3B, C). Aunque el método [K+] alta demostraron un fenotipo más robusto para mutantes Notum , todavía utilizamos el método eléctrico debido a la mayor control4. Hay muchos parámetros a controlar como la fuerza, frecuencia y duración de la estimulación, y dichos valores deben decidirse en base en el mutante y la pregunta. Por ejemplo, la elección del método de estimulación puede depender de la SV piscina interrogada a7 y el mecanismo dependiente de la actividad de investigación10.

Después de la carga en el terminal NMJ FM1-43, uno puede emplear photoconversion de colorante de la fluorescencia para producir la señal de electrón-densos para microscopía electrónica (figura 4). En este método la preparación cargado de tinte se expone a luz fluorescente intensa en presencia de diaminobenzidina (DAB), con la especie reactiva del oxígeno del tinte de FM oxidantes el DAB para crear un precipitado oscuro (Figura 4A)11. Consulte el artículo de Zeus en photoconversion de tintes styryl para detalles12. La ventaja de este método es que la SVs se revelaron claramente a nivel ultraestructural, aunque el ciclo SV es detenido por supuesto con la proyección de imagen de microscopio electrónico estático. En ausencia de estimulación, botones sinápticos en la Drosophila NMJ están densamente cargados de vesículas (~ 40 nm de diámetro; Figura 4B), con la rara ocurrencia de organelos ampliadas (>100 nm de diámetro) se supone que ciclismo endosomas. Alta solución salina [K+] despolarizantes estimulación fuertemente cambia este perfil, con un agotamiento parcial de la población de la SV y la rápida acumulación de numerosos organelos ampliadas (>100 nm de diámetro) se cree que derivan de a granel endocitosis de la membrana plasmática (figura 4, izquierda). Aunque compartimientos similares existen en los controles sin estimular, la alta densidad de estos orgánulos después alta [K+] salina despolarización provoca la preocupación de que esto puede ser una respuesta no fisiológica. Electrodo de succión estimulación eléctrica del nervio motor es relativamente más eficiente en el agotamiento de la población de SV y no producir más de las vesículas endosomal ampliada (figura 4, izquierda). Esto sugiere que la endocitosis a granel impulsada por despolarización [K+] alta ayuda a mantener la población de SV durante demanda más intensa.

FM1-43 photoconversion puede lograrse usando alta [K+] salina despolarización o electrodo de succión estimulación eléctrica del nervio motor, comparar ultraestructura sináptica en relación con un bouton de reposo (figura 4). Con alta [K+] despolarizantes estimulación, SVs individuales y agrandamiento de las vesículas (>100 nm de diámetro) puede ser etiquetada con el electrón-densos DAB precipitado siguiente basada en la luz photoconversion (figura 4, derecha). Por razones desconocidas, la membrana de la vesícula agrandada es típicamente menos densamente marcada que la membrana más pequeña del SV. Además SVs aparecen a menudo con el DAB precipitado, en lugar de sólo la membrana, pero esto les hace mucho más fáciles de distinguir de las vesículas sin etiqueta. Con el estímulo de succión del electrodo del nervio motor, la población de SV ciclismo puede marcarse también en relación con SVs sin etiqueta (figura 4, derecha). Con estimulación eléctrica, agrandamiento de las vesículas (>100 nm de diámetro) no se forman perceptible en botones y, consecuentemente, las membranas de la presunta endosomas no están etiquetados por FM1-43 photoconversion. Como arriba, SVs ciclismo normalmente llenan el DAB precipitada de manera algo escogiendo y por lo tanto más fácilmente distinguible de los SVs que no se han formado durante la estimulación (figura 4, derecha). Todavía no hemos intentado photoconversion Tras estimulación de ChR2. Con cursos de diverso tiempo de estimulación, FM1-43 tinte photoconversion permite determinar donde SVs se forman, cómo se trafica con SVs y la sincronización de movimientos entre diferentes piscinas espaciales en el bouton sináptico. La comparación de alta [K+] y el estímulo del nervio permite la disección de bulto y solo mecanismos de endocitosis SV.

Figure 1
Figura 1: Diagrama de flujo del tinte FM1-43 carga del protocolo en la Drosophila NMJ. La disección cola larvaria produce una preparación neuromusculature aplanado, con la cuerda ventral del nervio (VNC) proyectando los nervios segmentarios de la línea media ventral (Vm) a la hemisegmentally repetida pared del cuerpo muscular matrices (paso a). La VNC se corta gratis, y la disección larval entera entonces se incuba en la solución rosa de FM1-43 (4 μm) en preparación para la estimulación (paso b). FM1-43 entonces se carga con un paradigma de estimulación seleccionado (paso 3); con las opciones de alta despolarización [K+] de la larva entera (cI), la succión estimulación de electrodos de un solo nervio motor (cII), o basada en la luz de activación de channelrhodopsin altamente específicos (cIII). FM1-43 incorporación es arrestado con Ca2 +-solución salina gratis y el NMJ cargado de tinte reflejada (paso d). Un segundo estímulo se hace entonces sin FM1-43 en el baño a exocitosis de la vesícula sináptica de tinte (paso e). El mismo NMJ entonces es reflejada vuelva a para ensayo de la terminal sináptica descargada (paso f). Se mide la intensidad fluorescente de NMJs cargados y descargados para cuantificar niveles de exocitosis SV y endocitosis SV. El panel inferior muestra los parámetros de construcción y dimensiones de la cámara de acrílico transparente utilizada para estos estudios. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: comparación de carga y descarga de todos los métodos de estimulación del tinte FM. Comparación de la FM1-43 tinte carga y descarga en el estadio tercero errante NMJ despolarización 1) alto [K+] de toda preparación larval (superior), 2) succión estimulación eléctrica electrodo del nervio motor (medio) y 3) la luz activación de la channelrhodopsin específica (ChR2) sólo en las neuronas motoras (abajo). NMJ (A) las larvas con el anti-HRP:647 marcador de membrana presináptica (azul, izquierda), cargado con FM1-43 via alta despolarización [K+] durante 5 minutos (medio) y luego descargado vía alta despolarización [K+] durante 2 minutos (B) Comparación con la estimulación eléctrica del nervio de electrodo de succión con los mismos períodos de estímulos tanto tinte FM1-43, carga y descarga. (C) objetivo vglut-Gal4>UAS-ChR2-H134R expresión en las neuronas motoras activadas con azul (470 nm) luz para los mismos períodos de estímulos de tinte FM1-43, carga y descarga. Asteriscos refieren a inserciones Mostrar botones de aumento mayor. La barra de escala es 10 μm, con botones sinápticos recuadro ampliado 3.5 X paneles principales. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Mutantes nulos Notum muestran menor tinte de FM carga en botones sinápticos. FM1-43 carga en terminales sinápticos de la errante tercer ínstar NMJ comparando el control genético (w1118) a Notum mutantes nulos (NotumKO). (A) NMJ botones etiquetados con alta despolarización [K+] de toda preparación larval (arriba) o electrodo de succión estimulación de un nervio motor (abajo) w1118 (izquierda) y NotumKO (derecha). (B) Quantified había cargado fluorescencia FM1-43 por NMJ como un diagrama de dispersión comparando la despolarización [K+] alto y electrodo de succión estimulación en w1118 controles vs mutantes NotumKO . (C) Quantified cargado de fluorescencia sobre una base de bouton por bouton como un diagrama de caja y bigote que comparan la despolarización [K+] alto y estimulación de succión electrodo w1118 controles vs NotumKO . Se realizaron pruebas de t dos colas del estudiante para cada comparación con valores p aparece en los gráficos. Las barras indican la media ± SEM con prisma (versión 7.0 para Windows). Los datos de la estimulación eléctrica ha sido adaptados con permiso de Kopke et al., desarrollo 144 (19): 3499-510, 2017. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: ultraestructura sináptica con FM photoconversion de tinte para marcar vesículas. FM1-43 fluorescente puede ser photoconverted a un precipitado de electrón-densos oxidado diaminobenzidina (DAB) para la visualización mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM). (A) A diagrama esquemático del método para etiquetar la NMJ de Drosophila después tinte de FM1-43 dependiente de actividad cargando. photoconversion Imagen de (B) TEM representativo de un tipo salvaje bouton sináptico en reposo (sin estimular). Cuenta la densidad de población de tamaño uniforme SVs. (C) sináptico boutons que han sido estimulados con alta [K+] despolarización salina durante 5 min, sin photoconversion (izquierda) o con photoconversion FM1-43 (derecha). Nota la presencia de estructuras de endosomal a granel, etiquetados y sin etiqueta. Botones sinápticos (D) que han sido estimulados eléctricamente con un nervio de la succión electrodo en 20 Hz durante 5 minutos con no photoconversion (izquierda) o con photoconversion FM1-43 (derecha). Observe que las vesículas cargadas de tinte aparecen mucho más oscuras que las vesículas descargadas adyacentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

Alta estimulación despolarización salina [K+] es por lejos el más fácil de las tres opciones para teñir de FM dependientes de actividad ciclismo, pero probablemente la menos fisiológica29. Este sencillo método despolarizan cada célula accesible en el animal entero y por lo tanto no permite estudios dirigidos. Es posible aplicar localmente alta [K+] solución salina con una micropipeta, pero esto todavía despolarizar pre/postsynaptic células y probable glia sinapsis asociadas1. Otra preocupación importante es eso alta [K+] despolarización unidades rápida formación de endosomas a granel que sólo raramente se ven en botones sin estimular. Sin embargo, a granel endosome formación es un activo mecanismo bloqueado por mutaciones29, lo que indica un proceso fisiológico real. Así, FM1-43 imágenes con alta despolarización [K+] pueden ser utilizado para estudiar selectivamente endocitosis a granel en las sinapsis. Electrodo de succión estimulación eléctrica del nervio motor es un método mucho más controlado. Tiene la ventaja de que sólo un paquete único axón es estimulado, y sólo el termini presináptica es directamente despolarizado (por supuesto, la fibra muscular es entonces despolarizada por acción del transmisor). Por lo tanto, proporciona un gran control interno de NMJs en el mismo animal que no son estimulados. Este método permite controlar estrechamente los parámetros de estimulación, a diferencia del método de estimulación [K+] alto, lo que permite la comparación directa con electrofisiología grabaciones4. Sin embargo, esta técnica requiere de equipo especializado y un nivel bastante alto de habilidad técnica y por lo tanto es menos accesible. Activación basada en luz de channelrhodopsin específica (ChR2) tiene la ventaja de apuntar las neuronas seleccione30. Este método no requiere familiaridad con los métodos de electrofisiología y se puede hacer con equipos muy baratos en cualquier laboratorio, pero este enfoque requiere familiaridad básica con la genética de Drosophila .

La elección de los parámetros de estimulación es críticamente importante para la prueba dinámica de ciclo SV consultado dentro de un rango de condiciones genéticas con fenotipos muy variables1. Todos los métodos, el exterior [Ca2 +] utilizado es un parámetro fundamental del control de la fuerza motriz de SV ciclismo. Con el método de estimulación alta [K+], una decisión importante es [K+] utilizado, que determina el grado de fuerza de despolarización. Las mediciones de la hemolinfa de Drosophila indican un [K+] de 5 mM y 90 mM por lo general es la concentración más a menudo seleccionada para actividad estimulación3,7,15,17 , 31. sin embargo, un rango de [K+] de 30-90 mM se ha empleado para variar la fuerza de estímulo5,16,32. Otra decisión del parámetro crítico es la duración de la estimulación de alta [K+] para ambos FM1-43 de carga y descarga. El período de carga determina si efectivamente se carga toda la población SV ciclismo, o sólo un subconjunto de las vesículas activa7. El período para la descarga del mismo modo dicta el porcentaje de SVs sometidos a exocitosis en el período de estimulación, que puede revelar u ocultar fenotipos mutantes depende de la tasa de cambios en el SV ciclismo frecuencia2. Con el estímulo eléctrico del nervio motor de electrodo de succión, parámetro opciones incluyen también estimulación voltaje, frecuencia, duración y pulso el intervalo. Patrón temporal actividad es un determinante clave de SV bicicleta dinámica7, y patrones de estimulación diferentes pueden movilizar selectivamente distintas piscinas SV. Con la activación ChR2 impulsado por la luz dirigida, las opciones incluyen todo lo anterior (con variables de intensidad de la luz) y opciones adicionales de transgénicos discuten en la sección siguiente. Con estos parámetros, opciones viene control más experimental, pero también mayor complejidad técnica.

Channelrhodopsin-2 (ChR2) es un canal de luz-bloqueado de la membrana permeable a los mono - y cationes divalentes33. Si se selecciona estimulación ChR2, hay muchas opciones para hacerse incluyendo el conductor de Gal4, UAS-ChR2 construcción y variables de la fuente de luz para la activación del canal. Gal4 controladores entre ubicuos y altamente específico. Por ejemplo, omnipresente UH1-Gal4 (daughterless) expresar ChR2 en cada célula, mientras que CcapR-Gal4 (Janelia) unidades de ChR2 en el músculo NMJ 6/7 pero no el músculo 4 NMJ31,34. Esta selectividad puede utilizarse como un control interno de gran alcance. Hay además muchas variantes de UAS-ChR2, incluyendo ChR2-H134R (aquí usado; los photocurrents mayor residuo mutado causas)35, VChR1, jefe y muchas más36. Cada una de estas variantes de canal tiene propiedades distintas de luz de sincronización, conductancia, la selectividad del ion, la cinética y la desensibilización. Cuenta que algunas construcciones contienen una etiqueta fluorescente que puede interferir con la proyección de imagen FM. Por ejemplo, la UAS-ChR2-H134R usado aquí es con la etiqueta mCherry (ex: 587 nm, em: 610 nm), pero no produce emisiones detectible con el FM1-43 (ex: 479 nm, em: 598 nm) filtros de imagen. Parámetro técnico las opciones incluyen la fuente de luz, la longitud de onda y la intensidad para la activación del canal. Una opción utilizada aquí es un barato azul-de emisión de LED, con el estímulo visualmente confirmada analizando las contracciones musculares. También tuvimos éxito en la activación de ChR2 con epifluorescencia, aunque un láser confocal de barrido no era suficiente. Epifluorescencia podría ser utilizado en la estimulación específica (segmentos específicos en lugar del animal entero), pero los parámetros de estimulación son difíciles de controlar, mientras que el LED conectado a un estimulador simple fácilmente altera la duración y la frecuencia de la luz legumbres. Enfocando la luz a través del puerto de cámara del microscopio de disección permite más controlada, intensa estimulación ligera.

Es el experimentador decide dejar el cerebro cuerda ventral del nervio intacto durante el paradigma de la estimulación o no. Elegimos eliminar el sistema nervioso central para la comparación de los tres métodos utilizados aquí, pero a veces el cableado de arriba quedo intacta15. Una complicación es que la actividad neuronal endógena ocurre cuando se deja todo en el sistema nervioso. El grado de esta actividad es muy variable de animal a animal, depende en gran medida la experiencia de la disección del experimentador. Esta actividad variable puede contribuir a la cantidad de tinte FM1-43 que se carga y descarga, que por lo tanto, no es únicamente debida a la estimulación exógena empleada15. Una complicación técnica relacionada es que larvas disecadas intactas contraen la musculatura en movimiento fictive, y este desplazamiento interfiere grandemente con la proyección de imagen NMJ. Este movimiento se alivia si se retira el sistema nervioso central y también a través de la aplicación de Ca2 +-solución salina gratis durante proyección de imagen4. Estos enfoques utilizados aquí son suficientes para permitir excelente tinte FM1-43 imágenes en la preparación de la NMJ. Sin embargo, algunos experimentadores elegir añadir fármacos para inhibir la contracción del músculo (por ejemplo, rianodina, philanthotoxin-433), o utilizar el potencial de acción bloqueadores (por ejemplo, tetrodotoxin)37,38. Una gama de drogas puede utilizarse para manipular selectivamente el ciclo SV, con el fin de resaltar ciertos pasos, o acentuar los fenotipos mutantes para examinar los mecanismos de neurotransmisión. Por ejemplo, algunos investigadores han empleado veratridina (activa los canales de Na+ voltaje39) para aumentar la carga en la piscina de reserva, Cyclosporin A (inhibe la actividad de calcineurina40) para mejorar la endocitosis de la SV, SV y Forskolin (activa cyclase ciclasa41, que aumenta la transmisión sináptica42) para aumentar la exo/endo bicicleta piscina7,43,44. Tales manipulaciones farmacológicas pueden proporcionar perspectivas adicionales. Por último, FM1-43 fondo puede ocurrir en distintos grados basados en la calidad de la disección, protocolo de estímulo y eficacia de lavado. Algunos añaden un derivado sulfobutylated de la β-ciclodextrina Advasep-745, o el fluoróforo acuosa sulforodamina46, para apagar de la fluorescencia no específica y mejorar la relación de señal a fondo.

Existen numerosas técnicas que pueden acompañar la FM fluorescente de la proyección de imagen a la comprensión adicional del ciclo del SV (p. ej., electrofisiología, synaptopHluorin, microscopía electrónica). Un ejemplo que se muestra aquí es FM fluorescencia photoconversion que se utiliza para investigar la SV ciclo detalles ultraestructurales. SVs se organizan en varias piscinas que son espacial y funcionalmente distintos2. La piscina fácilmente liberable (RRP) contiene vesículas inmediatamente lanzadas sobre el estímulo agudo. Un conjunto más amplio de reciclaje mantiene liberación SV en condiciones de actividad moderada. Una piscina de interior de la reserva (RP) es reclutada sólo con estimulación fuerte (aparentemente cerca no fisiológico)2. Las piscinas SV que se activan dependen del tipo de estímulo utilizado47, y los informes de la NMJ de Drosophila usar photoconversion FM han revelado ideas claves sobre propiedades espaciales y funcionales de estos diferentes SV piscinas48. FM photoconversion puede utilizarse para el estudio de piscinas SV activados bajo paradigmas diferentes de estimulación y preguntas de la consulta como la interacción trata ampliamente debatidos entre endosomas y SVs49. Si el experimentador está interesado en la proyección de imagen de FM en combinación con otros cambios dependientes de actividad en la sinapsis, hay un análogo al parecer corregir del tinte FM1-43 (FM1-43FX). Este sondeo debe permiten fijar la Drosophila NMJ después tinte dependiente de actividad de carga y luego seguir con anticuerpo etiquetado para probar las correlaciones entre el nivel de actividad de bouton (FM colorante de la fluorescencia) y expresión de actividad dependiente de un proteína de interés. En el futuro, de muy gratificante explorar métodos adicionales que podrían permitir la combinación de tintes de FM proyección de imagen con otros métodos por imágenes en la sinapsis de modelo hermosa NMJ de Drosophila .

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Disclosures

Los autores declaran a no hay intereses contrapuestos.

Acknowledgments

Agradecemos a los miembros de Broadie Lab contribuciones a este artículo. Este trabajo fue financiado por los NIH R01s MH096832 y MH084989 a K.B. y beca predoctoral NIH MH111144 F31 a D.L.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

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Neurociencia número 135 Drosophila Unión neuromuscular FM1-43 photoconversion electrofisiología microscopía electrónica de transmisión
Tinte de FM ciclismo en la sinapsis: comparación de potasio alto despolarización, eléctrico y Channelrhodopsin estimulación
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Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye… More

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

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