Synaptiskt vesikelprotein (SV) cykling är core mekanismen för kommunikationen i nervcellernas synapser. FM dye upptag och utsläpp är det primära sättet att kvantitativt testmetoder SV endo- och exocytos. Här, jämför vi alla stimulering metoder för att driva FM1-43 cykling på Drosophila neuromuskulära förbindelsen (NMJ) modell synapsen.
FM färgämnen används att studera cykelns synaptiskt vesikelprotein (SV). Dessa amfipatiska sonder har en hydrofil huvud och hydrofoba svans, vilket gör dem vattenlösliga med förmågan att reversibelt ange och avsluta membran lipider lipidmonolager. Dessa styryl färgämnen är relativt icke-fluorescerande i vattenhaltigt medium, men införande i den yttre bipacksedeln av plasmamembranet orsakar en > 40 X ökning av fluorescens. I nervcellernas synapser, är FM färgämnen internaliserad under SV endocytos, trafikerade både inom och mellan SV pooler och utsläppt med SV exocytos, som tillhandahåller ett kraftfullt verktyg för att visualisera presynaptiska stadier av neurotransmission. En primär genetisk modell av glutamatergic synaps utveckling och funktion är den Drosophila neuromuskulära förbindelsen (NMJ), där FM färga imaging har använts i stor utsträckning att kvantifiera SV dynamik i ett brett utbud av muterade villkor. NMJ synaptic terminalen är lättillgänglig, med en vacker samling av stora synaptic knappar som är perfekt för imaging applikationer. Här, vi jämför och kontrast på tre sätt att stimulera den Drosophila NMJ att driva aktivitet-beroende FM1-43 dye upptag/release: 1) bad tillämpningen av hög [K+] att depolariseras neuromuskulära vävnader, 2) sug elektrod motor nerv stimulering till depolariseras presynaptiska nerven terminal, och 3) riktade transgena uttrycket för channelrhodopsin varianter för ljus-stimulerad, spatial kontroll av depolarisation. Dessa metoder har fördelar och nackdelar för att studera genetisk mutation effekter på SV cykeln på den Drosophila NMJ. Vi kommer att diskutera dessa fördelar och nackdelar att bistå vid valet av metoden stimulering, tillsammans med metoderna som är specifika för varje strategi. Utöver fluorescerande imaging, kan FM färgämnen vara photoconverted electron-tät signaler visualiseras med transmissionselektronmikroskopi (TEM) för att studera SV cykel mekanismer på en ultrastrukturella nivå. Vi erbjuder jämförelser av confocal och elektronmikroskopi imaging från de olika metoderna för Drosophila NMJ stimulering, att vägleda urvalet av framtida experimentella paradigm.
Vackert-kännetecknas Drosophila larval neuromuskulära förbindelsen (NMJ) glutamatergic synaps modellen har använts att studera synaps bildning och funktion med ett brett spektrum av genetiska störningar1. Motorneuronen terminalen består av flera axon grenar, alla med många utvidgade synaptic knappar. Dessa rymlig varicosities (upp till 5 µm i diameter) innehåller alla neurotransmission maskiner, inklusive enhetliga glutamatergic synaptiska vesikler (SVs; ~ 40 nm i diameter) i cytosoliskt reserven och lätt-releasable pool2. Dessa blåsor docka på presynaptiska plasmamembranet fusion webbplats aktiva zoner (AZs), där exocytos förmedlar glutamat neurotransmitterfrigöraren för trans-synaptiska kommunikation. Därefter hämtas SVs från plasmamembranet via kiss-och-kör återvinning eller clathrin-medierad endocytos (CME) för upprepad exo/endocytos cykler. Den Drosophila NMJ är lättillgängligt och väl lämpad för både isolera och karakterisera SV cykel mutanter. Nya mutationer använder framåt genetiska skärmar, och har lett till identifiering av nya gener kritiska för SV cykel3. Omvänd genetiska metoder börjar med redan kända gener har dessutom lett till förtydligandet av nya SV cykel mekanismer genom en noggrann beskrivning av mutant cykling fenotyper4. Den Drosophila NMJ är nästan perfekt som en experimentell synaptic förberedelse för dissekera SV endocytos och exocytos mekanismer via metoder för att optiskt spår vesikler cykling under neurotransmission.
En rad fluorescerande markörer tillåta visuell spårning av blåsor under cykling dynamics, men den mest mångsidiga är FM dye analoger som syntetiseras först av Mao, F., et al. 5. strukturellt, FM färgämnen innehåller en hydrofil huvud och en lipofila svans ansluten via en aromatisk ring, med en central region ger spektrala egenskaper. Dessa styryl färgämnen partitionera reversibelt i membran, inte ‘flip-flop’ mellan membran broschyrer och så är aldrig gratis i cytosolen, och är långt mer fluorescerande i membran än vatten5. Reversibel införande i en lipid lipidens orsakar en 40-fold ökning av fluorescens6. På nervcellernas synapser bestå klassiska FM dye märkning experiment av badningen synaptic preparatet med färgämnet under depolariserande stimulering att ladda dye via SV endocytos. Yttre färgämne sedan tvättas bort och cykelns SV grips i en kalciumfri ringer-lösning till bild laddade synapserna7. En andra omgång stimulering i ett färgämne-fria bad utlöser FM utsläpp via exocytos, en process som kan följas genom mätning av fluorescens intensitet minskningen. SV populationer från en enda vesikler till pooler som innehåller hundratals blåsor kan vara kvantitativt övervakade6,7. FM färgämnen har använts att dissekera aktivitet-beroende mobilisering av funktionellt distinkta SV pooler och jämföra kiss-och-kör vs. CME cykling8,9. Metoden har ändrats till separat analys framkallat, spontan och miniatyr synaptic cykel aktiviteter (med mycket känslig utrustning för att upptäcka mycket små fluorescens förändringar och minska fotoblekning)10. Analyser kan förlängas till ultrastrukturella nivå genom photoconverting den fluorescerande FM-signalen till en elektron-tät etikett för överföring elektronmikroskopi11,12,13,14 .
Historiskt, bad synaptic preparat i en hög koncentration av kalium (hädanefter benämnd ”hög [K+]”) har varit metoden för val av depolariserande stimulering för att inducera SV Cykling; allt från grodan kolinerga NMJ5, till odlade gnagare hjärnan Hippocampus nervceller15, till Drosophila glutamatergic NMJ modell16,17. Denna hög [K+] metod är enkel, kräver ingen specialutrustning, och är därför tillgänglig för de flesta laboratorier, men har begränsningar för både tillämpning och tolkning av data. En mycket mer fysiologiskt lämplig metod är att använda sug elektrod elektrisk stimulering av nerven4,5,12. Detta synsätt driver aktionspotentialens spridning för direkt stimulering av presynaptiska nerven terminal, och resultatet kan direkt jämföras med elektrofysiologiska analyser neurotransmission funktion13,14, 15, men kräver specialutrustning och är tekniskt mycket mer utmanande. Med tillkomsten av optogenetik har användandet av channelrhodopsin neuronala stimulering ytterligare fördelar, inklusive snäva spatiotemporal kontroll av kanal uttryck med binära Gal4/UAS system20. Detta tillvägagångssätt är tekniskt mycket lättare än sug elektrod stimulering och kräver inget annat än en mycket billig LED-ljuskälla. Här, vi anställer imaging FM1-43 (N-(3-triethylammoniumpropyl)-4-(4-(dibutylamino)styryl) specificiteten etylenedibromid) att både jämföra och kontrastera dessa tre olika stimulering metoder på den Drosophila NMJ: enkel hög [K+ ], utmanande elektriska och nya channelrhodopsin metoder.
Hög [K+] saltlösning depolariserande stimulering är den absolut enklaste av de tre alternativen för aktivitet-beroende FM dye Cykling, men sannolikt den minst fysiologiska29. Den här enkla metoden depolarizes varje tillgänglig cell i hela djuret, och så tillåter inte riktade studier. Det kan vara möjligt att tillämpa lokalt hög [K+] saltlösning med en mikropipett, men detta kommer fortfarande depolariseras pre/postsynaptiska celler och sannolikt synaps-associerade…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Broadie Lab medlemmar för bidrag till denna artikel. Detta arbete fick stöd av NIH R01s MH096832 och MH084989 till K.B., och NIH pre gemenskap F31 MH111144 till D.L.K.
SylGard 184 Silicone Elastomer Kit | Fisher Scientific | NC9644388 | To put on cover glass for dissections |
Microscope Cover Glass 22×22-1 | Fisherbrand | 12-542-B | To put SylGard on for dissections |
Aluminum Top Hot Plate Type 2200 | Thermolyne | HPA2235M | To cure the SylGard |
Plexi glass dissection chamber | N/A | N/A | Handmade |
Borosilicate Glass Capillaries | WPI | 1B100F-4 | To make suction and glue micropipettes |
Laser-Based Micropipette Puller | Sutter Instrument | P-2000 | To make suction and glue micropipettes |
Tygon E-3603 Laboratory Tubing | Component Supply Co. | TET-031A | For mouth and suction pipette |
P2 pipette tip | USA Scientific | 1111-3700 | For mouth pipette |
0.6-mL Eppendorf tube cap | Fisher Scientific | 05-408-120 | Used to put glue in for dissection |
Vetbond 3M | WPI | vetbond | Glue used for dissections |
Potassium Chloride | Fisher Scientific | P-217 | Forsaline |
Sodium Chloride | Millipore Sigma | S5886 | For saline |
Magnesium Chloride | Fisher Scientific | M35-500 | For saline |
Calcium Chloride Dihydrate | Millipore Sigma | C7902 | For saline |
Sucrose | Fisher Scientific | S5-3 | For saline |
HEPES | Millipore Sigma | H3375 | For saline |
HRP:Alexa Fluor 647 | Jackson ImmunoResearch | 123-605-021 | To label neuronal membranes |
Paintbrush | Winsor & Newton | 94376864793 | To manipulate the larvae |
Dumont Dumostar Tweezers #5 | WPI | 500233 | Used during dissection |
7 cm McPherson-Vannas Microscissors (blades 3 mm) | WPI | 14177 | Used during dissection |
FM1-43 | Fisher Scientific | T35356 | Fluorescent styryl dye |
Digital Timer | VWR | 62344-641 | For timing FM dye load/unload |
LSM 510 META laser-scanning confocal microscope | Zeiss | For imaging the fluorescent markers | |
Zen 2009 SP2 version 6.0 | Zeiss | Software for imaging on confocal | |
HeNe 633nm laser | Lasos | To excite HRP:647 during imaging | |
Argon 488nm laser | Lasos | To excite the FM dye during imaging | |
Micro-Forge | WPI | MF200 | To fire polish glass micropipettes |
20mL Syringe Slip Tip | BD | 301625 | To suck up the axon for electrical stimulation. |
Micro Manipulator (magnetic base) | Narishige | MMN-9 | To control the suction electrode for electrical stimulation |
Stimulator | Grass | S48 | To control the LED and electrical stimulation |
Zeiss Axioskop Microscope | Zeiss | Used during electrical stimulation. | |
40X Achroplan Water Immersion Objective | Zeiss | Used during electrical stimulation and confocal imaging | |
All-trans Retinal | Millipore Sigma | R2500 | Essential co-factor for ChR2 |
Zeiss Stemi Microscope with camera port | Zeiss | 2000-C | Used during channelrhodopsin stimulation |
LED 470nm | ThorLabs | M470L2 | Used for ChR activation |
T-Cube LED Driver | ThorLabs | LEDD1B | To control the LED |
LED Power Supply | Cincon Electronics Co. | TR15RA150 | To power the LED |
Optical Power and Energy Meter | ThorLabs | PM100D | To measure LED intensity |