Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

FM fargestoff sykling Synapse: sammenligne høyt kalium Depolarization, elektrisk og Channelrhodopsin stimulering

Published: May 24, 2018 doi: 10.3791/57765
Automatic Translation
1, 2
1Department of Biological Sciences, Vanderbilt University, 2Departments of Biological Sciences, Pharmacology, Cell and Developmental Biology, Kennedy Center for Research on Human Development, Vanderbilt University and Medical Center

Summary

Synaptiske vesicle (SV) sykling er kjernen mekanisme intercellulære kommunikasjon på neuronal synapser. FM fargestoff opptak og utgivelsen er hovedmåten å kvantitativt assaying SV endo- og exocytosis. Her sammenligne vi alle stimulering metoder for å drive FM1-43 sykling Drosophila nevromuskulær krysset (NMJ) modell synapse.

Abstract

FM fargestoffer brukes til å studere synaptic vesicle (SV) syklusen. Disse amphipathic sonder har et hydrofile hode og hydrofobe hale, noe som gjør dem vannløselige med reversibel angi og avslutte membran lipid bilayers. Disse styryl fargestoffer er relativt ikke-fluorescerende i vandig medium, men innsetting ytre heftet av plasma membranen forårsaker en > 40 X økning i fluorescens. I neuronal synapser, er FM fargestoffer internalisert under SV endocytose, trafikkert både innenfor og mellom SV bassenger, og befridd med SV exocytosis, gir et kraftig verktøy for å visualisere presynaptic stadier av neurotransmission. En primær genetisk modell av glutamatergic synapse utvikling og funksjon er Drosophila nevromuskulær krysset (NMJ), der FM fargestoff bildebehandling har vært brukt mye å kvantifisere SV dynamikken i en rekke mutant forhold. NMJ synaptic terminalen er lett tilgjengelig, med en vakker rekke store synaptic boutons ideelt for bildebehandlingsprogrammer. Her vi sammenligne og kontrast på tre måter å stimulere Drosophila NMJ å kjøre aktivitet-avhengige FM1-43 fargestoff opptak/release: 1) bad anvendelse av høy [K+] depolarize nevromuskulær vev, 2) enkel sugeevnen elektrode motor nerve stimulans til depolarize presynaptic nerve terminal, og 3) målrettet transgene uttrykk for channelrhodopsin varianter for lys-stimulert, romlig kontroll av depolarization. Hver av disse metodene har fordeler og ulemper for studier av genetisk mutasjon effekter på SV syklusen på Drosophila NMJ. Vi vil diskutere disse fordeler og ulemper å hjelpe valg av stimulering tilnærming, sammen med metodikkene som er spesifikke for hver strategi. I tillegg til fluorescerende bildebehandling kan FM fargestoffer photoconverted til elektron-tette signaler visualisert bruker overføring elektronmikroskop (TEM) for å studere SV syklus mekanismer på et ultrastructural nivå. Vi tilbyr sammenligninger av AC confocal og elektronmikroskop imaging fra ulike metoder for Drosophila NMJ stimulering, å hjelpe valg av fremtidige eksperimentelle paradigmer.

Introduction

Vakkert preget Drosophila larver nevromuskulær krysset (NMJ) glutamatergic synapse modellen er brukt til å studere synapse dannelse og fungere med et stort spekter av genetisk forstyrrelser1. Motor neuron terminalen består av flere axon avdelinger, hver med mange forstørret synaptic boutons. Disse capacious varicosities (opptil 5 µm i diameter) inneholder alle neurotransmission maskiner, inkludert uniform glutamatergic synaptic blemmer (SVs; ~ 40 nm i diameter) i cytosolic reserve og lett releasable bassenger2. Disse vesikler dock på de presynaptic plasma membranen fusion aktive områdene (AZs), der exocytosis formidler glutamat nevrotransmitter utgivelsen for trans-synaptic kommunikasjon. Senere, hentes SVs fra plasma membranen via kyss-and-run resirkulering eller clathrin-mediert endocytose (CME) for gjentatte exo/endocytose sykluser. Drosophila NMJ er lett tilgjengelig og godt egnet for både isolere og karakterisere SV syklus mutanter. Bruke frem genetisk skjermer, har romanen mutasjoner ført til identifisering av nye gener kritisk for SV syklus3. Videre har omvendt genetisk tilnærminger starter med allerede kjent gener ført til utviklingen av nye SV syklus mekanismer gjennom forsiktig beskrivelse av mutant sykling fenotyper4. Drosophila NMJ er nesten perfekt som en eksperimentell synaptic forberedelse for dissekere SV endocytose og exocytosis mekanismer via metoder å optisk spor vesicle Sykling under neurotransmission.

En rekke fluorescerende markører tillate visuell sporing av blemmer under sykling dynamics, men den mest allsidige er FM fargestoff analogs som er først syntetisert av Mao, F., et al. 5. strukturelt, FM fargestoffer inneholder en hydrofile hode og en lipofile hale knyttet gjennom en aromatiske ringen, et sentralt område overdragelse spektrale egenskapene. Disse styryl fargestoffer partisjonere reversibel i membraner, ikke 'flip-flop' mellom membran brosjyrer og så er aldri gratis i stoffer, og er langt mer fluorescerende i membraner vann5. Reversibel innsetting en lipid bilayer forårsaker en 40-fold økning i fluorescens6. På neuronal synapser består klassisk FM fargestoff merking eksperimenter av bading synaptic utarbeidelse med fargestoff under depolarizing stimulering laste fargestoff via SV endocytose. Eksterne fargestoff deretter vasket bort og SV syklusen er arrestert i en kalsium-gratis ringe løsning å image lastet synapser7. En ny runde med stimulering i en dye-fri bad utløser FM utgivelse gjennom exocytosis, en prosess som kan følges ved å måle fluorescens intensitet reduksjon. SV bestander fra en enkelt vesicle å bassenger som inneholder hundrevis av blemmer kan være kvantitativt overvåkede6,7. FM fargestoffer har blitt brukt til å dissekere aktivitet-avhengige mobilisering av funksjonelt forskjellige SV bassenger og sammenligne kyss-and-run vs CME sykling8,9. Metoden er endret til separat analysen fremkalt, spontane og miniatyr synaptic syklus aktiviteter (med svært følsom utstyr å oppdage svært liten fluorescens endringer og redusere photobleaching)10. Analyser kan utvides til ultrastructural nivå ved photoconverting fluorescerende FM signalet til et elektron-tette etikett for overføring elektronmikroskop11,12,13,14 .

Historisk bading synaptic forberedelser i en høy konsentrasjon av kalium (heretter referert til som "high [K+]") har vært metoden for valg for depolarizing stimulering å indusere SV syklingen. mellom frosk cholinergic NMJ5, kultivert gnager hjernen hippocampus neurons15 Drosophila glutamatergic NMJ modell16,17. Denne høy [K+] tilnærmingen er enkel, krever ingen spesialisert utstyr, og er derfor tilgjengelig for de fleste laboratorier, men har begrensninger for både programmer og data tolkning. En mye mer fysiologisk metoden er å bruke sugekraft elektrode elektrisk stimulering av nerve4,5,12. Denne tilnærmingen kjører handlingen potensial overføring for direkte stimulering av presynaptic nerve terminal, og resultatene kan være direkte forhold til elektrofysiologiske analyser av neurotransmission funksjonen13,14, 15, men krever spesialisert utstyr og er teknisk mye mer utfordrende. Bruk av optogenetics har bruk av channelrhodopsin nevrale stimulering flere fordeler, inkludert tett spatiotemporal kontroll over kanalen uttrykk med de binære Gal4/UAS system20. Denne tilnærmingen er teknisk mye lettere enn sugekraft elektrode stimulering og krever ikke annet enn en veldig billig LED-lyskilde. Her, brukes avbilding av FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) pyridinium dibromide) å både sammenligne metodene for tre ulike stimulering i Drosophila NMJ: enkel høy [K+ ], utfordrende elektriske og nye channelrhodopsin tilnærminger.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. larver lim disseksjon

  1. Grundig blande 10 deler av silikon-elastomer base med 1 del av silikon-elastomer herding agent fra elastomer kit (Tabell for materiale).
  2. Coat 22 x 22 mm glass coverslips med elastomer og kur på en varm plate på 75 grader i flere timer (inntil lenger klissete å ta).
  3. Plassere en enkelt elastomer-belagt glass dekkglassvæske i skreddersydde plexi glass disseksjon kammeret (figur 1, nederst) i forberedelse til larver dissection.
  4. Forberede lim Pipetter fra Borosilikatglass kapillær bruker en standard microelectrode avtrekker å få ønsket taper og tips størrelse.
  5. Forsiktig bryte tipset brønnene og den andre enden, legge 2 ft av fleksible plast røret (1/32" indre diameter, ID, 3/32" utvendig diameter, OD, 1/32" muren. Tabell av materialer) med munnen passer (P2 pipette tips).
  6. Fyll en liten beholder (0,6 mL Eppendorf tube cap) med et lite volum (~ 20 µL) lim (Tabell for materiale) i forberedelse til larver dissection.
  7. Fylle kammeret med saltvann (i mM): 128 NaCl, 2 KCl, 4 MgCl2, 1 CaCl2, 70 sukrose og 5 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic syre (HEPES) pH 7.2.
  8. Legg til anti-hest reddik peroxidase (HRP) antistoff konjugert til Alexa Fluor 647 (anti-HRP:647; fortynne 1:10 fra en 1 mg/mL aksje) for merking av NMJ presynaptic terminal under disseksjon21,22.
  9. Bruker en fin pensel (størrelse 2), fjerne en vandrende tredje skikkelsen fra mat ampullen og plasser på elastomer-belagt dekket glasset.
  10. Fyll glasset brønnene spissen med en liten mengde lim bruker negative lufttrykket generert av munnen med vedlegg (trinn 1.5).
  11. Posisjon Larven dorsal side opp med tang og lim hodet til elastomer-belagt dekkglassvæske med en liten dråpe lim med positive lufttrykket ved munnen.
  12. Gjenta dette med den bakre enden av Larven, å sørge for at dyret er strukket stram mellom to lim vedleggene.
  13. Ved hjelp av saks (blader 3 mm; Tabell for materiale), gjør et vannrett kutt (~ 1 mm) på bakre og en vertikal kutt langs dorsal midtlinjen.
  14. Ved hjelp av fine pinsett (#5, Tabell for materiale), forsiktig fjerne dorsal luftrøret, gut, fett kroppen og andre indre organer som dekker muskulatur.
  15. Gjenta liming for fire kroppen veggen flaps, gjør sikker å forsiktig strekke kroppen veggen både horisontalt og vertikalt.
  16. Løfte det ventrale (VNC) ved hjelp av pinsett, nøye klippe motor nerver med saksen og deretter fjerne VNC.
  17. Erstatte disseksjon saltkildene med Ca2 +-gratis saltvann (samme som ovenfor disseksjon saltkildene uten CaCl2) for å stoppe SV sykling.

2. alternativ 1: High [K+] FM fargestoff lasting

  1. Fra en FM1-43 lagerløsning (4 mM), legge til 1 µL 1 mL av 90 mM KCl løsning (høy [K+] i disseksjon saltvann) for en siste konsentrasjon av 4 µM.
  2. Bruke en pipette, erstatte Ca2 +-gratis saltvann i tenkelig kammer med høy [K+] FM fargestoff løsning å stimulere SV endocytose fargestoff opptak.
  3. Straks en digital timer for forhåndsbestemt varigheten av høye [K+] depolarizing stimulering periode (f.eks., 5 min; Figur 2).
  4. For å bekrefte en sunn larver forberedelse, Merk de sterke sammentrekninger av muskulaturen i hele høy [K+] depolarization perioden.
  5. Når tidtakeren perioden avsluttes raskt fjerne høy [K+] FM fargestoff løsningen og erstatte med Ca2 +-gratis saline stoppe SV sykling.
  6. Vask i rask rekkefølge med Ca2 +-gratis saltvann (5 x for 1 min) for å sikre høy [K+] FM fargestoff løsningen fjernes fullstendig.
  7. Opprettholde larver forberedelse i frisk Ca2 +-gratis saltløsning i umiddelbar bildebehandling med AC confocal mikroskop.

3. imaging: AC Confocal mikroskopi

  1. Bruk en oppreist AC confocal mikroskop med en 40 X vann nedsenking mål å bilde NMJ fargestoff fluorescens (andre mikroskop kan brukes).
  2. Bildet muskel 4 NMJ av abdominal segmenter 2-4 (andre NMJs kan avbildes) og samle bilder ved hjelp av riktig programvare (Tabell for materiale).
  3. Bruk en HeNe 633 nm laser for å opphisse HRP:647 (med lang-pass filter > 635 nm) og en Argon 488 nm laser å opphisse FM1-43 (med Båndpassdesign filter 530-600 nm).
  4. Operativt bestemme optimal forsterkning og forskyvning for begge kanaler.
    Merk: Disse innstillingene forblir konstant gjennom hele eksperimentet.
  5. Ta en AC confocal Z stabel gjennom hele valgte NMJ ovenfra HRP-merket nederst synaptic terminalen.
  6. Ta forsiktig notat av NMJ fotografert (segment, side og muskel) for å sikre overskudd til den nøyaktig samme NMJ etter FM fargestoff lossing.

4. high [K+] stimulering: FM fargestoff lossing

  1. Erstatte Ca2 +-gratis saline med høy [K+] saltkildene (uten FM1-43 fargestoff) å kjøre depolarization, SV exocytosis og fargestoff utgivelsen.
  2. Straks en digital timer for forhåndsbestemt varigheten av høy [K+] stimulering perioden (f.eks., 2 min; Figur 2).
  3. Når tidtakeren perioden avsluttes umiddelbart fjerne høy [K+] saltkildene og erstatte med Ca2 +-gratis saline stoppe SV sykling.
  4. Vask i rask rekkefølge med Ca2 +-gratis saltvann (5 x for 1 min) for å sikre høy [K+] saltkildene fjernes fullstendig.
  5. Opprettholde larver forberedelse i frisk Ca2 +-gratis saltløsning i umiddelbar bildebehandling med AC confocal mikroskop.
  6. Være sikker på å image FM1-43 fargestoff fluorescens på den samme NMJ ovenfor med samme AC confocal innstillinger.

5. alternativ 2: Elektrisk stimulering FM fargestoff lasting

  1. Forberede en suge pipette bruker microelectrode puller (Tabell for materiale) å skaffe nødvendig taper og tips størrelse.
  2. Brann-polsk microelectrode spissen med en mikro-smi til en enkelt motor nerve kan bli sugd med trangt.
  3. Skyv sugekraft pipette på elektrodeholderen på en micromanipulator og legge til den lange fleksible plast røret og en sprøyte.
  4. Angi stimulator parametere (f.eks., 15 V, 20 Hz frekvens, 20 ms varighet og 5 min (figur 2) eller 1 min (Figur 3)).
  5. Erstatte Ca2 +-gratis saltvann på larver utarbeidelse med over FM1-43 saltvann (4 µM, 1 mM CaCl2) på elektrofysiologi riggen.
  6. Sett forberedelsen på mikroskopet scenen og heve objektbordet til Larven og suge pipette blir i fokus (40 X vann nedsenking objektiv).
  7. Suge opp en løkke av kuttet motor nerve innervating den valgte hemisegment med negativ lufttrykket generert av sprøyten til sugekraft elektroden.
  8. Teste funksjonen sugekraft elektrode med en kort burst av stimuli mens visuelt overvåking for muskel sammentrekning i den valgte hemisegment.
  9. Stimulere motor nerve valgte parametere (trinn 5.4) å kjøre SV endocytose og FM1-43 fargestoff opptak (figur 2).
  10. Vask i rask rekkefølge med Ca2 +-gratis saltvann (5 x for 1 min) for å sikre FM1-43 fargestoff løsningen fjernes fullstendig.
  11. Opprettholde larver forberedelse i frisk Ca2 +-gratis saline umiddelbar bildevisning AC confocal tenkelig protokollen ovenfra.
  12. Legg nøye merke til NMJ fotografert (segment, side og muskel) for å sikre tilgang til nøyaktig samme NMJ etter FM fargestoff lossing.

6. elektrisk stimulering: FM fargestoff lossing

  1. Erstatte Ca2 +-gratis saline med vanlig saltvann (uten FM1-43 fargestoff) og utarbeidelse tilbake på elektrofysiologi riggen scenen.
  2. Angi stimulator parametere for lossing (f.eks15 V, 20 Hz frekvens, 20 ms varighet og 2 min (figur 2) eller 20 s (Figur 3)).
  3. Suge den samme motor nerven i samme elektroden som ovenfor, og deretter stimulere for å aktivere SV exocytosis og FM1-43 fargestoff utgivelsen.
  4. Vask i rask rekkefølge med Ca2 +-gratis saltvann (5 x for 1 min) for å sikre ekstern fargestoff fjernes fullstendig.
  5. Opprettholde larver forberedelse i frisk Ca2 +-gratis saltløsning i umiddelbar bildebehandling med AC confocal mikroskop.
  6. Sikre for å image FM1-43 fargestoff fluorescens på den samme NMJ ovenfor med samme AC confocal innstillinger.

7. alternativ 3: Channelrhodopsin stimulering FM fargestoff lasting

  1. Øke ChR2-uttrykke larver på mat som inneholder den ChR2 co-faktor all-trans retinal (oppløst i etanol, 100 µM siste konsentrasjon).
  2. Plass larver forberedelse i plexiglass kammer på en disseksjon mikroskop scene utstyrt med kameraet port.
  3. Knytte en blå LED (470 nm; Tabell av materialer) til en programmerbar stimulator bruker en koaksialkabel og plasser LED i kameraet porten.
  4. Fokus den blå LED lysstråle på dissekert larver funksjonen bruke zoomfunksjonen mikroskop.
  5. Erstatte Ca2 +-gratis saltvann på larver utarbeidelse med over FM1-43 saltvann (4 µM, 1 mM CaCl2) på optogenetic scenen.
  6. Angi LED parametere bruke stimulator (f.eks15 V, 20 Hz frekvens, 20 ms varighet og 5 min (figur 2)).
  7. Starter lett stimulering og spore med en tidtaker for forhåndsbestemt varigheten av optogenetic stimulering perioden (f.eks, 5 min; Figur 2).
  8. Når tidtakeren stopper, raskt fjerne FM fargestoff løsningen og erstatte med Ca2 +-gratis saline stoppe SV sykling.
  9. Vask i rask rekkefølge med Ca2 +-gratis saltvann (5 x for 1 min) for å sikre FM fargestoff løsningen fjernes fullstendig.
  10. Opprettholde larver forberedelse i frisk Ca2 +-gratis saltløsning i umiddelbar bildebehandling med AC confocal mikroskopet ved hjelp imaging protokollen ovenfra.
  11. Legg nøye merke til NMJ fotografert (segment, side og muskel) for å sikre tilgang til nøyaktig samme NMJ etter FM fargestoff lossing.

8. Channelrhodopsin stimulering: FM fargestoff lossing

  1. Erstatte Ca2 +-gratis saline med vanlig saltvann (uten FM1-43 fargestoff) på disseksjon mikroskop scenen med kameraet port LED fokusert på larvene.
  2. Angi stimulator parametere for lossing (f.eks 15 V, 20 Hz frekvens, 20 ms varighet og 2 min (figur 2)).
  3. Starter lett stimulering og spore med en tidtaker for forhåndsbestemt varigheten av optogenetic stimulering perioden (f.eks 2 minutter; Figur 2).
  4. Når tidtakeren perioden avsluttes raskt fjerne FM fargestoff løsningen og erstatte med Ca2 +-gratis saline stoppe SV sykling.
  5. Vask i rask rekkefølge med Ca2 +-gratis saltvann (5 x for 1 min) for å sikre ekstern fargestoff fjernes fullstendig.
  6. Opprettholde larver forberedelse i frisk Ca2 +-gratis saltløsning i umiddelbar bildebehandling med AC confocal mikroskop.
  7. Sikre for å image FM1-43 fargestoff fluorescens på den samme NMJ ovenfor med samme AC confocal innstillinger.

9. fluorescens kvantifisering

  1. Belaste bildet i bildet J (NIH åpen kildekode) og opprette en maksimale intensitet projeksjon ved å klikke bildet | Stabler | Z-prosjekt.
  2. Bruke anti-HRP:647 kanal, gå til Image | Justere | Terskelen og skyv den øverste verktøylinjen til bare NMJ er uthevet.
  3. Bruke tryllestav verktøyet, klikk på NMJ. Hvis NMJ er usammenhengende, holder Shift-knappen og velger alle deler.
  4. Endre bildet til FM1-43 fargestoff kanalen og gå analyser | Mål å få fluorescens målingen.
  5. Gjenta trinn 9.1-9.4 for "fjernet" bildet fra det samme NMJ (identifisert segmentet, side og muskel).
  6. For å oppnå ønsket fargestoff som ble fjernet, ta forholdet mellom losset/lastet fluorescens intensiteten.
    Merk: Denne fremgangsmåten kan endres for å analysere fluorescens på bouton per bouton basis ved hjelp av enten "oval" eller "Frihånd" markeringsverktøyene. Bakgrunn fluorescens kan trekkes av prøvetaking muskel fluorescens. Agenter kan også legges til redusere denne bakgrunn.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 viser arbeidsflyten for aktivitet-avhengige FM fargestoff imaging protokollen. Eksperimentet begynner alltid med samme larver lim dissection, uansett stimulering senere. Figur 1a er en skjematisk av en dissekert larve, viser ventrale nervesystemet (VNC), utstråler nerver og gjentatte hemisegmental muskel mønster. VNC fjernes og utarbeidelse badet i en 4 µM løsning av FM1-43 (figur 1b, rosa). Utarbeidelse stimuleres deretter i nærvær av FM fargestoff bruke én av tre mulige alternativer laste fargestoff via aktivitet-avhengige SV endocytose (figur 1cI-III). Neste, FM fargestoff sykling er arrestert ved hjelp av Ca2 +-gratis saltvann og en bestemt NMJ terminal som er lastet med FM fargestoff er fotografert ved hjelp av en AC confocal mikroskop ("lastet bilde"; Figur 1 d). I dette tilfellet lastet muskelen 4 NMJ er valgt med skjematisk viser plasseringen av nerve, NMJ terminal forgrening og FM synaptic boutons. Synaptiske utarbeidelse stimuleres for annen gang benytter det likt metoden valgt ovenfor, men i fravær av FM fargestoff kjøre SV exocytosis og FM1-43 utgivelsen (figur 1e). Samme identifisert NMJ (muskel 4 NMJ i dette eksemplet) er så re-fotografert HRP:647 synaptic etikett og gjenværende FM1-43 vesicle signal ("losset bilde"; Figur 1f). Eksperimentator avgjør styrken og varigheten av lasting og lossing faser for å optimalisere målene for en bestemt analysen eller mutant tilstand. Fluorescens intensitet er kvantifisert etter lasting og lossing (figur 1 d, 1f), for å få målinger av synaptic fargestoff endocytose, exocytosis og andelen lastet FM fargestoff utgitt. Analyser kan gjøres for hele NMJ eller én boutons.

FM fargestoff sykling stimuleret på tre måter: 1) høy [K+] saltvann depolarization av hele preparatet, 2) sugekraft elektrode stimulering av motor nerve eller 3) lys drevet aktivering av målrettet channelrhodopsin (ChR2; Figur 2). En direkte side ved side sammenligning mellom alle metodene, vi stimulert med hver tilnærming for 5 min i nærvær av FM1-43 (lasting) og deretter 2 min i fravær av FM1-43 (fjerne), og fotografert HRP-merket NMJs ved hjelp av identiske AC confocal innstillinger ( Figur 2). Høy [K+] saltvann depolarization metoden følger brukte FM1-43 protokollen for Drosophila larver NMJ23, bortsett fra vi bruke lim i stedet for pins larver dissection. Limet unngår forstyrrelser med målene som mikroskop og gir mer nøyaktig bestemmelse av kroppen veggen spenning, men krever en moderat læringskurve. Alle metodene produsere sterke og konsekvent fluorescerende signaler gjennom NMJ synaptic bouton arbor og personlige synaptic boutons (insets). Høy [K+] saltvann depolarization metoden forårsaker alle NMJs å være FM-lastet gjennom Larven som det depolarizes hver Nevron i dyr (figur 2A, midten). Metoden nerve sugekraft elektrode elektrisk stimulering stasjoner i en enkelt hemisegment næringsplante som den tilsvarende innervating motor nerve er stimulert (figur 2B, midten). Unstimulated segmenter i samme dyret skiller bruker HRP etiketten, men inneholder ingen observerbare fluorescerende fargestoff lasting, og tjene som utmerket internkontroll. Optogenetic ChR2 metoden produserer målrettet depolarization avhengig av transgene Gal4 driveren ansatt (figur 2C). Her var sjåføren en vesicula glutamat transporter (vglut) Gal4, så alle glutamatergic neurons er depolarized med blått lys stimulering, inkludert glutamatergic motor neurons. Som et resultat, er alle NMJs lastet med FM1-43 fargestoff i dette eksemplet (figur 2C, midten). Celle-spesifikke drivere kan brukes til å merke bestemte NMJs og la andre umerkede for en intern kontroll.

FM fargestoff lossing ble nådd via samme metode som ble brukt til å laste fargestoff. I den første metoden, var larver utarbeidelse bare badet i høy [K+] saltvann i fravær av FM1-43 depolarize celler, kjøre SV exocytosis, og losse synaptic terminalene (figur 2A, høyre). Vi ofte velge en kortere lossing periode (2 min), så lossing er delvis og terminaler forblir synlig i FM-kanal. Sugekraft elektrode elektrisk stimulering lossing er betydelig mer utfordrende, fordi det innebærer tilbake til den samme hemisegment, identifisere samme nerve og å stimulere den nerven i fravær av FM1-43 kjøre fargestoff lossing (figur 2B , høyre). Merk at fargestoff lossing var igjen delvis. Det ChR2 lossing innebærer en andre periode blå LED-belysning av larver utarbeidelse i fravær av FM1-43 å aktivere kanalene, depolarize motor neurons og stimulere SV exocytosis fargestoff utgivelsen (figur 2C, høyre). Med denne tidsskalaen lossing (2 min), hver av disse depolarization metoder losset bare en prosentandel av lastet FM1-43 fargestoff, med høy [K+] sterkeste og ChR2 svakeste drive fargestoff utgivelsen (figur 2). Vi målt LED lysintensiteten brukes (140 µW/mm2), som var i den publiserte utvalg (20-1000 µW/mm2)24,25,26. ChR2 aktiveres maksimalt ~ 1 mW belysning fra 50-200 mW lyskilder, med ChR2 effektivitet også avhengig av ATR konsentrasjonen matet til Larvene27,28. Dermed kan ChR2 stimulering styrke manipuleres. Videre kan forholdet ikke være sant med andre stimulering styrker, tidsrammer eller genotyper. Hvis eksperimentator arbeider med en mutant som har redusert SV endocytose eller uvanlig rask exocytosis, må stimulasjonsparameteret endres for å opprettholde et observerbare signal etter lossing. Anti-HRP etiketten gjør det mulig å identifisere NMJ selv i den komplette fraværet av FM, men dette er ikke ideelt for kvantifisering. I prinsippet kunne også fjerne stimulering av en annen type fra lasting stimulering.

Vi har nylig studert tap av utskilles synaptic deacylase Notum effekter på SV syklusen bruker elektrisk stimulering4. Her utvide vi denne analyse for å sammenligne 1) høy [K+] depolarization og 2) sug elektrode motor nerve stimulering metoder (Figur 3). Vi finner at begge metodene gir et lignende resultat, viser redusert FM1-43 fargestoff lasting i en Notum null mutant; men er graden av fenotypen forskjellig mellom de to metodene. Etter depolarization med høy [K+] saltvann i fem minutter er det en stor nedgang i lastet fluorescens intensitet mellom genetisk bakgrunn kontroll (w1118) med høye nivåer og Notum null mutanter (NotumKO ) med lave nivåer (figur 3A, topp). I kvantifisert målinger, er normalisert FM fluorescens intensiteten i HRP-skissert NMJ terminaler betydelig redusert i fravær av Notum (w1118 1.0 ± 0,05 vs NotumKO 0.57 ± 0,07, n≥13, p < 0.0001; Figur 3B). Etter elektrisk stimulering på 20 Hz for 1 min finner vi en ubetydelig nedgang i lastet FM1-43 intensitet mellom kontroller og Notum nullverdier når kvantifisere hele NMJ fluorescens (w1118 1.0 ± 0,05 vs NotumKO 0,86 ± 0,06; n = 8, p = 0,10; Figur 3A, B). Når måle fargestoff innlemmelse på bouton per bouton basis, finner vi en betydelig reduksjon i dye lastet med begge metodene. I kvantifisert målinger etter stimulering med høy [K+] saltvann, normalisert FM fluorescens intensitet per bouton er betydelig redusert (w1118 1.0 ± 0,02 vs NotumKO 0.52 ± 0,02, n≥241, p< 0.0001; Figur 3 c). Etter elektrisk stimulering, normalisert fluorescens intensitet per bouton er også betydelig redusert, men til en lavere grad (w1118 1.0 ± 0,02 vs NotumKO 0,83 ± 0,02, n≥127, p< 0,0001; Figur 3 c).

Resultatet forskjellene mellom to stimulering paradigmer kan skyldes flere faktorer. Først stimulering styrken er antatt å være større med høy [K+] sammenlignet med elektrisk motor nerve. Elektrofysiologi opptak kan ikke gjøres i nærvær av den høye [K+] saltvann, men den larver neuromusculature klart å være robust stimuleres, muskelsammentrekninger er sterk og kontinuerlig i hele 5 min bading perioden. Men vet vi ikke styrke eller hyppigheten av stimulering. Elektrisk stimulering er derimot mye mer kontrollert med brukeren å velge nøyaktig spenning styrke og hyppigheten av stimulering. Andre stimulering varigheten var lengre med høy [K+] sammenlignet med elektrisk nervestimulering (Figur 3). Vi valgte 1 min til 20 Hz elektrisk stimulering etter gjentatte forsøk. Etter 1 min fargestoff lasting var det en sterk og pålitelig FM1-43 signal, så vi valgte det paradigmet for vår studie4, selv om 5 min av stimulering ga en enda sterkere fluorescerende signal (figur 2). Dermed bidrar lengden på stimulering paradigmet sannsynlig til omfanget variasjon i FM1-43 lasting mellom høy [K+] og elektrisk stimulering (figur 3B, C). Selv om høy [K+] metoden viste en mer robust fenotypen for Notum mutanter, brukte vi fortsatt metoden elektrisk på grunn av større kontroll4. Det er mange parametere til å styre som styrke, hyppighet og varighet av stimulering, og disse innstillingene må avgjøres basert på mutant og spørsmålet. For eksempel stimulering metoden valget kan avhenge av SV bassenget avhørt7 og aktivitet-avhengig mekanisme undersøkt10.

Etter FM1-43 lastes inn i terminalen NMJ, kan man bruke fluorescens fargestoff photoconversion å produsere elektron-tette signalet for elektronmikroskop (Figur 4). I denne metoden utsatt fargestoff lastet utarbeidelse for intens fluorescent lyset i nærvær av diaminobenzidine (DAB), med reaktive oksygen arter fra FM fargebad oksiderende DAB for å opprette en mørk utløse (figur 4A)11. Se JoVE artikkelen på photoconversion av styryl fargestoffer for fullstendige detaljer12. Fordelen med denne metoden er at SVs avsløres tydelig på et ultrastructural nivå, selv om SV syklusen er selvfølgelig arrestert med statisk elektronmikroskop imaging. I fravær av stimulering, synaptic boutons på Drosophila NMJ lastes tett med blemmer (~ 40 nm i diameter; Figur 4B), med sjeldne forekomst av forstørret organeller (>100 nm i diameter) antas å være sykling endosomes. Høy [K+] saline depolarizing stimulering sterkt endrer denne profilen med en delvis uttømming av befolkningen SV og rask akkumulering av mange forstørret organeller (>100 nm i diameter) antatt å være avledet fra bulk endocytose av plasma membranen (figur 4C, venstre). Selv om lignende rom finnes i unstimulated kontroller, reiser av disse organeller etter høy [K+] saltvann depolarization bekymringen at dette kan være en ikke-fysiologiske reaksjon. Sugekraft elektrode elektrisk stimulering av motor nerve mer effektiv relativt i å tappe befolkningen SV og produserer ikke mer av forstørret endosomal blemmer (Figur 4 d, venstre). Dette tyder på at bulk endocytose drevet av høy [K+] depolarization bidrar til å opprettholde befolkningen SV under mer intens etterspørsel.

FM1-43 photoconversion kan oppnås med høy [K+] saltvann depolarization eller sug elektrode elektrisk stimulering av motor nerve, sammenligne synaptic ultrastructure i forhold til en hvile bouton (Figur 4). Med høy [K+] depolarizing stimulering, både individuelle SVs og forstørret blemmer (>100 nm i diameter) kan merkes med den elektron-tette DAB bunnfall følgende lys-drevet photoconversion (figur 4C, høyre). For ukjente grunner er forstørret vesicle membranen vanligvis mindre tett merket enn mindre SV membranen. Videre SVs vises ofte fylt med DAB bunnfall, snarere enn bare membranen, men dette gjør dem mye enklere å skille fra umerkede blemmer. Med sugekraft elektrode stimulering av motor nerve, kan sykling SV befolkningen også merkes i forhold til umerkede SVs (Figur 4 d, høyre). Med elektrisk stimulering, forstørret blemmer (>100 nm i diameter) er ikke detectably dannet i boutons og konsekvent membraner av den antatte endosomes er ikke merket av FM1-43 photoconversion. Som er ovenfor, sykling SVs vanligvis fylt med DAB bunnfall i noe all-or-none mote, og derfor lettere skilles fra SVs som ikke er dannet under stimulering (Figur 4 d, høyre). Vi har ikke ennå forsøkt photoconversion etter ChR2 stimulering. Med annen kurs av stimulering gjør FM1-43 fargestoff photoconversion det mulig å bestemme hvor SVs dannes, hvordan SVs smugles og tidspunktet for bevegelse mellom forskjellige romlige bassenger i synaptic bouton. Sammenligning av høy [K+] og nervestimulering lar Disseksjon av bulk og enkelt SV endocytose mekanismer.

Figure 1
Figur 1: Flytskjema FM1-43 fargestoff lasting protokollen på Drosophila NMJ. Larver lim dissection produserer en flat neuromusculature forberedelse, med ventrale (VNC) prosjektering Segmentinformasjon nervene fra ventrale midtlinjen (Vm) til hemisegmentally gjentok kroppen veggen muskler matriser (trinn en). VNC kuttes gratis, og hele larver dissection er deretter ruges i rosa FM1-43 løsningen (4 µM) i forberedelse til stimulering (trinn b). FM1-43 er så lastet med et valgt stimulering paradigme (trinn 3); med alternativene for høy [K+] depolarization av hele Larven (cI), enkel sugeevnen elektrode stimulering av en enkelt motor nerve (cII) eller lys-drevet aktivering av målrettet channelrhodopsin (cIII). FM1-43 innlemmelse er arrestert ved hjelp av Ca2 +-gratis saltvann og fargestoff lastet NMJ fotografert (trinn d). En andre stimulering utføres uten FM1-43 i badekaret å kjøre fargestoff synaptic vesicle exocytosis (trinn e). Den samme NMJ er så re-fotografert for å analysen losset synaptic terminalen (trinn f). Fluorescerende intensitet måles fra både lastet og losset NMJs å kvantifisere SV endocytose og SV exocytosis nivåer. Det nedre panelet viser bygging parametere og dimensjoner for gjennomsiktig akryl kammeret brukes til disse studiene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: FM fargestoff lasting / lossing sammenligning av alle stimulering metoder. Sammenligning av FM1-43 fargestoff lasting og lossing i den vandrende tredje skikkelsen NMJ med 1) høy [K+] depolarization av hele larver preparatet (øverst), 2) enkel sugeevnen elektrode elektrisk stimulering av motor nerve (midten) og 3) lys-drevet aktivering av de målrettede channelrhodopsin (ChR2) bare i motor neurons (nederst). (A) den larver NMJ merket med anti-HRP:647 presynaptic membran markør (blå, venstre), lastet med FM1-43 via høy [K+] depolarization i 5 min (midten) og deretter losset via høy [K+] depolarization for 2 min. (B) Sammenligning med sugekraft elektrode elektrisk nervestimulering med samme stimuli perioder for begge FM1-43 fargestoff lasting og lossing. (C) målrettet vglut-Gal4>UAS-ChR2-H134R uttrykk i motor neurons aktivert med blå (470 nm) lys for samme stimuli perioder FM1-43 fargestoff lasting og lossing. Stjerner se insets vise høyere forstørring boutons. Baren skala er 10 µm, med innfelt synaptic boutons forstørret 3,5 X fra panelene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Notum null mutanter viser redusert FM fargestoff lasting i synaptic boutons. FM1-43 inn i synaptic terminalene på den vandrende tredje skikkelsen NMJ sammenligne kontrollen genetiske (w1118) til Notum null mutanter (NotumKO). (A) NMJ boutons merket med høy [K+] depolarization hele larver forberedelser (øverst) eller suge elektrode stimulering av en motor nerve (nederst) i w1118 (venstre) og NotumKO (høyre). (B) Quantified lastet FM1-43 fluorescens per NMJ som et spredningsdiagram sammenligne høy [K+] depolarization og suge elektrode stimulering i w1118 kontroller vs NotumKO mutanter. (C) Quantified lastet fluorescens på bouton per bouton basis som en boksen og whisker plott sammenligne høy [K+] depolarization og suge elektrode stimulering i w1118 kontroller vs NotumKO . Student tosidige t-tester ble utført for hver sammenligning med p-verdier vises på grafene. Viser gjennomsnittlig ± SEM med prisme (versjon 7.0 for Windows). Elektrisk stimulering dataene er tilpasset med tillatelse fra Kopke et al., utvikling 144 (19): 3499-510, 2017. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: Synaptic ultrastructure med FM fargestoff photoconversion merke blemmer. Fluorescerende FM1-43 kan photoconverted til en oksidert diaminobenzidine (DAB) elektron-tette utløse for visualisering via overføring elektronmikroskop (TEM). (A) A skjematisk diagram av metoden photoconversion merke Drosophila NMJ etter aktivitet-avhengige FM1-43 fargestoff lasting. (B) representant TEM bilde av en wildtype synaptic bouton på rest (unstimulated). Merk tett befolket av uniform størrelse SVs. (C) Synaptic boutons som har blitt stimulert med høy [K+] saltvann depolarization etter 5 min, uten photoconversion (til venstre) eller FM1-43 photoconversion (høyre). Legg merke til tilstedeværelsen av bulk endosomal strukturer, merket og umerkede. (D) Synaptic boutons som har vært påtrykkes med en nerve enkel sugeevnen elektrode på 20 Hz for 5 min med ingen photoconversion (venstre) eller FM1-43 photoconversion (høyre). Merk at fargestoff lastet blemmer vises mye mørkere enn tilstøtende losset blemmer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Høy [K+] saltvann depolarizing stimulering er den enkleste av de tre alternativene for aktivitet-avhengige FM fargestoff sykling, men sannsynligvis den minste fysiologiske29. Denne enkle metoden depolarizes hver tilgjengelig celle i hele dyret, og så tillater ikke rettet studier. Det kan være mulig å bruke lokalt høy [K+] saline brønnene med, men dette vil fortsatt depolarize pre/postsynaptic celler og sannsynlig synapse-assosiert glia1. Et annet stort problem er at høy [K+] depolarization stasjoner rask dannelse av bulk endosomes som bare sjelden sett i unstimulated boutons. Bulk endosome formasjon er imidlertid en aktiv mekanisme blokkert av mutasjoner29, som indikerer en ekte fysiologiske prosess. Dermed kan FM1-43 bildebehandling med høy [K+] depolarization brukes å selektivt studere bulk endocytose på synapser. Sugekraft elektrode elektrisk stimulering av motor nerve er en mye mer kontrollert metode. Det har fordelen at bare en enkelt axon bunt stimuleres, og bare presynaptic jernbanestasjonen termini er direkte depolarized (selvfølgelig, depolarized muskel fiber så sender handling). Det gir derfor en stor intern kontroll over NMJs i samme dyret som ikke er stimulere. Denne metoden gjør det mulig å tett kontroll parameterne stimulering, i motsetning til høy [K+] stimulering metoden muliggjør direkte sammenligning med elektrofysiologi opptak4. Men denne teknikken krever spesialisert utstyr og et ganske høyt nivå av teknisk ferdighet, og er derfor mindre tilgjengelig. Lys-drevet aktivering av målrettet channelrhodopsin (ChR2) har fordelen av målretting Velg neurons30. Denne metoden krever ingen kjennskap elektrofysiologi metoder, og kan gjøres med veldig billig utstyr i et laboratorium, men dette krever grunnleggende kjennskap Drosophila arvelighetsforskning.

Valg av stimulering parametere er kritisk viktig for testing SV syklus dynamics spørres innen en rekke genetiske forhold med svært variabel fenotyper1. For alle metodene, eksterne [Ca2 +] brukes er en viktig parameter kontrollere drivkraft for SV sykling. Med høy [K+] stimulering metoden, er et viktig valg [K+] brukes, som bestemmer graden av depolarization styrke. Målinger av Drosophila haemolymph angir en [K+] 5 mm, og 90 mM er vanligvis konsentrasjonen ofte valgt for aktivitet, stimulering,3,,7,,15,,17 , 31. imidlertid [K+] området fra 30-90 mM har vært ansatt å variere stimulering styrke5,16,32. En annen viktig parameter avgjørelse er høy [K+] stimulering for begge FM1-43 lasting og lossing. Perioden for lasting avgjør om hele sykling SV befolkningen effektivt er lastet, eller bare et delsett av aktive blemmer7. Perioden for lossing tilsvarende dikterer andelen SVs gjennomgår exocytosis i stimulering periode, som kan vise eller skjule mutant fenotyper avhengig av rate endringer i SV sykling frekvens2. Med sugekraft elektrode elektrisk motor nervestimulering inkluderer parameteren valg også stimulering spenning, frekvens, varighet og puls. Timelig mønstret aktivitet er en viktig determinant av SV sykling dynamics7og annen stimulering mønstre kan selektivt mobilisere distinkte SV bassenger. Målrettet lys-drevet ChR2 aktivering, valgene inkluderer alle de ovennevnte (med lysintensiteten variabler) og transgene tilleggsalternativer omtalt i neste avsnitt. Med disse parametrene, valg kommer mer eksperimentelle kontroll, men også økt tekniske kompleksiteten.

Channelrhodopsin-2 (ChR2) er en lys-gated membran kanal permeable til mono- og divalent kasjoner33. Hvis ChR2 stimulering, er det mange valg gjøres inkludert Gal4 driveren, UAS-ChR2 konstruksjon og lyskilde variabler for kanal aktivisering. Gal4 drivere spenner fra allestedsnærværende til svært spesifikke. For eksempel allestedsnærværende UH1-Gal4 (daughterless) ville uttrykke ChR2 i hver celle, mens CcapR-Gal4 (Janelia) kjører ChR2 i muskelen 6/7 NMJ men ikke de muskel 4 NMJ31,34. Denne selektiviteten kan brukes som et kraftig internkontroll. Det er likeledes mange UAS-ChR2 varianter, inkludert ChR2-H134R (brukes her, muterte rester forårsaker økt photocurrents)35, VChR1, ChIEF og mange flere36. Hver av disse kanal varianter har forskjellige egenskaper av lys gating, konduktans, ion selektivitet, kinetics og desensitization. Merk noen konstruksjoner inneholder en fluorescerende kode som kan forstyrre FM bildebehandling. For eksempel UAS-ChR2-H134R her er merket med mCherry (ex: 587 nm, em: 610 nm), men ikke produsere detectible utslipp med FM1-43 (ex: 479 nm, em: 598 nm) imaging filtre. Teknisk parameter valg inkluderer lyskilden, bølgelengde og intensitet for kanal aktivisering. Brukt her er en billig blå-emitting LED, med stimulering visuelt bekreftet av assaying muskelsammentrekninger. Vi var også vellykket i aktivere ChR2 bruker epifluorescence, selv om en skanning AC confocal laser ikke var tilstrekkelig. Epifluorescence kan brukes i målrettede stimulering (spesifikke segmenter i stedet for hele dyret), men stimulasjonsparameteret er vanskelig å kontrollere, mens LED koblet opp til en enkelt stimulator lett endrer både varigheten og frekvensen av lys pulser. Fokusere smal avsats lyset gjennom disseksjon mikroskop kameraet port kan mer kontrollert, intens lys stimulering.

Det er opp til eksperimentator å avgjøre hvorvidt å forlate ventrale nerve ledningen/hjernen intakt under stimulering paradigmet. Vi valgte å fjerne hele sentralnervesystemet for sammenligning av de tre metodene brukes her, men noen ganger oppstrøms ledningene er igjen intakt15. En complication er at endogene nevrale aktivitet forekommer når nervesystemet igjen hele. Graden av denne aktiviteten er svært variabel fra dyr til dyr, avhengig disseksjon ekspertisen til eksperimentator i stor grad. Denne variabelen aktivitet kan bidra til mengden FM1-43 fargestoff som er lastet og losset, som er derfor ikke utelukkende på grunn av ytre stimulering ansatt15. En teknisk relaterte complication er at intakt dissekert Larvene kontrakt muskulaturen i får bevegelse, og denne forskyvning sterkt forstyrrer NMJ bildebehandling. Denne bevegelsen er lindres hvis sentralnervesystemet fjernes, og også gjennom anvendelse av Ca2 +-gratis saline under imaging4. Disse metodene er brukt her er tilstrekkelig for å gjøre utmerket FM1-43 fargestoff imaging NMJ forberedelse. Imidlertid velge noen eksperimentelle til medisiner for å hemme muskel sammentrekning (f.eks ryanodine, philanthotoxin-433), eller bruke handlingen potensial blokkere (f.eks tetrodotoxin)37,38. En rekke legemidler kan brukes til å manipulere selektivt SV syklusen, for å fremheve bestemte trinn eller fremheve mutant fenotyper for å undersøke neurotransmission mekanismer. For eksempel noen forskere har ansatt Veratridine (aktiveres spenning-gated Na+ kanaler39) øke SV lasting i reservatet bassenget, Ciklosporin A (hemmer Calcineurin aktivitet40) for å forbedre SV endocytose, og Forskolin (aktiveres adenylyl cyclase41, som forbedrer synaptic overføring42) å øke den exo/endo sykling bassenget7,43,44. Slike farmakologiske manipulasjoner gir ytterligere innsikt. Til slutt, FM1-43 bakgrunn kan oppstå i varierende grad basert på kvaliteten på disseksjon, vaske effektivitet og stimulering. Noen legger en sulfobutylated derivat av β-cyclodextrin Advasep-745eller den vandige fluorophore sulforhodamine46, å slukke uspesifikke fluorescens og forbedre signal-til-bakgrunn forhold.

Det er mange teknikker som kan ledsage FM fluorescerende imaging til videre forståelse av SV syklusen (f.eks elektrofysiologi, synaptopHluorin, elektronmikroskop). Et eksempel vist her er FM fluorescens photoconversion som brukes til å undersøke SV syklus ultrastructural detaljert. SVs er organisert i flere bassenger som romlig og funksjonelt forskjellige2. Lett releasable bassenget (RRP) inneholder blemmer umiddelbart lansert på akutt stimulering. En resirkulering basseng opprettholder SV utgivelsen under forhold med moderat aktivitet. En intern reservatet bassenget (RP) er bare rekruttert med sterk (tilsynelatende nær ikke-fysiologiske) stimulering2. SV bassengene som aktiveres avhengig av stimulering brukes47og rapporter fra Drosophila NMJ bruker FM photoconversion har avdekket Nøkkel innblikk inn romlige og funksjonelle egenskaper for disse annerledes SV bassenger48. FM-photoconversion kan brukes til å studere SV bassenger aktivert under forskjellige stimulering paradigmer, og spørringen spørsmål som lang debattert menneskehandel samspillet mellom endosomes og SVs49. Hvis eksperimentator er interessert i FM imaging i kombinasjon med andre aktivitet-avhengige endringer på synapse, er det en angivelig fixable analog FM1-43 fargestoff (FM1-43FX). Denne sonde skal tillate en å fastsette Drosophila NMJ etter aktivitet-avhengige fargestoff lasting, og deretter følge opp med antistoff merking for å teste for sammenhenger mellom bouton aktivitetsnivå (FM fargestoff fluorescens) og aktivitet-avhengige uttrykk for en protein av interesse. I fremtiden, det vil være svært givende for å utforske flere metoder som kan føre til kombinasjonen av FM fargestoff tenkelig med andre tenkelig tilnærminger på vakre Drosophila NMJ modell synapse.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker Broadie Lab medlemmer for bidrag til denne artikkelen. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01s MH096832 og MH084989 til K.B., og NIH predoctoral fellesskap F31 MH111144 til D.L.K.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit Fisher Scientific NC9644388 To put on cover glass for dissections
Microscope Cover Glass 22x22-1 Fisherbrand 12-542-B To put SylGard on for dissections
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 Thermolyne HPA2235M To cure the SylGard
Plexi glass dissection chamber N/A N/A Handmade
Borosilicate Glass Capillaries WPI 1B100F-4 To make suction and glue micropipettes
Laser-Based Micropipette Puller Sutter Instrument P-2000 To make suction and glue micropipettes
Tygon E-3603 Laboratory Tubing Component Supply Co. TET-031A For mouth and suction pipette
P2 pipette tip USA Scientific 1111-3700 For mouth pipette
0.6-mL Eppendorf tube cap Fisher Scientific 05-408-120 Used to put glue in for dissection
Vetbond 3M WPI vetbond Glue used for dissections
Potassium Chloride Fisher Scientific P-217 Forsaline
Sodium Chloride Millipore Sigma S5886 For saline
Magnesium Chloride Fisher Scientific M35-500 For saline
Calcium Chloride Dihydrate Millipore Sigma C7902 For saline
Sucrose Fisher Scientific S5-3 For saline
HEPES Millipore Sigma H3375 For saline
HRP:Alexa Fluor 647 Jackson ImmunoResearch 123-605-021 To label neuronal membranes
Paintbrush Winsor & Newton 94376864793 To manipulate the larvae
Dumont Dumostar Tweezers #5 WPI 500233 Used during dissection
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) WPI 14177 Used during dissection 
FM1-43 Fisher Scientific T35356 Fluorescent styryl dye
Digital Timer VWR 62344-641 For timing FM dye load/unload 
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope Zeiss For imaging the fluorescent markers
Zen 2009 SP2 version 6.0 Zeiss Software for imaging on confocal
HeNe 633nm laser Lasos To excite HRP:647 during imaging
Argon 488nm laser Lasos To excite the FM dye during imaging
Micro-Forge WPI MF200 To fire polish glass micropipettes
20mL Syringe Slip Tip BD 301625 To suck up the axon for electrical stimulation.
Micro Manipulator (magnetic base) Narishige MMN-9 To control the suction electrode for electrical stimulation
Stimulator Grass S48 To control the LED and electrical stimulation
Zeiss Axioskop Microscope Zeiss Used during electrical stimulation.
40X Achroplan Water Immersion Objective Zeiss Used during electrical stimulation and confocal imaging
All-trans Retinal Millipore Sigma R2500 Essential co-factor for ChR2
Zeiss Stemi Microscope with camera port Zeiss 2000-C Used during channelrhodopsin stimulation
LED 470nm ThorLabs M470L2 Used for ChR activation
T-Cube LED Driver ThorLabs LEDD1B To control the LED
LED Power Supply Cincon Electronics Co. TR15RA150 To power the LED
Optical Power and Energy Meter ThorLabs PM100D To measure LED intensity

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Menon, K. P., Carrillo, R. A., Zinn, K. Development and plasticity of the Drosophila larval neuromuscular junction. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 647-670 (2013).
  2. Rizzoli, S. O., Betz, W. J. Synaptic vesicle pools. Nat Rev Neurosci. 6 (1), 57-69 (2005).
  3. Long, A. A., et al. Presynaptic calcium channel localization and calcium-dependent synaptic vesicle exocytosis regulated by the Fuseless protein. J Neurosci. 28 (14), 3668-3682 (2008).
  4. Kopke, D. L., Lima, S. C., Alexandre, C., Broadie, K. Notum coordinates synapse development via extracellular regulation of Wingless trans-synaptic signaling. Development. 144 (19), 3499-3510 (2017).
  5. Betz, W. J., Mao, F., Bewick, G. S. Activity-dependent fluorescent staining and destaining of living vertebrate motor nerve terminals. J Neurosci. 12 (2), 363-375 (1992).
  6. Richards, D. A., Bai, J., Chapman, E. R. Two modes of exocytosis at hippocampal synapses revealed by rate of FM1-43 efflux from individual vesicles. J Cell Biol. 168 (6), 929-939 (2005).
  7. Verstreken, P., Ohyama, T., Bellen, H. J. FM 1-43 labeling of synaptic vesicle pools at the drosophila neuromuscular junction. Methods Mol Biol. 440, 349-369 (2008).
  8. Dickman, D. K., Horne, J. A., Meinertzhagen, I. A., Schwarz, T. L. A Slowed Classical Pathway Rather Than Kiss-and-Run Mediates Endocytosis at Synapses Lacking Synaptojanin and Endophilin. Cell. 123 (3), 521-533 (2005).
  9. Verstreken, P., et al. Endophilin Mutations Block Clathrin-Mediated Endocytosis but Not Neurotransmitter Release. Cell. 109 (1), 101-112 (2002).
  10. Iwabuchi, S., Kakazu, Y., Koh, J. -Y., Goodman, K. M., Harata, N. C. Examination of synaptic vesicle recycling using FM dyes during evoked, spontaneous, and miniature synaptic activities. J Vis Exp. (85), (2014).
  11. Sandell, J. H., Masland, R. H. Photoconversion of some fluorescent markers to a diaminobenzidine product. J Histochem Cytochem. 36 (5), 555-559 (1988).
  12. Opazo, F., Rizzoli, S. O. Studying Synaptic Vesicle Pools using Photoconversion of Styryl Dyes. J Vis Exp. (36), e1790 (2010).
  13. Sabeva, N. S., Bykhovskaia, M. FM1-43 Photoconversion and Electron Microscopy Analysis at the Drosophila Neuromuscular Junction. Bio-protocol. 7 (17), (2017).
  14. Sabeva, N., Cho, R. W., Vasin, A., Gonzalez, A., Littleton, J. T., Bykhovskaia, M. Complexin Mutants Reveal Partial Segregation between Recycling Pathways That Drive Evoked and Spontaneous Neurotransmission. J Neurosci. 37 (2), 383-396 (2017).
  15. Ryan, T. A., Reuter, H., Wendland, B., Schweizer, F. E., Tsien, R. W., Smith, S. J. The kinetics of synaptic vesicle recycling measured at single presynaptic boutons. Neuron. 11 (4), 713-724 (1993).
  16. Ramaswami, M., Krishnan, K. S., Kelly, R. B. Intermediates in synaptic vesicle recycling revealed by optical imaging of Drosophila neuromuscular junctions. Neuron. 13 (2), 363-375 (1994).
  17. Trotta, N., Rodesch, C. K., Fergestad, T., Broadie, K. Cellular bases of activity-dependent paralysis in Drosophila stress-sensitive mutants. J Neurobiol. 60 (3), 328-347 (2004).
  18. Long, A. A., et al. The nonsense-mediated decay pathway maintains synapse architecture and synaptic vesicle cycle efficacy. J Cell Sci. 123 (Pt 19), 3303-3315 (2010).
  19. Parkinson, W., Dear, M. L., Rushton, E., Broadie, K. N-glycosylation requirements in neuromuscular synaptogenesis. Development. 140 (24), 4970-4981 (2013).
  20. Brand, A. H., Perrimon, N. Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes. Development. 118 (2), (1993).
  21. Jan, L. Y., Jan, Y. N. Antibodies to horseradish peroxidase as specific neuronal markers in Drosophila and in grasshopper embryos. Proc Natl Acad Sci. 79 (8), (1982).
  22. Paschinger, K., Rendić, D., Wilson, I. B. H. Revealing the anti-HRP epitope in Drosophila and Caenorhabditis. Glycoconj J. 26 (3), 385-395 (2009).
  23. Ramachandran, P., Budnik, V. Fm1-43 labeling of Drosophila larval neuromuscular junctions. Cold Spring Harb Protoc. 2010 (8), (2010).
  24. Yawo, H., Kandori, H., Koizumi, A. Optogenetics: light-sensing proteins and their applications. , (2015).
  25. Pulver, S. R., Pashkovski, S. L., Hornstein, N. J., Garrity, P. A., Griffith, L. C. Temporal dynamics of neuronal activation by Channelrhodopsin-2 and TRPA1 determine behavioral output in Drosophila larvae. J Neurophysiol. 101 (6), 3075-3088 (2009).
  26. Hornstein, N. J., Pulver, S. R., Griffith, L. C. Channelrhodopsin2 Mediated Stimulation of Synaptic Potentials at Drosophila Neuromuscular Junctions. J Vis Exp. (25), e1133 (2009).
  27. Britt, J. P., McDevitt, R. A., Bonci, A. Use of channelrhodopsin for activation of CNS neurons. Curr Protoc Neurosci. , Chapter 2, Unit 2.16 (2012).
  28. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  29. Vijayakrishnan, N., Woodruff, E. A., Broadie, K. Rolling blackout is required for bulk endocytosis in non-neuronal cells and neuronal synapses. J Cell Sci. 122, 114-125 (2009).
  30. Honjo, K., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Optogenetic manipulation of neural circuits and behavior in Drosophila larvae. Nat Protoc. 7 (8), 1470-1478 (2012).
  31. Dear, M. L., Shilts, J., Broadie, K. Neuronal activity drives FMRP- and HSPG-dependent matrix metalloproteinase function required for rapid synaptogenesis. Sci Signal. 10 (504), (2017).
  32. Baldwin, M. L., Rostas, J. A. P., Sim, A. T. R. Two modes of exocytosis from synaptosomes are differentially regulated by protein phosphatase types 2A and 2B. J Neurochem. 85 (5), 1190-1199 (2003).
  33. Nagel, G., et al. Channelrhodopsin-2, a directly light-gated cation-selective membrane channel. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (24), 13940-13945 (2003).
  34. Pfeiffer, B. D., et al. Tools for neuroanatomy and neurogenetics in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (28), 9715-9720 (2008).
  35. Nagel, G., Brauner, M., Liewald, J. F., Adeishvili, N., Bamberg, E., Gottschalk, A. Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses. Curr Biol. 15 (24), 2279-2284 (2005).
  36. Lin, J. Y. A user's guide to channelrhodopsin variants: features, limitations and future developments. Exp Physiol. 96 (1), 19-25 (2011).
  37. Sullivan, K. M., Scott, K., Zuker, C. S., Rubin, G. M. The ryanodine receptor is essential for larval development in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (11), 5942-5947 (2000).
  38. Narahashi, T., Moore, J. W., Scott, W. R. Tetrodotoxin Blockage of Sodium Conductance Increase in Lobster Giant Axons. J Gen Physiol. 47 (5), 965-974 (1964).
  39. Narahashi, T. Chemicals as tools in the study of excitable membranes. Physiol Rev. 54 (4), 813-889 (1974).
  40. Kuromi, H., Yoshihara, M., Kidokoro, Y. An inhibitory role of calcineurin in endocytosis of synaptic vesicles at nerve terminals of Drosophila larvae. Neurosci Res. 27 (2), 101-113 (1997).
  41. Seamon, K. B., Daly, J. W. Forskolin, cyclic AMP and cellular physiology. Trends Pharmacol Sci. 4, 120-123 (1983).
  42. Zhang, D., Kuromi, H., Kidokoro, Y. Synaptic Transmission at the Drosophila Neuromuscular Junction: Effects of Metabotropic Glutamate Receptor Activation. Slow Synaptic Responses Modul. , 260-265 (2000).
  43. Kuromi, H., Kidokoro, Y. The optically determined size of exo/endo cycling vesicle pool correlates with the quantal content at the neuromuscular junction of Drosophila larvae. J Neurosci. 19 (5), 1557-1565 (1999).
  44. Kuromi, H., Kidokoro, Y. Selective Replenishment of Two Vesicle Pools Depends on the Source of Ca2+ at the Drosophila Synapse. Neuron. 35 (2), 333-343 (2002).
  45. Kay, A. R., et al. Imaging Synaptic Activity in Intact Brain and Slices with FM1-43 in C. elegans, Lamprey, and Rat. Neuron. 24 (4), 809-817 (1999).
  46. Pyle, J. L., Kavalali, E. T., Choi, S., Tsien, R. W. Visualization of Synaptic Activity in Hippocampal Slices with FM1-43 Enabled by Fluorescence Quenching. Neuron. 24 (4), 803-808 (1999).
  47. Denker, A., Rizzoli, S. O. Synaptic vesicle pools: an update. Front Synaptic Neurosci. 2, 135 (2010).
  48. Denker, A., Kröhnert, K., Rizzoli, S. O. Revisiting synaptic vesicle pool localization in the Drosophila neuromuscular junction. J Physiol. 587 (12), 2919-2926 (2009).
  49. Wucherpfennig, T., Wilsch-Bräuninger, M., Gonz ález-Gait án, M. Role of Drosophila Rab5 during endosomal trafficking at the synapse and evoked neurotransmitter release. J Cell Biol. 161 (3), 609-624 (2003).

Tags

Nevrovitenskap problemet 135 Drosophila nevromuskulær junction FM1-43 elektrofysiologi photoconversion overføring elektronmikroskop
FM fargestoff sykling Synapse: sammenligne høyt kalium Depolarization, elektrisk og Channelrhodopsin stimulering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye… More

Kopke, D. L., Broadie, K. FM Dye Cycling at the Synapse: Comparing High Potassium Depolarization, Electrical and Channelrhodopsin Stimulation. J. Vis. Exp. (135), e57765, doi:10.3791/57765 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter